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Cultivo de Pleurotus ostreatus.
Graciela ColmanMariana SanabiaÁlvaro Soto3º BiologíaCeRP del Sur
Asesoramiento técnico: Prof. Ricardo Indarte.
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Objetivo:
• Cultivar hongos pertenecientes a la especie Pleurotus ostreatus utilizando el instrumental con que cuenta el laboratorio de nuestra institución educativa.
• Aprender a utilizar técnicas de laboratorio, vinculando tres asignaturas: Taller de laboratorio, Botánica y Microbiología.
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Un poco de información…
Los hongos son organismos eucariotas pertenecientes al reino Fungi.
Inicialmente se los consideró como plantas, pero presentan algunas características importantes que los diferencian de ellas:
• La pared celular de los hongos no está compuesta de celulosa, como las plantas, sino de quitina. La quitina es un polisacárido que también forma el exoesqueleto de los artrópodos.
• No poseen pigmentos fotosintéticos, como clorofilas, entre otros. Por ende, no son capaces de realizar fotosíntesis.
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No forman verdaderos tejidos. Sus células están juntas y muy relacionadas, pero no cumplen una función en conjunto.
Las células de los hongos se denominan hifas y el conjunto de todas las hifas de un hongo se conoce como micelio.
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El cultivo del Pleurotus, es simple y requiere de poca inversión inicial.
El sistema más común de siembra es en bolsas.
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Como sustrato se puede usar casi cualquier elemento que contenga celulosa: pajas, aserrines, hojas, marlos molidos, subproductos de los cultivos de café, algodón, arroz, etc.
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Autoclave
• Para la esterilización del material y medios de cultivo utilizamos un autoclave. El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de cultivo in vitro, fue inventado por el microbiólogo francés Charles Chamberland, en 1879.
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•El proceso de esterilización en autoclave se compone de 3 fases:
• Fase de purgado: La resistencia calienta el agua del fondo del calderín, se va produciendo vapor que desplaza el aire que comienza a salir por la válvula de purgado que está abierta. Esta fase termina cuando se alcanza la temperatura de esterilización.
•Fase de esterilización: Una vez cerrada la válvula de purgado y alcanzada la temperatura de esterilización previamente seleccionada se inicia el proceso de esterilización. Este proceso toma entre 15-20 minutos.
•Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilización, deja de funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor. La presión y temperatura del calderín empieza a bajar poco a poco.
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Estufa de cultivoLa estufa de cultivo es el aparato donde se incuban bacterias y hongos a una
temperatura adecuada y constante, para realizar luego diversos análisis en el laboratorio.
•Tienen una cámara interior de acero inoxidable con soporte para estantes desmontables y posee dos puertas. La temperatura se calibra digitalmente y se controla mediante un termómetro incorporado. La temperatura fue 28ºC.
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Materiales:
• De vidrio:- Cajas de Petri.- Matraces.- Tubos de ensayo.- Vaso de bohemia.- Probeta
• Otro instrumental:- Horno microondas.- Balanza.- Mechero Bunsen.- Ansas.- Tapabocas.- Guantes de látex y de amianto.- Autoclave.- Estufa de cultivo.
• Medios de cultivo:- Czapek.- Plate count agar.- Antibiótico.- Paja.- Agua destilada.
• Cuerpos fructíferos del hongo Pleurotus ostreatus.
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Procedimiento:1º Etapa:
1) Preparación de los medios de cultivo:
- Dilución del medio en agua destilada.
- Esterilización del medio y de las cajas de Petri.
- Añadidura de antibiótico.
- Llenado de cajas de petri al calor del mechero.
1) Extracción e inoculación de micelio:
- Extracción de trozos de micelio con bisturí y pinzas.
- Colocación de los trozos en las cajas de Petri con el medio solidificado.
- Se llevan las cajas inoculadas a estufa de cultivo a 28ºC.
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3) Multiplicación del micelio:
Una vez que el micelio primario prolifera en las cajas de los pasos anteriores, se multiplica para obtener más cantidad.
-Se preparan más cajas con medio de cultivo.
-Se recortan trozos de medio sólido con micelio primario y se inoculan en las nuevas cajas.
-Las nuevas cajas inoculadas se llevan a estufa de cultivo a 28ºC.
2º Etapa:
1) Preparación del medio donde se hará fructificar el micelio primario de Pleurotus ostreatus:
-Se arman paquetes de paja envueltos en diario y se esterilizan en autoclave.
-Humidificación de la paja con agua destilada para favorecer la fructificación.
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2) Inculación del micelio primario en la paja:
-En una bolsa de nylon, se colocan capas alternadas de paja y de micelio primario.
- La bolsa se mantiene cerrada y en condiciones de humedad y luz moderada.
Pleurotus ostreatus demora aproximadamente tres meses en fructificar.
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Procedimiento alternativo: Esporada.
- En un vaso de bohemia se coloca círculo de papel blanco con un orificio en el centro.
- Sobre él, se coloca un cuerpo fructífero de Pleurotus ostreatus (el estípite se sostiene en el agujero de la hoja).
- Sobre el vaso de bohemia se coloca una campana de vidrio, que puede ser un vaso de bohemia más grande dado vuelta.
Se espera que, dos o tres días después, la hoja contenga las esporas que cayeron de las láminas del sombrero. Esas esporas se inoculan en cajas de Petri con medio de cultivo.
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Resultados:
Nos enfrentamos a nuevas limitaciones: Ventajas y desventajas del laboratorio.
Descartamos uno de los medios de cultivo, y nos quedamos con Czapek.
De cada generación de placas con micelio primario se contaminó el 50%: Las condiciones no eran del todo favorables para lograr esterilidad absoluta.
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Luego de inocular la paja, descubrimos que el hongo que habíamos cultivado no era Pleurotus ostreatus:
- Al microscopio descubrimos que era un Deuteromycota.
- Compitió con Pleurotus ostreatus, colonizando el medio de cultivo.
Nos vimos obligados a repetir la experiencia desde cero.
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La repetición fue exitosa: Logramos obtener micelio primario de Pleurotus ostreatus.
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La repetición retrasó los tiempos:
- Pleurotus ostreatus demora tres meses en fructificar, y la inoculación en la paja se hizo hace seis semanas.
Aún no podemos saber si obtendremos micelio secundario de Pleurotus ostreatus.
Modificaciones para la repetición: A la paja le agregamos aserrín, que ayuda a mantener la humedad y provee una fuente de lignina (Pleurotus ostreatus es un hongo ligninolítico: degrada lignina).
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Conclusiones finales:
• Aprendimos técnicas de laboratorio esenciales en la enseñanza y el aprendizaje de la Biología.
• Comprendimos las limitaciones y las ventajas de un laboratorio de Biología de formación docente.
• Comprobamos que toda práctica experimental está inmersa en un contexto determinado, y que éste determina en buena medida los resultados de la misma.
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FIN.
¡Muchas gracias!
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