Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León)
Facultad de Ciencias Médicas
Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas (CEI)
Tesis para optar al título de Máster en Microbiología Médica
PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección y
cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus.
Autora:
Lic. Eliana María Espinoza Tórrez. Tutor: Filemón Bucardo, PhD Profesor Titular. Dpto. Microbiología y Parasitología Facultad de Ciencias Médicas UNAN-León Asesor: Johan Nordgren, PhD División de Virología Molecular Facultada de Ciencias Médicas. Universidad de Linköping, Suecia.
León, Nicaragua 2011
“A la libertad por la Universidad”
A mis padres, Rafael Espinoza y Eliana Torrez, por su amor y sabiduría.
“No tengas miedo de tener valor” Karol Wojtyla
AGRADECIMIENTO
Primero quiero dar gracias a Dios por finalizar esta etapa de mi vida llena de muy buenas
experiencias y muchos conocimientos que serán herramientas en mi futuro como persona y
como profesional.
Agradecer a mis abuelos por estar pendiente de cada miembro de la familia y su presencia.
Mis padres por darme la vida, por su ejemplo, su disciplina, sentido de la responsabilidad y
sobre todo por su amor. A mis hermanos, María José y Rafael, gracias por su amistad, su
apoyo en todo momento y su infaltable música. A mi cuñado Mike, por su apoyo y
disponibilidad para ayudarme. A mi novio, Graziano por ser mi OZ y coraje, y transmitirme
su amor. A la personita más grande en mi vida, mi sobrino Juan Pablo, la luz y alegría de
mis días.
Muchas gracias a mi tutor Filemón Bucardo. PhD por que con su profesionalismo,
paciencia y sincera amistad ha sido un excelente guía en este caminar, gracias a él hoy
puedo ver finalizada esta tesis. A Johan Nordgren. PhD y Dr. Lenart Svensson. PhD de la
Universidad de Linköping, Suecia por proveer los estándares utilizados en este estudio y
revisar el documento.
Un profundo y sincero agradecimiento a la Lic. Yahoska Reyes, que fue la persona que
durante todo este proceso me brindó su mano, su apoyo incondicional, colaboración y su
amistad. Gracias a cada una de las personas del departamento y del laboratorio de
Microbiología de la universidad, cada uno de ellos con su trabajo dio un granito de arena
para que este trabajo se pudiera desarrollar.
Quiero agradecer a mi amigo William Morales. Msc quien a lo largo de mí recorrido por
esta universidad ha sido un excelente profesor y ha compartido conmigo sus conocimientos,
su sabiduría, sus consejos y una buena amistad.
Este estudio fue desarrollado con fondos de Netropica Grant 05-N-2010.
RESUMEN
Norovirus es reconocido como la causa principal de gastroenteritis aguda no bacteriana. En
países en desarrollo, la infección por NoV causa aproximadamente 200,000 muertes al año
en niños ≤ 5 años. A pesar que NoV es un patógeno importante en humanos los métodos
diagnósticos son escasos, particularmente en países en desarrollo. Debido a la alta
diversidad genética del NoV humano y la falta de un cultivo celular, no se cuenta con un
reactivo para un diagnóstico de rutina, como el ELISA. Para mejorar la capacidad en el
diagnóstico de NoV, un ensayo de PCR en tiempo real fue optimizado y validado.
Utilizando una curva estándar de plásmidos para NoV GI y GII, nuestro método puede
cuantificar NoV en un rango dinámico de 103-107 e.g por reacción, con un límite de
detección de 100 e.g por reacción (~1.9 x 105 e.g/gr. h). Para validar el nuevo método
optimizado de PCR en tiempo real, un total de 60 muestras fueron seleccionadas
aleatoriamente de una colección de 253 muestras de heces de niños ≤ 5 años con diarrea, el
mismo material se analizó con un PCR convencional utilizado tradicionalmente para el
tamizaje de NoV. De interés es que 4 muestras fueron positivas por PCR en tiempo real y
negativas por el PCR convencional. Estas 4 muestras tienen < 1000 e.g por reacción, lo que
sugiere que el PCR convencional es menos sensible que nuestro método. La curva de
disociación y el Tm de estas 4 muestras fueron similares con las muestras de referencia, por
lo tanto pueden ser verdaderos NoV positivos. El nuevo ensayo de PCR en tiempo real
puede incrementar el número de NoV positivos en estudios epidemiológicos moleculares y
puede ser fácilmente adaptado para el diagnóstico clínico de rutina en infecciones causadas
por NoV. Este es el primer PCR en tiempo real optimizado y validado para la detección y
cuantificación de NoV en el laboratorio de Microbiología de la UNAN-León y
probablemente el primero en Nicaragua.
CONTENIDOS
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 3 3. PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA ....................................................................... 4 4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 5 5. MARCO TEÓRICO ................................................................................................. Véase 5.1. Biología del virus ........................................................................................................... 6 5.2. Características y evolución de NoV ............................................................................. 7 5.3. Epidemiología y transmisión ........................................................................................ 9 5.4. Características clínicas ................................................................................................ 10 5.5. Susceptibilidad del huésped, inmunología y patogénesis ......................................... 11 5.6. Métodos diagnósticos ............................................................................................. Véase 5.6.1. Ensayos inmunoenzimáticos .................................................................................... 14 5.6.2. Ensayos de PCR convencional ................................................................................. 15 5.6.3. Ensayo de PCR en tiempo real .......................................................................... Véase 5.6.3.1 Terminología en el análisis del PCR en tiempo real ............................................ 18 5.6.3.2. Químicas usadas en el PCR en tiempo real ......................................................... 23 5.6.3.3 Moléculas fluorescentes utilizadas en PCR en tiempo real ................................. 32 6. MATERIAL Y MÉTODO ............................................................................................. 36 7. RESULTADOS ............................................................................................................... 43 8. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 53 9. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 58 10. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 59 11. REFERENCIAS ........................................................................................................... 60 12. ANEXOS ....................................................................................................................... 65
ABREVIACIONES
NoV Norovirus
GI Genogrupo I
GII Genogrupo II
LUX Light-Upon-Extension
NS Región N-terminal Shell
ADN Acido desoxirribonucleico.
ADNc ADN complementario.
ADNds ADN de cadena doble.
ARN Acido ribonucleico.
ELISA Ensayos inmunoenzimático
Tm Temperatura de disociación
RT Transcripción Reversa.
PCR Reacción en Cadena de la
Polimerasa.
RdRp Región dependiente de ARN
Polimerasa
Ct Threshold cycle
∆Rn Variación de la intensidad de
fluorescencia.
nt nucleótido
kd kilo dalton
pb pares de bases
nM nano-Molar
µl micro litro
nm nanómetro
pmol pico-mol
VP1 proteína mayor de la cápside
VP2 proteína estructural menor.
VLP Virus-Like Particle.
ORF Open Reading Frame.
e.g equivalente genómico
e.g/gr h equivalente genómico por
gramo de heces.
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1. INTRODUCCIÓN
Norovirus (NoV) es considerado como una de las principales causas de gastroenteritis viral,
tanto esporádica como epidémica, a nivel mundial. Un estudio reciente estima que cada año
NoV puede causar más de un millón de hospitalizaciones y 200.000 muertes en niños ≤ 5
años [Patel et al., 2008]. La mortalidad por gastroenteritis aguda para el año 2000 fue
estimada de 2.1 millones, y la mortalidad en niños fue mayor en países en desarrollo [Patel
et al., 2008]. NoV son un grupo amplio de patógenos entéricos con una alta diversidad
genética. Estas variantes incluyen 5 genotipos dentro del GI y al menos 17 genotipos dentro
del GII [Zheng et al., 2006]. En los últimos años, el PCR en tiempo real ha surgido como
un método altamente reproducible y sensible para la detección de NoV, probando ser más
sensible que los métodos utilizados previamente como el microscopio electrónico y el PCR
convencional. Pero los análisis moleculares para NoV se han visto incapacitado por la
necesidad de múltiples primers para detectar la gran variedad genética. [Nordgren et al.,
2008]
Existen varios ensayos de PCR en tiempo real reportados para la detección de NoV,
incluyendo ensayos TaqMan [Kageyama et al., 2003; Pang et al., 2004; Tajiri-Utagawa et
al., 2009; Trujillo et al., 2006; Vainio and Myrmel, 2006], basados en la química de SYBR
Green [Pang et al., 2004; Richards et al., 2004a] y recientemente aplicando un sistema LUX
[Nordgren et al., 2008]. Varios de los ensayos desarrollados recientemente están dirigidos
al segmento de traslape ORF1-ORF2 en el genoma viral, el cual es posiblemente la región
más conservada del genoma de NoV [Kageyama et al., 2003; Katayama et al., 2002;
Nordgren et al., 2008].
La técnica de PCR en tiempo real utilizada en este estudio se basa en el sistema de SYBR
Green que consiste en un fluoróforo que se intercala en la doble cadena amplificada de
ADN (ADNds) por tanto la fluorescencia es inespecífica, es decir los dímeros de primers o
productos inespecíficos emiten fluorescencia, a diferencia de los métodos que usan una
sonda como TaqMan.
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Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la
reacción es muy fácil y además es más barato que las sondas específicas. Para mejorar la
especificidad se debe emplear condiciones óptimas de reacción, así como una selección
cuidadosa de los primers para disminuir la formación de dímeros.
En Centroamérica los reportes sobre la prevalencia de NoV son muy limitados, así los
primeros datos sobre la prevalencia de NoV en Nicaragua fue realizada por Bucardo et al.,
en el 2008 quienes realizaron un estudio epidemiológico molecular en niños ≤ 5 años
hospitalizados y de la comunidad, quienes reportaron una prevalencia de NoV del 12%,
considerando a NoV como un agente etiológico importante de la diarrea aguda en niños. La
propagación rápida del virus y su estabilidad en algunos ambientes dificulta su control en
brotes, así como la falta de un diagnóstico rápido y preciso. En gran medida las deficiencias
atribuidas a la complejidad de los ensayos para NoV se deben a que el virus no puede
propagarse en cultivo de células, así los métodos moleculares han sido los ensayos de
elección para su detección.
Es por ello, que con este estudio pretendemos optimizar y validar un ensayo de PCR en
tiempo real que permita la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de NoV
en muestras diarreicas en niños ≤ 5 años, y tener acceso a un ensayo sensible y específico
de costo más reducido en comparación con otros sistemas de PCR en tiempo real, y ser
implementado como diagnóstico de rutina en futuros estudios epidemiológicos moleculares
de NoV como causa de diarrea aguda en nuestro país.
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2. JUSTIFICACIÓN
Las infecciones en humanos causadas por NoV se han convertido en un creciente problema
de salud de gran impacto en la salud pública a nivel mundial. La prevalencia de NoV como
causa de gastroenteritis esporádica y epidémica seguramente está subestimada debido a que
no se realiza habitualmente un diagnóstico específico.
La aplicación reciente de técnicas sensibles y específicas como es el PCR en tiempo real ha
demostrado que los NoV son causa frecuente e importante de gastroenteritis esporádica y
endémica en todo el mundo y en todos los grupos de edad. En países en vías de desarrollo,
donde la diarrea es la principal causa de muerte en niños, se sabe relativamente poco sobre
el papel desempeñado por los NoV, pero se estima que representan, aproximadamente el
12% de los casos de gastroenteritis grave en niños ≤ 5 años en todo el mundo [Fankhauser
et al., 2002; Patel et al., 2009].
A pesar que NoV es un patógeno importante en humanos los métodos diagnósticos son
escasos, particularmente en países en desarrollo. Debido a la alta diversidad genética de
NoV y el hecho de ser virus no cultivables, los reactivos para un diagnóstico de rutina,
como el ELISA son poco disponibles y poco específicos. Por ello, con el objetivo de
mejorar la capacidad en el diagnóstico de NoV un ensayo de PCR en tiempo real basado en
SYBR Green fue optimizado y validado.
El nuevo ensayo de PCR en tiempo real permitirá la realización de estudios
epidemiológicos moleculares dirigidos a la detección y cuantificación de los genogrupos GI
y GII de NoV en muestras diarreicas, así como a la implementación de un diagnóstico de
rutina sensible y específico disponible en el departamento de Microbiología de la UNAN-
León que permita brindar a la comunidad y al medio hospitalario un diagnóstico importante
de la etiología viral de la diarrea aguada principalmente en niños.
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3. PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA
El diagnóstico de una infección por NoV es muy limitado, el Ministerio de Salud hasta
ahora no dispone de un método diagnóstico de rutina para la detección de NoV en muestras
diarreicas que permita conocer la prevalencia de gastroenteritis por este virus.
Los métodos diagnósticos utilizados en estudios epidemiológicos han resultado ser pocos
sensibles y poco específicos en la detección de los genogrupos GI y GII de estos virus,
como es el caso de los ELISA que se han visto limitados por presentar reacciones
inespecíficas, así como también los métodos moleculares como el PCR convencional que
requiere de múltiples primers para detectar las diferentes variantes genéticas del virus y
presenta baja especificidad en muestras donde la carga viral es baja.
De esta manera, en este estudio nos planteamos la siguiente interrogante: ¿Cuáles
parámetros deben ser optimizados para obtener un método de PCR en tiempo real sensible,
específico y de costo reducido para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y
GII de NoV en muestras diarreicas?
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4. OBJETIVOS
Objetivo general • Desarrollar un ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la
detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus en muestras
diarreicas.
Objetivos específicos
• Optimizar los parámetros químicos y termodinámicos del ensayo de PCR en tiempo
real basado en SYBR Green para la detección de los genogrupos GI y GII de
Norovirus en muestras diarreicas.
• Validar el ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green para la detección
de los genogrupos GI y GII de Norovirus en muestras diarreicas.
• Evaluar las propiedades del ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green
para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de Norovirus en
muestras diarreicas.
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5. MARCO TEÓRICO
La gastroenteritis, tanto epidémica como esporádica, es causa frecuente de morbilidad y
mortalidad en personas de todas las edades [Patel et al., 2008]. Los NoV son reconocidos
como la principal causa de gastroenteritis epidémica y agente importante de gastroenteritis
esporádicas en niños como en adultos, responsable de al menos el 50% de todos los brotes
de gastroenteritis en todo el mundo, así como también causa importante de enfermedades
transmitidas por alimentos [Hall et al., 2011].
El agente Norwalk fue el primer virus identificado causante de gastroenteritis en humanos,
pero el reconocimiento de su importancia como patógeno ha sido limitada debido a la falta
de un método diagnóstico sensible, disponible y de rutina. Los recientes avances en la
comprensión de la biología molecular de los NoV junto con la aplicación de nuevas
técnicas diagnósticas, han alterado radicalmente la apreciación de su impacto. Aunque la
gastroenteritis por NoV es generalmente de media o poca duración, nuevas evidencias
sugieren que la enfermedad puede ser severa y a veces fatal entre la población vulnerable, y
es causa común de hospitalizaciones por gastroenteritis. Los métodos de diagnósticos de
rutina aún no están disponibles a la mayoría de los médicos, pero estudios epidemiológicos
han identificado una transmisión rápida local y el surgimiento de nuevas cepas de NoV que
se difunden a nivel global [Glass et al., 2009].
5.1. Biología del virus
Los NoV son un grupo de virus pequeños no envueltos e icosaédricos, su genoma está
constituido por una única molécula de ARN de cadena simple y de sentido positivo. NoV
está clasificado dentro del género Norovirus de la familia Caliciviridae. Otros géneros
dentro de la familia Caliciviridae incluyen Sapovirus, que también causa gastroenteritis en
humanos, así como también Lagovirus, Vesivirus y Nebovirus que no son patógenos para el
humano. NoV pueden ser divido en 5 genogrupos designados como GI - GV, basado en la
identidad del aminoácido en la VP1 [Green et al., 2000; Zheng et al., 2006].
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Las cepas que infectan a los humanos se han encontrado en GI, GII y GIV mientras que las
cepas infectantes en vaca y ratón se han encontrado en GIII y GV, respectivamente.
Aunque la transmisión de NoV entre especies no se ha documentado, cepas que infectan a
los cerdos se han encontrado en GII [Wang et al., 2007], y un NoV GIV se descubrió
recientemente como causa de diarrea en perros [Martella et al., 2008]. Sugiriendo potencial
transmisión zoonótica. Basados en una similaridad de secuencias > 85% en el genoma
completo de VP1, NoV puede ser clasificado en al menos 5 genotipos pertenecientes al GI
y 17 genotipos pertenecientes al GII [CDC, 2011; Hall et al., 2011; Martella et al., 2008;
Zheng et al., 2006].
5.2. Características y evolución de NoV
Antes del año de 1993, NoV fue diagnosticado en muestras de heces por microscopía
electrónica. Fueron reportados en la literatura por su forma (virus de estructura pequeña y
redonda) o por su similitud al agente Norwalk (Norwalk–like virus) y se les llamó así por el
sitio donde fueron encontrados (por ejemplo, Norwalk, Ohio; Hawaii; y Snow mountain,
Colorado). Una vez secuenciado, el genoma del virus Norwalk reveló una sola cadena de
ARN de sentido positivo aproximadamente de 7.7-kd de tamaño, encerrado en una cubierta
proteica sin envoltura con distintas depresiones en forma de copa que los colocó como un
nuevo género -Norovirus- en la familia Caliciviridae (cuyo nombre es derivado de calyx,
que significa copa en Griego). La diversidad en NoV es grande, y las cepas humanas fueron
enseguida clasificadas, basadas en sus secuencias en tres genogrupos (GI, GII y GIV), al
menos 25 genotipos, y numerosos subgrupos, con el prototipo Norwalk virus, designado
como GI.1 (es decir genogrupo I, genotipo 1). La gran diversidad de cepas es atribuida
tanto a la acumulación de mutaciones puntuales asociadas a la replicación del ARN
propenso a errores y a la recombinación entre dos virus relacionados [Bull et al., 2007;
Nayak et al., 2008]. A pesar de esta diversidad, en los últimos años solo algunas cepas,
principalmente aquellas del genogrupo II genotipo 4 (GII.4), son responsables de la
mayoría de los casos y brotes.
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Algunos NoV han sido identificados en animales, pero ninguno de ellos ha sido aún
detectado en humanos, pero el potencial zoonótico ha sido especulado. Cuando los genes de
la cápside de NoV fueron expresados en Baculovirus, las Virus-Like-Particle (VLP) fueron
producidas y parecían ser indistinguibles de los virus tipo salvaje [Jiang et al., 1992]. Estas
VLP se han convertido en reactivos claves para el desarrollo de técnicas de diagnóstico,
para el estudio de la estructura y unión a la célula, y utilizadas como posible candidato a
vacuna. Estudios estructurales indican que 180 moléculas de la proteína de la cápside están
organizadas como dímeros, cada una dividida dentro de un depósito y un dominio que
sobresale. Una región altamente variable del dominio sobresaliente, P2, reconoce los
antígenos de grupo sanguíneo, los cuales son reconocidos como factores de susceptibilidad
del huésped para la infección. Al menos dos sitios de unión distintos de antígenos de grupo
sanguíneo han sido localizados para varias cepas del virus (Figura 1).
Figura 1. Estructura de la cápside y genoma del virus Norwalk [Glass et al., 2009].
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Un análisis de varios brotes ha identificado NoV del GII como la cepa más frecuente en
todo el mundo. En los últimos 20 años, con la acumulación de mutaciones en el dominio
P2, los patrones de unión de los antígenos de grupo sanguíneo en diferentes NoV de GII.4
han evolucionado. Esta observación apoya la idea de la derivada genética y evolución de
los NoV que han venido evolucionando por la inmunidad de la población, incluyendo
interacciones carbohidratos - proteínas [Le Pendu et al., 2006; Siebenga et al., 2007]. El
resultado es un patrón de evolución de época, como la gripe, con el surgimiento de
variantes de NoV que remplazan cepas que dominaban previamente y causan epidemias
alrededor del mundo [Lindesmith et al., 2003; Siebenga et al., 2007].
5.3. Epidemiología y transmisión
La disponibilidad de técnicas de diagnóstico más sensibles han cambiado radicalmente la
apreciación de la epidemiología de la enfermedad por NoV [Amar et al., 2007]. En los
Estados Unidos, más del 90% de los brotes de los cuales anteriormente se desconocía la
causa, ahora pueden ser atribuidos a NoV [Fankhauser et al., 1998]. Estos brotes implican a
personas de todas las edades, ocurridos en varios lugares (hospitales, guarderías, cruceros y
restaurantes) y dirigidos a un número de grupos de alto riesgo, particularmente niños
pequeños, personas mayores, viajeros, soldados y algunos pacientes que están inmuno-
comprometidos o están recibiendo trasplante de órganos.
Se cree que los seres humanos son el único huésped para los NoV humanos. La transmisión
fecal-oral es el modo primario de transmisión, aunque el vómito infeccioso también puede
desempeñar un papel similar. Muchas características de NoV facilitan su transmisión.
Primero, la baja dosis infecciosa (aproximadamente 18 a 1000 partículas virales) [Teunis et
al., 2008] permite la transmisión del virus a través de aerosoles, fómite, contacto persona a
persona y por contaminación ambiental, como lo muestra la tasa de contagio secundario de
un 30% ó más entre contacto cercano y miembros de la familia.
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Segundo, la excreción de virus precede a la aparición de la enfermedad en más del 30% de
las personas expuestas y puede continuar hasta después de la enfermedad, aumentando el
potencial de riesgo de una transmisión secundaria, una preocupación especial entre los
manipuladores de comida y los miembros de la familia [Atmar et al., 2008; Graham et al.,
1994; Rockx et al., 2002]. Tercero, el virus puede soportar un amplio rango de temperaturas
(congelación a 60ºC) y persiste en superficies del ambiente, en agua potable, y en una
variedad de alimentos, incluyendo ostras, vegetales y frutas crudas que son regadas con
aguas residuales. Cuarto, debido a la gran diversidad genética de las cepas de NoV y la falta
de protección cruzada completa, así como la falta de inmunidad a largo plazo, repetidas
infecciones pueden ocurrir a lo largo de la vida. Finalmente, el genoma de NoV es muy
sensible a las mutaciones que causan cambio antigénico y de recombinación, lo cual resulta
en la evolución de nuevas cepas que están disponibles a infectar a huéspedes susceptibles
[Glass et al., 2009].
5.4. Características clínicas
En estudios realizados en voluntarios y en investigaciones de brotes, la infección por NoV
causó diarrea en unos y vómito en otros, en aquellos que fueron expuestos y alrededor de
un tercio de los voluntarios fueron asintomáticos. Después del período de incubación de 10
a 51 horas la enfermedad a menudo comienza con vómitos, seguido de calambres
abdominales, fiebre (en 37 a 45% de los casos) diarrea acuosa y otros síntomas tales como
dolor de cabeza, escalofríos y mialgias. La enfermedad normalmente dura sólo de 2 a 3 días
pero puede durar más tiempo (es decir de 4 a 6 días) en brotes nosocomiales y en niños
menores de 11 años [Bon et al., 1999; de Wit et al., 2001a; de Wit et al., 2001b; Lopman et
al., 2004; Monica et al., 2007; Pang et al., 1999; Parrino et al., 1977; Patel et al., 2008;
Rockx et al., 2002]. Aproximadamente un 10% de las personas con gastroenteritis por NoV
buscan atención médica, lo cual incluye hospitalización y tratamiento por deshidratación
con terapia con líquidos vía oral e intravenosa [de Wit et al., 2001b; Phillips et al., ;
Widdowson et al., 2005].
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NoV es excretado primeramente en las heces, pero también se puede encontrar en el vómito
de personas infectadas, aunque aún no está claro si la detección del virus solamente indica
un riesgo de transmisión [Marshall et al., 2007; Turcios-Ruiz et al., 2008]. El virus puede
ser detectado en las heces en 4 semanas en promedio después de la infección, aunque el
pico de excreción viral ocurre de 2 - 5 días después de la infección con una carga viral de
aproximadamente 100 billones de copias de virus por gramo de heces [Atmar et al., 2008].
Sin embargo, debido a la falta de un sistema de cultivo celular o un modelo animal para
NoV humano se desconoce si estos virus representan virus infecciosos o cuánto tiempo
después de la enfermedad una persona infectada no es más contagiosa. Afortunadamente,
más del 30% de las infecciones por NoV son asintomáticas, y las personas asintomáticas
pueden excretar virus aunque a bajos títulos en comparación con las personas sintomáticas
[Atmar et al., 2008; Graham et al., 1994; Phillips et al., 2009]. Aunque el papel de la
infección asintomática en la transmisión y en brotes por NoV aún no está claro.
5.5. Susceptibilidad del huésped, inmunología y patogénesis
Debido a la falta de un modelo animal y la incapacidad de cultivar los NoV, la mayoría de
información sobre la patogénesis e inmunología son de estudios en humanos voluntarios
[Johnson et al., 1990; Parrino et al., 1977; Wyatt et al., 1974], lo cual ha proporcionado
mucha visión sobre la susceptibilidad y el desarrollo de la inmunidad después de la
infección con NoV. Los primeros estudios mostraron que mientras los voluntarios
infectados desarrollaban inmunidad después de un desafío [Johnson et al., 1990; Parrino et
al., 1977; Wyatt et al., 1974], la inmunidad de corta duración apareció y las personas que
fueron sintomáticas fueron re-infectadas cuando fueron desafiadas 2 - 3 años después con el
mismo inóculo de NoV [Johnson et al., 1990]. Sin embargo, estos estudios en voluntarios y
la disminución de la duración de los síntomas con la edad en estudios de cohorte en la
comunidad, sugieren el desarrollo de una protección parcial contra NoV [Johnson et al.,
1990; Rockx et al., 2002].
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Aproximadamente un 13 - 40% de los voluntarios nunca se enfermaron y sólo el 50%
desarrollaron la enfermedad [Parrino et al., 1977; Wyatt et al., 1974]. Aunque en un
principio no estaba claro porque algunos sujetos no desarrollaban la enfermedad,
investigaciones recientes sugieren que el tipo sanguíneo del huésped es un factor
importante en el desarrollo de la infección con NoV desde que la infección por NoV
depende de la presencia de receptores de antígenos de grupo sanguíneo en el intestino del
huésped susceptible [Lindesmith et al., 2003]. La combinación de cepas específicas unidas
y la expresión de los receptores variables de antígenos de grupo sanguíneo puede explicar
las diferencias observadas en los brotes de NoV y en estudios con voluntarios [Parrino et
al., 1977; Wyatt et al., 1974]. La especificidad del huésped puede también explicar porque
las personas con altos niveles de anticuerpos pre-existentes para NoV tienen más
probabilidad de desarrollar la enfermedad después de reinfectarse con NoV [Johnson et al.,
1990; Parrino et al., 1977]. Personas sin anticuerpos a una cepa en particular de NoV
pueden carecer de susceptibilidad genética a la infección.
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5.6. Métodos diagnósticos
Hasta 1990, el único método disponible para diagnosticar las infecciones por NoV era la
microscopía electrónica. Desde la clonación del virus Norwalk en 1990, los ensayos de
PCR convencional han sido utilizados como método de referencia para la detección de NoV
en muestras clínicas y ambientales (agua y alimentos). Los ensayos de PCR convencional
son utilizados ampliamente en laboratorios comerciales y de investigación permitiendo la
detección del virus en muestras recolectadas al final de la enfermedad, cuando la cantidad
de virus es baja [Atmar and Estes, 2001]. El ensayo de PCR convencional seguido por la
secuenciación de nucleótidos han sido particularmente útiles en estudios de epidemiología
molecular para identificar puntos de origen de la infección, así como para diferenciar brotes
que se asumían erróneamente que estaban relacionados [Parashar et al., 1998]. Mientra la
disponibilidad de los primers para los ensayos de PCR convencional detecta varias cepas de
NoV, algunas cepas pueden escapar a la detección. El PCR en tiempo real, el cual es más
rápido y más sensible que el PCR convencional, se han desarrollado recientemente para la
rápida detección de NoV en un gran número de muestras de heces durante las
gastroenteritis epidémicas o esporádicas [Trujillo et al., 2006].
Varios métodos de ELISA comerciales para la detección de NoV en heces también han sido
desarrollados, su utilidad es en función de la sensibilidad y especificidad del ensayo y varía
dependiendo del objetivo del ensayo y de las investigaciones del brote versus el diagnóstico
clínico [Jiang et al., 1992]. Los ELISA son altamente específicos para algunos NoV pero
generalmente no lo necesariamente sensible para detectar un amplio rango de NoV [Jiang et
al., 1992]. La nueva generación de ELISA basada en el aumento de anticuerpos contra un
amplio rango de antígenos virales expresados en Baculovirus (es decir VLP) han sido
desarrolladas y probadas, pero la sensibilidad del ELISA sigue siendo limitado [de Bruin et
al., 2006]. La alta especificidad de estos ensayos los hacen útiles para el diagnóstico de
NoV en investigaciones de brotes, donde se dispone de muchas muestras y la detección
confiable del virus en algunos casos puede ser suficiente para la confirmación etiológica
[de Bruin et al., 2006].
14
Sin embargo la sensibilidad de estos ensayos depende del genotipo y los resultados pueden
variar dependiendo de la variedad de cepa circulante en la población [de Bruin et al., 2006].
Por lo tanto, si las muestras del brote son negativas por ELISA, deben ser evaluadas
utilizando un PCR convencional. Como tecnología diagnóstica evolucionada el PCR
convencional está siendo remplazado por el PCR tiempo real, la mayoría de los laboratorios
de virología clínica utilizan PCR en tiempo real para la detección de NoV.
5.6.1. Ensayos inmunoenzimáticos
Para la detección de antígenos de NoV en muestras clínicas, los ensayos rápidos (por
ejemplo, ELISA) ofrecen una alternativa atractiva a los ensayos de detección molecular
exigentes y costosos. Sin embargo, el desarrollo de una serie de reactivos ELISA para NoV
han sido probados debido al número de cepas antigénicamente distintas de NoV y a la alta
carga viral requerida para una señal positiva por este ensayo. Los kits comerciales incluyen
Norovirus ELISA (Oxoid, Ely, United Kingdom), SRSV (II)-AD (Denka Seiken Co. Ltd.,
Tokyo, Japón) y RIDASCREEN incluye alícuota de anticuerpos monoclonales y
policlonales de reacción cruzada [de Bruin et al., 2006; Okitsu-Negishi et al., 2006;
Richards et al., 2003]. En evaluaciones, al comparar la sensibilidad de estos kits con PCR
convencional oscilaron entre un 36 - 80%, y la especificidad osciló entre 47 - 100% [de
Bruin et al., 2006; Okitsu-Negishi et al., 2006; Richards et al., 2003]. Debido al modesto
desempeño de estos kits comerciales, particularmente su pobre sensibilidad, no son
recomendados para el diagnóstico clínico de una infección por NoV en casos esporádicos
de gastroenteritis. Sin embargo, dada su facilidad de uso y rápidos resultados, los kits de
ELISA con alta especificidad (> 85%) y al menos una sensibilidad moderada (> 50%)
podrían ser útiles en el tamizaje preliminar de múltiples muestras de heces asociados con un
brote de gastroenteritis aguda. Sin embargo, muestras negativas podrían ser confirmadas
por una segunda técnica de PCR convencional ó PCR en tiempo real, y por lo tanto los kits
de ELISA no serían considerados como un remplazo para los métodos moleculares durante
una investigación de brote.
15
5.6.2. Ensayos de PCR convencional
Cuatro regiones conservadas diferentes en el genoma de NoV han sido exploradas más
frecuentemente para el diseño de primers. Estas regiones están localizadas en el gen de la
polimerasa, en la unión ORF1-ORF2, en la terminal NS (N-Terminal Shell region) y en el
extremo 5´ del gen de la cápside [Vinje et al., 2004]. La región en el extremo 5´ del gen de
la cápside fue evaluada en una sola reacción con un ensayo de PCR convencional utilizando
un panel de 81 cepas de NoV (31 GI y 50 GII), donde un 95% de las muestras fueron
positivas [Vinje et al., 2004]. En un estudio colaborativo internacional para comparar
diferentes ensayos de PCR convencional para la detección y genotipificación de NoV en
Europa ninguno se destacó como el mejor [Vinje et al., 2003]. Cuatro de los cinco ensayos
de PCR convencional utilizaron el gen de la polimerasa que es el más utilizado en los
ensayos de campo [Ando et al., 1995; Green et al., 1995; Le Guyader et al., 1996; Maunula
et al., 1999]. Otro ensayo de PCR convencional utilizando la región NS detectó 100% de
las muestras positivas por microscopía electrónica, mientras que otros ensayos de PCR
convencional para los genes de la polimerasa y de la cápside detectaron un 31% y 77%,
respectivamente [Green et al., 1995; Jiang et al., 1999; Kojima et al., 2002]. El PCR
convencional diseñado por Jiang et al., en 1999 que utilizó el gen de la polimerasa tiene
ventaja sobre los otros ensayos de PCR convencional para detectar NoV y Sapovirus
simultáneamente [Jiang et al., 1999]
Las cuatro regiones diferentes (designadas A - D) del genoma han sido utilizados
exitosamente para la genotipificación de NoV [Kojima et al., 2002; Vinje et al., 2004]. Sin
embargo, la tipificación basada en los genes de la cápside (región C y D) permiten la mejor
diferenciación entre cepas (Figura 2). Aunque la secuencia de la región C ha sido utilizada
ampliamente para la genotipificación de cepas para el diagnóstico de laboratorios clínicos
en Estados Unidos, Europa y Japón, la resolución de esta región no es suficiente para
distinguir las diferencias entre ciertas variantes de GII.4, las cuales son las cepas
predominantes asociadas con brotes.
16
El estándar de oro para la genotipificación de cepas de NoV es la secuenciación completa
de la cápside. Sin embargo, en muestras clínicas con alto número de copias, la
amplificación parcial de la secuencia de la cápside es más práctica y es la única que es aún
menos discriminatoria que la secuenciación completa de la cápside [Vinje et al., 2004]. Por
esta razón, actualmente los laboratorios de investigación y el CDC (Centers for Disease
Control and Prevention) utilizan la región D para la genotipificacion.
Figura 2. Regiones del genoma de NoV usadas como diana para detección y
genotipificación. Las posiciones son basadas en la cepa Norwalk (GenBank No.
M87661)
17
5.6.3. Ensayo de PCR en tiempo real
Varios ensayos de PCR en tiempo real han sido desarrollados para mejorar la sensibilidad
en la detección de NoV en muestras de heces y del ambiente. Diferentes enfoques han sido
desarrollados, tomando ventaja de los primers inicialmente diseñados para PCR
convencional y tecnologías SYBR Green y TaqMan. Vainio et al., en el 2006 comparó
cuatro ensayos publicados [Hohne and Schreier, 2004; Jothikumar et al., 2005; Loisy et al.,
2005; Richards et al., 2004a]. Los resultados indicaron que los tres ensayos TaqMan
detectaron un número similar de muestras NoV positivas ( ≥ 88%) como lo hizo SYBR
Green (86%) [Richards et al., 2004a]. Trujillo et al., en el 2006 desarrollaron un PCR en
tiempo real para detectar GI, GII y GIV de NoV en muestras de heces utilizando primers
dirigidos a la región de unión ORF1-ORF2. El ensayo detectó un 98% (64/65) de muestras
NoV positivos que habían sido analizadas previamente por un ensayo de PCR
convencional.
El PCR en tiempo real ofrece ventajas obvias sobre los formatos de PCR convencional,
tales como la reducción del tiempo de análisis, mayor sensibilidad < 10 copias transcritas
por mezcla de reacción y cuantificación de partículas virales en el análisis de muestras. Sin
embargo, se necesita un poco de cuidado a la hora de interpretar los resultados. La
eficiencia del ensayo de PCR en tiempo real puede ser estimada analizando la fase
exponencial de la curva de amplificación. El método de PCR en tiempo real cuantitativo
presume que las secuencias dianas y las muestras son amplificadas con eficiencias
similares. Sin embargo, pequeñas variaciones en la eficiencia reflejan una disminución en
la actividad de la ADN polimerasa entre los estándares y las muestras que pueden tener un
impacto negativo en la cuantificación.
18
5.6.3.1 Terminología en el análisis del PCR en tiempo real
Existen 3 pasos principales que integran la reacción del PCR en tiempo real y las
reacciones son generalmente ejecutadas por 40 ciclos. Los pasos son 1) Desnaturalización:
aquí la temperatura debería ser apropiada para la polimerasa (usualmente 95°C). El tiempo
de la desnaturalización puede aumentarse si los contenidos de Guanina y Citosina en el
amplicon son altos 2) Hibridación: utiliza temperaturas apropiadas basadas en el cálculo
del Tm de los primers (5°C por debajo del Tm de los primers) y 3) Extensión: entre 70 -
72°C, la actividad de la ADN polimerasa es óptima, y la extensión de los primers sucede a
rangos por encima de 100 bases por segundo.
Línea Base. La línea base en la reacción del PCR en tiempo real se refiere al nivel de señal
durante los ciclos iniciales del PCR en tiempo real, usualmente de 3 a 15 ciclos, en los
cuales hay pequeños cambios en la señal de la fluorescencia. El nivel bajo de señal de una
línea base puede ser comparado al fondo o al “ruido” de la reacción. La línea base en un
PCR en tiempo real es determinado empíricamente para cada reacción, utilizando manuales
teóricos ó análisis automatizados de la marca de ampliación. La línea base puede ser
ajustada cuidadosamente para permitir una determinación precisa del Ct, definido
posteriormente. La determinación de la línea base debe de tomar en cuenta suficientes
ciclos para eliminar el fondo encontrado en los primeros ciclos de la amplificación, pero no
debe incluir los ciclos en los cuales la señal de amplificación comienza aumentar por
encima del fondo. Cuando se comparan diferentes experimentos de PCR en tiempo real, la
línea base debería ser definida en la misma forma para cada experimento [Dorak, 2007].
Umbral. El umbral de la reacción del PCR en tiempo real es el nivel de la señal que refleja
un aumento estadísticamente significativo por encima de la señal de la línea base calculada.
Esta es ajustada para distinguir señales de amplificaciones relevantes del fondo.
19
Generalmente, el software del instrumento del PCR en tiempo real automáticamente ajusta
el umbral a 10 veces la desviación estándar del valor de la señal de fluorescencia de la línea
base. Sin embargo, la posición del umbral puede ser ajustado en cualquier punto en la fase
exponencial del PCR en tiempo real [Dorak, 2007].
Threshold Cycle (Ct). El Ct es el número de ciclos donde la señal de fluorescencia de la
reacción cruza el umbral. El Ct es utilizado para calcular el número de copias inicial de
ADN, ya que el valor de Ct es inversamente proporcional a la cantidad inicial de producto
(Figura 3) [Dorak, 2007].
Figura 3. Gráfica de amplificación en el PCR en tiempo real.
Curva estándar. Series de diluciones de concentraciones conocidas de amplicones que
pueden ser utilizadas para establecer una curva estándar, y así poder determinar la cantidad
de amplicon iniciadora de estudio o evaluar la eficiencia de la reacción. El logaritmo de
cada concentración conocida en la serie de diluciones (eje x) es marcado contra los valores
de Ct para esa concentración (eje y).
20
De esta curva estándar, se obtiene información acerca de la ejecución de la reacción así
como de varios parámetros de la reacción (incluyendo pendiente, coeficiente de correlación
e intercepto-y) pueden ser derivados. Las concentraciones escogidas en la curva estándar
pueden incluir el rango de concentración esperada del estudio [Dorak, 2007].
Coeficiente de correlación (R2). El coeficiente de correlación es una medida de como los
datos ajustan la curva estándar. El valor de R2 refleja la linealidad de la curva estándar.
Idealmente, un R2=1, aunque generalmente 0.999 es el valor máximo [Dorak, 2007].
Intercepto-y. Corresponde al límite de detección teórico de la reacción ó el valor de Ct
esperado sí el número de copias de las moléculas en estudio denotan en el eje de las x un
aumento en la amplificación estadísticamente significativo. Aunque el PCR en tiempo real
es teóricamente capaz de detectar una sola copia, un número de copias de 10 es
especificado comúnmente como el nivel más bajo que se puede cuantificar realmente
utilizando el PCR en tiempo real. Esto limita el uso de los valores del intercepto-y que
pueden ser útiles para comparar diferentes sistemas de amplificación [Dorak, 2007].
Fase Exponencial. En el PCR en tiempo real es mejor cuantificar los productos de la
amplificación (amplicones) al inicio de la fase exponencial ó al final, cuando la curva busca
el Plateau (Figura 3). Al inicio de la fase exponencial, todos los reactivos están en exceso,
la ADN polimerasa está altamente eficiente, y el producto que está presente en bajas
cantidades no competirá con la capacidad de hibridación de los primers [Dorak, 2007].
Pendiente. La pendiente de la fase exponencial de la reacción de amplificación es una
medida de la eficiencia de la reacción. Para obtener resultados precisos y reproducibles, las
reacciones deben tener una eficiencia ideal del 100%, equivalente a una pendiente de -3.32.
La eficiencia se determina según la siguiente ecuación, eficiencia= 10(-1/pendiente) – 1.
Un PCR en tiempo real con una eficiencia ideal del 100% debería duplicar el número de
amplicones en cada ciclo, es decir el porcentaje de eficiencia refleja la capacidad de
amplificación en cada ciclo de una reacción de PCR en tiempo real.
21
Los factores experimentales tales como la longitud, estructuras secundarias y contenido de
GC del amplicon pueden influenciar la eficiencia. Otras condiciones es la dinámica de la
reacción por sí misma, el no utilizar concentraciones de reactivos óptimas y la calidad de la
enzima, puede resultar en una eficiencia por debajo del 90%. La presencia de inhibidores en
uno o más reactivos en el PCR en tiempo real pueden producir una eficiencia de más de
110%. Una buena reacción debería tener una eficiencia entre un 90 - 110% que corresponde
a una pendiente entre -3.58 y -3.10 [Dorak, 2007].
Rango dinámico. Es el rango de concentración inicial del amplicon sobre el cual se
obtienen valores de Ct precisos. Si se utiliza controles endógenos en el método de
cuantificación el rango dinámico del amplicon y del control deben ser comparables. En la
cuantificación absoluta la interpolación dentro de este rango es exacta, pero la
extrapolación más allá del rango dinámico se debe evitar. Cuando mayor sea el rango
dinámico, mayor será la capacidad de detectar muestras con bajo y alto número de copias
en una misma reacción [Dorak, 2007].
Curva de disociación. Es la curva gráfica de los cambios en la fluorescencia que se
producen por la liberación de los fluoróforos cuando se disocia el ADNds a medida que
aumenta la temperatura. El análisis de la curva de disociación después del PCR en tiempo
real es una simple y fuerte forma de revisar las reacciones del PCR en tiempo real de los
artefactos, los dímeros de primers, la contaminación y asegurar la especificidad de la
reacción. Debido a que la temperatura de disociación de los ácidos nucléicos es afectada
por el contenido de Guanina y Citosina y la presencia de bases “mismatches” entre otros
factores, diferentes productos de PCR en tiempo real pueden ser distinguidos con
frecuencia por sus características de disociación. La caracterización de los productos de la
reacción por medio del análisis de la curva de disociación reduce la necesidad de consumir
tiempo con el gel de electroforesis [Dorak, 2007].
22
El análisis de la curva de disociación puede ser formado solamente con las tecnologías de
detección del PCR en tiempo real en el cual el fluoróforo permanece asociado con la
amplificación. Las amplificaciones que han sido usadas en SYBR Green o con primers
LUX pueden ser sometidos al análisis de la curva de disociación.
Los dímeros de primers se producen cuando dos primers con secuencias homólogas se
unen unas con otras en el producto. El análisis de la curva de disociación puede identificar
la presencia de dímeros de primers debido a que ellos exhiben una temperatura de
disociación menor a la de los amplicones. La presencia de dímeros de primers no son
deseables en muestras que contienen producto, ya que estos disminuyen la eficiencia del
PCR en tiempo real [Dorak, 2007].
Para llevar a cabo la curva de disociación, en el instrumento del PCR en tiempo real debe
ser programado para incluir un perfil de disociación seguido inmediatamente del protocolo
de la termociclación. Después de que la amplificación es completada el instrumento
recalentará los productos amplificados para dar datos de la curva de disociación completa.
La mayoría de las plataformas de los instrumentos de PCR en tiempo real incluyen esta
característica dentro de sus paquetes de análisis. Los pasos para la programación consisten
en un calentamiento rápido de la muestra amplificada a 94°C para desnaturalizar el ADN,
calentar lentamente la muestra a 60°C (por aumento de la temperatura a 0.2°C/segundo)
mientras se marcan las señales de la fluorescencia versus temperatura (a medida que la
temperatura aumenta y el ADNds se disocia, la señal de la fluorescencia disminuirá)
[Dorak, 2007].
23
5.6.3.2. Químicas usadas en el PCR en tiempo real
Un paso clave en el diseño de un PCR en tiempo real es la selección de la química que
controlan la amplificación de la secuencia diana. La variedad de los productos químicos
fluorescentes disponibles se pueden clasificar así:
• Fluoróforos unidos al ADN (tecnologías de SYBR Green I y SYBR GreenER).
• Primers Fluorescentes (primers LUX, Amplifuor y BDQzyme).
• Sondas Fluorescentes (sondas TaqMan, Escorpiones y Beacons moleculares).
Las químicas comúnmente utilizadas para el PCR en tiempo real son SYBR Green y las
sondas TaqMan. La química que se seleccione para el ensayo del PCR en tiempo real
depende de la aplicación, del formato (monoplex o multiplex) y del costo. En general, las
reacciones simples con fluoróforos unidos al ADN pueden ser preferibles debido a que
estos ensayos son más fácil de diseñar, más rápidos de instalar y más rentables. Sin
embargo, no permite la detección de diferentes secuencias dianas en una misma reacción,
como lo hace TaqMan, que usa sondas que permiten reconocer diferentes secuencias dianas
[Dorak, 2007].
Fluoróforos unidos al ADN
El sistema más común para la detección de ADN amplificado es el uso de fluoróforos
intercalados que emiten fluorescencia cuando se une al ADNds (Figura 4). La tecnología de
SYBR Green I y SYBR GreenER utilizan este tipo de método de detección. La
fluorescencia del fluoróforo unido al ADN aumenta significativamente cuando se une al
ADNds. La intensidad de la señal de fluorescencia depende de la cantidad de ADNds que
está presente.
24
Figura 4. Los fluoróforos emiten fluorescencia cuando se unen al ADNds.
Las ventajas de utilizar fluoróforos que se unen al ADN incluyen diseños de ensayos
sencillos (sólo se necesita un par de primers y no se requieren diseños con sondas), la
habilidad de detectar múltiples genes rápidamente sin el diseño de múltiples sondas, de bajo
costo en comparación con otros sistemas de detección y la habilidad de elaborar una curva
de disociación para verificar la especificidad de la amplificación en la reacción [Dorak,
2007].
El análisis de la curva de disociación puede ser utilizada para identificar los diferentes
productos de reacción, incluyendo productos no específicos. Después de completar la
reacción de amplificación, la curva de disociación es generada por el aumento de la
temperatura en pequeños incrementos y las señales de fluorescencia son monitoreadas en
cada paso. Como el ADNds en la reacción de desnaturalización se disocia la fluorescencia
decrece. Los primeros derivados negativos del cambio en la fluorescencia son marcados en
función de la temperatura. Un pico característico del Tm del amplicon se distingue de los
otros productos, como dímeros de primers, los cuales se disocian a diferentes temperaturas.
25
Esta tecnología, aunque simple, puede carecer de especificidad debido a que el fluoróforo
colorante se une indiscriminadamente a todos los ADNds formados durante el PCR en
tiempo real, no sólo al ADN diana. Además, los artefactos del PCR en tiempo real, como
dímeros de primers y productos de amplificación inespecífica, pueden ser detectados y
contribuir a la señal de la fluorescencia total. El diseño de buenos primers y la calidad de
los reactivos del sistema son críticos para evitar la formación de productos inespecíficos
[Dorak, 2007].
Primers fluorescentes
En general, estas químicas toman ventaja sobre los trasferidores de energía de resonancia
fluorescente (FRET), como TaqMan y Beacons moleculares, porque aseguran que la
fluorescencia específica sea detectada sólo en presencia del producto amplificado. Los
primers están marcados con un fluoróforo reportero, que emite fluorescencia únicamente
cuando se une a la secuencia diana.
LUX. Emplean dos primers, uno en forma de horquilla con un reportero fluorescente unido
en el extremo 3´. Aquí el reportero está apagado por la estructura secundaria de la
horquilla, durante la amplificación el primer LUX es incorporado dentro del producto y el
reportero emite fluorescencia (Figura 5).
Figura 5. El primer LUX forma una horquilla que tiene un reportero apagado que
durante la amplificación emite fluorescencia cuando es incorpora dentro del producto.
26
Amplifluor. Emplean dos primers específicos y un primer universal llamado Uniprimer.
Uno de los primers específicos contiene una secuencia en la terminal 5´ llamada secuencia-
z, que también se encuentra en el extremo 3´ del Uniprimer. El Uniprimer forma una
estructura de horquilla. Un reportero fluorescente y un apagador se unen a los extremos 5´ y
3´ en la estructura del tallo, respectivamente. En la conformación de la horquilla, el
reportero de fluorescencia se apaga debido a su proximidad con el apagador. Durante el
primer ciclo de amplificación, uno de los primers específicos (con la secuencia-z) se
hibrida con la secuencia diana y se extiende. Durante el segundo ciclo de la amplificación,
el segundo primer específico es utilizado para sintetizar la secuencia diana que contiene
una secuencia complementaria para la secuencia-z. El producto de la segunda amplificación
puede servir como molde para el Uniprimer. En el tercer ciclo de amplificación, el
Uniprimer se extiende y sirve como molde para el próximo ciclo de amplificación. En el
cuarto ciclo de la amplificación, la extensión del amplicon a través de la región de la
horquilla del Uniprimer hace que este se abra y adopte una configuración lineal que permite
que el reportero emita fluorescencia. La amplificación exponencial utilizando un segundo
primer específico Uniprimer sucede en los ciclos de las amplificaciones posteriores. La
señal de la fluorescencia es proporcional al producto amplificado.
BD QZyme. Emplean un primer específico zymogen, un primer específico reverso y un
sustrato de oligonucleótido universal. El oligonucleótido contiene un reportero fluorescente
en el extremo 5´ y un apagador en el extremo 3´. Cuando el sustrato de oligonucleótido está
intacto, la fluorescencia del reportero es apagada por el apagador debido a su proximidad.
El primer zymogen contiene una secuencia que codifica un ADN catalítico. Durante el
primer ciclo de amplificación, el primer zymogen se extiende. En el segundo ciclo, el
producto del primer ciclo es utilizado como molde por el primer específico reverso que se
extiende para crear una secuencia nueva que contiene una región ADN catalítica.
27
En la siguiente etapa de hibridación, el sustrato de oligonucleótido marcado
fluorescentemente hibrida la secuencia de ADN catalítico y se separa. Esta división separa
al reportero del apagador resultando en una señal fluorescente que es proporcional al
producto amplificado [Dorak, 2007].
Sondas fluorescentes
Son sondas de hibridación que emplean una sonda con secuencia específica de
oligonucleótidos y dos secuencias de primers específicas. La sonda está diseñada para que
se una a las secuencia diana. La sonda lleva un colorante donador en su extremo 5´ y un
colorante aceptor en su extremo 3´ (apagador). El donante y el receptor de los fluoróforos
se seleccionan de manera que el espectro de emisión del fluoróforo donador se traslape de
forma significativa con el espectro de excitación del fluoróforo receptor, mientras que el
espectro de emisión del fluoróforo del donante es espectralmente separado del espectro de
emisión del fluoróforo aceptor. La excitación se realiza en una longitud de onda específica
para el fluoróforo del donante, y la reacción se controla con la emisión de longitud de onda
del fluoróforo aceptor. Durante la etapa de hibridación del PCR en tiempo real, las sondas
se hibridan con sus secuencias dianas [Dorak, 2007].
TaqMan. Emplean una secuencia específica, sondas de oligonucleótidos marcadas
fluorescentemente llamadas sondas TaqMan, agregadas a la secuencia específica del primer
(Figura 6). También conocidos como ensayos nucleasa-5´, el ensayo TaqMan utiliza la
actividad de la exonucleasas 5´de ciertas polimerasas termoestables, como la Taq. La sonda
contiene un reportero fluorescente unido al extremo 5´ y un apagador unido al extremo 3´.
Cuando se juntan la fluorescencia del reportero es apagada debido a la proximidad con el
apagador [Dorak, 2007].
28
Figura 6. Sondas TaqMan. En la hibridación la sonda se une a la secuencia diana, en
la extensión la sonda es desplazada y el reportero es separado emitiendo fluorescencia.
Durante los pasos de hibridación y extensión de la reacción de amplificación, la sonda
hibrida la secuencia y la actividad de la exonucleasa 5´ → 3´ de la Taq específica del
ADNds separa al reportero. Como resultado, el reportero es separado de su apagador, y la
señal de fluorescencia resultante es proporcional a la cantidad de producto amplificado en
la muestra. La ventaja más importante de utilizar las sondas TaqMan incluye la alta
especificidad y la habilidad de llevar a cabo reacciones de multiplex. La desventaja es que
el costo inicial de las sondas es alto y el diseño del ensayo son pocos triviales [Dorak,
2007].
Beacons moleculares. Emplea un par de primers específicos y una sonda que contiene una
secuencia específica que reconoce la secuencia diana, en el extremo 5`de la sonda esta el
fluoróforo y en extremo 3`el apagador. En ambos extremos de la sonda hay secuencias
complementarias (5 nt) que al unirse forman un horquilla, que mantiene apagada la
fluorescencia. Cuando la sonda encuentra su secuencia diana la horquilla se abre y el
reportero al separarse del apagador fluórese (Figura 7). La secuencia diana del Beacon está
diseñado para hibridar específicamente la sección de 15 – 30 nt de la secuencia blanco
[Dorak, 2007].
29
Figura 7. La molécula Beacon forma una horquilla que al unirse con la secuencia
diana se abre separando la sonda del apagador emitiendo fluorescencia.
A diferencia de los ensayos TaqMan, las moléculas Beacons son desplazadas pero no
destruidas durante la amplificación, ya que la ADN polimerasa carece de la actividad de la
exonucleasa 5´. La cantidad de fluorescencia emitida por el reportero en el ensayo Beacons
es proporcional a la cantidad de producto amplificado en la reacción. [Dorak, 2007]
El Beacons molecular tiene algunas ventajas sobre otras químicas de detección. Estos son
muy específicos y se pueden utilizar para las reacciones de multiplex y si la secuencia
blanco no coincide exactamente con la secuencia Beacons la hibridación y la fluorescencia
no ocurrirán. La principal desventaja del uso de esta química radica en el diseño de los
tallos de la horquilla que deben ser lo suficientemente fuerte para que la molécula no se
pliegue de forma espontánea en conformaciones no deseadas. Al mismo tiempo el tallo de
la horquilla no debe ser demasiado fuerte, ó el Beacons no puede hibridar adecuadamente la
secuencia blanco [Dorak, 2007].
30
Escorpión. Emplean dos primers específicos, uno de los cuales sirven como una sonda y
contiene una estructura de tallo-lazo con un reportero en el extremo 5´ y un apagador en el
extremo 3´ (Figura 8). La secuencia de la sonda Escorpión es complementaria a una parte
interna de la secuencia diana en la misma cadena. Durante el primer ciclo de amplificación,
el primer Escorpión se extiende y la secuencia complementaria al lazo es generada en la
misma cadena.
Figura 8. La sonda Escorpión en su estructura lazo-tallo no emite fluorescencia,
posteriormente al unirse con su secuencia diana el reportero se separa y fluórese.
La sonda Escorpión contiene un bloqueador de PCR en el apagador del extremo 3´ para
evitar la lectura durante la extensión a través de la cadena opuesta. Después de la
desnaturalización e hibridación posterior, el lazo de la sonda Escorpión hibrida a la
secuencia diana mediante una interacción intramolecular y el reportero se separa del
apagador. La señal fluorescente es proporcional al producto amplificado de la muestra
[Dorak, 2007].
31
Eclipse. Emplean dos primers y una sonda de secuencia específica de oligonucleótidos. La
sonda se une a una secuencia complementaria dentro de la amplificación y contiene un
reportero fluorescente en el extremo 3´, un apagador en su extremo 5´, y un surco menor
unido (MGB). La sonda no hibridada adopta una conformación que permite que el
reportero y apagador juntos, mantengan apagado al reportero.
Durante la etapa de hibridación del PCR en tiempo real, la sonda se hibrida con la
secuencia diana con la ayuda del MGB (Figura 9). La sonda se desdobla linealmente,
separando el reportero y apagador permitiendo que el reportero emita fluorescencia. La
señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto amplificado [Dorak, 2007].
Figura 9. La sonda Eclipse se hibrida con la secuencia diana con la ayuda del MGB
(línea roja). La sonda se desdobla linealmente separando reportero y apagador
emitiendo fluorescencia.
32
5.6.3.3 Moléculas fluorescentes utilizadas en PCR en tiempo real
Las moléculas fluorescentes (fluoróforo) absorben luz en forma de fotones en un rango
estrecho de longitud de onda. La longitud de onda máxima de absorción es también llamada
longitud de onda de excitación. Después de la excitación, la molécula alcanza un estado de
energía más alto, este estado de energía es transitorio y de corta duración. La molécula
excitada decae rápidamente, volviendo a su estado basal de energía. Cuando esto ocurre, un
fotón de luz es emitido en una longitud de onda mayor. La luz que se libera es la longitud
de onda de emisión. Este cambio entre las longitudes de ondas de excitación y de emisión
se denomina “shift Stoke” (cambio de Stoke). Para cada fluoróforo hay una longitud de
onda óptima de excitación y de emisión. Las moléculas fluorescentes con “cambios de
Stoke” mayores son las más convenientes ya que permiten la separación más limpia de
longitud de onda de excitación y de emisión de la luz [Dorak, 2007].
Un requisito fundamental para cualquier ensayo fluorescente es que la intensidad de la
señal inicial y final tengan diferencias tan grandes como sea posible. Esto se llama el
ensayo “delta”. Todos los ensayos fluorescentes para el PCR en tiempo real logran este
“delta” mediante la utilización de FRET (transferidores de energía de resonancia
fluorescente). Los FRET requieren de dos moléculas que pueden interactuar entre sí, por lo
menos uno de los cuales puede ser capaz producir fluorescencia. El componente
fluorescente se llama donante y la segunda molécula se llama aceptor. Durante el FRET, el
colorante fluorescente donante es excitado por una fuente de energía externa de luz en ó
cerca de su longitud de onda de excitación óptima y entonces emite una luz en un cambio
mayor de longitud de onda (“cambio de Stoke”).
En lugar de ser detectado por el instrumento, la luz emitida se utiliza para excitar a la
molécula aceptora, que está en estrecha proximidad física. La molécula aceptora absorbe la
energía de luz emitida por el donante fluorescente, apagando eficientemente la señal del
donador [Dorak, 2007].
33
La longitud de onda emitida por la molécula donante debe estar cerca del máximo de
absorción de la molécula aceptora. La molécula aceptora puede o no emitir luz. Si la luz es
emitida por el aceptor, el cambio será mayor así como la longitud de onda, que aquella
emitida por el donante. La señal del aceptor será detectada por el instrumento en tiempo
real, pero no se registrará como una señal de reportero por el software. Los FRET dependen
de que las moléculas del donante y del aceptor estén muy cerca (10 – 100 Å) y disminuye
con el aumento de la distancia. Algunos de los donantes y colorantes aceptores (reportero y
apagador) más habituales que se utilizan actualmente en el PCR en tiempo real se muestran
en la Tabla Nº 1 [Dorak, 2007].
Hay tres clases de fluoróforos utilizados en el PCR en tiempo real. Los tres tipos se definen
por su función dentro de un ensayo. Los primeros son fluoróforos donantes, también
llamados reporteros. La señal fluorescente del reportero es el que se controla durante el
transcurso del experimento (ejemplo FAM). Los segundos son fluoróforos receptores o
extintores y son los responsables de la extinción inicial de la señal de reportero (ejemplo
BHQ). El último es el fluoróforo de referencia, el cual es común en todas las reacciones, no
interactúa con los componentes del ensayo y se utiliza para normalizar la señal de cada
pocillo en el software (ROX) [Dorak, 2007].
En teoría cualquier colorante fluorescente puede ser un reportero en un ensayo. El que se
utiliza con mayor frecuencia es FAM (6-carboxi fluoresceína). Este colorante es eficiente
para excitar a 448 nm, la longitud de onda producida por el láser argón-ión utilizado en los
instrumentos de ABI (Applied Biosystems Inc.,). FAM se ha mantenido como la primera
opción para otros instrumentos ya que puede ser fácilmente conjugado con oligonucleótidos
y da una fuerte señal. Otro reportero, utilizado hoy en día es SYBR Green I. A diferencia de
FAM, SYBR Green I es un colorante libre en el PCR en tiempo real y trabaja
proporcionando un dramático aumento en la fluorescencia cuando se une al ADNds [Dorak,
2007].
34
Las moléculas extintores pueden ser fluoróforos o cualquier molécula que pueda absorber
la energía de luz dentro del rango de longitud de onda apropiada. El fluoróforo apagador
original utilizado con el reportero FAM fue TAMRA (6-carboxi-tetrametilrodamina).
Cuando se acoplan los extremos de un oligonucleótido (Beacons), la señal del FAM se
apaga con eficiencia por la proximidad de TAMRA, debido al plegamiento oligo, en
solución. También hay fluoróforos apagadores conocidos como “hoyos negros” (BHQ:
Black Hole Quencher), los cuales apagan la señal del reportero y no emiten luz. Desde
hace tiempo se sabe que la fluoresceína de FAM se extingue con residuos de guanidina,
este fenómeno es el principio del funcionamiento del sistema LUX (Invitrogen), y también
es la explicación porque las sondas con reporteros fluorescentes nunca deben comenzar con
residuos de guanidina [Dorak, 2007].
35
Tabla Nº 1. Colorantes utilizados en el PCR en tiempo real.
36
6. MATERIAL Y MÉTODO
El diseño de este estudio involucra 3 etapas fundamentales: La primera es la optimización
de los parámetros químicos y termodinámicos de un PCR en tiempo real basado en SYBR
Green; la segunda es la validación del ensayo de PCR en tiempo real utilizando muestras
clínicas, sin diagnóstico de NoV, y a su vez analizar el mismo material con un PCR
convencional y la tercera consiste en la evaluación de las propiedades del nuevo ensayo de
PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de los genogrupos GI y GII de NoV.
6.1. Optimización de los parámetros químicos y termodinámicos
Se realizó la optimización de los siguientes parámetros químicos y termodinámicos del
PCR en tiempo real: volumen de muestra, concentración de primers, temperatura de
hibridación de los primers, temperatura de disociación (Tm) del amplicon y reacciones
cruzadas con otros virus que infectan el intestino.
6.1.2. Material biológico de referencia.
Panel con NoV: En total se utilizaron 10 muestras de referencia de NoV detectados
previamente en Nicaragua. Las secuencias de nucleótidos de estas muestras se encuentran
disponibles en el GenBank. En total 6 pertenecen al GII, y 4 al GI. Las muestras del GII
pertenecen a los genotipos, GII.2, GII.4, GII.17 y GII.18 NICA (GenBank N° de acceso:
EU780735 (32), EU780757 (482), EU780764 (696), EU780739 (166), EU780768 (735) y
EU780755 (432)) y las GI pertenecen a los genotipos GI.2, GI.4, y GI.11 (Genbank N° de
acceso: HM055926 (741), HM055935 (394), HM055939 (771) y HM055040 (826))
[Bucardo et al., 2008].
Panel reacciones cruzadas: Para investigar reacciones cruzadas se preparó un panel con
muestras de referencia de Rotavirus (GI [P8]), Sapovirus humanos (GI.1), Sapovirus
porcino, Poliovirus (Tipos I, II, III), Astrovirus y Adenovirus.
37
6.1.3. Volumen de ADNc para NoV GI y GII
Se probaron diferentes volúmenes de muestra de ADNc para NoV GI y GII de 1µl, 1.5µl, 2
µl, 2.5 µl y 3 µl. Para ello se utilizó el panel de muestras con NoV y se ensayó por
duplicado un PCR en tiempo real.
6.1.4. Concentración óptima de primer.
Los primers utilizados fueron NVG1f1b mwg® [20nM], NVG1rlux mwg® [20nM],
NVG2flux1 mwg® [20nM] y COG2R cibergene® [109.96 pmol], los cuales amplifican un
segmento de 87-pb y 88-pb en el traslape de ORF1-ORF2 en el genoma de los NoV GI y
GII, respectivamente [Nordgren et al., 2008] (Tabla N° 2). Todos los primers fueron
reconstituidos con agua libre de nucleasas y se preparó una solución de trabajo de 10
pmol/µl. Para investigar la concentración óptima de primers se analizaron las siguientes
concentraciones finales: 50nM, 100nM, 200nM, 400nM y 800nM.
Tabla N° 2. Primers utilizados para la detección de NoV mediante el método de PCR
convencional y PCR en tiempo real.
Primer Secuencia (5´→ 3´)b Localización Región Tamaño Ref.a
289h TGACGATTTCATCATCACCATA 4865-4886
RdRp
289i TGACGATTTCATCATCCCCGTA 4865-4886
290h GATTAC CCAGGTGGTGGGACTCCAC 4568-4590 319-pb 1
290i GATTACTCCAGGTGGTGGGACTCAAC 4568-4590
290j GATTACTCCACCTGGGATTCAAC 4568-4590
290k GATTACTCCACCTGGGATTCCAC 4568-4590
GI
NVG1f1b CGYTGGATGCGNTTCCATGA 5291-5310 ORF1-ORF2 87-pb 2
NVG1rlux GTCCTTAGACGCCATCATC 5397-5379 2
GII
NVG2flux1 ATGTTYAGRTGGATGAGRTTYTC 5012-5034 ORF1-ORF2 88-pb 2
COG2R TCGACGCCATCTTCATTCACA 5100-5080 3 a. Ref = referencia. 1 [Zintz et al., 2005] , 2 [Nordgren et al., 2008], 3 [Kageyama et al., 2003]. b. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.
38
6.1.5. Temperatura óptima de hibridación de los primers.
Las temperaturas de hibridación teóricas para los primers utilizados en este estudio están en
el rango de 50 – 60ºC. Con el fin de determinar la temperatura de hibridación experimental
para cada genogrupo se realizaron 3 diferentes experimentos con las siguientes
temperaturas: 50°C, 55°C y 60°C.
6.1.6. Temperatura de disociación (Tm) óptima de los amplicones.
En este ensayo se determinó el Tm teórico y el Tm práctico de los amplicones. Para
calcular el Tm teórico se utilizaron secuencias de referencias con diferentes genotipos de
GI y GII de NoV (Tabla N° 3), las secuencias se seleccionaron en el GenBank y
posteriormente se alinearon utilizando el programa bioinformático Bioedit™, se identificó
la secuencia positiva y negativa donde se unen los primers correspondientes a un segmento
de 87-pb para GI y 88-pb para GII. Cada una de las secuencias de GI y GII fue introducida
en el programa Oligocalculator™ para calcular la media de los Tm más 2 desviación
estándar y se obtuvo el Tm teórico para GI y GII.
Para calcular el Tm experimental se utilizó el panel de muestras con NoV descritas
anteriormente y se ensayaron en un PCR en tiempo real. Se determino el Tm de cada una de
las muestras y se calculó la media de los Tm más 2 desviación estándar, determinando así
el Tm práctico óptimo para GI y GII.
39
Tabla N° 3. Secuencias de referencias de NoV utilizadas para determinar el Tm
teórico del amplicon.
G. Genotipos Nombre N° de acceso en GenBank
GI.1 NV-USA93 M87661
GI.2 SOV-GBR93 L07418
GI.3 DSV-USA93 U04469
GI.4 Chiba-JPBN00 AB042808
GI.6 Hesse-DEU98 AJ277614
GII.1 Hawaii-USA94 U07611
GII.2 Msham-GBR95 X81879
GII.3 Toronto-CAN93 U02030
GII.4 Bristol-GBR93 X76716
GII.4 Lordsdale-93 X86557
GII.9 VABeach-USA01 AY038599
GII.11 SW918-JPN01 AB074893
GII.16 Tiffin-USA03 AY502010
GII.17 CSE1-USA03 AY502009
40
6.2. Validación de PCR en tiempo real para la detección de Norovirus GI y GII.
6.2.1. Muestras clínicas
Un total de 60 muestras de heces sin diagnóstico de NoV fueron seleccionadas
aleatoriamente de una colección de 253 muestras de niños ≤ 5 años con diarrea aguda
procedentes del barrio Rubén Darío y del Hospital Escuela Oscar Danilo Rosales Argüello
(HEODRA) de la ciudad de León. Estas muestras fueron analizadas con un PCR
convencional descrito por Jiang et al., en 1999 y modificado por Zintz et al., en el 2005.
Posteriormente las mismas muestras fueron analizadas con el PCR en tiempo real SYBR
Green descrito en este estudio.
6.2.2. Extracción del ARN viral
Para realizar la extracción del ARN viral, la suspensión de heces (1:10) fue descongelada a
4°C y centrifugadas a 5000 rpm por 3 minutos. Se tomaron 200 µl del sobrenadante, y
ARN viral fue extraído y purificado con el kit High Pure ARN isolation (ROCHE)
siguiendo las especificaciones del fabricante. Un total de 50 µl de ARN aislado fue
obtenido y guardado a -20°C hasta su posterior análisis (Anexo #1).
6.2.3. Reverso transcripción
Con 28 µl de ARN extraído en el paso anterior, se realizó una mezcla del random primer
dexadeoxynucleotidos (pd (N)6) [50 pmol] y agua libre de nucleasas para completar un
volumen final de 50 µl, se desnaturalizó a 97°C por 5 minutos, y rápidamente se colocó
sobre hielo por 2 minutos, luego se agregó una bead de RT-PCR (Amersham Biosciences,
United Kingdom) y la reacción de reverso transcripción se llevó a cabo a 42°C por 30
minutos en un termociclador y así obtener el ADNc.
41
6.2.4. PCR convencional
Los productos de la reverso transcripción fueron amplificados por el método de PCR
convencional para NoV utilizando los primer degenerados p289hi/290hijk dirigidos al gen
que codifica para la RdRp en la región ORF1 del genoma de NoV, resultando en un
amplicon de 319-pb para NoV (Tabla N° 2). Para la reacción de PCR convencional se
utilizó 1 µl de primer, una bead de PCR PuRe Taq-Ready-To-Go™ (Amersham
Biosciences, United Kingdom), 2.5 µl de ADNc y 21.5 µl de agua libre de nucleasas para
completar un volumen final de 25 µl. El termociclador (GeneAmp® 2700 Applied
Biosystems) fue programado de la siguiente forma: 94°C por 3 minutos, 40 ciclos a 94°C
por 30 segundos, 49°C por 1 minuto y 20 segundos, y 72°C por 1 minuto, y una elongación
final a 72°C por 10 minutos. Los productos del PCR fueron evaluados en una electroforesis
en gel de agarosa al 2% seguido por su visualización bajo luz ultravioleta (Anexo #2)
[Jiang et al., 1999; Zintz et al., 2005].
6.2.5. PCR en tiempo real basado en SYBR Green
El PCR en tiempo real fue realizado en un equipo 7500 Real-Time PCR Systems (Applied
Biosystems) utilizando un kit Fast Start SYBR Green® PCR Master (ROCHE). Se preparó
un master mix conteniendo 12.5µl de 2X Fast Start SYBR Green PCR Master, se agregaron
los primers para GI y GII de NoV a una concentración de 400nM cada uno y 8 µl de agua
libre de nucleasas, se agregó 2.5 µl de ADNc para completar un volumen final de reacción
de 25 µl. El equipo fue programado para un precalentamiento a 95°C por 5 minutos, luego
40 ciclos a 95°C por 15 segundos, una temperatura de hibridación de 55°C por 30
segundos, y una elongación a 72°C por 1 minuto (Anexo #3). Para investigar el Tm de cada
uno de los amplicones, se incremento la temperatura desde 60°C hasta 95°C, a una
velocidad de 0.1°C/s, la fluorescencia de cada reacción fue registrada para elaborar una
curva de disociación. El Tm de cada amplicon corresponde a la lectura más baja de
fluorescencia. Una muestra se consideró positiva cuando la fluorescencia de la reacción
sobrepasó el Ct óptimo y el Tm del amplicon era de 76.1 ± 0.6ºC para GI y 77.1 ± 0.6ºC
para GII.
42
6.3. Evaluación de las propiedades del ensayo de PCR en tiempo real.
6.3.1. Estándares de Norovirus GI y GII.
Los estándares de NoV GI y GII son plásmidos extraídos de Escherichia coli ultra
competentes (XL10-Gold, Stratagene) que habían sido transformadas con el vector pPCR-
Script Amp SK(+) (Stratagene) que contenían un inserto del extremo 5’ del gen de la
cápside de NoV GI (597-bp) o de NoV GII (1188-bp). Estos segmentos corresponde a las
variantes genéticas GI.4 y GII.4 de NoV aislados de muestras clínicas [Nordgren et al.,
2008]. Las Escherichia coli clonadas fueron gentilmente proporcionadas por el Dr. Lennart
Svensson del laboratorio de Virología Molecular de la Universidad de Linköping de Suecia.
6.3.2. Generación de la curva estándar.
La curva estándar se realizó utilizando una serie de siete diluciones 1:10 a partir de una
solución estándar que contiene 0.5 x 108 plásmidos/µl de GI o GII. El rango dinámico de
cada una de estas series fue de 107 a 101. Se colocó 2.5 µl de cada estándar en una reacción
de PCR en tiempo real, cuyo volumen final fue de 25 µl, como se describió anteriormente.
Una vez que se obtuvieron las lecturas de intensidad de fluorescencia (∆Rn) de cada uno de
los estándares de la serie, se realizó un análisis de regresión lineal simple y se determinaron
el valor de la pendiente y el coeficiente de correlación (R2). Estos parámetros permiten
determinar la eficiencia, reproducibilidad y el rango dinámico de detección del método de
PCR en tiempo real basado en SYBR Green. El límite de detección se estableció calculando
el promedio de las lecturas fluorescencia del ruido (∆Rn) más 10 desviaciones estándar. El
límite de cuantificación se determinó de acuerdo al modelo de regresión lineal, es decir, el
rango de concentraciones donde el método mantiene la linealidad.
43
6.4. Análisis Estadísticos
Las análisis de la curva estándar se obtuvieron mediante un modelo de regresión lineal
utilizando el software HID Real-time PCR Analysis v 1.1 para Applied Biosystems 7500
Real-time PCR. Para medir la concordancia entre el ensayo de PCR convencional y PCR en
tiempo real SYBR Green se calculó el índice de Kappa utilizando el programa estadístico
SPSS (Statistical Program for Social Science, Inc. Chicargo, IL) versión 17.
44
7. RESULTADOS
7.1. Optimización de los parámetros químicos y termodinámicos del PCR en tiempo
real.
7.1.1. Volumen de muestra
El volumen óptimo de muestra de ADNc tanto para GI como para GII está en el rango de
1.5 - 3 µl. Con estos volúmenes se obtuvo la mejor eficiencia en la amplificación del ADNc
viral, reflejados en cambios en la fluorescencia (∆Rn) mayores y en Ct menores (Ct = 29).
Con 1 µl de muestra el cambio en la fluorescencia (∆Rn) fue menor y el Ct fue alto (Ct =
31), como era de esperarse. En cambio cuando se utilizaron volúmenes de muestra en el
rango descrito (1.5 - 3 µl) no se observaron cambios significativos en el Ct, por lo tanto el
volumen de muestra seleccionado fue el promedio (Figura 10).
Figura 10. Determinación del volumen óptimo de ADNc (GI), en el eje x se grafica los
ciclos de amplificación (Ct) de PCR y en el eje y los cambios en la fluorescencia (∆Rn).
45
7.1.2. Concentración de los primers.
La concentración óptima de los primers para GI y GII fue de 400 nM. En el análisis para
determinar la concentración óptima de primer (Figura 11), se observa que las lecturas de la
fluorescencia disminuyen a medida que disminuye la concentración de primer. Por
ejemplo, a una concentración de 50 nM, la amplificación fue baja y el Ct fue
indeterminado, así también cuando se utilizó una concentración de 100 nM no se alcanzó el
máximo de amplificación (plateau), y a una concentración de 200 nM el valor del Ct fue
alto (Ct = 28). Sin embargo a una concentración de 400 nM se observa que se alcanza el
máximo de la amplificación y un Ct menor (Ct = 24). Cuando se utilizó 800 nM también se
alcanzó el máximo de la amplificación y el Ct fue un ciclo más bajo (Ct = 23), en estos
términos la concentración es óptima, pero el uso de una concentración de 800 nM
representa un mayor gasto de primers y la posibilidad de la formación de dímeros de
primers en muestras con baja carga viral.
Figura 11. Determinación óptima de primer (GI), en el eje x se grafica los ciclos de
amplificación (Ct) del PCR en tiempo real y en el eje y los cambios en la fluorescencia
(∆Rn).
46
7.1.3. Efecto de la concentración de primer y dilución de una muestra sobre el Tm del
amplicon.
Para investigar si la concentración de primer para NoV GI y GII influyen en el Tm se
analizó las curvas de disociación (Figura 12 A) observándose que, cuando se utiliza la
concentración más baja de primer el Tm es indetectable, en el resto de las concentraciones
de primers analizados, los Tm tienen pocas variaciones, es decir ≤ 0.5ºC. Mientras que
cuando se analizó el efecto de la dilución de una muestra sobre el Tm (Figura 12 B), se
observan variaciones de 1.0 ºC con una tendencia hacia la derecha del Tm óptimo.
.
Figura 12. Curva de disociación del PCR en tiempo real. A) Determinación óptima de
primer (GI). B) Efecto de la dilución de la muestra (105-108) sobre el Tm (GII).
47
7.1.4. Temperatura óptima de hibridación de los primers.
La temperatura de hibridación experimental óptima determinada para este estudio fue de
55ºC tanto para los primers GI y GII. Utilizando una temperatura de hibridación de 50ºC se
observó que la amplificación del segmento específico disminuye ó la amplificación es nula
con mayor formación de dímeros de primers. Igual ocurrió a una temperatura de 60ºC. Una
observación interesante es que cuando se usan primers con cola, como los utilizados por
Nordgren et al., en el 2008 la temperatura óptima es de 60ºC.
7.1.5 Temperatura de disociación (Tm)
El análisis de las secuencias de los amplicones de distintas cepas de referencia de NoV GI y
GII, utilizando el programa de bioinformatica BioEdit, reveló que la temperatura de
disociación teórica de los amplicones es de 78.5 ± 0.6 °C y 78.6 ± 0.6 °C para GI y GII,
respectivamente (Figura 13). Sin embargo la temperatura de disociación óptima
experimental (Figura 14) determinada para los amplicones GI y GII fue de 76.1 ± 0.6 °C y
77.1 ± 0.6 °C, respectivamente, es decir que las temperaturas de disociación experimental
son menores (Tabla Nº 4).
48
Figura 13. Temperaturas de disociación teóricas de los amplicones de distintas cepas
de referencia de NoV GI (A) y NoV GII (B).
5579.9 5278.5
5379.0
4977.6 5278.5 5278.5 5278.5 5278.5 5278.5
%CG Tm
88-pb B)
53 79.2
51 78.2
51 78.2
50 77.8
53 79.2
%CG Tm
A) 87- pb
49
Figura 14. Determinación de la temperatura de disociación experimental óptima para
GI y GII.
Tabla Nº 4. Temperaturas de disociación experimental de NoV GI y GII.
Referencias GI Tm (ºC) Referencias GII Tm (ºC)
GI.11-771 75.2 GII.17-696 77.5
GI.4-826 76.2 GII.4-735 77.5
GI.4-394 76.6 GII.4-482 76.4
GI.2-741 76.5 GII.8NICA-166 78.0
GII.2-32 76.5
GII.4-432 76.8
x 76.1 x 77.1
Dímero de primer
50
7.2 Validación del ensayo de PCR en tiempo real SYBR Green.
7.2.1. Comparación del ensayo PCR en tiempo real y un PCR convencional.
El nuevo ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green fue comparado con un
PCR convencional utilizado tradicionalmente para el tamizaje de NoV [Zintz et al., 2005].
Se encontró una concordancia de 70% entre el PCR en tiempo real y el PCR convencional,
dicha concordancia es considerada como buena según la escala de valoración propuesta por
Landis y Koch [Landis and Koch, 1977].
El PCR convencional detecto un 28 % (17/60) de positividad en muestras clínicas, mientras
que el PCR en tiempo real detectó un 35 % (21/60) de positividad en el mismo material. Es
decir, el PCR en tiempo real detectó un 7 % (4/60) más de muestras positivas que el PCR
convencional. Otra ventaja del PCR en tiempo real sobre el PCR convencional fue la
capacidad de diferenciar entre muestras NoV positivas que contienen NoV GI ó GII (Tabla
N° 5).
7.2.2. Determinación de Ct en las muestras analizadas.
La media de los valores de Ct de las muestras positivas para GI y GII fue de 24.2 ± 5.6 y
26.2 ± 6.1, respectivamente (Figura 15 A y 16 A). En cambio, la media de los valores de Ct
para las muestras que fueron positivas por PCR en tiempo real y negativas por PCR
convencional fue de 30 ± 1.4. En este estudio el PCR convencional no logró detectar NoV
en muestras que contenían una carga viral baja (≤ 106) (Tabla Nº 5 muestras: 96, 242, 165 y
221).
51
Tabla N° 5. Detección y cuantificación de NoV GI y GII por PCR en tiempo real
SYBR Green en 60 muestras diarreicas.
Muestrasa
PCR en tiempo real basado en SYBR Green PCR
convencional b Genogrupo Ct Cuantificación
copias/gr. heces
208 GI 26 4 x 106 +++
190 GI 22 5.9 x 107 +++
96 GII 29 2 x 106 -
144 GII 25 2.1 x 107 +
152 GII 27 7 x 106 ++
163 GII 22 1.7 x 108 +++
166 GII 23 7.3 x 107 +++
167 GII 24 5.0 x 107 ++
171 GII 24 5.0 x 107 +++
186 GII 23 8.8 x 107 +++
195 GII 24 4.8 x 107 +++
199 GII 28 3 x 106 ++
215 GII 24 3. 7 x 107 +
220 GII 22 1.2 x 108 +
225 GII 25 1.6 x 107 ++
240 GII 25 2.4 x 107 +
242 GII 29 1 x 105 -
151 GII 25 2. 5 x 107 ++
155 GII 30 8 x 105 +
165 GII 30 9 x 105 -
221 GII 32 2 x 105 -
a. Muestras que fueron positivas por uno o ambos métodos utilizados en este estudio.
b. La intensidad de la banda de los productos del PCR convencional en gel de agarosa,
están indicados como alta (+++), media (++) y baja (+).
52
7.2.3. Análisis de la curva de disociación de las muestras analizadas.
La curva de disociación de los productos amplificados tanto para GI como para GII (Figura
15B y 16 B) muestra dos picos, el primer pico (lado izquierdo) corresponde a los dímeros
de primers y el segundo a los productos específicos. Una muestra fue considerada como
positiva para NoV cuando el Tm para GI fue de 76.1 ± 0.6 ºC y para GII de 77.1 ± 0.6 ºC.
Figura 15. A) Amplificación de las muestras positivas para GI. B) Curva de
disociación para muestras positivas para GI.
Figura 16. A) Amplificación de muestras positivas para GII B) Curva de disociación
para muestras positivas GII.
53
7.3. Evaluación de las propiedades del ensayo del PCR en tiempo real para la
detección y cuantificación de NoV GI y GII.
La curva estándar para NoV GI y GII se muestran en la Figura 17 A y B. El límite de
detección determinado para NoV fue de 100 e.g por reacción de PCR (~1.9 x 105 e.g/gr. h)
y un rango dinámico de 103 – 107 e.g por reacción para el ensayo con NoV GI y GII. El
coeficiente de correlación (R2) entre el número de amplicones y ∆Rn fue de 0.999 y 0.995
para GI y GII, respectivamente. La eficiencia de los ensayos para GI y GII fue del 93% con
una pendiente para ambos genogrupos de -3.5. La pendiente ideal es de -3.3, sin embargo
una pendiente entre -3.1 y -3.6 generalmente es aceptable. No se observaron reacciones
cruzadas con otros virus que infectan el intestino (Rotavirus, Sapovirus Porcino, Sapovirus
humanos, Astrovirus, Poliovirus y Adenovirus).
Figura 17. Curva estándar A) NoV GI y B) NoV GII.
R2 =0.995 Pendiente= -3.5 Eficiencia= 93%
R2 =0.999 Pendiente= -3.5 Eficiencia= 93%
B) A)
54
8. DISCUSIÓN En este estudio se ha establecido un ensayo de PCR en tiempo real basado en la
fluorescencia de SYBR Green para la detección y cuantificación de productos de PCR de
los genogrupos GI o GII de NoV en muestras clínicas. A su vez, este método utiliza valores
de Ct, datos de la curva de disociación y curva estándar, para la detección y cuantificación
de los genogrupos GI y GII de NoV. Este PCR en tiempo real ofrece la ventaja de ser un
método sencillo y rápido, y cuando se utiliza el sistema de detección de SYBR Green
permite hacer uso del análisis de la curva de disociación para verificar los productos
específicos y con ello se asegura no solo la especificidad, sino también poder distinguir
entre NoV GI y GII. Este sistema se optimizó para realizarse en reacciones separadas para
GI y GII, es decir el método no se probó para la detección simultánea en una misma
reacción con ambos genogrupos, no obstante las diferencias entre el Tm de GI y GII
podrían permitir el uso del método en un sistema de multiplex.
La optimización de los parámetros de un ensayo de PCR en tiempo real permite reducir la
formación de dímeros de primers y aumentar la eficiencia y especificidad de los procesos
de amplificación. Por ello, se determinaron los parámetros químicos y termodinámicos
óptimos para este ensayo. Uno de los parámetros químicos importantes es la concentración
de primer, en un estudio realizado por Richard et al., en el 2004 determinó una
concentración óptima de primer de 640 nM, sin embargo estuvo presente la producción de
dímeros de primers y de productos espurios debido a la alta concentración y degeneración
de los primers. En este estudio la concentración óptima de primer fue de 400 nM,
encontrando que la eficiencia de la amplificación era similar que cuando se utilizaba una
concentración más alta, sin embargo el gasto de primers era menor y la producción de
dímeros de primers y de productos espurios era menor.
Otro dato importante fue el valor de Ct, ya que el promedio de Ct de las muestras positivas
para GI y GII mediante el PCR en tiempo real fue 24.2 ± 5.6 y 26.2 ± 6.1 respectivamente,
mientras que el promedio de Ct de las muestras que fueron positivas solo por PCR en
tiempo real y negativas por PCR convencional fue mayor (Ct=30). Pang et al., en el 2004
reportó datos similares, con un promedio de Ct de 24.3 ± 4.4 para muestras positivas por
55
PCR en tiempo real y el promedio de Ct en las muestras negativas por PCR convencional y
positivas por PCR en tiempo real fue de 32. Con estos datos se puede sugerir que el PCR
convencional en ambos estudio no logra detectar NoV en muestras con una carga viral baja
(Ct ≥ 30). Sin embargo, en nuestro estudio una muestra con carga viral alta no fue detectada
por el PCR convencional (Tabla N° 5, muestra 96), lo que sugiere que nuestro PCR en
tiempo real no sólo detecta bajas concentraciones de virus, sino también otros tipos de
NoV, probablemente por la sensibilidad de los primers.
La principal dificultad en el desarrollo de un ensayo molecular para NoV es el diseño y
construcción de los primers debido a la alta diversidad genética del género Caliciviridae.
Las heterogeneidades existen aún en las regiones más conservadas del genoma viral, un
ejemplo de ello es la región dependiente de la ARN polimerasa (RdRp). Hasta ahora
existen cuatro estudios publicados de ensayos de PCR en tiempo real basados en SYBR
Green [Miller et al., 2002; Pang et al., 2004; Richards et al., 2004a; Richards et al., 2004b]
utilizando diferentes primers en su mayoría dirigidos a la región RdRp. Así, Miller et al., en
el 2002 comparó la microscopía electrónica y un PCR en tiempo real utilizando primers
dirigidos a la región RdRp y reportó que el PCR en tiempo real detectó mayor número de
muestras positivas. Otro estudio por Pang et al., en el 2004 evaluó varios set de primers
diseñados originalmente para PCR convencional, encontrando que los primers CapA/CapB
para GI dirigidos al gen de la cápside [Vinje et al., 2003] y los primers NVp110/SR46 para
GII dirigidos al gen de la región RdRp [Ando et al., 1995] cumplieron con los criterios de
sensibilidad y especificidad. Por otro lado, un tercer estudio realizado por Richards et al.,
en el 2004 utilizando primers dirigido a la región RdRp reveló que eran específicos
únicamente para la cepa 8FIIA prototipo de NoV GI [Matsui et al., 1991] pero no
amplificaban ningún otro NoV GI o GII. Por último, en otro estudio [Richards et al., 2004a]
utilizando un par de primers degenerados (primers MON) dirigidos a la región RdRp
encontró que dichos primers detectaban una gran variedad de NoV.
56
Kageyama et al., en el 2003 mediante análisis filogenéticos demostró que la homología
nucleótida entre secuencias del mismo genogrupo era entre un 86 - 100% en la región
ORF1-ORF2 del genoma, estos datos coinciden con otros estudios [Nordgren et al., 2008;
Zheng et al., 2006] que indican que la región RdRp es menos conservada que la región
ORF1-ORF2, por tanto dicha región es ideal para la selección de primers.
Basados en estos últimos hallazgos, en este estudio se utilizaron dos set de primers
degenerados dirigidos al sitio ORF1-ORF2 del genoma de NoV, un set de primers para
cada genogrupo (GI y GII) con el objetivo de maximizar la sensibilidad del ensayo. Se
escogió un sistema basado en SYBR Green relativamente menos específico pero más
sensible para maximizar la detección de GI y GII, y para compensar la baja especificidad
del mismo, se utilizó un criterio de valoración combinado de valores de Ct y curvas de
disociación tal como lo había sugerido un estudio previamente [Ririe et al., 1997]. Así
mismo Nordgren et al., en el 2008 al utilizar primers degenerados dirigidos a la región
ORF1-ORF2 para NoV (GI y GII) y un sistema de detección LUX reveló que la
sensibilidad incrementó al compararlo con un ensayo inmunológico y un PCR
convencional.
Una limitación al comparar un PCR en tiempo real y un PCR convencional en el
diagnóstico de NoV es la ausencia del gold estándar. En este estudio se obtuvo un 70% de
concordancia entre el ensayo de PCR en tiempo real y el ensayo de PCR convencional. Por
otro lado, 7% (4/60) de muestras positivas por PCR en tiempo real fueran negativas por
PCR convencional, una de las razones por las que el PCR convencional falló en la
detección de NoV puede deberse a que se utilizaron diferentes set de primers para evaluar
cada método. Sin embargo, Pang et al., en el 2004 al comparar un PCR en tiempo real
SYBR Green con un PCR convencional utilizó un mismo set de primers para ambos
métodos y reportó que el PCR en tiempo real incremento en un 19% el número de muestras
positivas en comparación con el PCR convencional.
57
Los inhibidores frecuentemente encontrados en muestras biológicas resultan en una
reducción significativa de la sensibilidad y cinética del PCR convencional, Richards et al.,
en el 2004 observó que algunas muestras analizadas por PCR convencional pueden resultar
negativas debido a los altos niveles de inhibidores en las mismas, a pesar que los títulos por
PCR en tiempo real sean bastantes altos. En nuestro estudio sugerimos que la principal
razón por que el PCR convencional detectó menos NoV, es por la baja concentración de
virus en las muestras como lo revela la cuantificación de algunas muestras en este estudio
(Tabla N° 5, muestras 96, 242, 165 y 221). Un estudio reciente por Nordgren et al., en el
2008 reporta observaciones similares y plantea que una de las razones por las que el PCR
convencional falla en la detección de NoV es la baja carga viral.
Nuestro ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR Green ha mostrado ser más
sensible que el método de PCR convencional. Los amplicones cortos del ensayo de PCR en
tiempo real probablemente resultan en una amplificación más eficiente y de mayor
sensibilidad, como lo reportó Nordgren et al., en el 2008 al utilizar primers degenerados
con amplicones cortos. Pang et al., en el 2004 determinó que el PCR en tiempo real fue
10,000 veces más sensible que el PCR convencional, utilizando una serie de diluciones a
partir una muestra positiva. Un hallazgo interesante es que al re-analizar las 4 muestras
positivas por nuestro PCR en tiempo real y negativas por PCR convencional, con el método
de PCR en tiempo real basado en sondas TaqMan [Kageyama et al., 2003] solamente 1 de
las 4 muestras fue positiva (no se muestran datos), lo cual puede sugiere que nuestro
método es más sensible que dicho método, para confirmar estos resultados es necesario
secuenciar los amplicones de SYBR Green.
Nuestro método puede ser utilizado para la cuantificación de carga viral en muestras
clínicas. El rango dinámico reportado en este estudio para GI y GII está entre 103-107 e.g
por reacción de PCR, con un límite de detección de 100 copias genómicas por reacción
(~1.9 x 105 copias/ gr. h) y una media geométrica de 1.5 x 107 e.g/gr. h tanto para GI como
para GII. Nordgren et al., en el 2008 utilizó estándares de plásmidos y reportó un rango
dinámico de 101-107 con un límite de detección de 10 copias genómicas (~20.000 e.g/gr. h)
para GI y 20 copias genómicas (~40,000 e.g/ gr. h) para GII.
58
Kageyama et al., en el 2003 reporta un límite de detección menor (~20,000 e.g/gr. h para
NoV GI y GII) que el reportado en este estudio. Aunque el método optimizado en este
estudio tiene un límite de detección más bajo que aquellos estudios que utilizan un sistema
TaqMan o LUX es un método muy útil para el tamizaje de muestras clínicas, entonces
cuando se requiera cuantificar NoV en muestras clínicas que contienen ≤ 1000 e.g lo ideal
sería utilizar un sistema TaqMan o LUX a pesar de su alto costo. En estudios recientes se
ha observado que los pacientes con infecciones sintomáticas y asintomáticas por NoV
excretan > 106 e.g/gr. h, es decir cantidades mayores que nuestro límite de detección
[Bucardo et al., 2010; Bucardo et al., 2008].
59
9. CONCLUSIONES
• Los parámetros químicos y termodinámicos óptimos del ensayo de PCR en tiempo
real SYBR Green para NoV GI y GII fueron: volumen de ADNc de 2.3 µl,
concentración de primer de 400 nM, temperatura de hibridación para los primers de
55°C, un Tm experimental para NoV GI de 76.1±0.6 y para GII de 77.1± 0.6.
• Al comparar el ensayo de PCR en tiempo real SYBR Green con un PCR
convencional utilizado para el tamizaje de NoV se obtuvo una concordancia del
70%, y nuestro método detectó NoV en un mayor número de muestras.
• El límite de detección alcanzado para NoV GI y GII fue de 100 e. g por reacción
(~1.9 x 105 e.g/gr h) y un rango dinámico de 103 – 107 e.g por reacción de PCR y
una buena correlación entre los valores de Ct y la concentración de plásmidos (log
10n) para GI (R2=0.999) y para GII (R2=0.995).
• La eficiencia del PCR en tiempo real SYBR Green fue de 93% (pendiente -3.5)
tanto para GI como para GII.
60
10. RECOMENDACIONES
• Ensayar un sistema de multiplex para la detección simultánea de NoV GI y GII
utilizando los mismo sets de primers que permitan evaluar la eficiencia del método
en la detección de NoV de forma simultánea en una sola reacción.
• En la optimización de los parámetros termodinámicos se recomienda incluir cepas
de referencia de otros genogrupos de NoV para obtener el Tm óptimo experimental
de los amplicones, debido a que Tm entre los diferentes genogrupos puede variar.
• Para confirmar las muestras que resultaron positivas utilizando nuestro ensayo de
PCR en tiempo real SYBR Green y PCR convencional se recomienda secuenciar los
productos del PCR en tiempo real SYBR Green.
• Cuando se requiera analizar muestras clínicas que contenga ≤ 1000 e.g se
recomienda utilizar un PCR en tiempo real utilizando un sistema TaqMan o LUX
debido a que en este estudio el límite de detección fue menor.
61
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66
12. ANEXOS
Anexo #1
Extracción ARN (ROCHE cat. N°. 11 858 882 001)
1. Descongelar las muestras en hielo.
2. Diluir las muestras 1:10 con PBS 1X y centrifugar brevemente.
3. Mezclar 200 µl de la muestra diluida con 400 µl del Poli (A) en un vial de 1.5 ml
estéril e incubar a T° ambiente por 10 minutos.
4. Depositar la mezcla anterior en una columna contenida en un tubo colector.
Centrifugar a 8,000 x g por 15 segundos.
5. Descartar el tubo colector que contiene el filtrado y colocar la columna en un nuevo
tubo colector. Agregar 500 µl de Buffer de Inhibición. Centrifugar a 8,000 x g por 1
minuto.
6. Descartar el tubo colector que contiene el filtrado y colocar la columna en un nuevo
tubo colector. Agregar 450 µl de solución de lavado y centrifugar a 8,000 x g por 1
minuto.
7. Descartar el tubo colector que contiene el filtrado y colocar la columna en un nuevo
tubo colector. Agregar 450 µl de solución de lavado. Centrifugar a 8,000 x g por 1
minuto.
8. Descartar únicamente el filtrado y centrifugar a 13,000 x g por 10 segundos.
Descartar el tubo colector que contiene el filtrado.
9. Colocar una nueva columna en un vial estéril de 1.5 ml, agregar 50 µl de buffer de
elución y centrifugar a 8,000 x g por 1 minuto.
10. Descartar la columna y rotular el vial que contiene el ARN.
11. Guardar a -20°C hasta su uso.
67
Anexo # 2
PCR convencional
(Zintz et al., 2005)
1. Descongelar los productos de la transcripción reversa y colocar los viales sobre
hielo.
2. En el cuarto blanco colocar en un vial que contiene una PCR bead 1 µl de primers
p289hi/290hijk (Tabla N°1) y 21.5 µl de agua libre de nucleasas.
3. En el cuarto oscuro agregar a la mezcla anterior 2.5 µl de ADNc para completar un
volumen final de 25 µl.
4. Colocar los viales en el equipo GeneAmp® 2700 Applied Biosystems y correr el
siguiente programa: 94°C por 3 minutos, 40 ciclos de 94°C por 30 segundos, 49°C
por 1minuto y 20 segundos, 72°C por 1 minuto y una extensión a 72°C por 10
minutos.
5. Colocar en un gel de agarosa los productos amplificados y realizar la corrida
electroforética.
6. Visualizar mediante luz ultravioleta el gel de agarosa (2%) una banda de 319-pb
para NoV.
68
Anexo # 3
Screening de Norovirus GI mediante PCR en Tiempo Real usando FastStart
Universal SYBR Green Master (ROX)
1. Descongelar los reactivos y el ADNc viral en hielo.
2. Preparar el Master Mix.
Componente [Final] (nM)
Vol (μl)x Rxn
FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 2X
1X 12.5
NV-GI-fwd1b (10 μM)
400 nM
1
NV-GI-rev (10 μM) 400 nM 1 Agua libre de nucleasas 8 ADNc 2.5 Total
25 μl
3. Agregar 22.5 μl del Master Mix en cada pozo de la placa a utilizar.
4. Agregue 2.5 μl de ADNc viral, estándar o agua en cada pozo, según se especifica a
continuación:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101
B NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101
C NTC U U U U U U U U U U U
D NTC U U U U U U U U U U U
E NTC U U U U U U U U U U U
F NTC U U U U U U U U U U U
G NTC U U U U U U U U U U U
H NTC U U U U U U U U U U U
NTC: Non Template Control, U: Desconocido, S: Standard
5. Mezclar y centrifugar a 4000 rpm por 3 min.
6. Sellar los pocillos.
69
7. Colocar la placa en el equipo para PCR en Tiempo Real (ABI 7500)
8. Correr el siguiente programa:
• Precalentamiento a 95°C por 5 minutos.
• 40 ciclos de 95°C a 15 segundos, 55°C a 30 segundos y 72°C por 1 minuto.
Especificaciones de los Primer:
Genogrupo I
Primers Secuencia (5’ – 3’)a Localización
NVG1f1b CGYTGGATGCGNTTCCATGA 5391-5310
NVG1rlux GTCCTTAGACGCCATCATC 5397-5379 a. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.
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Screening de Norovirus GII mediante PCR en Tiempo Real usando FastStart
Universal SYBR Green Master (ROX)
1. Descongelar los reactivos y el ADNc viral en hielo.
2. Preparar el Master Mix.
Componente [Final]
(nM)
Vol (μl)x
Rxn
FastStart Universal SYBR
Green Master (ROX) 2X
1X 12.5
NVG2flux1 (10 μM)
400 nM
1
COG2R (20 μM) 400 nM 1
Agua libre de nucleasas 8
ADNc 2.5
Total 25 μl
3. Agregar 22.5 μl del Master Mix en cada pozo de la placa a utilizar.
4. Agregue 2.5 μl de ADNc viral, estándar o agua en cada pozo, según se especifica a
continuación:
A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101
C NTC S106 S105 S104 S103 S102 S101
D NTC U U U U U U U U U U U
E NTC U U U U U U U U U U U
F NTC U U U U U U U U U U U
G NTC U U U U U U U U U U U
H NTC U U U U U U U U U U U
NTC: Non Template Control, U: Desconocido, S: Standard
5. Mezclar y centrifugar a 4000 rpm por 3 min.
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6. Sellar los pocillos.
7. Colocar la placa en el equipo para PCR en Tiempo Real (ABI 7500)
8. Correr el siguiente programa:
• Precalentamiento a 95°C por 5 minutos.
• 40 ciclos de 95°C a 15 segundos, 55°C a 30 segundos y 72°C por 1 minuto.
Especificaciones de los Primer:
Genogrupo II
Primers Secuencia (5’ – 3’)a Localización
NVG2flux1 ATGTTYAGRTGGATGAGRTTYTC 5012-5034
COG2R TCGACGCCATCTTCATTCACA 5100-5080
a. Código de ambigüedad: Y, Pirimidina (C/T); R, Purina (A/G); N, A, G, C o T.