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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.
VARIEDAD Riesling x Sylvaner.
GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C. 2000.
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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.
VARIEDAD Riesling x Sylvaner.
GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ
__________________ Marcela Franco C.
Directora.
________________ David Gómez
Asesor.
__________________ Ximena Sanchez
Asesora.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C 2000.
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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.
VARIEDAD Riesling x Sylvaner.
GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
BACTERIOLOGAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C. 2000.
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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.
VARIEDAD Riesling x Sylvaner.
GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ
________________________ Doctor. Hernando Valencia Docente del departamento de Biología. Universidad Nacional.
________________________ Doctora Myriam de Rico Docente del departamento de Microbiología. Universidad Javeriana.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C. 2000.
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ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO DE MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS DE CULTIVOS DE VID, Vitis vinífera L.
VARIEDAD Riesling x Sylvaner.
GLORIA PATRICIA MUÑOZ FIGUEROA MAGDA JULIANA RODRIGUEZ RODRIGUEZ
________________________ Doctor. Carlos Corredor Ph.D Decano académico Facultad de Ciencias Básicas.
________________________ Doctora Aura Rosa Manascero Directora de Carrera Bacteriología.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa Fe de Bogotá, D.C. 2000.
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LOS CRITERIOS EXPUESTOS, LAS OPINIONES EXPRESADAS Y LAS CONCLUSIONES ANOTADAS SON
RESPONSABILIDAD DE LOS AUTORES Y NO COMPROMETEN EN NADA A LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD
JAVERIANA.
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1. INTRODUCCION
En la historia se ha evidenciado que el cultivo de Vitis vinífera L. se convirtió
en un factor económico importante especialmente en los países
mediterráneos, puesto que no sólo el fruto producido por esta planta puede
ser consumido en estado fresco y seco, sino así mismo puede ser procesado
de tal forma que se generen vinos de óptima calidad (CHAUVET & REYNIER
1984).
Debido a esta clase de beneficios, actualmente existen otros países
localizados en Centro y Sur América que se han encargado de desarrollar
cultivos de Vid para no sólo mejorar su nivel económico, sino así mismo crear
nuevas fuentes de trabajo. Vale la pena mencionar a México, Perú,
Argentina, Chile y, sin lugar a dudas Colombia; teniendo en cuenta que éste
último inició su producción de uva hace setenta y un años en el
departamento del Valle del Cauca, zona tropical, sin importar que esta
especie es originaria de la zona templada del Asia Occidental, desde donde
se ha empezado a expandir la producción de Vid, debido a que en este
momento se pueden encontrar viñedos en otros departamentos del país
como lo son, Santander y Boyacá (MARRO, 1989).
El nivel rizosférico, es aquella porción del suelo sobre la cual influyen física,
química y biológicamente las raíces de las plantas. Desde el punto de vista
8
agrícola, esta zona es de gran interés porque en ella se producen las
interacciones de los microorganismos y las plantas.
La microbiología del suelo, tiene como objetivo principal el estudio de la
población microscópica del suelo, las propiedades fisiológicas y bioquímicas
de los microorganismos, la participación que tienen en las numerosas
transformaciones para aumentar la fertilidad del suelo, el desarrollo de las
plantas, el rendimiento de las cosechas y la importancia que tiene esa
población para la nutrición de las plantas (HARVEY, 1976).
Cada suelo tiene su microflora y microfauna característica, correspondiente a
las cualidades de su entorno. El clima predominante y la especie de planta
cultivada también influyen notablemente en la naturaleza; y a su vez
aumentan o no la diversidad microbiana.
Las características del suelo para el cultivo de Vitis vinífera L. son de gran
interés para obtener excelentes recolecciones de frutos que beneficien a los
cultivadores, tanto en cantidad como en calidad, por lo tanto es de
importancia contar con estudios que evalúen y analicen el número de
variedades comerciales que predominan y las causas de enfermedades que
éstas pueden padecer.
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Por el interés de conocer los microorganismos rizosféricos que prevalecen en
los cultivos de vid de la variedad Riesling X Sylvaner, se introduce a la
elaboración de un cepario de microbiología, que permita a los estudiantes la
manipulación experimental de estos organismos y con el tiempo aumenten
las expectativas en el estudio no sólo de los microorganismos rizosféricos de
la vid, sino de otros cultivos relacionados con los microorganismos
involucrados en esta investigación.
10
2. MARCO TEORICO.
2.1 CULTIVO VID.
La Vid pertenece a la familia Vitaceae, la cual reúne los arbustos trepadores
con zarcillos rameales, hojas alternas, flores pequeñas, inflorescencia en
racimo compuesto, fruto en baya, semillas de cubierta dura y albumen
carneo. Esta familia comprende 14 géneros entre los cuales se puede
mencionar el de Vitis.
Las plantas de vid cultivadas corresponden a variedades de la especie Vitis
vinífera L.; cada variedad se distingue por la morfología de sus órganos y
particularmente por la vellosidad, la forma y el color de la sumidad, de las
hojas jóvenes, de las hojas adultas y de los racimos (CHAUVET & REYNIER,
1984).
2.2 CULTIVO VID EN COLOMBIA
La vid fue introducida en Colombia posiblemente durante los años de
expansión de los cultivos en América (1920-1930); en 1925 se introdujeron
las primeras plantas por Don Inocencio Franco, al Valle del Cauca, años más
tarde se fue diseminando el cultivo por todo el país, entonces se
establecieron plantaciones en la hoya del río Tequendama; región
comprendida entre Cúcuta y San Antonio, en Villeta y la Mesa
11
(Cundinamarca), en poblaciones de los departamentos de Atlántico y Bolívar,
en poblaciones del departamento de Antioquia y recientemente en el Valle de
Sogamoso en Boyacá (RUIZ, 1976).
El cultivo se encuentra principalmente en explotaciones pequeñas ocupando
buena cantidad de mano de obra; el Valle del Cauca, zona tropical, es el
departamento número uno en producción de uva en Colombia, con más de
300 hectáreas cultivadas desde hace 61 años, destacándose los municipios
de Bolívar, Roldanillo, la Unión, Toro, Tulúa, Guacarí, Ginebra y Cerrito.
(BAYONA & SANCHEZ, 1992)
En el Valle del Cauca, la vid crece, se desarrolla y produce bien entre los 800
y 1600 metros sobre el nivel del mar a condiciones tropicales, cada planta
produce dos cosechas al año, gracias a la intervención del hombre por medio
de la poda, con la que rompe el descanso que aproximadamente es de dos
meses, situación favorable para exportar fruta tanto en el hemisferio norte
como al hemisferio sur, con grandes ventajas comparativas y competitivas
por la época y la calidad de la fruta.
2.2.1 CULTIVO VID EN BOYACÁ.
Entre 1926 y 1930, fueron introducidas las primeras vides al departamento de
Boyacá, por la comunidad de los jesuitas en la hacienda de la “Compañía” en
12
el municipio de Firavitoba, con el fin de obtener el vino que utilizan para
consagrar en las ceremonias religiosas, porque les resultaba más fácil
producirlo que traerlo de España; esta actividad se mantuvo hasta la
expulsión de la comunidad de los Jesuitas, por Carlos III, quien también
ordenó erradicar los viñedos. Algunos vestigios de vides, posiblemente de
las mismas variedades, sobreviven hoy en los patios de casas en Firavitoba,
Iza, Tibasosa, Monguí, Corrales, Tuta, Sogamoso entre otros, que se han
mantenido por muchos años sin ningún tipo de cuidado, ni labor cultural.
Otras evidencias de existencia de viticultura en la zona, en tiempos pasados,
es la decoración con hojas de vid y racimos de uvas de las cúpulas de las
iglesias de Monguí, Oicatá y Santo Domingo de Tunja.
Boyacá tiene un gran potencial para la viticultura de alta calidad; cuenta con
los tres factores más importantes que son clima, suelo y variedades de uva
(REVISTA CARTA GANADERA, 1984.)
2.2.2 CULTIVO VID EN LA FLORESTA.
A comienzos de 1998, el alcalde de la Floresta, Ingeniero Hernando
Salamanca Álvarez manifestó interés por adelantar un programa de
viticultura en el municipio, fue así como se concretó la siembra de 11.000
plantas de vid, las que fueron distribuidas entre 23 agricultores cuya cantidad
13
oscilaba entre 200 y 1000, de algunas de esas plantas ya se obtuvo la
primera cosecha.
La finca del Señor Próspero Naranjo donde se realizó el presente estudio,
inició con 260 plantas, pertenecientes al programa adelantado por el alcalde
del municipio. Observando buena adaptación y desarrollo, aumentó el
viñedo a 500, continuando con 100 más y en este momento cuenta con 900
vides, de las cuales las primeras que son objeto del presente trabajo ya
dieron la primera cosecha.
Actualmente observando los resultados obtenidos el interés tanto del alcalde
como de los viticultores es ampliar el número de vides (REVISTA CARTA
GANADERA, 1984).
2.3 CARACTERÍSTICAS CLIMÁTICAS.
Para el óptimo desarrollo de la vid y de su producto, la uva, se necesitan
prolongadas estaciones de verano, calientes y secas, e inviernos fríos. Estas
condiciones, propias de los países con clima sub-tropical pero no de países
del trópico, donde la temperatura es similar durante todo el año.
La temperatura es un factor primordial, dependiendo de esta se puede
presentar una alta o baja incidencia de enfermedades fungosas; como es el
caso de las variedades que han logrado adaptarse en climas tropicales, la
14
alta humedad relativa que impera en esas regiones (clima tropical) permite la
alta incidencia de enfermedades fungosas limitando en forma considerable el
cultivo.
Los fenómenos meteorológicos, ejercen su influencia en la vida y desarrollo
de la vid, es decir que el ciclo vital de la planta depende principalmente de la
temperatura, la cual regula las épocas de brotación, floración, envero, entre
otros. Se deduce que la vid no vivirá igualmente en todos los climas, sino
que existirán climas que serán más favorables para su desarrollo y habrán
otros en los cuales no puede vivir.
A condiciones climáticas favorables, condiciones del sub-trópico, las plantas
comienzan a crecer en la primavera, inmediatamente la temperatura media
alcanza los 10 ºC. Anterior a este periodo las plantas han descansado por 3
meses en invierno, a –10ºC. Por el contrario, para el desarrollo de las
plantas y la maduración de sus frutos, se necesitan temperaturas mayores a
18ºC hasta 25ºC (RUIZ, 1976).
La temperatura ejerce gran influencia en los factores que afectan la calidad,
como contenido de acidez y azúcar y la coloración externa.
No todas las variedades de Vitis vinífera L. se comportan o responden de
igual forma al factor climático; distribución de las lluvias, insolación y
15
temperaturas, pero la mayoría se comportan de modo similar (MARRO,
1989).
Las investigaciones y experiencias que se han desarrollado a través de los
años, la gran adaptación a variaciones de temperatura le han permitido vivir a
la vid en los países de clima templado, lo mismo en Europa que en América,
lo mismo que en Africa en Asia, Francia o Grecia, Argelia o Turquía,
Rumania o Chile, Argentina o Colombia, ya sean selectos productores de
ricos vinos o de excelentes uvas de mesa (HARVEY, 1976).
2.4 CARACTERÍSTICAS DEL SUELO.
Comercialmente, las vides se cultivan en el mundo entero, lo cual demuestra
que crecen en muchos y diferentes tipos de suelos; que varían desde los
arenosos hasta los arcillosos, desde los poco profundos hasta los muy
profundos y desde los muy fértiles hasta los de baja fertilidad (CHAUVET &
REYNIER 1984).
La vid prefiere los suelos de tipo medio, aquellos que se caracterizan por
presentar una capa arable y un subsuelo bien aireado. Los suelos arenosos,
sueltos, poco fértiles asimilan bien los abonos químicos u orgánicos que se
les apliquen (CHAUVET & REYNIER 1984).
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Los suelos destinados a la viticultura deben ser mas bien pobres, de poca
fertilidad, con texturas que van de francoarcillosa a francoarenosa y pH de
5.3 a 7.0 (MARRO, 1989).
Los terrenos arcillosos, se mantienen fértiles pero no son de fácil manejo, por
esto son poco recomendados para la vid. Los suelos areno-arcillosos, dan
mejores resultados para el desarrollo de vid; si encuentra suficiente humedad
y poca sal. El problema de fertilidad del suelo en sí no es un problema serio,
debido a que el hombre puede cambiar ciertas características de éste, las
prácticas de cultivo y la maquinaria, pero no puede modificar el clima, la
altitud, ni la exposición al sol, condiciones naturales que influyen de manera
irreversible en la calidad de la uva o del vino que se produzca (MARRO,
1989).
Para obtener los mejores resultados en los cultivos de las vides es necesario
evitar suelos muy pesados, poco profundos, con altas concentraciones de sal
y mal drenaje. Se recomiendan terrenos con buenas propiedades físicas,
livianos, pedregosos, de grano fino, textura media, profundos, permeables,
con buen drenaje, suficiente materia orgánica y buena capacidad de
retención de agua que faciliten la aireación y el descenso de las aguas;
evitando ambientes húmedos, favorables para enfermedades fungosas
(MARTIN, 1980).
17
2.5 EL SUELO Y SUS PRINCIPALES MICROORGANISMOS.
Un suelo maduro es el resultado de una mezcla compleja de compuestos
orgánicos e inorgánicos, la combinación de la roca madre, topografía, clima,
tiempo y actividad biológica. En un buen terreno agrícola la materia mineral
procedente de las rocas erosionadas normalmente alcanza el 50% del
volumen, la fracción orgánica derivada de las plantas, animales y
microorganismos, el 10 – 15%. En su gran mayoría el volumen restante está
ocupado por aire y por agua, encajados en un sistema de poros y canales en
donde la relación entre aire y poros está en función del contenido del agua
del suelo. Los organismos vivos ocupan menos del 1% del volumen total; las
diferentes clases de microorganismos se relacionan con los diferentes tipos
de suelo, las diferencias estacionales del mismo suelo, la profundidad de sus
perfiles y demás. Se ha concretado que el número de microorganismos se
relaciona con la humedad, el pH, el contenido orgánico y la temperatura. Así
los suelos neutros fértiles en áreas relativamente cálidas y lluviosas tienden a
presentar las cifras más elevadas de microorganismos. La correlación
particularmente significativa entre el contenido orgánico y los recuentos
microbianos se evidencia por el número incrementado de microorganismos
en la rizosfera y la asociación de estos con las capas de humus en los
perfiles de suelo. Así, el recuento mayor se halla en el estrato superior,
correspondiente al horizonte A, rico en humus, apareciendo un segundo pico
18
de recuento en los podsoles dentro del estrato superior rico en humus del
horizonte B. Existen estimaciones para varios tipos de microorganismos
determinados por el procedimiento del recuento de gérmenes. Tabla 1.
(GRANT, 1989).
Tabla 1. Estimaciones de varios tipos de microorganismos determinados por el procedimiento de recuento de gérmenes viables (10 –3 g).
Horizonte Bacterias Aerobias
Actinomycetos Bacterias Anaerobias
Hongos
Tierras marrones A (Superior) A (Inferior) B (Superior) B (Inferior)
9.500 2.000
10 1
1.800 150
0 0
2.000 400
0 0
400 50
6 3
Podsoles A (Superior) A (Inferior) B (Superior) B (Inferior)
5.200 1.800 2.900
80
600 50
180 40
1.000 10
100 10
580 230 400
10
(GRANT, 1989).
El suelo se desarrolla cuando la roca sufre cambios conocidos como erosión
atmosférica. La roca madre se disgrega en pequeños fragmentos por las
oscilaciones térmicas, la acción del agua, alcalinidad o acidez extremas y
otras acciones químicas producidas por la actividad biológica. Los elementos
que más abundan en el suelo son Si, Al, Fe y O, básicamente en forma de
silicatos; por otra parte se encuentran fósforo orgánico el cual es difícilmente
asimilable por las plantas, polisacáridos como: celulosa, peptinas y
hemicelulosas y humus, que constituye la mayor parte de la materia orgánica
19
de los suelos y es un residuo pardo insoluble en ácidos (MAYEA & NOVO,
1991).
El suelo es un gran depósito para los organismos, y casi todos los seres.
Con respecto a las bacterias, el aislamiento y la identificación dependen de la
capacidad de cultivar el microorganismo y de las técnicas empleadas. En
general la mayoría de la población bacteriana organotrófica aerobia de gran
parte de los suelos está compuesta por géneros Gram positivos; no sería
extraño encontrar que hasta el 70% de la totalidad de los aislamientos
bacterianos del suelo pertenezcan al género Arthrobacter, siendo la mayoría
de la microflora aerobia restante Bacillus sp. y Micrococcus sp. La población
Gram negativa en su mayor parte se compone por Pseudomonas sp. y
Flavobacterium sp (GRANT, 1989).
El género más representativo de los actinomycetes es Streptomyces, a estos
procariotas se debe el olor característico a tierra húmeda generado por la
producción de geosminas (GRANT, 1989).
Los hongos imperfectos de los géneros Penicillium sp., Aspergillus sp.,
Cephalosporium sp., Cladosporium sp. son aptos para ser aislados, porque
las conidias son producidas abundantemente. Existen muchos ascomycetes
y basidiomycetes diferentes presentes en el suelo que muestran una
distribución geográfica destacada, a diferencia de la mayoría de los hongos
20
imperfectos. Lo más probable es que los hongos imperfectos constituyan el
grupo principal, especialmente en condiciones de sequía. Es necesario tener
en cuenta que el suelo contiene un gran grupo de hongos de micorriza no
cultivables, que incluye los arbusculares.
En los últimos años los investigadores se han preocupado por el aislamiento,
identificación y descripción de los microorganismos del suelo, entre los
cuales se pueden mencionar: los actinomycetes, las bacterias y los hongos,
teniendo en cuenta que éstos han influido en numerosos procesos que son
de considerable importancia a nivel rizosférico (MARTIN, 1980)
Con el análisis del suelo se estudia la población microscópica que habita en
éste, logrando obtener resultados que beneficien a las plantas, para que así,
las cosechas tengan un óptimo rendimiento, puesto que en éste se sustenta
la vida vegetal (ALEXOPOULOS, 1976).
2.5.1 BACTERIAS.
2.5.1.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS
Las bacterias son los organismos más abundantes en el suelo, su presencia
se ha detectado en los más diversos ecosistemas y regiones del planeta.
21
Las formas más comunes que se hallan en el suelo son los bacilos, los cocos
y los espirilos. El número de las células bacterianas en suelo es grande pero
estas son muy pequeñas en tamaño, difícilmente miden unos cuantos
micrómetros de longitud. A esto se debe que las bacterias representen
mucho menos de la mitad de la masa celular microbiana total (NOVO &
MAYEA, 1991).
Los hongos y las bacterias prevalecen en suelos poco aireados, pero estas
últimas tiene la capacidad de generar todos los cambios químicos y
biológicos en ambientes que poseen niveles bajos de oxígeno, o que no
existe la presencia de éste.
Las bacterias del suelo se dividen en dos grandes grupos: las especies
nativas o autóctonas, estos son residentes verdaderos, se pueden presentar
en estados resistentes y perduran por largos periodos sin tener alguna
actividad metabólica, en un momento determinado estas formas nativas
proliferan y participan en las funciones bioquímicas de la comunidad
(MARTIN, 1980) y los organismos invasores o alóctonos, que no participan
de manera significativa en las actividades de la comunidad. Por medio de la
precipitación entran en tejidos enfermos, estiércol o aguas negras y pueden
permanecer por algún tiempo como formas inactivas e incluso crecen por
periodos cortos.
22
La cantidad y el tipo de bacterias se determinan en gran medida por el tipo
de suelo y las prácticas de cultivo. La abundancia aumenta conforme se va
de zonas más frías a zonas más cálidas. El contenido de materia orgánica
del hábitat influye en gran parte sobre la densidad bacteriana, esto nos indica
que el número de bacterias es mayor en zonas cultivadas que en zonas
vírgenes (ALEXOPOULOS, 1976).
Entre los géneros más comúnmente aislados de diferentes suelos se
encuentran: Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Alcaligenes sp.,
Arthrobacter sp., Bacillus sp., Brevibacterium sp., Caulobacter sp.,
Cellulomonas sp., Clostridium sp., Corynebacterium sp., Pedomicrobium sp.,
Pseudomonas sp., Sarcina sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp. Y
Xanthomonas sp. (NOVO & MAYEA 1991).
2.5.1.2 ACTINOMYCETES.
Los actinomycetes son bacterias filamentosas Gram positivas, abundantes y
ampliamente distribuidas en el suelo, en las aguas de charcos, lodos y
abonos orgánicos. Son organismos de nutrición heterótrofa, con
requerimientos nutricionales muy variados, porque son capaces de utilizar
una amplia diversidad de fuentes de carbono entre los que se hallan
azúcares simples, proteínas, ácidos orgánicos y una significativa colección
23
de sustratos complejos como celulosa, lignina, quitina y parafinas (MAYEA &
NOVO, 1991).
Abundan más en los suelos secos que en los húmedos, así como se
desarrollan también en suelos alcalinos, el pH óptimo para su crecimiento es
el neutro. Son microorganismos que producen filamentos delgados que
pueden ser bastante largos, aunque en algunas ocasiones son cortos, y
pueden fragmentarse en muchas unidades más pequeñas; también, son
ramificados y se desarrollan en un micelio en todos los géneros del suelo.
Muchos de los actinomycetes forman sobre sus filamentos propágulos
asexuales, los cuales son comúnmente conocidos como conidias, aisladas,
en pares o formando cadenas, mientras que otros habitantes rizosféricos
producen los propágulos en una estructura especializada conocida como
esporangio (ALEXOPOULOS, 1976).
Las conidias indican la resistencia de estas estructuras a condiciones
ambientales nocivas, es decir que desempeñan una función de
sobrevivencia. Muchas cepas tienen propágulos resistentes a la desecación;
estas conidias permanecen por muchos años en suelos secos (MARTIN,
1980).
24
En relación con las bacterias, en algunas ocasiones existe la presencia de
flagelos semejantes a los de bacterias verdaderas, relación en la
composición de la pared celular y la sensibilidad a inhibidores antibacterianos
y no a inhibidores antifúngicos. Además, son semejantes en cuanto a la
morfología y el tamaño de los filamentos, las conidias y los fragmentos
individuales de las especies cuyo micelio sufre segmentación. Se debe tener
en cuenta, que como se mencionó anteriormente existen algunos
actinomycetes que producen micelio aéreo, lo cual los hace bastante
semejantes a los Mycobacterium y a las bacterias corineformes en su
morfología general; también, en los métodos de tinción, debido a que
reaccionan con el método de Gram y en cuanto a la fisiología (NOVO &
MAYEA, 1991).
Existen medios de cultivo que son óptimos para el crecimiento de los
actinomycetes, uno de estos es el Agar Avena, en el cual se pueden
desarrollar perfectamente colonias macroscópicamente distintas a las
colonias bacterianas, desarrollando masa de filamentos ramificados que se
originan de un fragmento de micelio; estas colonias pueden tener una
consistencia firme y se pueden adherir fuertemente al sustrato solidificado;
en algunos actinomycetes la superficie parece pulverulenta y con frecuencia
llega a pigmentarse, en algunos casos se desarrolla un micelio sencillo
dando a las colonias una consistencia harinosa. (NOVO & MAYEA, 1991).
25
Es importante recordar, que las bacterias son derivadas por una sola célula
por fisión binaria, pero los actinomycetes por el contrario, antes de la
esporulación, constan de un organismo, un micelio derivado de una sola
unidad de propagación (FARB, 1965).
Para los actinomycetes, la materia orgánica, el pH, la humedad y la
temperatura son los determinantes ecológicos principales. Estos
microorganismos no toleran valores bajos de pH; en cuanto a la humedad,
cuando existen condiciones de inundación o los niveles de agua sobrepasan
entre un 80 a 100% estos microorganismos aparecen muy raramente. Lo
anterior es debido a que en algunas especies de actinomycetes comunes de
suelo tienen metabolismo aeróbico, y por lo tanto son incapaces de
desarrollarse cuando el O2 es relativamente escaso; en cuanto a los estados
de sequedad, estos microorganismos no se ven afectados debido a que
favorece a los grupos filamentosos en su desarrollo vegetativo como en la
formación de conidias. (WILLIAMS, 1984).
De los géneros, el más común es Streptomyces. La mayoría de los
estreptomycetes aislados del suelo presentan la gran capacidad de producir
antibióticos de importancia médica e industrial, tales como: Estreptomicina,
26
Cloramfenicol, Tetraciclina, Neomicina, Nistatina y otros, bajo condiciones de
laboratorio y a nivel comercial (BALOWS, 1991).
Los antibióticos en el suelo, son capaces de controlar enfermedades de
plantas mediante la acción directa sobre el patógeno, actuando en el
hospedero, provocando transformaciones de sustancias sin la participación
de la planta, neutralizando toxinas secretadas por el patógeno o una
combinación de dos o más de uno de estos efectos (NOVO & MAYEA, 1991).
2.5.2 HONGOS.
Los hongos se reconocen como los microorganismos que hacen parte de
una significativa cantidad de biomasa en el suelo, debido al diámetro de sus
filamentos y a la extensa red de micelio que forman; la cual está constituida
por cadenas de hifas independientes. Estos microorganismos predominan
en el lecho en descomposición, en general, son los principales agentes de
descomposición en los ambientes ácidos (ALEXOPOULOS, 1989).
Algunos hongos presentan septos en su micelio, que en compañía con las
paredes transversales hacen que éste pueda subdividirse en células
individuales. Una de las diferencias de los hongos frente a los actinomycetes
es la existencia de hifas más anchas para los hongos, además, las que no
poseen septos son continuas y multinucleadas sin la presencia de las
27
paredes transversales. Las hifas individuales pueden ser vegetativas o
fértiles, cuando son fértiles tienen la capacidad de producir las esporas
sexuales que no son muy comunes y su micelio es incoloro en medios de
cultivo; o asexuales que son abundantes y están bastante diseminadas,
además en medios de cultivo su micelio es bastante coloreado (NOVO &
MAYEA, 1991)
Para el estudio de los hongos, la técnica que se ha usado con mayor
frecuencia es aquella donde la muestra de suelo es suspendida en agua
estéril, y después de una completa homogenización se procede a realizar
una serie de diluciones que van a ser suspendidas en un medio de cultivo
donde no se puedan desarrollar las bacterias, es por esto, que los primeros
microbiólogos resolvieron el problema acidificando el medio de cultivo a pH
4.0. Otra forma que idearon para inhibir el crecimiento de bacterias es
adicionándole al Agar antibióticos, como: Penicilina, Novobiocina,
Vancomicina y Estreptomicina (MARTIN, 1980).
El desarrollo de un microorganismo depende del hábitat en que éste se
encuentre; existen diferentes características ambientales que benefician a la
comunidad de los hongos incluyendo el estado de la materia orgánica,
concentración del ión hidrógeno, fertilizantes orgánicos e inorgánicos, el nivel
de humedad, aireación, temperatura, estación del año y la composición de la
vegetación (MARGALEF, 1995).
28
La temperatura es uno de los factores físicos limitantes dentro del ambiente y
desempeña un papel decisivo en la distribución de los seres vivos. La
mayoría de los hongos son mesófilos en sus requerimientos de temperatura
para el crecimiento, con un mínimo entre 5 y 10ºC y un máximo entre 30 y
40ºC. Algunos hongos resisten temperaturas entre 40 y 50ºC (GRANT,
1989).
La nutrición de los hongos es heterótrofa y ni la luz solar, ni la oxidación de
sustancias inorgánicas proporcionan a estos microorganismos la energía
necesaria para su crecimiento, por lo cual se infiere la importancia que para
su desarrollo tiene la presencia de materia orgánica. Una gran variedad de
sustancias orgánicas naturales son descompuestas por los hongos del suelo,
entre las que se encuentran azúcares simples, alcoholes, aminoácidos y
polímeros como la lignina, celulosa, hemicelulosa, proteínas y los ácidos
nucléicos (MARGALEF, 1995).
El número de hongos filamentosos en el suelo varía directamente con el
contenido de materia orgánica utilizable; sin embargo, este grupo microbiano
se encuentra aún en áreas de bajo nivel de materia orgánica. Mejorando los
niveles nutricionales mediante la incorporación de restos de cultivo, abonos
verdes u otros materiales carbonados en el suelo, se incrementa el tamaño
de la comunidad. Al mismo tiempo, la aplicación de sustratos orgánicos
29
altera la composición de la flora y se afecta marcadamente el dominio relativo
de géneros como Penicillium, Trichoderma, Aspergillus, Fusarium y Mucor
(NOVO & MAYEA, 1991).
Muchas especies pueden desarrollarse dentro de un amplio intervalo de pH,
desde el extremo ácido al alcalino. En cultivo no es rara la capacidad de
crecer a valores de pH tan bajos como 2.0 – 3.0 y muchas cepas son aún
activas a pH de 9.0 o más. La sensibilidad al pH puede ser de gran
importancia para los agentes patógenos de las plantas que se originan en el
suelo, las cuales, como consecuencia del intervalo de pH en el cual se
desarrollan, pueden ser más destructivos en reacción ácida, neutra o alcalina
(GILMAN, 1988).
El agua es requerida para todos los seres vivos, es por esto que ésta tiene
un valor considerable sobre la abundancia y las funciones de los hongos. El
mejoramiento en la humedad del medio ambiente favorece al número de
hongos de modo que a niveles subóptimos de agua, su cifra está
correlacionada positivamente con la humedad. Sin embargo, estos
organismos pueden persistir en condiciones relativamente semiáridas y
pueden ser metabólicamente activos en lugares con bajo contenido de agua
(ALEXOPOULOS, 1989).
30
Los hongos filamentosos son aerobios estrictos aunque existen algunas
excepciones y algunas especies consideradas comúnmente como aerobias
obligadas, crecen en cierta medida cuando el O2 no está presente por más
tiempo. Sin embargo, aun entre los aerobios obligados parte del micelio
puede penetrar en lugares donde no hay O2 pero gran parte de la masa de
las hifas debe tener fácil acceso al aire (KORMONDY, 1978).
En cuanto a las estaciones climáticas, el calor de la primavera resulta
beneficioso en una región tropical la cual es más apta para los cultivos vid
en cuanto numero de cosechas al año; pero los periodos de sequía en
verano o el frío del invierno cobran sus víctimas. La disponibilidad de materia
orgánica está influenciada notablemente por la estación y los nutrientes
carbonados son abundantes en el otoño; lo cual significa que el número de
organismos tiende a elevarse durante el otoño y la primavera y
frecuentemente disminuye en los periodos secos del verano.
2.6 CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.
El objetivo de la preservación de microorganismos en cultivo, es mantener
como referencia organismos vivos, libres de contaminación y sin variaciones
por mutación.
31
Se han empleado muchos métodos de preservación, pero no todas las
especies responden de manera similar, de hecho algunas cepas de la misma
especie responden diferente frente al mismo procedimiento (DAGUET, 1977).
La preservación de un cultivo depende del medio que se emplea; el
procedimiento, la edad y el tiempo de preservación que se requiera y son
particularmente acertados cuando se trabaja con bacterias que contienen
plásmidos o DNA recombinante, o que pueden presentar partes de
crecimiento como formación de esporas (DAGUET, 1977).
Tabla 2. Métodos de conservación de microorganismos a corto plazo.
a. Subcultivo. c. Congelación.
b. Inmersión en aceite mineral. d. Desecación.
(DAGUET, 1977)
Tabla 3. Métodos de conservación de microorganismos a largo plazo.
a. Liofilización. c. Altacongelación.
b. Criofijación.
(DAGUET, 1977)
32
2.6.1 CONSERVACION DE MICROORGANISMOS A CORTO PLAZO.
La preservación se efectúa por métodos muy rápidos, que muchas veces no
dan buenos resultados. Se logran mantener los microorganismos, utilizando
pequeños volúmenes repartidos sobre una gran superficie, por pocos meses
o años (DAGUET, 1977).
2.6.1.1 SUBCULTIVO.
El tradicional método de cultivo para preservación de microorganismo es muy
importante porque es altamente sensible y porque produce un gran número
de microrganismos vivos que brindan valiosa colaboración en estudios de
patogenicidad, sensibilidad a fármacos y otras propiedades biológicas del
microorganismo (KIRSOP, 1983).
El intervalo entre transferencias depende del organismo, del medio de cultivo
y la temperatura de almacenamiento, a alta contaminación no se puede
aplicar el subcultivo en áreas rurales debido a que se hace necesario el uso
de medios de cultivo fresco y preferiblemente simple ya que puede prolongar
la tasa de crecimiento del microorganismo por período entre fases (KIRSOP,
1983).
33
2.6.1.2 INMERSION EN ACEITE MINERAL.
Muchas especies pueden ser preservadas por meses e incluso años por un
medio relativamente simple y económico, la inmersión en aceite mineral.
Cuando se obtiene crecimiento en medio de cultivo apropiado y se está en
fase logarítmica o en la formación de esporas y/o conidias se procede a
agregar al medio inclinado una cantidad de 2 ml de aceite mineral estéril,
para prevenir la deshidratación y reducir la actividad metabólica y de
crecimiento del cultivo (KIRSOP, 1983).
2.6.1.3 CONGELACION.
Se recomienda evaluar diferentes temperaturas. Los daños o problemas que
pueden causar los cristales formados por las bajas temperaturas a las células
en congelación se pueden disminuir con la utilización de un agente
crioprotector como el DIMETIL SULFOXIDO (DMSO) y el glicerol que hace
por presión osmótica que el agua del interior de la célula migre al exterior
evitando así la cristalización del citoplasma (KIRSOP, 1983).
2.6.1.4 DESECACION.
Muchos cultivos mueren en ausencia de agua. Sin embargo, algunos en
especial bacterias esporo-formadoras pueden preservarse por años, por su
34
resistencia a la desecación, se pueden llevar a cabo con tiras de papel
impregnadas con el microorganismo y mantenidas en tubos tapa rosca,
gelatina a –20ºC o a temperatura ambiente, silica gel estéril o con perlas de
porcelana para la preservación de cultivos a temperatura ambiente
(DAGUET, 1977).
2.6.2 CONSERVACION DE MICROORGANISMOS A LARGO PLAZO.
Estos métodos actualmente dan los mejores resultados, logran mantener
los microorganismos por muchos años; manteniendo intacto la morfología y
comportamiento de las especies (DAGUET, 1977).
2.6.2.1 LIOFILIZACION.
Método más común de preservación de cultivos bacterianos usado por
muchos años; la liofilización consiste en la remoción de agua de la
suspensión bacteriana por sublimación a baja presión, así que el agua se
evapora sin pasar por fase líquida y las células liofilizadas pueden vivir en
ausencia de oxígeno y en la oscuridad y pueden ser fácilmente rehidratadas
para luego ser liofilizadas sin evidencia del traumatismo (FERNANDEZ,
1988).
Los cultivos liofilizados se pueden almacenar de 2 ºC a 8 ºC prolongándose
el promedio de vida de –30 ºC a -70 ºC pudiéndose rehidratar con la adición
35
de un caldo de cultivo e incubandolo por tiempo relativamente corto para ver
si se quiere volver a liofilizar (KIRSOP, 1983).
La liofilización es un método de conservación, que actualmente da los
mejores resultados, consiste en una desecación al vacío de los
microorganismos congelados y del líquido que los baña (FERNANDEZ,
1988).
La liofilización exitosa es posible para hormonas, péptidos, enzimas,
esteroides, ácidos nucleicos, antibióticos, vacunas, bacterias, virus y tejidos
biológicos. La estabilidad y el largo tiempo de almacenaje de estos
materiales es la principal ventaja del proceso de liofilización, por lo tanto, se
previene o limita la descomposición de la sustancia en solución acuosa, la
disminución de la actividad de componentes activos y la reacción química
entre dos o más de los componentes en la misma solución.
El proceso de liofilización se divide en tres partes principales:
• Congelación del producto en solución.
• El secado primario (sublimación)
• El secado secundario (post-secundario). (FERNANDEZ, 1988).
36
2.6.2.1.1 CONGELACIÓN.
Durante la congelación de una solución acuosa binaria diluida consistente de
un soluto en agua, el hielo puro se separa y la solución residual (fluido
intersticial), se vuelve más concentrada con respecto al soluto, hasta que se
forma una composición en la cual el agua y el soluto se solidifican. La
temperatura a la cual ocurre la solidificación final se le llama “temperatura
eutéctica”; esta es la temperatura más baja a la cual el material no congelado
existe en equilibrio con el material congelado (KIRSOP, 1983).
En un ciclo normal de liofilización, el material se enfría alrededor de 5ºC a
10ºC por debajo del punto eutéctico y se mantiene a ésta temperatura por lo
menos dos o tres horas con el fin de asegurar la completa solidificación,
elevando después la temperatura hasta la temperatura de secado
(sublimación); en esta etapa es importante que el agua esté completamente
congelada. La descongelación del agua causa el colapso de la pastilla, si
ésta contiene humedad (agua líquida por descongelación), o no puede
permanecer rígida como el soporte dado a ella por la masa congelada la cual
es removida por el proceso de liofilización. Si la liofilización es exitosa, en la
pastilla liofilizada al hacer cortes transversales, se observan perfectamente
los pequeños canales por donde sublima el agua. En caso de colapso, la
pastilla pierde su estructura porosa, bloquea el paso de vapor de agua y evita
37
el enfriamiento evaporativo, lo cual causaría una fusión total o parcial del
material remanente congelado (FERNANDEZ, 1988).
2.6.2.1.2 SECADO PRIMARIO.
Durante el secado primario (sublimación), el solvente (vapor) es extraído
directamente del material (congelado).
El secado empieza siempre por la parte superior del material congelado
(cuando se trata de masas congeladas en recipientes como ampolletas o
viales), o bien de la superficie exterior (cuando la masa congelada está en
forma esférica u otra semejante). En los lugares en donde sublima el hielo
se forman pequeños orificios que no se perciben fácilmente a primera vista;
para verlos con claridad, es necesario cortar la pastilla ya liofilizada
(FERNANDEZ, 1988).
A través de estos pequeños orificios, el agua en forma de vapor escapa de
las capas cada vez más bajas o profundas de la masa congelada. El grosor
de la capa seca, aumenta gradualmente durante el proceso de secado y el
vapor de agua experimenta un aumento de resistencia a escapar en la capa
seca. De este modo, la velocidad de sublimación va disminuyendo durante el
proceso. En general el flujo de vapor de agua se impide por tres tipos de
resistencia:
38
• Resistencia de la capa de producto seco.
• Resistencia del tapón de hule (si lo hay).
• Resistencia de la cámara de Liofilización.
El suministro de calor al nivel de sublimación es un factor determinante para
conseguir una velocidad óptima en esta etapa del proceso. La temperatura
de sublimación debe alcanzar lo más alto posible, sin permitir la fusión de la
masa congelada (que todavía tiene hielo), a modo de obtener la mayor
diferencia de temperatura, así como la máxima diferencia de presión de
vapor de agua; entre el producto y el condensador de hielo cuya presión se
encuentra alejada lo más posible del producto en proceso, denominada
“fuerza impulsora de sublimación” (KIRSOP, 1983).
El calor se aplica durante esta fase para suministrar el “calor latente en
sublimación” y de este modo mantener la velocidad de secado.
La capa seca se enfría al escapar el vapor de agua, hasta que el hielo ha
sido sublimado completamente del producto. Cuando la sublimación ha
terminado, el producto adopta la temperatura del anaquel (o el de la charola
cuando se trata de liofilización a granel). Si el proceso de sublimación se
39
detiene demasiado pronto, antes de que todo el hielo se haya sublimado, la
“matriz” puede sufrir colapso cuando el vacío se interrumpe (KIRSOP, 1983).
El punto final de sublimación y la iniciación del secado secundario, puede
apreciarse automáticamente por medio de mediciones de temperatura
barométrica, con el uso de un dispositivo microprocesador (FERNANDEZ,
1988).
2.6.2.1.3 SECADO SECUNDARIO.
Después del secado primario, la remoción de la humedad residual de la
pastilla porosa, depende de la naturaleza del material, de la temperatura del
producto y de la presión de vapor. El contenido de humedad residual
dependerá de la efectividad de secado del anaquel. En las partes laterales
externas del anaquel el secado es más efectivo (FERNANDEZ, 1988).
Si la cantidad de humedad residual disminuye obteniéndose un producto
estable, aún después de liofilizar, el secado secundario es necesario para
remover el agua absorbida intermolecularmente. Para el secado secundario
se elegirá una temperatura más alta, la presión dentro de la cabina tenderá
siempre a ser más baja. El secado secundario es muy importante en el
proceso de liofilización; sin embargo, no siempre es adecuado porque se
disminuye el contenido de humedad al máximo. Varias sustancias son más
40
estables cuando están totalmente secas por ejemplo las proteínas (BRAVO,
1988).
El control del proceso se realiza para obtener una pastilla liofilizada con
contenido óptimo de humedad; con el fin de descubrir qué tanto debe
aumentar la presión en un tiempo fijo y a cuál secado secundario puede
ejecutarse (BRAVO, 1988).
2.6.2.2 CRIOFIJACION.
Es un mecanismo de preservación en frío cuyo objetivo es congelar la
muestra tan rápido como sea posible para reducir la formación de cristales y
poder preservar la estructura de la célula por posteriores análisis
micróscopicos (DAGUET, 1977).
2.6.2.3 ALTA CONGELACION.
La preservación por largo tiempo de cultivos de referencia de
microorganismos se ha hecho en congelación a –196ºC y a –70ºC siendo
métodos altamente costosos.
Las sustancias crioprotectoras son de dos tipos, agentes como el glicerol al
10% (v/v) y dimetil sulfoxido al 5 % (v/v) que pasan a través de la membrana
41
brindando protección intra y extracelular contra la congelación, y agentes
como el dextran, glucosa, lactosa, manitol, sucrosa con efectos externos a la
membrana celular.
Se emplean cultivos que se encuentran en la mitad de la fase de crecimiento,
la descongelación rápida de los cultivos ejerce importancia sobre la cantidad
de células que se pueden recuperar para esto se hace necesario llevar los
cultivos en agitación moderada a 37 ºC hasta que desaparezca el hielo y
para el transporte; mejor en estado de liofilización.
2.7 CEPARIO.
Así como la química y la bioquímica cesarían actividades sin un
abastecimiento de químicos, de igual forma, la microbiología necesita de la
disponibilidad de cepas puras logrando establecer que mientras la mayoría
de los químicos son fácilmente almacenados, las cepas microbianas son
altamente vulnerables y pueden contaminarse, sufrir o morir; a menos que se
disponga de asistencia técnica experta para prevenir esto (KIRSOP, 1983).
Es necesario mantener una librería de trazas que produce reacciones típicas,
porque es de importancia para los laboratorios industriales y taxonomistas,
que necesitan mantener trazas de producción a grandes cantidades para ser
usadas en programas de muestreo y en estudios comparativos; los
42
laboratorios de investigación requieren cepas puras para muchos propósitos,
como erradicación de microorganismos patógenos tratados en control
biológico.
El Cepario constituye un conjunto ilimitado de especies microbianas
identificadas y organizadas cada una bajo su género. En un laboratorio, en
principio estas cepas pueden provenir de grandes centros nacionales o
internacionales especializados; o como es el caso, se puede dar origen a un
Cepario de Microbiología de Suelos y tener a disposición un cierto número de
especies microbianas conservadas; con el fin de guardar intacto el conjunto
de sus caracteres y poder ser llevados a las clases prácticas de laboratorio
en la Pontificia Universidad Javeriana.
Las especies microbianas de un Cepario deben ser conservadas con el fin de
mantenerlas por mucho tiempo respetando sus caracteres morfológicos,
bioquímicos y eventualmente su virulencia, de igual forma evitando
contaminaciones fatales. Existen varios métodos para la conservación de
microorganismos, uno de estos y el más utilizado es la liofilización.
43
3. JUSTIFICACION
El Departamento del Valle del Cauca fue el primer cultivador de Vid y desde
hace algunos años existe una nueva región cultivadora en el Departamento
de Boyacá. Las plantaciones se han expandido por toda la zona, tomando
como referencia el valle de Sogamoso, donde hoy existen 20 hectáreas
cultivadas en el municipio de la Floresta; donde colaboran en este proyecto
personas de escasos recursos que han centrado todas sus esperanzas en
ver salir adelante esta empresa, como una nueva opción económica, debido
a que los cultivos tradicionales en esta zona no les están produciendo las
ganancias suficientes para el sostenimiento de sus familias, al no conocerse
el comportamiento microbiológico en estos suelos (REVISTA CARTA
GANADERA, 1984).
El principal factor de índole económico que se debe considerar en la
plantación de Vid, es la selección del terreno y sus características
ambientales, porque es allí de donde proviene un buen desarrollo vegetativo
de la planta, altos rendimientos, buena calidad, bajos costos de
mantenimiento y permanente producción de las parras.
El propósito de esta investigación es ayudar al conocimiento y análisis de la
microflora normal del suelo, como un aporte al conocimiento de esta
población de organismos en suelos pobres y ácidos del municipio de la
44
Floresta, en el Departamento de Boyacá, diferenciándola de
microorganismos patógenos causantes de pérdidas fatales para los
cultivadores. Además, se pretende iniciar un banco de cepas de
Microbiología de Suelos; organizando bacterias, actinomycetes y hongos;
indicando la morfología macroscópica y microscópica con su respectivo
comportamiento bioquímico, basado en un índice fotográfico de cada grupo
de microorganismos.
45
4. OBJETIVOS.
4.1 OBJETIVO GENERAL
Aislar, identificar, caracterizar y conservar microorganismos rizosféricos en la
variedad Riesling x Sylvaner de cultivos de vid de Vitis vinífera L. en el
Municipio de Floresta, (Boyacá); organizando un cepario en el Departamento
de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
ð Aislar e identificar los microorganismos (hongos, bacterias y
actinomycetes) rizosféricos, presentes en plantaciones de vid, variedad
Riesling X Sylvaner.
ð Reportar los microorganismos aislados e identificados (actinomycetes,
bacterias y hongos), a nivel rizosférico en la variedad Riesling X Sylvaner
de cultivos de vid de Vitis vinífera L., conociendo según bibliografía la
población patógena.
ð Caracterizar los microorganismos identificados, organizando un cepario
general de la población rizosférica predominante; presente en los suelos
rizosféricos del municipio de la Floresta, sembrados con la variedad
Riesling X Sylvaner de Vitis vinífera L.
ð Determinar la densidad poblacional de los microorganismos
caracterizados a nivel rizosférico en la variedad Riesling X Sylvaner de
Vitis vinífera L.
46
5. MATERIALES Y METODOS.
5.1 DESCRIPCION DEL AREA.
La estación “Horno y Vivas”, donde se encuentra el viñedo estudiado está
ubicada en el municipio de la Floresta, departamento de Boyacá, a una
altura de 2.450 msnm y a una presión atmosférica de 764 mv. Figura 1.
5.2 FASE DE CAMPO.
Las muestras rizosféricas fueron tomadas adoptando la metodología del
muestreo aleatorio simple, en un viñedo conformado por 260 plantas de la
variedad Riesling X Silvaner de Vitis vinífera L., sembrado en 7 filas, cada
una aproximadamente con 37 plantas. Las muestras se tomaron por sorteo
a las diferentes filas; quedando cada planta marcada con su respectiva
ubicación; este proceso se realizó igualmente en los tres muestreos llevados
a cabo durante los meses de marzo, abril y mayo, tomándose muestras de
suelo a 26 plantas en estadio nouvason (formación de frutos). Figura 2.
Además se realizaron análisis informales de pH con cinta y de humedad por
el método de peso seco en horno, este último tomando 10 g de suelo
secándolo a 350 ºC durante 5 horas, procedimiento que se hizo después de
cada muestreo.
47
Figura 1. Vereda Horno y Vivas, Municipio de la Floresta, 1998 Agustin codazzi.
Figura 2. Muestreo cultivo vid.
Cultivo VID
MUNICIPIO LA FLORESTA (BOYACA)
48
5.2.1 TRANSPORTE
Las muestras fueron transportadas con las precauciones necesarias desde el
municipio de la Floresta a Santa Fe de Bogotá, en un tiempo no mayor de 5
horas. Cada muestra de suelo rizosférico fue colocada en bolsas plásticas
cuidadosamente rotuladas para evitar confusiones y luego fueron
introducidas en una nevera de icopor, cuidando que ésta conservara los
12ºC, temperatura óptima para este tipo de muestras.
5.3 FASE DE LABORATORIO.
En el laboratorio de Microbiología de Suelos de la Pontificia Universidad
Javeriana se manipularon las muestras rizosféricas procedentes de la vereda
“Horno y Vivas”, municipio de la Floresta. El primer paso fue pesar 1 gramo
de cada una de las muestras individuales para obtener finalmente una
muestra homogénea de 26 gramos. De este pool se pesaron 11 gramos que
fueron disueltos en 99 mililitros de agua destilada estéril, el cual se agitó por
más de 10 minutos hasta lograr disolver la muestra rizosférica.
49
5.3.1 PREPARACION DE DILUCIONES DE MUESTRAS RIZOSFÉRICAS.
De la suspensión homogénea, se lograron obtener las siguientes diluciones
seriadas 10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9 de la siguiente manera:
1 ml
5.3.2 CULTIVO.
Se midieron 0.1 mililitro de cada una de estas diluciones y se inocularon por
duplicado para cada uno de los muestreos en las cajas de petri con los
medios de cultivo para cada microorganismo: Agar Nutritivo (AN); (Anexo
A) para bacterias totales, Agar Avena (AAv); (Anexo B) para actinomycetes y
Agar Papa Dextrosa (PDA); (Anexo C) para hongos. Las cajas de petri con
AAv y PDA, fueron incubadas a temperatura ambiente de 7 a 9 días, las
cajas de petri con AN, se incubaron a 35ºC de 24 a 48 horas, en el
Laboratorio de Microbiología de Suelos.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
99 ml de agua destilada estéril. 11 gr muestra Rizosferica. 10-1
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
9 ml agua
destilada estéril
50
5.3.2.1 RECUPERACION DE BACTERIAS.
5.3.2.1.1 RECUPERACION DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.
Se sembraron 0.1 ml de las diluciones 10-7, 10-8 y 10-9 por duplicado en
cajas de petri con AN para bacterias totales con un pH de 7.0.
Las cajas se marcaron con las letras A y B diferenciándose una de la otra por
la dilución inoculada. Para finalizar, se incubaron a 35ºC de 24 a 48 horas,
siendo revisadas continuamente, con el fin de repicar las cepas obtenidas.
Luego de haber recuperado un número determinado de bacterias, se
mantuvieron en AN por medio de continuos repiques; evitando así
contaminaciones y aumentando las posibilidades de mantener cepas
jóvenes.
5.3.2.1.2 RECUPERACION DE ACTINOMYCETES.
Se sembró 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7, por duplicado en
cajas de petri con AAv pH 7.2, preparado en el laboratorio. Cada caja
marcada con las letras A y B diferenciándose cada una de estas por la
dilución inoculada. Estas cajas se incubaron a temperatura ambiente por 7
días revisadas diariamente; con el fin de hacer repiques tan pronto crecían
51
los microorganismos evitando crecimiento masivo y así mantener cepas
puras.
Luego de haber recuperado un número determinado de actinomycetes, se
mantuvieron en AAv por medio de continuos repiques; evitando así
contaminaciones y aumentando las posibilidades de mantener cepas
jóvenes.
5.3.2.2 RECUPERACION DE HONGOS.
Se sembraron 0.1 ml de las diluciones 10-4, 10-5,10-6 y 10-7 por duplicado en
cajas de petri con PDA, a pH 6.5, para evitar el crecimiento de bacterias. Las
cajas se marcaron con las letras A y B diferenciándose una de la otra por la
dilución inoculada. Para finalizar, se incubaron a temperatura ambiente de 7
a 9 días siendo revisadas continuamente, con el fin de repicar las cepas
obtenidas.
Luego de haber recuperado un número determinado de hongos, se
mantuvieron en PDA por medio de continuos repiques; evitando
contaminaciones y aumentando las posibilidades de mantener cepas
jóvenes.
52
5.4 IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS.
5.4.1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS.
5.4.1.1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.
Luego de los continuos repiques se recuperaron las diferentes colonias
bacterianas; realizándose una descripción macroscópica y microscópica. La
descripción macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias:
talla, aspecto, elevación, borde, color, apariencia, densidad y consistencia.
En cuanto a la descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la
tinción de Gram (Anexo D) y la coloración de Wayson (Anexo E), llevando
acabo la precisión de los tiempos de exposición de los colorantes frentes al
extendido microbiano.
Por consiguiente, después de tener las bacterias puras, identificadas macro y
microscópicamente se procedió a la identificación de especie de cada una de
éstas; por medio de pruebas bioquímicas.
Se montaron para bacterias Gram positivas pruebas bioquímicas por el
método de BBL CRYSTAL Identification Systems Rapid Gram-Positive ID Kit
(Anexo F), este es un método de identificación en miniatura que utiliza
sustratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos modificados. Para
53
bacterias Gram negativas se montó el api 20 E (Anexo G) Sistema de
Identificación de Enterobacterias y otros Bacilos Gram negativos, este es un
sistema que utiliza 23 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados. Se
montaron pruebas bioquímicas adicionales como: D-xylosa, D-fructosa e
Inositol.
5.4.1.2 IDENTIFICACION DE ACTINOMYCETES.
Luego de los continuos repiques se recuperaron las diferentes colonias de
actinomycetes; realizándose una descripción macroscópica y microscópica.
La descripción macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias:
tamaño, forma, elevación, borde, color, apariencia, densidad y consistencia
(ROMANO, 1989).
En cuanto a la descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la
tinción de Gram (Anexo H) y la coloración de Ziehl Nielsen (Anexo I). Una
minuciosa revisión a estos extendidos microbianos y la utilización de
referencias como Bergey`s nos condujo al género de cada actinomycete
(WILLIAMS, 1984).
Por consiguiente, después de tener los actinomycetes puros, identificados
macro y microscópicamente se procedió a la identificación de especie de
cada uno de éstos; por medio de pruebas bioquímicas.
54
Se montaron pruebas bioquímicas por el método de BBL CRYSTAL
Identification Systems Rapid Gram Positive ID Kit, este es un método de
identificación en miniatura que utiliza sustratos convencionales, fluorogénicos
y cromogénicos modificados los cuales dan un resultado más preciso y
amplio para la identificación de especies microbianas. Adicionalmente se
realizaron pruebas de D-xylosa, D-fructosa e Inositol.
5.4.2 IDENTIFICACION DE HONGOS.
Luego de los continuos repiques se recuperaron los diferentes hongos;
realizándose una descripción macroscópica y microscópica. La descripción
macroscópica, se elaboró en términos físicos de las colonias: aspecto, color,
borde, crecimiento, exudación, reverso, pigmento y olor. En cuanto a la
descripción microscópica, se utilizó la técnica tradicional de la tinción de Azul
de Lactofenol (Anexo J) (GILMAN, 1991).
A diferencia de los actinomycetes y bacterias, los hongos pueden ser
identificados mediante observación al microscópio alternada con la ayuda
comparativa de claves especializadas, como la clave de Barnett
(ALEXOPOULOS, 1989).
55
5.5 PROCESO DE LIOFILIZACION.
La preparación del inóculo, se considera el punto crítico principal del proceso
de liofilización, pues deben tenerse todas las condiciones de esterilidad para
que garanticen que al realizar la recuperación de los liofilizados, sólo se va a
obtener el microorganismo deseado, libre de contaminantes (BRAVO, 1998).
Este proceso se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental de
la Pontificia Universidad Javeriana. El esquema utilizado en el método de
liofilización para la conservación de microorganismos fue el siguiente:
• Preparación del inóculo para liofilizar.
a) Se esteriliza adecuadamente el material que se va a utilizar, se rotulan los
frascos con el nombre completo del microorganismo y se parte de un
cultivo axénico ya sea de hongos miceliales y bacterias.
b) Si son bacterias, con un asa redonda se toma una colonia aislada del
cultivo y se emulsiona en el frasco de vidrio correspondiente, en 4 ml. de
agua estéril.
c) Para hongos miceliales; se toma con una pipeta 4 ml. de la muestra
(suspensión de conidias en caldo Papa Dextrosa) y se lleva al frasco
estéril correspondiente.
56
d) Para hongos miceliales y bacterias; se toma 1 ml. del frasco con el
inóculo y se lleva a otro frasco que está destinado para la toma de la
muestra del conteo en cámara de Neubauer.
e) Se adiciona a cada muestra de 2 a 3 ml de leche descremada al 15%
que ha sido previamente esterilizada, y se lleva a precongelar a -70ºC
ubicando los frascos oblicuamente.
f) Para validar este método, se realizan los liofilizados por duplicado de
cada microorganismo y se recupera uno de los mismos para verificar que
se halla el microorganismo deseado en el inóculo que se preparó así
como la viabilidad del mismo (BRAVO, 1998).
• Liofilización
a) Precongelamiento de la muestra
b) Precalentamiento del liofilizador (se utilizó un liofilizador LABCONCO,
MODELO 77500-00P, SERIE 708245).
c) Se llevan las muestras precongeladas a – 70ºC.
d) Se conecta las muestras al liofilizador.
e) Tiempos (bacterias y actinomycetes 12 horas), (hongos 15 horas)
f) Se cierra la válvula de las muestras a retirar.
g) Se apaga la bomba de vacío, desocupando el contenido de las
mangueras.
57
h) Los cultivos liofilizados, son estables por unas semanas a temperatura
ambiente, para conservarlas de 6 a 8 meses se deben mantener de 4 a
6 ºC y por más tiempo a -20 ºC (BRAVO, 1998).
5.6 ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO.
El Cepario ha sido organizado con el fin de otorgar al departamento de
Microbiología y a los estudiantes de la Pontificia Universidad Javeriana la
facilidad de poder adquirir las cepas de los diferentes microorganismos que
predominan en los suelos de los cultivos de vid de Vitis vinífera L. de la
variedad Riesling X Sylvaner.
En este banco de cepas, cada una de éstas ha sido ordenada por medio de
un código de dos letras, donde la primera de éstas es mayúscula y la
segunda es minúscula, de la siguiente manera:
♦ Para las bacterias es Bt.
♦ Para los actinomycetes es Ay.
♦ Para los hongos el código es Hn.
58
Después de ser clasificado por letras a cada microorganismo, se le ha
otorgado un número secuencial de tal forma que a través del tiempo se siga
este orden evitando confusiones y repeticiones.
Finalmente, se creó un manual para el cepario con el registro de cada una de
las cepas, con su respectivo índice fotográfico.
5.7 ANALISIS ESTADISTICO.
En esta etapa del estudio se hizo un análisis de distribución porcentual de la
densidad microbiológica utilizando los recuentos, para posteriormente
realizar una comparación con los porcentajes normales de la carga
microbiana en muestras de suelo.
59
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES.
Como resultado de los métodos empleados en el transcurso de este estudio
para el aislamiento, identificación y caracterización de los microorganismos a
nivel rizosférico del cultivo de vid Vitis vinífera L. sembrados con la variedad
Riesling x Sylvaner se obtuvo una diferencia en los recuentos realizados.
Tabla 4.
Tabla 4. Recuentos microbiológicos de los tres muestreos en el cultivo vid.
CULTIVO VID Agar nutritivo Agar Avena Agar Papa dextrosa
Muestreo 1 12 x 109 UFC 22 x 107 UFC 21 x 107 UFC
Muestreo 2 13 x 109 UFC 24 x 107 UFC 19 x 107 UFC
Muestreo 3 12 x 109 UFC 31 x 107 UFC 25 x 107 UFC
Los resultados de los recuentos microbiológicos, permiten deducir que no se
encuentran grandes diferencias en los tres muestreos, indicando que las
condiciones ambientales prevalecieron durante el periodo estudiado. Para el
óptimo desarrollo de la vid y de su producto, la uva, se necesitan
prolongadas estaciones de verano, calientes y secas, e inviernos fríos. Estas
condiciones, propias de los países con clima sub-tropical pero no de países
del trópico, donde la temperatura es similar durante todo el año.
60
Por consiguiente se deduce que la ubicación respecto al cultivo vid
estudiado, cumple con las características de un clima variable dentro del
rango de sus largos periodos de verano e invierno. Colombia
meteorológicamente hablando posee gran variedad de climas y cambios
repentinos, asegurando un desarrollo propio y óptimo en el cultivo vid de la
vereda “Horno y Vivas”. Estudios realizados en el departamento de Boyacá
(MARTINEZ, 1989) revelan que a lo largo del año es impredecible referirse al
verano o invierno, solamente en el momento en que se presentan.
La temperatura es un factor primordial, dependiendo de esta se puede
presentar una alta o baja incidencia de enfermedades fungosas; como es el
caso de las variedades que han logrado adaptarse a climas tropicales, la alta
humedad relativa que impera en esas regiones (clima tropical) permite la alta
incidencia de enfermedades fungosas limitando en forma considerable el
cultivo. Los fenómenos meteorológicos, ejercen su influencia en la vida y
desarrollo de la vid, es decir que el ciclo vital de la planta depende
principalmente de la temperatura, la cual regula las épocas de brotación,
floración, envero, etc. Se deduce que la vid no vivirá igualmente en todos los
climas, sino que existirán climas que serán más favorables para su desarrollo
y habrán otros en los cuales no podrá vivir (MARRO, 1989).
En este caso referirse al clima en el departamento de Boyacá comprueba
que la vida larga de un cultivo vid depende de esos cambios atmósfericos
61
típicos y representativos de Colombia, gracias a la ubicación tropical que
posee, razón por la que el estudio se realiza en las mismas plantas para
llegar a datos más precisos.
6.1 DESCRIPCION MACROSCOPICA.
Observando las características morfológicas de las colonias sobre las placas
de Agar se inició la identificación de microorganismos en el estudio.
En este procedimiento se obtuvieron 6 diferentes colonias para bacterias,
14 para actinomycetes y 16 para hongos. Tablas 5, 6 y 7 respectivamente.
(Figuras 3 , 4 y 5 respectivamente).
Tabla 5. Descripción macroscópica de Bacterias.
BACTERIAS
MORFOLOGIA AGAR NUTRITIVO
Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 Colonia 4 Colonia 5 Colonia 6
Tamaño Grandes Medianas Medianas Medianas Pequeñas Pequeñas
Aspecto Rizoides Circulares Circulares Circulares Circulares Circulares
Elevación Planas Convexas Convexas Convexas Convexas Convexas
Borde Irregulares Regulares Regulares Regulares Regulares Regulares
Color Blancas Blancas Blancas Blancas Crema Amarillas
Apariencia Cremosas Lisas Cremosas Lisas Cremosas Cremosas
Densidad Opacas Opacas Brillantes Opacas Opacas Brillantes
Consistencia Membranosas Membranosas Viscosas Membranosas Viscosas Viscosas
62
Bt. 1 Bt. 2
Bt. 3 Bt. 4
Bt. 5 Bt. 6
Figura 3. Macroscopía Bacteriana. Agar Nutritivo. 24-48 horas. 35ºC.
63
Tabla 6. Descripción macróscopica de Actinomycetes.
ACTINOMYCETES
AGAR AVENA
PAUTAS Tamaño Forma Elevación Borde Color
directo reverso
Densidad Consistencia
Colonia 1 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Café Café
Opacas Pulverulentas
Colonia 2 Grandes Circular Convexas Entero Crema Blanco
Opacas Pulverulentas
Colonia 3 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Rosado Crema
Opacas Pulverulentas
Colonia 4 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Crema Blanco
Opacas Pulverulentas
Colonia 5 Medianas Irregulares Convexas Ondulado Rosado Rosado
Opacas Pulverulentas
Colonia 6 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Rosado Crema
Opacas Pulverulentas
Colonia 7 Pequeñas Irregulares Umbeliformes Ondulado Rosado Rosado
Opacas Pulverulentas
Colonia 8 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Rosado Gris
Opacas Pulverulentas
Colonia 9 Pequeñas Circulares Convexas Entero Violeta Café
Opacas Membranosas
Colonia 10 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Gris Café
Opacas Pulverulentas
Colonia 11 Medianas Irregulares Umbilicadas Ondulado Gris Café
Opacas Pulverulentas
Colonia 12 Pequeñas Irregulares Convexas Entero Rosado Rosado
Opacas Pulverulentas
Colonia 13 Grandes Irregulares Monticulares Ondulado Gris Café
Opacas Pulverulentas
Colonia 14 Pequeñas Irregulares Convexas Entero Blanco Crema
Opacas Pulverulentas
De la anterior tabla las colonias que presentaron pigmento difusible al medio
fueron: Ay. 1 color rosado, Ay. 3 color café, Ay. 7 color rosado.
64
Ay. 1 Ay. 2 Ay. 3 Ay. 4
Ay. 5 Ay. 6 Ay. 7 Ay. 8
Ay. 9 Ay. 10 Ay. 11 Ay. 12
Ay. 13 Ay. 14
Figura 4. Macroscopia de Actinomycetes. Agar Avena. 7-9 días. Temperatura ambiente.
65
Tabla 7. Descripción macroscópica de Hongos.
HONGOS
AGAR PAPA DEXTROSA
Colonias Aspecto Color Borde Crecimiento Exudación Reverso Pigmento Difusible
Olor
Colonia 1 Pulverulentas Verde olivo Definido Radial No produce Sin color No produce No presenta
Colonia 2 Lanosas Café-negro Definido Radial No produce Negro cordones
miceliales
No produce No presenta
Colonia 3 Algodonosas Rosado Definido Radial No produce Rosado No produce No presenta
Colonia 4 Algodonosas Curuba Definido Radial No produce Amarillo-
curuba
No produce Dulce
Colonia 5 Algodonosas Rosado Definido Radial Pequeñas de
color rosado
Durazno-
rosado
No produce Dulce
Colonia 6 Lanosas Blanco
verdoso
Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta
Colonia 7 Lanosas Rosado
grisáceo
Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta
Colonia 8 Algodonosas Amarillo-
rosado
Definido Radial No produce Rosado-rojo No produce Mohoso
Colonia 9 Pulverulentas Amarillo-
rosado
Irregular Radial Granulacion
rosada
Rosado-rojo Rosado-rojo No presenta
Colonia 10 Pulverulentas Verde
oscuro
Irregular Circular
pequeñas
Verde claro Blanco No produce No presenta
Colonia 11 Lanosas Amarillo
verdoso
Definido Radial No produce Sin color No produce Dulce
Colonia 12 Pulverulentas Amarillo
verdoso
Definido Radial No produce Rosado-rojo No produce Pronunciado
a tierra
Colonia 13 Pulverulentas Verde olivo Definido Radial Incoloras Sin color No produce Pronunciado
a tierra
Colonia 14 Algodonosas Blanco Definido Radial No produce Blanco No produce No presenta
Colonia 15 Lanosas Blanco Definido Radial Amarillo Blanco No produce No presenta
Colonia 16 Algodonosas Blanco-
amarillo
pálido
Irregular Radial No produce Sin color No produce No presenta
66
Hn. 1 Hn. 2 Hn. 3 Hn. 4
Hn. 5 Hn. 6 Hn. 7 Hn.8
Hn. 9 Hn. 10 Hn. 11 Hn. 12
Hn. 13 Hn. 14 Hn. 15 Hn. 16
Figura 5. Macroscopía de Hongos. Agar Papa Dextrosa. 7-9 días. Temperatura ambiente.
67
6.2 DESCRIPCION MICROSCOPICA
Para continuar la caracterización de las colonias, la coloración de Gram
reconoció las características bioquímicas de la pared celular microbiana,
facilitando la clasificación morfológica. Adicionalmente la coloración de
Wayson ratificó la presencia de esporas en el género Bacillus, esto en cuanto
bacterias. Tabla 8.
Referido a actinomycetes complementaria a la coloración de Gram se realizó
la coloración de Zielh Nielsen evidenciando la presencia del género Nocardia.
Tabla 9. En cuanto los hongos su morfología fue evidenciada con la
coloración de Azul de Lactofenol. Tabla 10. Figuras (6,7 y 8).
Tabla 8. Caracterización microscópica por coloración de Gram y Wayson (Bacterias).
BACTERIAS
Colonia 1 Bacilos Gram positivos. Espora cilíndrica terminal
Colonia 2 Bacilos Gram positivos. Espora oval terminal
Colonia 3 Bacilos Gram positivos
Colonia 4 Bacilos Gram positivos
Colonia 5 Bacilos Gram negativos
Colonia 6 Cocos Gram positivos
68
Bt. 1 Bt. 2
Bt. 3 Bt. 4
Bt. 5 Bt. 6
Figura 6. Microscopía Bacteriana. En aumento de 100X con aceite de inmersión.
69
Tabla 9. Caracterización microscópica por coloración de Cristal Violeta y Ziehl Nielsen (Actinomycetes).
ACTINOMYCETES
Colonia 1 Hifas septadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes
Colonia 2 Hifas septadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes
Colonia 3 Hifas delgadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes
Colonia 4 Hifas delgadas Gram positivas, ácido alcohol resistentes
Colonia 5 Hifas irregulares septadas Gram positivas
Colonia 6 Hifas septadas Gram positivas esporulada
Colonia 7 Hifas irregulares septadas multiesporuladas Gram positivas
Colonia 8 Hifas cortas septadas esporuladas Gram positivas
Colonia 9 Hifas cortas septadas esporuladas en espiral Gram positivas
Colonia 10 Hifas largas septadas, espiraladas, esporuladas Gram positivas
Colonia 11 Hifas escasas cortas, septadas Gram positivas
Colonia 12 Hifas largas septadas, espiraladas, esporuladas Gram positivas
Colonia 13 Hifas largas septadas, espiraladas, esporuladas Gram positivas
Colonia 14 Hifas largas septadas, multiesporuladas Gram positivas
70
Ay. 1 Ay. 2 Ay. 3 Ay. 4
Ay. 5 Ay. 6 Ay. 7 Ay. 8
Ay. 9 Ay. 10 Ay. 11 Ay. 12
Ay. 13 Ay. 14 Figura 7. Microscopía de Actinomycetes. En aumento de 100X con aceite de inmersión.
71
Tabla 10. Caracterización microscópica por coloración de Azul de lactofenol (Hongos).
HONGOS
Colonia 1 Conidióforo largo terminado en gran vesícula en forma de clava, presenta cadena de conidios
esféricos.
Colonia 2 Hifas septadas de color amarillo castaño, conidiofóros doblados y engrosados en los puntos de
unión con los conidios, macroconidios divididos en cuatro células por septos transversales
apariencia curvada.
Colonia 3 Hifas hialinas septadas, notoria clamidospora, macroconidios multicelulares en forma de
banana.
Colonia 4 Hifas septadas y ramificadas conidias cilíndricas
Colonia 5 Hifas hialinas septadas, conidioforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten
de esterigmas largos.
Colonia 6 Hifas hialinas septadas, conidióforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten
de esterigmas largos.
Colonia 7 Hifas hialinas septadas, conidióforo ramificado en forma de pincel, conidios ovales que parten
de esterigmas largos.
Colonia 8 Hifas hialinas, septadas, conidioforos con fiálides ramificadas en forma de pincel, conidios
esféricos en cadenas.
Colonia 9 Hifas hialinas, septadas, conidios en forma de globo, fiálide en forma de frasco.
Colonia 10 Hifas hialinas, septadas, conidioforos con fiálides cilíndricas, conidios esféricos en cadenas.
Colonia 11 Hifas hialinas, septadas, conidióforos ramificando de tres a seis fiálides, conidios subglobosos
esféricos en cadenas.
Colonia 12 Hifas hialinas, septadas, conidióforos ramificando fiálides, conidios s esféricos en cadenas.
Colonia 13 Hifas finas, ramificadas, tabicadas irregularmente, partes filamentosas, esféricas.
Colonia 14 Hifas finas, ramificadas, tabicadas irregularmente, partes filamentosas, esféricas.
Colonia 15 Hifas largas delgadas, franjas combinadas poco septada.
Colonia 16 Hifas septadas, conidiófors erectos septados o ramificados, ramas verticiladas.
72
Hn. 1 Hn. 2 Hn. 3 Hn. 4
Hn. 5 Hn. 6 Hn. 7 Hn. 8
Hn. 9 Hn. 10 Hn. 11 Hn. 12
Hn. 13 Hn. 14 Hn. 15 Hn. 16
Figura 8. Microscopía de Hongos. En aumento de 40 X.
73
6.3 PROMEDIO GENERAL DE LOS MICROORGANISMOS
ENCONTRADOS
La distribución microbiana se encontró en una proporción porcentual donde
el estudio inferencial adoptó el muestreo aleatorio simple para la estimación
de la prevalencia de cada microorganismo, (Anexo K) evidenció el 16.7%,
38.9 % y el 44.4 % para bacterias, actinomycetes y hongos respectivamente.
Figura 9.
Figura 9. Distribución porcentual según Microorganismos.
Esta prevalencia microbiana permite inferir que la comparación de los
microorganismos con el entorno, depende de las características propias del
suelo refiriéndonos exclusivamente a las características de las muestras
extraídas del cultivo vid.
Por lo que se deduce, que la acidez del suelo hace que la manifestación
bacteriana sea en menor proporción relacionada con los otros
DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE MICROORGANISMO
38.9%
16.7 %
44.4 %
Actinomycetes
Bacterias
Hongos
74
microorganismos, debido a que la pared celular es atacada líticamente
usufructuando al peptidoglicano el cual es responsable de la resistencia
mecánica de la pared, dejando a las bacterias en una forma hipertónica; y de
esta forma las únicas bacterias capaces de resistir, son aquellas que crean
estructuras o interrelaciones microbianas para aceptar los cambios en el
entorno donde estas participan (ALEXOPOULOS, 1976).
Por ser un microorganismo intermedio entre bacterias y hongos, los
actinomycetes pueden resistir rangos amplios de pH, gracias a la creación de
mecanismos como sus conidias, este comportamiento en el presente estudio
se manifiesta ayudado por la humedad que el suelo del cultivo vid tiene
como característica en las zonas tropicales (STANLEY, 1994) .
Haciendo referencia a los hongos, el suelo de cultivos vid cumple las
características principales en cuanto acidez y humedad, por lo que estos
microorganismos se encuentran en mayor proporción coherentemente con
los resultados obtenidos (NOVO & MAYEA 1991). La acidez en los tres
muestreos mostró un rango entre 5.5 y 5.7 en el cultivo vid y la humedad en
un 40 % frente al peso seco de 10 g de suelo analizado en cada muestreo.
Cabe mencionar que la interrelación microbiana puede ser un punto
desfavorable para la reproducción de bacterias, donde los actinomycetes y
75
los hongos inducen reacciones adversas; por la producción de antibióticos y
enzimas que ataquen a estos microorganismos (ROMANO, 1989).
6.4 CARACTERIZACION BIOQUIMICA
Para corroborar la clasificación taxonómica de nuestro grupo de
microorganismos la serie de bioquímicas realizadas se muestran en las
tablas 11, 12 y 13., para bacterias y actinomycetes.
Tabla 11. Bioquímicas para Bacterias Gram positivas.
BIOQUÍMICAS Bt.1 Bt.2 Bt.3 Bt.4 Bt.6
Arginina Débil Neg. Neg. Neg. Débil
Fosfato Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.
L – Valina – AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
L – arabinosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
D – manitol Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.
Trehalosa Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.
o–nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) y p–nitrofenil-β-D-glucósido Neg. Débil Neg. Neg. Pos.
p-nitrofenil-β-D-glucósido Neg. Neg. Neg. Pos. Pos.
Úrea Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
4MU-β-D-glucósido Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.
Na Neg. Pos. Neg. Pos. Pos.
L-ácido piroglutámico-AMC Pos. Neg. Neg. Neg. Neg.
L-Fenilalanina-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.
Maltosa Neg. Neg. Débil Pos. Neg.
– galactosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
Manosa Neg. Neg. Neg. Pos. Pos.
p-nitrofenil-α-D-glucósido Pos. Neg. Neg. Pos. Pos.
p-nitrofenil-fosfato Pos. Pos. Neg. Pos. Pos.
Esculina Neg. Pos. Neg. Pos. Neg.
Prolina-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.
4MU-β-D-celobiósido Neg. Neg. Neg. Pos. Neg.
Triptófano-AMC Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.
D – glucosa Neg. Neg. Pos. Pos. Neg.
Dextrina Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
N-acetil-D-glucosamina Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
Maltotriosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
p-nitrofenil-β-D-celobiósido Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
p-nitrofenil-β-D-galactósido y p-nitrofenil-α-D-galactósido Neg. Neg. Neg. Neg. Pos.
Ornitina Pos. Pos. Pos. Pos. Pos.
D- xylosa Neg. Neg. Neg. Neg. Neg.
D – fructosa Neg. Neg. Pos. Pos. Pos.
Inositol Débil Neg. Neg. Neg. Neg.
76
Tabla 12. Bioquímicas para Bacterias Gram negativas.
BIOQUÍMICAS Bt.5
Arginina Positivo
Lisina Positivo
Ornitina Positivo
Citrato – sódico l Débil
Tiosulfato sódico Débil
Úrea Débil
Triptófano Débil
Triptófano indol Débil
Piruvato sódico Débil
Hidrólisis de gelatina Positivo
Glucosa Positivo
Manitol Positivo
Inositol Positivo
Sorbitol Positivo
D – ribosa Negativo
Sacarosa Positivo
Melibiosa Positivo
Arabinosa Positivo
Amigdalia Positivo
77
78
En cuanto a los hongos, la clave de Barnett y la clave de Hoekstra identifica a
estos por su morfología. Consta de un estudio minucioso de las estructuras
fructíferas ayudado microscópicamente. Con solo su morfología es mas
complejo determinar las especies con excepción del género Penicillium,
pues este cumple requisitos en sus formas dentro de la clave de Barnett,
dando como única opción a los restantes Hongos encontrados, la clásica
descripción sp.
Tabla 14.
Tabla 14. Descripción de Hongos para identificación de especies dentro del género Penicillium .
HONGO DESCRIPCIÓN MICROSCÓPICA
Hn.8 Estructuras conidiógenas, conidioforos de dos a tres niveles de ramificación , metula dando lugar
3 a 6 fiálides en forma de frasco con cuellos pequeños. Conidias en cadenas enredadas,
globosas y subglobosas, hialino ligeramente verde.
Hn.9 Conidioforos ramificadaos. Fiálides en forma de botella. Conidias producidas en columnas de
forma globosa y subglobosa.
Hn.10 Fiálides en forma de frasco. Conidias subglosas elipsoidales, lisas.
Hn.11 Conidioforo hialino de dos a tres ramas, con las ramas usualmente presionadas sobre el eje
principal, paredes lisas, algunas asperas, fiálides cilíndricas con cuello corto pero distinguido,
conidias verdes, de paredes lisas, globosas, subglobosas y elipsoidales.
Hn.12 Conidioforo surgiendo de hifas aéreas en una sola rama,formados por una pared lisa que termina
en un conjunto de tres a cinco metulas, terminando de tres a seis fiálides. Conidios subglobosos,
elipsoidales, lisos.
Hn. 13 Conjunto de conidioforos mezclados con conidioforos fasciculados, producidos en áreas
marginales, color verde oscuro. El micelio aéreo vegetativo ausente. Conidioforo de dos a tres
ramas, paredes ásperas, fiálides en forma de frascos, con cuellos cortos pero distintos. Conidias
globosas, subglobosas y elipsoidales.
79
Al evidenciar bioquímicamente a las bacterias y a los actinomycetes se
ratifica la similitud que hay entre estos dos microorganismos, pues las
pruebas demuestran que estos pueden compartir un mismo hábitat y
simultáneamente llevar relaciones mutuas como antagonismo o
protocooperación, beneficiándose entre ellas o beneficiando el entorno; sin
excluir el alto porcentaje de hongos encontrado, el cual debe estar en la
misma circunstancia formándose un consorcio microbiano dentro del cultivo
vid. Lo único que se puede encontrar como desventaja entre los
microorganismos es la competencia por el sustrato haciendo que unos de
ellos se adapten y otros mueran.
6.5 MICROORGANISMOS CARACTERIZADOS.
Al cumplir la metodología se encuentra un listado de géneros microbianos y
sus especies; esto respecto a bacterias (tabla 15) y actinomycetes (tabla 16)
con ayuda de las pruebas bioquímicas y para hongos con la clave de Barnett.
(Tabla 17).
80
6.5.1 BACTERIAS
6.5.1.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS.
Tabla 15. Caracterización de Bacterias.
COLONIA BACTERIAS
1 Bacillus azotoformans
2 Bacillus subtillis
3 Lactobacillus fructivorans
4 Lactobacillus minor
5 Pseudomonas mallei
6 Staphylococcus capitis
6.5.1.2 ACTINOMYCETES
Tabla 16. Caracterización de Actinomycetes
COLONIA ACTINOMYCETES
1 Nocardia asteroides
2 Nocardia autotrophica
3 Nocardia brasiliensis
4 Nocardia carnea
5 Streptomyces cinnamonensis
6 Streptomyces gobitricini
7 Streptomyces laurentii
8 Streptomyces lavendofoliae
9 Streptomyces mauvecolor
10 Streptomyces nojiriensis
11 Streptomyces pulveraceus
12 Streptomyces roseoflavus
13 Streptomyces sannanensis
14 Streptomyces somaliensis
81
6.5.2 HONGOS.
Tabla 17. Caracterización de Hongos.
COLONIA HONGOS
1 Aspergillus sp.
2 Curvularia sp.
3 Fusarium sp.
4 Geotrichum sp.
5 Paecilomyces sp.1
6 Paecilomyces sp.2
7 Paecilomyces sp.3
8 Penicillium camemberty
9 Penicillium citrium
10 Penicillium corylophilum
11 Penicillium expansum
12 Penicillium funiculosum
13 Penicillium verrucosum
14 Pythium sp.
15 Sclerotium sp.
16 Verticillium sp.
82
6.6 DISTRIBUCION PORCENTUAL DE LOS GENEROS DE CADA
MICROORGANISMO
Determinadas las especies de las bacterias, actinomycetes y hongos (figuras
10, 11 y 12 respectivamente) nos inferimos en la comparación en cuanto a la
frecuencia en que se presenta cada uno (Anexos L, M y N); involucrando las
características del hábitat estudiado.
6.6.1 BACTERIAS NO FILAMENTOSAS Y ACTINOMYCETES.
Figura 10. Promedio porcentual de Bacterias no filamentosas.
DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN EL TIPO DE BACTERIA
Bt.126%
Bt.212%
Bt.38%
Bt.424%
Bt.518%
Bt.612%
DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE ACTINOMYCETE
Ay.148%
Ay.16%
Ay.27%
Ay.37%
Ay.47%
Ay.512%
Ay.65%Ay.7
7%
Ay.126%
Ay.135%
Ay.811 %
Ay.118 %
Ay.105%
Ay.96%
83
Figura 11. Promedio porcentual de Actinomycetes.
6.6.2 HONGOS
Figura 12. Promedio porcentual de Hongos
Se sabe que en un 80% las enfermedades de las plantas son causadas por
hongos, y a pesar del uso de fungicidas y otros métodos de control, la
pérdida económica debida a la actividad de los hongos sigue siendo enorme.
Por otro lado, las pérdidas de cosechas causadas por bacterias fitopatógenas
son de menor importancia que las causadas por hongos, ya que la densidad
poblacional de los hongos fue mayor en este estudio.
Cualquiera que sea el agente etiológico causante de la enfermedad es fácil
reconocerlo debido a la gran diferencia de cada uno en la manifestación de
los síntomas, evolución de la enfermedad y órganos que afecta.
DISTRIBUCION PORCENTUAL SEGUN TIPO DE HONGO
Hn.165%
Hn.154%
Hn.117%
Hn.124%
Hn.136%
Hn.146%
Hn.102%
Hn.915%
Hn.89%
Hn.66%
Hn.55%
Hn.413%
Hn.36%
Hn.25%Hn.1
5%
Hn.72%
84
Se considera de gran importancia tener claro cuáles microorganismos
(bacterias y hongos) podrían ocasionar enfermedades en las plantas para
tomar medidas preventivas que aseguren el futuro de los cultivos vid, con el
fin de obtener frutos sanos; materia prima para la elaboración final del
producto.
En este estudio se resalta la microflora que allí habita, los beneficios que
puede brindar al cultivo, o si por el contrario en un momento dado causaría
daño a las plantaciones.
Se obtienen microorganismos aislados e identificados preliminarmente,
donde se encontró por revisión bibliográfica que muchos de estos pueden
estar relacionados con alteraciones de la fisiología normal de las plantas;
afectando diversos órganos vitales para su desarrollo (ALEXOPOULOS,
1989)
Algunas especies de Pythium y Fusarium (representados en el promedio
porcentual de este estudio en 5% para los dos) producen podredumbre por
exceso de humedad en las semillas; esto puede ocurrir antes o después de
emerger la planta. En el primer caso, las plantas no consiguen emerger del
suelo, mientras que en las infecciones que se producen después de emerger,
las plantas se colapsan justo por encima de la superficie del suelo. En
ambos casos los hongos consiguen que la planta se pudra, debido a la
85
producción de enzimas pépticas (ALEXOPOULOS, 1989) por tal razón se
encuentran algunos frutos reportados con estas características de
podredumbre.
Ciertas especies de los géneros Verticillium y Fusarium , (cuyos promedios
son 5% para los dos en este estudio) causan graves enfermedades en
plantas debido a la capacidad de bloquear los vasos del xilema conductores
del agua (ALEXOPOULOS, 1989) estos patógenos infectan un amplio rango
del cultivo vid. Casi siempre las esporas de los hongos son transmitidas por
un escarabajo vector, y tanto las esporas como el micelio bloquean los vasos
e impiden el flujo de agua, conduciendo así a la desecación y muerte de la
corteza, seguida de una infección generalizada y por último la muerte. Estos
vectores naturales se encuentran no de una forma masiva, pero si en una
cantidad donde algunas plantas se ven afectadas por falta del consumo del
agua, esta principal característica se notó por la resequedad de sus raíces y
tallos (HARVEY, 1976).
Varias especies de Aspergillus (cuyo porcentaje es de 5%) producen
sustancias tóxicas (micotoxinas) que pueden ocasionar daños a un nivel
sistémico. Las especies de Aspergillus son más importantes en medicina
porque causan enfermedades de órganos internos denominadas
colectivamente aspergilosis. Hay infección de los pulmones y produce
síntomas muy similares a los de la tuberculosis, anteriormente las infecciones
86
causadas por este hongo fueron diagnosticadas incorrectamente como
tuberculosis y se trataron con agentes antibacterianos, consiguiendo
resultados fatales. Desde el punto de vista médico nos referimos a las
posibles enfermedades que pueden contraer las personas que están en
contacto directo con las plantaciones vid, los “recolectores”, a pesar que no
se han encontrado casos de estas enfermedades en el hábitat trabajado,
cabe recomendar los posibles riesgos a los que pueden estar expuestas
estas personas.
Por otro lado, está la importancia de los hongos como agentes de biocontrol
potencialmente ideales. Muchas especies saprófitas antagonizan
representantes de todos los organismos de las plagas, incluyendo los
organismos patógenos de las plantas. Ciertas especies de Gliocladium,
producen gliotoxinas y pueden ser utilizadas para proteger las plantas contra
especies patógenas de Fusarium y Verticillium, así como contra especies de
Diplodia. Un auténtico control empleando micoparasitismo puede ser
conseguido utilizando Pythium nunn el cual ataca miembros patógenos del
mismo género como Pythium ultimum.
Gracias al interés cada vez mayor de obtener métodos no químicos para
llevar a cabo el control de los patógenos de plantas, se han realizado un sin
número de investigaciones consiguiendo muy buenos resultados. En el caso
del cultivo vid no se han hecho estudios específicos, pero la importancia de
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reconocer los patógenos ayuda a la intervención del control biológico y
ampliar nuevos estudios para el mejoramiento de estos cultivos.
En el caso de las bacterias, ciertas cepas de Bacillus subtillis (12%)
producen un metabolito termoestable que muestra un amplio espectro de
actividad antifúngica. La actividad de este metabolito se compara
favorablemente con los fungicidas que hay en el mercado. La acción de los
microorganismos usados en biocontrol se debe a la capacidad para producir
metabolitos con actividad biocida. Este es el caso de muchas especies de
Streptomyces (69 %) de estos se obtienen sustancias altamente eficientes
que ayudan a controlar enfermedades en las plantas, producidas por hongos
y bacterias patógenas (LESKIW, 1999).
Hay otras bacterias que pueden estar afectando los suelos de cultivos vid
contrarrestando el fosfato necesario para el desarrollo de las plantas como el
Bacillus azotoformans (26%) el cual mineraliza el fosfato en vez de
solubilizarlo. La solución biológica a este problema se realizaría efectuando
relaciones antagónicas con otras bacterias para insertarlas en el cultivo, este
grupo de bacterias son las llamadas Bacterias Fosfato Solubilizadoras; ya
que según los resultados arrojados, el porcentaje encontrado de hongos y
actinomycetes no afectan la participación de estas bacterias (ENSING,
1990).
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Al igual sucede con las bacterias del género Lactobacillus (32%) referido a
las relaciones antagónicas, estas bacterias son de gran desventaja en cuanto
su aspersión en un cultivo vid, fermentando el fruto antes de su
procesamiento, ya que estos microorganismos son activos a pH 5.5
característica principal en el suelo estudiado (GRANT, 1989).
En cuanto a los actinomycetes, se deduce que la capacidad de distribución
en la naturaleza, especialmente en el suelo, hace que secundariamente se
encuentren en el 38.9 % en este estudio; lo resaltante es el 69% del género
Streptomyces encontrado, pues es de gran importancia debido a que se
caracteriza por ser productor potencial de antibióticos y otros metabolitos
antagonistas. Siendo un grupo heterogéneo en el que la pared celular esta
compuesta por ácido diaminopimélico y glicina, utilizan un amplio rango de
compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía, para el
crecimiento aéreo extensivo con largas cadenas de esporas ( CROSS, 1989).
Lo cual nos introduce a evidenciar que este género reduce la actividad
bacteriana, ocupando esta el último lugar de los microorganismos
encontrados, donde las bacterias que pueden estar erradicando en los
cultivos vid son aquellas que ataquen más gravemente los cultivos. Por tal
motivo se puede decir que indirectamente los actinomycetes están actuando
como control biológico en el cultivo vid.
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Actualmente no se puede hablar de desventajas que conlleven al daño de
suelos o de cosechas de cultivos vid, causadas por actinomycetes, lo único
que haría una evidencia de esto, es el estudio antagónico de los
microorganismos frente a minerales útiles para las plantas, pues ya
refiriéndonos a nivel inorgánico estos microorganismos se han catalogado
como biodegradadores y biorremediadores ante compuestos tóxicos como
benceno, xileno, y algunos metales pesados como cromo y mercurio
(GONZALEZ, 1999), (CALDERON, 1999).
La participación de los microorganismos restantes los cuales no presentan un
resultado representativo, conllevan a concluir que su densidad poblacional se
ve afectada por la producción de metabolitos y otros compuestos que los
microorganismos más representativos segregan en los suelos de cultivos vid.
6.7 ORGANIZACIÓN DEL CEPARIO.
Con la creación del cepario, no sólo se está ofreciendo facilidades para los
estudiantes, sino a la vez se les está estimulando para que indaguen más
sobre los suelos, mejorando las condiciones agronómicas y previniendo
enfermedades y plagas que pueden generar daños de considerable
importancia en los cultivos.
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Se debe tener en cuenta que con la identificación de cada uno de los
microorganismos se logra tener una visión más clara de éstos, lo cual es de
considerable importancia debido a que día a día se van conociendo los pro y
contras que pueden afectar o no las cosechas.
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7. CONCLUSIONES
§ De acuerdo con los parámetros respecto a la densidad poblacional de
microorganismos en el suelo, el promedio presentó el 16.7 % para
bacterias, el 38.9 % para actinomycetes y 44.4 % para hongos, es
importante tener en cuenta que el promedio de hongos es superior dado a
las características del suelo del cultivo vid, y acorde con las referencias
de estudios hechos en suelos.
§ A partir de las muestras evaluadas fueron aisladas cepas
correspondientes a cada género donde las pruebas bioquímicas y las
claves de identificación para hongos caracterizaron en mayor porcentaje a
Lactobacillus con un 36 % dentro de las bacterias, a Streptomyces con un
69 % dentro de actinomycetes y a Penicillium con un 40% dentro de los
hongos.
§ Los mejores promedios por género y especie identificados fueron
Lactobacillus minor con un 24%, Streptomyces cinnamonensis con un
11% y Penicillium citrium con un 15%, corroborando que los hongos
representados por este último persisten en cuanto densidad poblacional.
§ Probablemente las lesiones encontradas en el cultivo vid de La Flo resta
son ocasionadas por los microorganismos identificados como
Fusarium sp., y Pythium sp. Los cuales están referenciados como
responsables de podredumbre en los frutos y sequedad de las plantas. Y
en cuanto su fermentación antes de la colecta, es posible que su principal
protagonista sea Lactobacillus, acompañando también a los Bacillus en la
mineralización de fosfato en el suelo.
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§ Aunque el crecimiento microbiano patógeno encontrado en el cultivo
ocasionen algunas lesiones, es importante mencionar que se identificaron
otros microorganismos benéficos posiblemente contrarrestando la acción
de los primeros, gracias a la producción de antibióticos y otros
metabolitos. Estos microorganismos pueden ser de los géneros
Streptomyces y Penicillium, desarrollando un “control biológico” en el
cultivo.
§ A partir del aislamiento, la identificación y la caracterización de los
microorganismos involucrados con la rizosfera del suelo en los cultivos
vid, se organiza un cepario con su registro y manual en el Departamento
de Microbiología, contribuyendo a próximos estudios.
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8. RECOMENDACIONES.
§ Evaluar la interrelación de los microorganismos encontrados mediante
pruebas antagónicas para futuros trabajos de control biológico.
§ Utilizando la misma metodología empleada en este estudio realizar
diagnósticos frente agentes entomopatógenos que puedan estar
influyendo en los cultivos vid.
§ Sería importante realizar este estudio a nivel foliar; de tal forma que se
integre el sistema vegetativo de la planta, conociendo los diferentes
microorganismos que allí están presentes, y de esta forma llegar a
nuevas conclusiones que complementen esta investigación.
§ Se recomienda realizar este mismo estudio en diferentes regiones de
Colombia para así conocer la microflora normal de los diversos cultivos
vid a nivel Nacional.
§ Se aconseja realizar una identificación a nivel molecular, proporcionando
datos precisos que confirmen los resultados expuestos en este estudio.
§ Se considera de gran importancia crear una base de datos de
microorganismos de suelo del departamento de Boyacá, con el fin de
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conocer la microflora que predomina en los diferentes cultivos vid de esta
región, incrementando la información del cepario elaborado en este
estudio.
§ Mediante un estudio epidemiológico evaluar el riesgo del personal que
está en contacto con los cultivos de vid contaminados, para evitar
patologías.