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Máster en
Nuevos Alimentos
Modelización de procesos
enzimáticos para la
obtención de oligosacáridos
pécticos.
Ana Blanco Doval
Directores: Dra. Antonia Montilla Corredera
Carlos Sabater Sánchez
Tutor: Dr. Luis Vázquez de Frutos
Lugar de realización: Instituto de Investigación en
Ciencias de la Alimentación / Grupo de química y
funcionalidad de carbohidratos y derivados.
Tra
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o 2
017-
2018
I
ÍNDICE
I. ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... III
II. ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................................... V
III. LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................... VI
IV. RESUMEN ....................................................................................................................... VII
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1
1.1 Pectina ............................................................................................................................ 2
1.1.1. Características estructurales ............................................................................... 2
1.1.2. Fuentes naturales ................................................................................................. 3
1.1.3. Métodos de obtención .......................................................................................... 4
1.1.4. Propiedades fisicoquímicas. Usos industriales. ............................................... 6
1.1.5. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones. .............................................. 7
1.2 Oligosacáridos pécticos (POS) ................................................................................... 8
1.2.1. Estructura ............................................................................................................... 8
1.2.2. Métodos de obtención .......................................................................................... 9
1.2.3. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones .............................................. 10
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12
3. PLAN DE TRABAJO ......................................................................................................... 14
4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 15
4.1 Reactivos y muestras ................................................................................................. 15
4.2 Caracterización de los preparados enzimáticos .................................................... 15
4.2.1 Purificación de los enzimas ................................................................................ 15
4.2.2 Determinación de la actividad hidrolítica (método del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) o método de Miller) ................................................................. 15
4.2.3 Cuantificación del contenido en proteína (Método de Bradford) .................. 17
II
4.3 Obtención de oligosacáridos pécticos (POS). Diseño experimental. ................. 18
4.3.1 Diseño experimental ............................................................................................ 18
4.3.2 Optimización del diseño experimental .............................................................. 20
4.4 Análisis de los hidrolizados ....................................................................................... 21
4.4.1 Cuantificación de azúcares reductores............................................................. 21
4.4.2 Análisis cromatográfico por GC-FID ................................................................. 21
4.4.3 Análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD ...................................................... 22
4.5 Determinación de la actividad antioxidante de los POS ....................................... 23
4.6 Análisis estadístico...................................................................................................... 24
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 24
5.1 Actividad hidrolítica de los preparados enzimáticos .............................................. 24
5.2 Caracterización de los hidrolizados enzimáticos de pectina de alcachofa ........ 25
5.2.1 Liberación de azúcares reductores. Extensión global de la hidrólisis. ........ 25
5.2.2 Estudio de la fracción de carbohidratos de baja masa molecular ................ 26
5.2.3 Distribución de la masa molecular de los POS liberados .............................. 29
5.3 Optimización de la obtención de POS ..................................................................... 34
5.4 Análisis de los hidrolizados obtenidos en las condiciones óptimas .................... 37
5.4.1 Determinación de la actividad antioxidante ..................................................... 40
6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 42
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 43
III
I. ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Representación de la estructura química de pectina (Mohnen, 2008). ...................... 3
Figura 2: Plan de Trabajo ........................................................................................................ 14
Figura 3: Diagrama de reacción entre DNS y azúcares reductores (Cruz & Soler, 2014)...... 16
Figura 4: Diagrama de reacción entre Coomassie Brilliant Blue G-250 y proteínas (Mata-
Gómez, Yasui, Guerrero-Rangel, Valdés-Rodrígez & Winkler, 2012). .................................. 17
Figura 5: Representación gráfica del diseño experimental. Los valores factoriales están
representados por su correspondiente símbolo (-, +), los valores axiales se representan mediante
puntos amarillos y los valores centrales se sitúan en la intersección entre las dos líneas continuas
(CAMO, 2018). ........................................................................................................................ 19
Figura 6: Arquitectura de las ANN utilizadas para modelar la producción de POS por PUO (a)
y CAN (b). Los parámetros de entrada fueron las condiciones de reacción (pH, tiempo, cantidad
de enzima e interacciones entre los factores) y el parámetro de salida la cantidad de POS
formada con una Mm comprendida entre 100 y 0,3 kDa. Las conexiones entre los elementos
del modelo son positivas (negras) o negativas (grises) y su grosor representa la repercusión en
el mismo. I: input, O: output, H: hidden, B: bias. .................................................................... 21
Figura 7: Perfiles cromatográficos (GC-FID) de muestras de pectina hidrolizadas, (en rojo:
ensayo 8 con CAN; en azul: ensayo 2 con PUO). .................................................................... 26
Figura 8: Porcentaje de liberación de cada monosacárido cuantificado, en % con respecto a la
pectina original. ........................................................................................................................ 28
Figura 9: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de muestras de pectina hidrolizadas, (a)
ensayo 14 con CAN; b) ensayo 1 con PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada
zona del cromatograma. ........................................................................................................... 30
Figura 10: Gráficos de cajas donde se relacionan las variables estudiadas: pH (a, d), tiempo (b,
e) y cantidad de enzima (c, f) con la producción de POS con masas moleculares comprendidas
entre 100 y 0,3 kDa en cada uno de los 17 ensayos que componen los diseños experimentales
para PUO (a, b, c) y CAN (d, e, f). a,b Diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos. ...................................................................................................................................... 34
Figura 11: Gráficos de superficie para las ANN utilizadas para modelar el comportamiento de
CAN (a, b, c) y PUO (d, e, f), mostrando la influencia de las variables independientes (tiempo
y cantidad de enzima (a, d), tiempo y pH (b, e) y pH y cantidad de enzima (c, f)) sobre la
producción de POS en el intervalo 100 > Mm > 0,3 kDa. ....................................................... 36
IV
Figura 12: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de los hidrolizados obtenidos en
condiciones óptimas, (en rojo: CAN; en azul: PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a
cada zona del cromatograma. ................................................................................................... 40
V
II. ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Fuentes vegetales de pectina y su contenido (%) (Chan et al., 2017). ....................... 4
Tabla 2: Diseños experimentales. Condiciones de reacción para cada ensayo y cada variable:
pH, tiempo (h) y cantidad de enzima (Ud/g pectina). .............................................................. 19
Tabla 3: Actividad hidrolítica, contenido en proteína y actividad hidrolítica específica de los
preparados enzimáticos comerciales. ....................................................................................... 24
Tabla 4: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los carbohidratos de baja Mm presentes
en los hidrolizados enzimáticos. Se representan los valores medios de los 17 ensayos realizados
con ambos enzimas (celulasa de A. niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO)) así como el
rango de la concentración (Cc) expresada en mg/100 mg sólidos y en % respecto al total de
compuestos cuantificados……………………………………………………………………..27
Tabla 5: Resultados obtenidos mediante HPSEC ELSD de los 17 ensayos realizados con CAN.
Para cada rango de Mm (indicados en la Figura 9a) se ha calculado la Mm media en kDa, la
concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los
compuestos cuantificados. Los resultados se expresan como media y desviación estándar entre
paréntesis, (n=2). ...................................................................................................................... 31
Tabla 6: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con PUO.
Para cada rango de Mm (indicados en la Figura 9b) se ha calculado la Mm media en kDa, la
concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los
compuestos cuantificados. Los resultados se expresan como media y desviación estándar entre
paréntesis, (n=2). ...................................................................................................................... 32
Tabla 7: Parámetros estadísticos importantes, ajustes y errores de los modelos RSM y ANN.
Condiciones óptimas determinadas mediante cada modelo. .................................................... 35
Tabla 8: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los hidrolizados optimizados. La
concentración de carbohidratos (Cc) se representa en mg/100 mg de sólidos………………..38
Tabla 9: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los hidrolizados obtenidos en las
condiciones óptimas. Para cada rango de Mm se representa la Mm media en kDa, la
concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg y el porcentaje (%) frente al contenido total
de carbohidratos cuantificados. Los datos están representados como valor medio y su
desviación estándar (DE) (n=2). a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las masas
moleculares, concentraciones y los porcentajes de los distintos fragmentos determinados en los
hidrolizados con las dos enzimas…………………………………………………………...…39
VI
III. LISTA DE ABREVIATURAS
λ: Longitud de onda.
ANN: Redes neuronales artificiales.
CAN: Celulasa de Aspergillus niger.
DM: Grado de metilación.
DNS: Ácido 3,5-dinitrosalicílico.
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo.
ELSD: Detector evaporativo de dispersión de luz.
FID: Detector de ionización de llama.
GalA: Ácido galacturónico.
GC: Cromatografía de gases.
GP: Grado de polimerización.
HG: Homogalacturonano.
HM: Pectina de alto grado de metilación.
HPSEC: Cromatografía de exclusión molecular de alta eficacia.
LM: Pectina de bajo grado de metilación.
Mm: Masa molecular.
POS: Oligosacáridos pécticos.
PUO: Pectinex® Ultra Olio.
RG-I: Ramnogalacturonano I.
RG-II: Ramnogalacturonano II.
RMSE: Error de la raíz cuadrada de la media.
RSM: Método de superficie respuesta.
SCFA: Ácidos grasos de cadena corta.
VII
IV. RESUMEN
En la actualidad existe una creciente concienciación por la gestión de los subproductos
generados en la industria alimentaria debido a su alto impacto medioambiental; por ello, se
están estudiando vías de aprovechamiento y revalorización. La alcachofa es un producto que
genera un 70% de residuos, y existen estudios que indican que puede ser una interesante fuente
de pectina. Este polisacárido, y en especial los oligosacáridos pécticos derivados (POS),
presentan propiedades biológicas de gran interés, actividad prebiótica y antiproliferativa de
células cancerosas, entre otras. Por el momento, no existen estudios sobre la generación de POS
a partir de subproductos de alcachofa, por ello, en este Trabajo de Fin de Máster se han
modelizado y optimizado dos métodos de obtención enzimática a través del estudio de las
enzimas celulasa de Aspergillus niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO). Los rendimientos
y condiciones fueron, para CAN, 66 mg/100 mg de pectina a pH 4,41, 54 minutos y 17,1 Ud/g
pectina, y para PUO 62 mg/100mg de pectina a pH 6,86, 90 minutos y 520,5 Ud/g pectina. Los
productos formados tras la hidrolisis se han caracterizado de forma preliminar, concluyendo
que CAN tiende a formar POS de mayor masa molecular (Mm) (74% tiene una Mm media de
13,8 kDa) que los hidrolizados de PUO (un 35% tiene una Mm media de 8,9 kDa y otro 35%
una Mm media de 3,8 kDa), y éstos presentaban mayor actividad antioxidante.
There is an increasing consciousness about the correct management of industrial by-products
due to their high environmental impact; therefore, the food industry is developing new ways of
reuse and revalorization. Artichoke manufacture industry generates a high amount of waste
(70%), and it has been demonstrated to be an interesting source of pectin. Pectin, and especially
pectic derived oligosaccharides (POS), have shown prebiotic and cancer cell antiproliferative
properties, among others. For the moment, no research has been done about the generation of
POS from artichoke by-products, therefore, the aim of this Final Master’s Degree Project is to
model and optimize enzymatic production of POS using cellulase from Aspergillus niger
(CAN) and Pectinex® Ultra Olio (PUO) enzymes. Reaction yields and conditions were 66
mg/100 mg of pectin at pH 4.41, 54 minutes and 17.1 Ud/g pectin for CAN, and 62 mg/100mg
of pectin at pH 6.86, 90 minutes and 520.5 Ud/g pectin for PUO. Products obtained were
characterized, concluding that CAN tends to form POS with higher molecular mass (Mm) (74%
has an average Mm of 13.8 kDa), than POS from PUO (35% of 8.9 kDa and 35% of 3.8 kDa).
In addition, as a preliminary functional evaluation, PUO’s hydrolysis products showed higher
antioxidant activity.
1
1. INTRODUCCIÓN
El sector agroalimentario desempeña un papel fundamental en España, ya que se posiciona en
el primer lugar de dicho sector económico, representando el segmento de alimentación y
bebidas aproximadamente el 22% de la industria manufacturera (MAPAMA, 2018a).
Según la Comisión Europea, cerca del 33% de los alimentos producidos en Europa se desechan,
y entre un 30 y un 40% de dichas pérdidas ocurre en las etapas de producción y transformación
de productos e ingredientes (Azti Tecnalia, 2015). Muchos de estos residuos se originan a partir
de la propia materia prima, incluso antes de su transformación, por lo que contienen macro- y
micronutrientes de gran interés, los cuales se pueden recuperar y usar como ingredientes en
otros productos y matrices alimentarias, con el fin de revalorizar dichos subproductos. Los
residuos generados suponen una preocupación en el sector alimentario, no sólo por las pérdidas
económicas que puedan suponer, sino también por el impacto medioambiental que conllevan.
Por ello, desde los ámbitos de investigación y desarrollo y empresarial, se trata de buscar e
implementar técnicas de recuperación de ingredientes alimentarios a partir de dichos
subproductos, principalmente en los sectores del aceite, cárnico, pesquero y frutas y hortalizas,
que son los sectores donde más desperdicios se generan (Sigma Biotech, 2017).
Dentro de la amplia variedad de ingredientes, los considerados bioactivos son de gran interés
para la investigación e industria alimentarias. Entre ellos destacan los lípidos insaturados,
compuestos fenólicos, péptidos y carbohidratos funcionales. Los carbohidratos bioactivos, por
su efecto principalmente enfocado al correcto funcionamiento del tracto gastrointestinal,
presentan un gran interés para su uso como ingredientes alimentarios. Entre ellos podemos
destacar dos grupos: la fibra, por su capacidad para mejorar el tránsito intestinal, y los
prebióticos, por su actividad beneficiosa sobre la microbiota intestinal.
Se entiende por prebiótico aquel ingrediente alimentario no digerible que llega al colon y sirve
de sustrato a la microbiota intestinal, dando lugar a metabolitos y micronutrientes que estimulan
el crecimiento selectivo de determinadas especies colónicas beneficiosas, fundamentalmente
bifidobacterias y lactobacilos (Corzo et al., 2015). La mayoría de los prebióticos son
oligosacáridos no digeribles los cuales se obtienen bien por síntesis enzimática a partir de
disacáridos o bien por hidrólisis química o enzimática de polisacáridos, carbohidratos más
complejos. Entre los prebióticos reconocidos se encuentran los fructanos (inulina y
oligofructosa) y fructo-oligosacáridos, galacto-oligosacáridos y lactulosa (Gibson et al., 2017),
2
y entre los posibles prebióticos con evidencias científicas importantes destacan las pectinas y
los oligosacáridos pécticos (POS) obtenidos por hidrólisis de la pectina (Gerschenson, 2017).
1.1 Pectina
1.1.1. Características estructurales
Las pectinas son polisacáridos muy complejos presentes en la estructura primaria de la pared
celular vegetal, cuyos principales dominios estructurales son el homogalacturonano (HG) y el
ramnogalacturonano I (RG-I) y II (RG-II). El HG es una cadena lineal (“región lisa”) de
moléculas de ácido galacturónico (GalA) unidas por enlaces α (1-4), con una longitud de hasta
un centenar de monómeros, que pueden estar parcialmente metilados en el grupo carboxilo (C-
6), u O-acetiladas en las posiciones O-2 u O-3, aunque se pueden encontrar también otro tipo
de sustituciones con azúcares neutros como la xilosa en el O-3 (Mohnen, 2008). La “región
ramificada” está formada por los dominios RG-I y RG-II, ambos compuestos por una cadena
de unidades de ramnosa y GalA alternadas ([4-α-D-GalA-1,2-α-L-Rha-1-]n). El RG-I puede
contener ramificaciones de arabinano, galactano y arabinogalactano en la posición O-4 de los
residuos de ramnosa (Babbar, Dejonghe, Sforza & Elst, 2017), y puede presentar acetilaciones
o metilaciones muy variadas, se cree que debido a una especialización funcional. Por último, el
RG-II, que suele ser la fracción péctica menos abundante, posee la estructura más compleja,
constituida por al menos 8 unidades de GalA y ramificada con hasta 12 tipos de azúcares unidos
por más de 20 tipos de enlaces diferentes (Gullón et al., 2013; Mohnen, 2008). La proporción
de cada una de las regiones de pectina varía en función de la fuente vegetal y del método de
extracción (Yang, Mu & Ma, 2018).
Una característica estructural relevante de las pectinas es su grado de metilación (DM), definido
como el porcentaje de unidades de GalA esterificadas con grupos metilo. En la naturaleza, la
pectina suele presentar un DM hasta del 90%, dependiendo de la especie vegetal, el tejido y su
madurez. Los grupos carboxílicos libres tienen una distribución definida a lo largo de la cadena
polimérica, por lo que existen dominios diferenciados por sus unidades de GalA esterificados
y libres (Pagan, 2001). Como se verá más adelante, esta característica influye en el
comportamiento fisicoquímico de la pectina, por lo que se considera un parámetro de gran
importancia.
En cuanto a la masa molecular (Mm), es difícil establecer valores específicos debido a la gran
heterogeneidad entre distintas pectinas, pero se considera que oscila entre 100 y 700 kDa, y
depende de la longitud de la cadena y la presencia de ramificaciones (Pagan, 2001; Muñoz-
3
Almagro, Rico-Rodríguez, Villamiel & Montilla, 2018). La Mm está estrechamente relacionada
con la viscosidad, y por tanto con la gelificación de las soluciones de pectina.
Figura 1: Representación de la estructura química de pectina (Mohnen, 2008).
1.1.2. Fuentes naturales
Las fuentes de obtención de pectina son productos de origen vegetal. En la industria se extraen
principalmente a partir de subproductos de cítricos (producción de zumo), pulpa de manzana
(elaboración de zumo y sidra) y remolacha azucarera (producción de azúcar), capítulos de
girasol (tras la separación de la semilla), etc. (Pagan, 2001). El contenido de pectina en
productos vegetales varía en función del género, especie y a veces incluso de la variedad del
producto, así como su grado de maduración y la parte de la planta. En la siguiente tabla (Tabla
1) se recogen algunas de las fuentes más importantes de pectina y su contenido.
Otra de las materias primas vegetales a partir de las cuales se puede obtener pectina son los
subproductos de la industria conservera de la alcachofa. España es el segundo productor
mundial de alcachofa, con alrededor de 225.600 toneladas producidas en 2016, de las cuales el
60% se destina a la industria. Su principal producción se da en provincias del litoral
mediterráneo, especialmente Murcia con el 47% de la producción total (MAPAMA, 2017;
MAPAMA, 2018b). Dentro de la industria transformadora de alcachofa, el 70% de la materia
prima se desecha como subproducto y se destina a alimentación animal. Dichos residuos se
componen fundamentalmente de tallo y brácteas (López-Molina et al., 2005). Teniendo en
cuenta las grandes cantidades de producto que se procesan en España anualmente, la pérdida
4
de materia prima que se genera es enorme, y cabría considerar otras vías de aprovechamiento.
En un estudio realizado por Sabater, Corzo, Olano y Montilla (2018) se han llegado a obtener
cantidades de pectina de 221 mg/g de subproducto, expresado en materia seca, mediante
hidrólisis enzimática con el preparado comercial Celluclast® 1,5L, lo que demuestra que los
subproductos de alcachofa son una fuente alternativa de pectina de gran interés.
Tabla 1: Fuentes vegetales de pectina y su contenido (%) (Chan et al., 2017).
FUENTE ALIMENTARIA CONTENIDO DE PECTINA (%)
Manzana 4,6 - 20,9
Cítricos (piel) 9,0 - 33,6
Remolacha azucarera 4,1 – 25,0
Semillas de girasol 7,4 – 11,6
Plátano (piel) 2,4 – 21,7
Zanahoria (desechos y piel) 8,7 – 9,1
Alubia (piel) 9,6 – 15,8
Puerro 10,6 – 11,0
Mango (piel) 9,2 – 31,8
Fruta de la pasión (piel) 2,3 – 30,3
Papaya (piel) 11,1 – 49,8
Pomelo (piel) 8,3 – 27,6
Tomate (piel) 14,9 – 83,5
1.1.3. Métodos de obtención
Aunque la pectina se puede obtener mediante síntesis química (Kinnaert, Daugaard, Nami &
Clausen, 2017), esto resulta sólo de interés científico, siendo habitual la extracción a partir de
subproductos agro-industriales, promoviendo así su revalorización, reduciendo los costes de
producción y el impacto medioambiental que ello conlleva. En cuanto a los procesos de
extracción, tradicionalmente se han utilizado métodos químicos, aunque actualmente están en
auge los métodos físicos y enzimáticos (Marić et al., 2018).
El método químico convencional consiste en una extracción sólido-líquido, utilizando
soluciones (0,05-2 M) de ácidos minerales fuertes (ácido sulfúrico, nítrico, fosfórico o
clorhídrico) como disolvente, durante 1-5 h a 80-100 °C, con agitación; la pectina se purifica
por precipitación, con alcoholes o por neutralización de cargas, y posterior filtración o
5
centrifugación; o por técnicas de membranas como ultrafiltración, entre otras (Marić et al.,
2018; Rabetafika, Bchir, Blecker & Richel, 2014). La extracción química tiene ciertas
desventajas, entre ellas la posible degradación de los compuestos de interés y el gran impacto
medioambiental, ambas debidas al tipo de disolvente tan agresivo que se utiliza. Por ello, se
han buscado disolventes alternativos para la extracción, por ejemplo, soluciones de ácidos
orgánicos, ácido acético o cítrico principalmente. Este tipo de disolventes son menos agresivos,
aunque por ello son también menos efectivos, que los ácidos minerales y, aunque suponen un
mayor coste económico, son más interesantes desde un punto de vista medioambiental (Marić
et al., 2018), y están más en línea con el concepto de “química verde” (Anastas & Warner,
1998) que tanta importancia ha adquirido en los últimos años.
Entre los métodos físicos ensayados, se han obtenido resultados positivos mediante el uso de
microondas. En este caso, son dos los fenómenos que hacen posible la extracción: por un lado,
el calor generado en el interior de la célula provoca una expansión de la misma y daña o rompe
la pared celular, posibilitando la pérdida de material celular; por otro lado, al aumentar la
temperatura del solvente polar (generalmente agua) aumenta su difusividad y se facilita la
transferencia de compuestos del interior al exterior de la célula (Marić et al., 2018; Rabetafika
et al., 2014). Otro proceso térmico es la aplicación de calor inducido por electromagnetismo.
Mediante esta técnica se han obtenido rendimientos similares al calentamiento convencional y
en menores tiempos. A pesar de las ventajas de los procesamientos térmicos (rendimientos altos
y tiempos cortos), existe una desventaja en común: el compuesto de interés (pectina) puede ser
degradado por efecto del calentamiento (Rabetafika et al., 2014; Zouambia, Ettoumi, Krea &
Moulai-Mostefa, 2017). Por ello, se están valorando nuevas técnicas físicas con el fin de reducir
la agresividad del proceso y preservar así la integridad de la pectina. Los ultrasonidos presentan
un mecanismo interesante para la extracción. La cavitación producida favorece la rotura de las
paredes celulares y la liberación de compuestos. La extracción por ultrasonidos es más rápida,
requiere menos energía y menor uso de disolventes y es medioambientalmente más adecuada,
en comparación con los métodos tradicionales (Marić et al., 2018; Rabetafika et al., 2014).
Por último, actualmente se está estudiando la extracción enzimática, muy prometedora a nivel
de tecnología de los alimentos. Se utilizan preparaciones comerciales multienzimáticas con
distintas actividades capaces de romper la pared celular liberando pectina: celulasa,
hemicelulasa, xilanasa, arabinasa, proteasa, alcalasa, α-amilasa, β-galactosidasa, etc.,
dependiendo del producto que se quiera obtener (Marić et al., 2018; Wikiera, Mika, Starzyńska-
Janiszewska & Stodolak, 2015). La utilización de enzimas para la hidrólisis de la pared celular
6
tiene diversas ventajas que la hacen interesante tecnológicamente. Primero, cabe mencionar que
se engloba dentro de la química verde, ya que reduce o elimina el uso de disolventes agresivos
y nocivos para el medioambiente. Los enzimas son capaces de actuar de forma específica (factor
propio de los catalizadores biológicos y que no ocurre en tratamientos físicos y químicos), es
relativamente rápida y actúa en condiciones de temperatura y pH suaves, lo cual permite
mantener la integridad de la pectina y una extracción más limpia y selectiva. Además, la
reducción del uso de disolventes permite un ahorro económico a nivel tecnológico, interesante
para procesos industriales (Marić et al., 2018). Para que la extracción sea más eficaz se pueden
combinar métodos enzimáticos y químicos o físicos, obteniendo mayor rendimiento con un
gasto de disolvente y de energía más reducido (Marić et al., 2018; Wikiera et al., 2015), aunque
en tal caso la selectividad del proceso se podría ver comprometida. Se ha observado que las
pectinas obtenidas mediante métodos enzimáticos tienen estructuras más complejas que
aquellas tradicionalmente extraídas mediante procesamiento químico (Wikiera et al., 2015).
1.1.4. Propiedades fisicoquímicas. Usos industriales.
Las propiedades fisicoquímicas de la pectina son muy importantes para su utilización en la
industria como ingrediente funcional. Este polisacárido es soluble en agua a bajas
concentraciones (1-5%), así como en otros disolventes como formamida, dimetilformamida o
glicerina caliente, y es insoluble en disolventes orgánicos y en soluciones con presencia de
detergentes cuaternarios, polímeros, proteínas y cationes polivalentes. La insolubilidad en este
tipo de soluciones permite la separación física por precipitación de la pectina disuelta en un
medio acuoso. Aunque las pectinas son neutras en su forma original, al solubilizarlas en
soluciones acuosas adquieren un carácter ácido, el cual depende del DM. Una solución de
pectina suele tener un pH de 2,8-3,4, y su grado de disociación es de 0,1-10 x10-4 (a 19 °C)
(Cabarcas, Guerra, Henao & Acevedo Morantes, 2012). Otra propiedad de la pectina es su
capacidad de formar soluciones viscosas en agua. Ambas propiedades, solubilidad y viscosidad,
dependen de diversos factores, entre ellos pH, temperatura, DM, Mm y concentración de
electrolitos. Además, la viscosidad de una solución de pectina aumenta a medida que la
temperatura se acerca al punto de ebullición (Cabarcas et al., 2012; Pagan, 2001). Por otra parte,
se ha visto una relación lineal entre la concentración en la solución y un aumento de la
viscosidad en pectina procedente de algunas frutas concretas: pulpa de manzana, cáscara de
cacao y piel de cítricos, entre otras (Chan, Choo, Young & Loh, 2017).
Como se ha mencionado previamente, el HG puede estar metil-esterificado; en función de la
proporción de grupos metilo se establece el DM, parámetro que determina algunas propiedades
7
fisicoquímicas de gran interés en tecnología alimentaria, como la viscosidad y la capacidad de
gelificación (Pagan, 2001). Se diferencian dos tipos de pectina en función de esta propiedad: de
alto grado de metilación (HM), donde más del 50% de los grupos carboxilo están metilados, y
de bajo grado de metilación (LM), con menos del 50%. Las pectinas de HM presentan mayor
viscosidad a medida que aumenta la Mm y las ramificaciones, y tienen la capacidad de formar
geles a pH ácido (2,8 a 3,5) y en medios con contenido de sólidos solubles de 60-70%. Las
pectinas de LM forman soluciones más viscosas cuanto mayor sea la presencia de cationes
divalentes, por lo que requieren su presencia (generalmente calcio) para formar geles (Cabarcas
et al., 2012). Los iones de calcio interaccionan con los grupos carbonilo libres de azúcares
neutros o ácidos (Pagan, 2001), formando complejos con estructura de red tridimensional. En
este caso, la gelificación puede ocurrir en un intervalo de pH y sólidos solubles más amplio (pH
1-7; contenido en sólidos solubles o azúcares de 0-80%), y el calcio debe estar presente en
concentraciones comprendidas entre 40 y 100 mg/g de pectina (Cabarcas et al., 2012).
La pectina tiene también cierto poder emulsificante, determinado por los dominios RG I y II,
que interaccionan con las proteínas, que son las verdaderas emulsificantes, confiriéndoles
mayor estabilidad (Funami et al., 2011). Se ha visto que existe una relación entre el grado de
acetilación y los azúcares neutros de las cadenas laterales y la capacidad de estabilización de
emulsiones (Yang et al., 2018), si bien el mecanismo por el que esto ocurre no está del todo
descrito, y la Mm y el contenido de proteínas influyen también en su emulsificación (Leorux,
Langendorff, Schick, Vaishnav & Mazoyer, 2003).
Debido a sus propiedades tecno-funcionales, la pectina es muy utilizada en la industria
alimentaria como agente gelificante, espesante o estabilizante de proteínas y carbohidrato
mimético (sustituto de grasas) (Dominiak et al., 2014). Como agente gelificante, las pectinas
de HM son utilizadas en matrices ácidas y azucaradas, como mermeladas o yogures. Para que
la gelificación sea rápida conviene utilizar pectinas de alto DM, Mm elevada y ramificaciones
abundantes. Por otro lado, las pectinas con LM pueden ser muy interesantes por gelificar, en
presencia de calcio, en matrices menos ácidas y con menos sólidos solubles, es decir, necesitan
menor cantidad de azúcares añadidos. Las pectinas se utilizan frecuentemente en la elaboración
de mermeladas, caramelos y gominolas de fruta, bebidas a base de fruta o bebidas lácteas ácidas,
sorbetes, preparados de fruta, postres ácidos, etc. (QuimiNet, 2011).
1.1.5. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones.
Otro aspecto importante de las pectinas son sus propiedades bioactivas. En primer lugar, son
consideradas como fibra soluble, que no puede ser digerida en el tracto gastrointestinal, y sin
8
embargo, puede ser degradada y fermentada por la microbiota del colon. Pero la pectina no sólo
presenta las propiedades de la fibra soluble, sino que es fermentada por ciertas bacterias
colónicas beneficiosas (Bacteroides thetaiotaomicron), formándose ácidos grasos de cadena
corta (SCFA) que favorecen el equilibrio de la microbiota intestinal (Gerschenson, 2017). El
DM es un factor de gran importancia en la fermentación de las pectinas, siendo más fácilmente
fermentables aquellas con LM (Olano-Martín, Gibson & Rastall, 2002). Por ello, se cree que,
mediante pectinas con estructura específica, sería posible extender la región de formación
intensa de SCFA desde las partes del colon proximales a las distales (Gerschenson, 2017). Por
otra parte, diversos estudios han demostrado que las pectinas presentan efecto prebiótico,
incrementando el nivel de bacterias beneficiosas como Bifidobacterium y Lactobacillus, e
inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas como Clostridium (Gullón et al., 2013).
Además, la pectina puede ayudar a reducir el riesgo de cáncer de colon, al afectar a la apoptosis
de las células cancerígenas (Gerschenson, 2017). Así, se ha visto que diferentes sustancias
pécticas o pectinas modificadas mediante tratamientos químicos, térmicos y/o enzimáticos han
presentado propiedades antiproliferativas en líneas celulares cancerosas. También pueden
adherirse a ácidos biliares y glucosa, lo que favorece la reducción de los niveles de colesterol
en sangre y la absorción intestinal de glucosa (Morris, Belshaw, Waldron & Maxwell, 2013).
Gracias a sus propiedades biológicas, la pectina y las sustancias pécticas resultan de gran interés
como ingrediente bioactivo para su incorporación a alimentos funcionales, aunque para su uso
existe una limitación, su baja solubilidad y alta viscosidad, que limitan su incorporación a dosis
superiores al 1%. Una forma de solventar este problema es la obtención de moléculas derivadas
de menor Mm, es decir, POS.
1.2 Oligosacáridos pécticos (POS)
1.2.1. Estructura
Los POS son oligosacáridos obtenidos por despolimerización parcial de la pectina con una
estructura que presenta entre 2 y 50 unidades monoméricas o Mm hasta 10 kDa, en función del
criterio seguido (Bonnin, Garnier & Ralet, 2014; Babbar et al., 2017). Los POS se producen
mediante métodos físicos, químicos, enzimáticos o una combinación de ellos. Las cadenas de
HG, RG-I y RG-II, en función de la materia prima de que proceda, pueden presentar importantes
diferencias estructurales, de forma que los POS obtenidos poseen distintos tipos de enlaces, α
y β, y hasta 14 monosacáridos diferentes, liberándose oligosacáridos ácidos sustituidos y no
sustituidos como oligogalacturónidos, ramnogalacturónidos o xilogalacturónidos, y neutros,
9
galactooligosacáridos, arabinooligosacáridos, y arabinogalactooligosacáridos, o una mezcla de
ellos (Gullón et al., 2013).
1.2.2. Métodos de obtención
Normalmente, la obtención de POS se realiza a partir de material vegetal en dos pasos, primero
extracción de la pectina de la pared celular y segundo rotura de la cadena polimérica para la
formación de oligosacáridos. Aunque con el fin de optimizar el proceso, se están estudiando
vías de obtención de POS directamente a partir de la materia prima en una sola etapa por medio
de combinación de enzimas (Babbar et al., 2017).
En los procesos químicos de despolimerización de la pectina, generalmente se realiza una rotura
parcial de las distintas fracciones pécticas por adición de ácidos, a altas temperaturas y/o
presiones (Berlin, Maximenko, Gilkes & Saddler, 2007).
En lo que a los métodos enzimáticos se refiere, se utilizan enzimas denominados pectinasas. Se
considera pectinasa, en general, a todo aquel enzima que catalice la hidrólisis o rotura del HG
y/o RG de una cadena péctica, dando lugar tanto a monómeros como a POS. Se incluyen
poligalacturonasas (E.C. 3.2.1.5), hidrolasas que rompen los enlaces α (1-4) de la cadena de
ácido poligalacturónico; las pectin liasas (E.C. 4.2.2.10), que catalizan la β-eliminación de la
pectina; y por último, las pectin esterasas (o metil esterasas; E.C. 3.1.1.11), las cuales catalizan
la hidrólisis de los grupos acetilo y/o metilo de los oligogalacturónidos (Kohli & Gupta, 2015).
Como pectinasas no se consideran otros enzimas que, aunque actúen sobre la pectina, no lo
hacen específicamente sobre las zonas de HG o RG, como es el caso de arabinasas o
galactanasas (Alimardani-Theuil, Gainvors-Claisse, & Duchiron, 2011; Castilho, Medronho &
Alves, 2000). Las pectinasas son enzimas que están naturalmente presentes en frutos y plantas,
ya que son las responsables del ablandamiento propio de la maduración (John, Yang, Liu, Jiang
& Yang, 2018), aunque su extracción a partir de esta matriz no es muy común. Además de para
la obtención de POS como ingrediente, este tipo de enzimas son muy utilizados en la industria
alimentaria para múltiples procesos: extracción, clarificación y concentración de zumos de
fruta, clarificación de vinos, y extracción de aceites, aromas y pigmentos de materia vegetal
(Castilho et al., 2000).
Para la rotura de la pectina se utilizan principalmente poligalacturonasas, pectin liasas, pectin
metilesterasas, ramnogalacturonasas, galactasas y arabinasas; dependiendo del enzima que se
utilice se obtendrán diferentes tipos de POS. Entre las glicosidasas en general y las
poligalacturonasas en particular, existen dos tipos de enzimas según la forma de hidrolizar los
10
carbohidratos: endo- y exopoligalacturonasas. Las exopoligalacturonasas eliminan residuos de
GalA desde los extremos mientras que las endopoligalacturonasas catalizan la rotura de enlaces
α (1-4) al azar; la actividad de las primeras se puede ver limitada con la aparición de residuos
diferentes de GalA, como ramnosa o arabinosa. Debido a su actividad, las
exopoligalacturonasas dan lugar a cadenas de pectina de alto Mm y residuos monoméricos de
GalA, mientras que las endopoligalacturonasas dan lugar a POS; por ello, es preferible el uso
de endopoligalacturonasas para alcanzar un mayor rendimiento en la obtención de POS, que
puede llegar al 95%. (Pagan et al., 2001; Gullón et al., 2013), mientras que las pectin liasas dan
lugar a oligogalacturónidos de bajo grado de polimerización (GP). Los otros tipos de enzimas,
como ramnogalacturonasas, galactasas o arabinasas, producen oligosacáridos con azúcares
distintos al GalA (ramnogalacturónidos, por ejemplo). También se han empleado mezclas de
los enzimas anteriores para obtener productos más variados (Gullón et al., 2013), si bien lo más
común es utilizar preparados enzimáticos comerciales que suelen presentar, junto con la
actividad principal, otras actividades que influyen también en las características de los POS
(Babbar et al., 2017).
Las pectinasas comerciales suelen ser de origen microbiano. Se obtienen principalmente a partir
de extractos celulares de Aspergillus spp. (Combo, Aguedo, Goffin, Wathelet & Paquot, 2012),
aunque hay investigaciones que han obtenido buenos resultados utilizando otras especies
microbianas como Bacillus spp. (Rehman et al., 2015; Uzuner & Cekmecelioglu, 2015; Yu &
Xu, 2017), Saccharomyces cerevisiae (Poondla, Bandikari, Subramanyam & Obulam, 2015) o
Penicillium viridicatum (Silva, Martins, Silva & Gomes, 2002). Según la bibliografía, los
hongos filamentosos del género Aspergillus spp. tienen la capacidad de sintetizar una gran
batería de enzimas involucrados en la degradación de los polisacáridos presentes en la pared
celular, como es el caso de la pectina (de Vries & Visser, 2001), y su expresión puede modularse
en función de las condiciones de crecimiento a las que es sometido.
1.2.3. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones
Como ingredientes bioactivos los POS parecen aún más interesantes que las pectinas. Algunos
POS se han propuesto como potenciales prebióticos por ser oligosacáridos no digeribles
(Gullón et al., 2013), ya que el carbono anomérico (C1 o C2) de las unidades monoméricas
posee una configuración que no es reconocida por los enzimas digestivos humanos (Roberfroid
& Slavin, 2000). Al ser oligosacáridos no digeribles, llegan al intestino grueso o colon y son
fermentados por la microbiota intestinal, donde se ha comprobado que expresan funcionalidad
bifidogénica, favoreciendo el crecimiento y colonización de este género. Como resultado de la
11
fermentación, se sintetizan metabolitos tales como SCFA, los cuales reducen el pH del medio
e inhiben la proliferación de bacterias patógenas, evitando así infecciones y un desequilibrio
del ecosistema microbiológico intestinal. Además de por su efecto prebiótico, se están
estudiando los POS para otros posibles usos beneficiosos como la inducción de la apoptosis y
la reducción de la progresión, transformación y metástasis de células cancerosas de colon, la
prevención de la adhesión de patógenos (Campylobacter jejuni, por ejemplo) y sus toxinas a
los receptores epiteliales, la detoxificación de metales pesados (RG II, específicamente), la
inhibición de la acumulación lipídica, la reducción de los niveles de glucosa en sangre y la
modulación del sistema inmune (Babbar et al., 2017; Bonnin et al., 2014; Gerschenson, 2017;
Holck, Hotchkiss, Meyer, Mikkelsen & Rastall, 2014).
Los POS son muy apropiados para su utilización en alimentos por ser azúcares no-cariogénicos
y tener un valor calorífico reducido (Mussatto & Mancilha, 2007). Además, debido a su baja
Mm, su mayor solubilidad en soluciones acuosas que la de la pectina, por lo que pueden ser
más adecuados para su incorporación como ingrediente bioactivo en alimentos funcionales. En
cuanto a la dosis necesaria para causar los efectos deseables, no hay consenso al respecto. Dicha
dosis debe basarse en estudios clínicos, y debe ser específica para cada tipo de oligosacárido,
ya que depende de numerosos factores (Illanes, 2015). Aunque existen pocos estudios que
relacionen la dosis con el efecto provocado, se ha comprobado que éste no depende tanto de la
cantidad de prebiótico ingerida sino del estado de la microbiota intestinal al inicio del
tratamiento, y de si se administra de forma simbiótica o no, por lo que es muy difícil establecer
valores generales. En los estudios realizados de cara a la mejora del tracto digestivo, se han
venido utilizando cantidades de entre 8 y 30 g/día (Hidalgo-García & Farran-Codina, 2013).
Por otra parte, existen pocas evidencias en lo que a la relación estructura-función respecta,
aunque se ha demostrado que los oligosacáridos parcial o totalmente ácidos no presentan
actividad bifidogénica, mientras que fragmentos neutros de bajo GP sí que presentan dicha
propiedad, sobre todo durante las primeras horas de fermentación colónica (Bonnin et al.,
2014). Considerando que la bioactividad de los POS está determinada por su estructura, se están
desarrollando métodos para la extracción y separación selectiva de mezclas de POS. Dichos
procesos proporcionarán nuevas rutas de valorización para los subproductos que proceden de
la biomasa vegetal de bajo valor (Holck et al., 2014). Aunque, por el momento, no existen
técnicas estandarizadas para su producción y dada la amplia variedad de sustratos utilizables y
la falta de estudios sistemáticos sobre su estructura, no es posible sacar conclusiones sobre la
12
relación estructura-función, y es necesario profundizar en estos estudios para ayudar al uso
racional de los POS en ingredientes funcionales.
2. OBJETIVOS
En los últimos años, la industria alimentaria está desarrollando una línea orientada hacia la
creación de nuevos alimentos funcionales con alto valor añadido y cada vez es más amplio el
mercado de este tipo de productos a nivel mundial. Esto, sumado a la mayor concienciación de
los consumidores y de la industria por la sostenibilidad medioambiental, ha provocado que se
esté mostrando un gran interés en la utilización de subproductos de la industria alimentaria para
obtener ingredientes funcionales y de esta forma lograr un aprovechamiento más sostenible de
las materias primas.
De entre los diferentes ingredientes funcionales descritos, uno de los grupos más atractivos para
la industria alimentaria es el de los prebióticos, relacionados con una mejora en la función
gastrointestinal. Dentro del grupo de prebióticos emergentes se están considerando los POS, ya
que existen trabajos en los que se ha demostrado su carácter prebiótico. Por este motivo, resulta
de gran interés la optimización de métodos de obtención de POS que permita producir grandes
cantidades de manera rápida y barata utilizando subproductos que genera la industria
agroalimentaria. Tradicionalmente, la pectina se extrae de subproductos de cítricos, manzana y
remolacha, aunque se están estudiando nuevas fuentes de las que se puedan obtener POS con
distintas características estructurales y, por tanto, distintas propiedades funcionales. Por el
momento, hasta nuestro conocimiento, hay pocos estudios acerca de la obtención de pectina a
partir de subproductos de alcachofa y ninguno de la obtención de POS, por lo que esta
investigación aportaría soluciones de cara a una posible revalorización de subproductos en un
sector de la industria alimentaria que, como se ha visto, es de gran importancia, principalmente
en el litoral mediterráneo. Por otro lado, y gracias a los últimos avances en los métodos
enzimáticos de extracción, es posible la producción de ingredientes y productos a nivel
industrial de forma económicamente viable.
Teniendo en cuenta lo anterior y la utilidad de la modelización matemática mediante técnicas
avanzadas de machine learning para optimizar procesos, el objetivo general planteado en este
Trabajo de Fin de Máster es la optimización de la obtención de oligosacáridos derivados de
pectina por vía enzimática, así como el análisis de los productos obtenidos, utilizando
pectina extraída a partir de subproductos de alcachofa generados en la industria.
13
Para cumplir el objetivo general se han tenido en cuenta los siguientes objetivos específicos:
• Obtención de POS mediante hidrólisis enzimática de la pectina de alcachofa, realizando
un diseño experimental y utilizando dos preparados enzimáticos comerciales: celulasa
de Aspergillus niger (CAN) y Pectinex®Ultra Olio (PUO).
• Análisis en los hidrolizados obtenidos de i) azúcares reductores liberados; ii)
carbohidratos de baja Mm y iii) distribución de la Mm de las fracciones liberadas y
cuantificación de las mismas.
• Modelización y optimización del proceso mediante un diseño experimental analizado
por el método de superficie respuesta (RSM) y el de redes neuronales artificiales (ANN)
utilizando los POS cuantificados con Mm entre 100 y 0,3 kDa.
• Determinación de las propiedades antioxidantes de los POS obtenidos de la pectina de
alcachofa en las condiciones óptimas.
14
3. PLAN DE TRABAJO
POS EN CONDICIONES ÓPTIMAS
- GC-FID
- HPSEC-ELSD
- DPPH (propiedades antioxidantes)
MODELIZACIÓN Y OPTIMIZACIÓN
Método de superficie respuesta (RSM) y redes neuronales
artificiales (ANN).
Variable a optimizar: POS 100 > Mm > 0,3 kDa
Método DNS
Cuantificación de azúcares
reductores liberados.
GC-FID
Cuantificación de monosacáridos
y oligosacáridos liberados.
HPSEC-ELSD
Distribución Mm de fracciones
liberadas y cuantificación.
OBTENCIÓN DE MEZCLAS DE POS
CARACTERIZACIÓN
Preparados enzimáticos.
Actividad
(DNS)
Proteína
(Bradford)
DISEÑO EXPERIMENTAL
3 factores: pH (4,5, 5,5 y 6,5), tiempo de reacción (1,5, 3,25 y 5 h) y
cantidad de enzima (CAN: 25,9-77,6 Ud/g pectina; y PUO: 123,9-
464,7 Ud/g pectina).
Enzimas comerciales
Pectinex® Ultra Olio (PUO)
Celulasa Aspergillus niger
(CAN)
Pectina
(Subproductos de
alcachofa).
MEZCLAS DE POS
DETERMINACIONES ANALÍTICAS
Figura 2: Plan de Trabajo
15
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Reactivos y muestras
Los patrones utilizados para la identificación y cuantificación de azúcares (D-xilosa, D-arabinosa,
L-ramnosa, D-galactosa, D-manosa, D-glucosa, GalA, sacarosa, β-fenil-glucósido, kestosa,
nistosa y fructosil nistosa) se adquirieron en Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Los
preparados enzimáticos comerciales utilizados en este estudio, Pectinex®Ultra Olio (PUO)
(preparado líquido), una pectin liasa con actividad secundaria poligalacturonasa de A. niger y A.
aculeatus, fue un regalo de la casa comercial Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca) y celulasa de
A. niger (CAN, preparado sólido) se obtuvo de la casa comercial Sigma-Aldrich (Steinheim,
Alemania).
La pectina de alcachofa utilizada como sustrato fue obtenida previamente en el laboratorio
mediante extracción enzimática (Sabater et al., 2018). Todas las disoluciones se realizaron con
tampón de acetato de sodio 50 mM al pH correspondiente a cada ensayo. El ajuste de pH se realizó
con ácido acético. El agua utilizada para preparar las distintas soluciones fue ultra-pura (18,2 MΩ
cm, Milli-Q Synthesis A 10 de Millipore, Billerica, MA, EEUU).
4.2 Caracterización de los preparados enzimáticos
4.2.1 Purificación de los enzimas
Para eliminar las impurezas de los preparados enzimáticos se purificaron mediante una columna
de desalinización con un volumen de resina de 2,4 mL (PD-10 Sephadex G25, Desalting
Workmate, General Electric, Buckinghamshire, Reino Unido). Primero, la columna se equilibró
con 10 volúmenes de tampón acetato 50 mM (pH 4,5; 5,5; 6,5 según el ensayo realizado) y
después se añadió 1 volumen de PUO (líquida) o de una solución de 140 mg/mL de CAN. Las
muestras se eluyeron con 1,4 volúmenes de tampón y la columna se lavó con otros 4 volúmenes
del mismo buffer.
4.2.2 Determinación de la actividad hidrolítica (método del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) o método de Miller)
Este ensayo consiste en la determinación de grupos reductores que se liberan tras una reacción
enzimática que se encuentra en la fase lineal de la cinética, la cual equivale a la velocidad lineal
de la reacción. El ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) es un reactivo de color amarillo con un
grupo nitro que, en medio alcalino, es reducido por el grupo carbonilo libre de los azúcares
16
reductores, dando lugar a un producto monoamino de color rojizo que se puede cuantificar
mediante espectrofotometría a una longitud de onda (λ) de 560 nm, ya que la intensidad de
color es proporcional a la cantidad de grupos reductores presentes en la disolución (Miller,
1959; Cruz & Soler, 2014).
Figura 3: Diagrama de reacción entre DNS y azúcares reductores (Cruz & Soler, 2014).
En este caso, se realizó la determinación de la actividad hidrolítica de los preparados
enzimáticos PUO y CAN antes y después de la purificación. Para el desarrollo del ensayo de
DNS se incubaron 0,5 mL de pectina de alcachofa al 2% en tampón a pH 5, con 125 µL de
disolución de 20 mg/mL de CAN o 12,5 µL de PUO, a 50 °C durante 5 minutos. La reacción
enzimática se paró añadiendo 0,5 mL de DNS y enfriando en hielo. Se tomaron 0,2 mL de la
mezcla de reacción y se llevaron a ebullición en un baño de agua durante 5 minutos. Después,
se añadieron 750 µL de agua, se centrifugó durante 2 minutos a 10.000 rpm y se transfirieron
300 µL de los sobrenadantes de cada muestra a una placa multipocillos, por duplicado. La
lectura se realizó mediante espectrofotometría en un lector de placas multipocillo a 560 nm.
Para la cuantificación se preparó GalA (azúcar mayoritario de la pectina) en tampón de acetato
de sodio pH 5 a distintas concentraciones entre 5 y 0,02 mg/mL. Cada patrón se preparó por
duplicado y se sometió al mismo proceso de reacción que las muestras. La curva de calibrado
17
presentaba una relación lineal con R2 ≥ 0,99. El cálculo se hizo considerando que la actividad
hidrolítica se define como la cantidad de enzima (en µg o µL) que es capaz de liberar 1 µmol
de azúcares reductores (expresado como µmol de GalA) por minuto. Este valor se expresa en
unidades por mL o por g de preparado enzimático (Ud/mL o Ud/g).
4.2.3 Cuantificación del contenido en proteína (Método de Bradford)
Para determinar la cantidad de proteína que contienen los preparados enzimáticos purificados
se utilizó el método de Bradford (Bradford, 1976). Este método utiliza un reactivo que contiene
Coomassie Brilliant Blue G-250 en dilución acuosa de ácido fosfórico. Éste es un agente
colorante que forma unión con proteínas, pasando de su color rojo original a un color azulado,
con lo que permite la cuantificación por colorimetría. Tras la unión, se observa un incremento
de la absorbancia, que se determina a una λ de 595 nm.
Figura 4: Diagrama de reacción entre Coomassie Brilliant Blue G-250 y proteínas (Mata-Gómez, Yasui,
Guerrero-Rangel, Valdés-Rodrígez & Winkler, 2012).
Para este ensayo se utilizó el preparado comercial BioRad Protein Assay Dye Reagent
(Hercules, California). Se mezcló 1 volumen del reactivo sin filtrar con 4 volúmenes de agua
MilliQ y, en tubos Eppendorf, se incorporaron 600 µL de esta disolución a 30 µL de muestra o
patrón. Esto se agitó en vórtex, se pasó a una placa multipocillo, se dejó en incubación a
temperatura ambiente durante 5 minutos y se cuantificó mediante un lector espectrofotométrico,
a una λ de 595 nm. Cada una de las muestras o patrones se preparó por duplicado. La curva de
calibrado se realizó con albúmina sérica bovina en concentraciones de 0,05 a 0,5 mg/mL (R2 ≥
0,99). Los enzimas comerciales purificados, CAN y PUO, se diluyeron a 5 mg/mL y 50 µL/mL,
respectivamente, para que la medida de absorbancia entrase dentro de la recta patrón.
18
La actividad específica de los preparados enzimáticos se calculó dividiendo la actividad
enzimática entre el contenido en proteína y se expresó como unidades por mg de proteína.
4.3 Obtención de oligosacáridos pécticos (POS). Diseño experimental.
Para la obtención de POS a partir de pectina de alcachofa por vía enzimática utilizando los
enzimas CAN y PUO se prepararon disoluciones de pectina de alcachofa al 2% en tampón de
acetato de sodio 50 mM (pH variable según el ensayo), a las cuales se añadió la correspondiente
cantidad de enzima. Los ensayos se realizaron en un baño de agua a 50 °C con agitación durante
el tiempo especificado para cada muestra. Terminada la reacción, el enzima se inactivó
introduciendo las muestras en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos.
Una vez determinadas las condiciones óptimas de hidrólisis para maximizar la obtención de
POS a partir de pectina, se llevaron a cabo las reacciones enzimáticas en las condiciones de pH,
tiempo y cantidad de enzima determinadas. La hidrólisis de la pectina se realizó por duplicado
con cada enzima.
Todos los hidrolizados se conservaron en congelación a – 18 °C.
4.3.1 Diseño experimental
Para modelar y establecer las condiciones óptimas de las distintas reacciones enzimáticas,
primero se utilizó el programa Statgraphics Centurion XVII para generar el diseño
experimental. Mediante el mismo, se obtuvieron un total de 17 ensayos para cada uno de los
enzimas, que se realizaron al azar y se resumen en la Tabla 2. En este diseño experimental se
utilizaron 3 variables independientes: cantidad de enzima, pH y tiempo de reacción, a cada cual
se le asignó un valor central (0), un valor factorial mínimo y uno máximo (-1 y +1,
respectivamente) y dos valores axiales (-α y +α), que se combinaron de forma lineal en un
sistema coordinado. Así, se obtuvieron 3 puntos centrales (x0, y0, z0), 8 puntos factoriales
(formados por combinaciones de -1, +1) y 6 puntos axiales, formados por alguno de los
extremos (-α, +α) y valores centrales (0).
19
Tabla 2: Diseños experimentales. Condiciones de reacción para cada ensayo y cada variable: pH, tiempo (h)
y cantidad de enzima (Ud/g pectina).
Celulasa de Aspergillus niger (CAN) Pectinex® Ultra Olio (PUO)
Ensayo pH Tiempo Enzima Ensayo pH Tiempo Enzima
1 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 1 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)
2 6,5 (+1) 5 (+1) 25,9 (-1) 2 4,5 (-1) 1,5 (-1) 123,9 (-1)
3 4,5 (-1) 1,5 (-1) 25,9 (-1) 3 6,5 (+1) 1,5 (-1) 464,7 (+1)
4 6,5 (+1) 1,5 (-1) 77,6 (+1) 4 6,5 (+1) 5 (+1) 123,9 (-1)
5 4,5 (-1) 5 (+1) 77,6 (+1) 5 4,5 (-1) 5 (+1) 464,7 (+1)
6 4,5 (-1) 1,5 (-1) 77,6 (+1) 6 6,5 (+1) 5 (+1) 464,7 (+1)
7 6,5 (+1) 1,5 (-1) 25,9 (-1) 7 6,5 (+1) 1,5 (-1) 123,9 (-1)
8 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 8 4,5 (-1) 5 (+1) 123,9 (-1)
9 6,5 (+1) 5 (+1) 77,6 (+1) 9 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)
10 4,5 (-1) 5 (+1) 25,9 (-1) 10 4,5 (-1) 1,5 (-1) 464,7 (+1)
11 3,83 (-α) 3,25 (0) 51,8 (0) 11 5,5 (0) 0,32 (-α) 294,3 (0)
12 5,5 (0) 0,32 (-α) 51,8 (0) 12 5,5 (0) 6,18 (+α) 294,3 (0)
13 7,17 (+α) 3,25 (0) 51,8 (0) 13 3,83 (-α) 3,25 (0) 294,3 (0)
14 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 14 7,17 (+α) 3,25 (0) 294,3 (0)
15 5,5 (0) 3,25 (0) 95,1 (+α) 15 5,5 (0) 3,25 (0) 9,3 (-α)
16 5,5 (0) 3,25 (0) 8,5 (-α) 16 5,5 (0) 3,25 (0) 579,3 (+α)
17 5,5 (0) 6,19 (+α) 51,8 (0) 17 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)
Figura 5: Representación gráfica del diseño experimental. Los valores factoriales están representados por
su correspondiente símbolo (-, +), los valores axiales se representan mediante puntos amarillos y los
valores centrales se sitúan en la intersección entre las dos líneas continuas (CAMO, 2018).
20
4.3.2 Optimización del diseño experimental
Para optimizar las condiciones de reacción, estudiando el comportamiento de cada una de las
variables dependientes en función de las variables independientes, primero se utilizó el método
de superficie de respuesta (RSM) mediante el programa informático StatGraphics Centurion
XVI. Se trata de un programa que es capaz de predecir el efecto de distintas variables en
términos lineales, cuadráticos y de correlaciones cruzadas (Astray, Gullón, Labidi & Gullón,
2016; Sabater et al., 2018). No obstante, dada la complejidad del proceso estudiado, se buscaron
métodos alternativos que permitiesen explicar y analizar el diseño con mayor exactitud. Con
este fin, se emplearon dos modelos de redes neuronales artificiales (ANN) previamente
programados en lenguaje R v3.4.3 en el grupo de investigación (Sabater, Ferreira-Lazarte,
Montilla & Corzo, en revisión).
Las ANN son una serie de modelos basados en el aprendizaje de máquinas (machine learning)
ampliamente utilizados para el reconocimiento de patrones en campos como la minería de datos
o la metabolómica. Se componen de una capa de entrada (input) que consta de los factores
estudiados (pH, tiempo, cantidad de enzima y las interacciones entre estos tres factores), una
capa de salida (output) que corresponde a la variable a optimizar (formación de POS) y una
serie de capas intermedias u ocultas (hidden layers) formadas por nodos o “neuronas”
conectadas entre sí mediante funciones matemáticas y cuyo número depende de la complejidad
del proceso que se estudia. La red utilizada para modelar el comportamiento de PUO poseía
una capa oculta de 9 nodos y la utilizada para modelar el comportamiento de CAN poseía una
capa oculta de 6 nodos. La arquitectura de las ANN se muestra en la Figura 6. La función de
activación de las ANN fue logística. Una función de activación es una transformada no lineal
que se aplica a los valores de entrada, después de que éstos hayan sido multiplicados por una
serie de coeficientes (weights), para determinar si la información que reciben los nodos es
relevante o no. Además, el resultado de estas decisiones que se van tomando en cada etapa del
modelo también está determinado por una constante (bias).
Los modelos se entrenaron con el 70% de los datos, se validaron mediante validación cruzada
y se comprobaron con el 30% de los datos restantes. De esta manera, se asegura la capacidad
del modelo de predecir muestras nuevas y, por tanto, de generalizarse. Posteriormente, se
realizó un análisis de sensibilidad para determinar la importancia de los factores estudiados
dentro del modelo. La exactitud del ajuste se midió calculando los coeficientes de regresión R2
y R2 ajustado, así como el error de la raíz cuadrada media (RMSE).
21
Figura 6: Arquitectura de las ANN utilizadas para modelar la producción de POS por PUO (a) y CAN (b).
Los parámetros de entrada fueron las condiciones de reacción (pH, tiempo, cantidad de enzima e
interacciones entre los factores) y el parámetro de salida la cantidad de POS formada con una Mm
comprendida entre 100 y 0,3 kDa. Las conexiones entre los elementos del modelo son positivas (negras) o
negativas (grises) y su grosor representa la repercusión en el mismo. I: input, O: output, H: hidden, B: bias.
4.4 Análisis de los hidrolizados
Las muestras hidrolizadas se caracterizaron mediante 3 técnicas: método espectrofotométrico
del DNS, análisis cromatográfico por GC-FID y análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD.
4.4.1 Cuantificación de azúcares reductores
Mediante el método del DNS se realizó una estimación preliminar de la intensidad de la
hidrólisis, ya que cuantifica los azúcares reductores presentes.
Este ensayo se realizó como se explica en el apartado 4.2.2, tomando 100 µL de las muestras
de hidrolizado y 100 µL de reactivo DNS. Para cada hidrolizado se preparó, en las mismas
condiciones, un control que era el sustrato con el enzima inactivado en agua en ebullición
durante 5 minutos. Sólo los ensayos del diseño experimental se analizaron por este método y
no se aplicó a los óptimos.
4.4.2 Análisis cromatográfico por GC-FID
Para cuantificar los carbohidratos con un GP ≤ 5 los hidrolizados enzimáticos se analizaron por
cromatografía de gases (GC) con detector de ionización de llama (FID). Se utilizó un
cromatógrafo de gases GC7890A con inyector automático 7693A (Agilent Technologies Inc.,
Palo Alto, CA). Debido a la baja volatilidad que los azúcares tienen por naturaleza, fue
necesario someter las muestras a un pretratamiento de derivatización donde se formaron
trimetilsilil oximas a partir de los carbohidratos presentes. Para ello, se tomaron 250 µL de
22
muestra (equivalente a 5 mg de carbohidratos), se añadieron 400 µL de patrón interno (β-fenil-
glucósido a 0,5 mg/mL) y la mezcla se deshidrató por rotaevaporación a 40 ºC. Tras esto, se
procedió a la formación de las trimetilsilil oximas siguiendo el método de Brobst y Lott (1966):
primero, se añadieron 250 µL de una disolución de cloruro de hidroxilamina en piridina al 2,5%
y se mantuvo a 70 °C en estufa durante dos etapas de 15 minutos, con una agitación en vórtex
entre ambas; después, se añadieron 250 µL de hexametildisilazano y 25 µL de ácido
trifluoroacético y se mantuvo a 50 °C durante 30 minutos. Finalmente, las muestras se
centrifugaron durante 2 minutos a 10.000 rpm, y el sobrenadante se recogió en un vial para su
posterior análisis por GC-FID.
Para la identificación y cuantificación se utilizó una columna capilar de sílice DB-5HT (30 m
× 0,25 mm × 0,10 µm) (J&W Scientific, Folson, California, USA). El horno se programó con
el siguiente gradiente de temperaturas: temperatura inicial 150 ̊ C, incremento de 1 ̊ C/min hasta
165 ˚C, incremento de 10 ˚C/min hasta 200 ˚C e incremento de 50 ˚C/min hasta 380 ˚C,
manteniéndose a esta temperatura durante 2 minutos. La temperatura del inyector y del detector
fue de 280 ˚C y 385 ˚C, respectivamente. La inyección de la muestra se realizó en modo split,
relación 1:30. El gas portador utilizado fue N2 a un flujo de 1 mL/min.
Para el análisis cuantitativo se calcularon los factores de respuesta de los distintos carbohidratos
respecto al patrón interno, β-fenil-glucósido. Para ello, se prepararon mezclas de patrones de
xilosa, arabinosa, ramnosa, galactosa, manosa, glucosa y GalA, sacarosa para disacáridos y
kestosa para la cuantificación de tri-, tetra- y pentasacáridos, a distintas concentraciones, en un
rango entre 0,02 y 2 mg/mL. La preparación de estas mezclas y su análisis por GC se realizaron
por duplicado; en todos los casos, la desviación estándar relativa fue inferior al 10%. La
adquisición y procesado de los datos obtenidos se realizó con el software Agilent ChemStation
en todos los casos.
4.4.3 Análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD
Para cuantificar todos los carbohidratos presentes en las muestras y determinar la distribución
de la Mm de los compuestos se utilizó la cromatografía de exclusión molecular (HPSEC) con
un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, evaporative light scattering detector). El
análisis se realizó en un equipo Agilent 1200 Infinity equipado con dos columnas de
polimetacrilato hidroxilado en serie: TSKgel G5000PWXL (7,8 mm × 300 mm, tamaño de
partícula 10 µm) específica para compuestos de tamaño molecular entre 50-7.000 kDa, y
TSKgel G2500PWXL, semejante con un tamaño de partícula de 6 µm (Tosoh Bioscience,
23
Montgomeryville, PA, USA) para la separación de compuestos de menor Mm (< 8 kDa). La
elución de los carbohidratos se realizó con acetato de amonio 10 mM como fase móvil, a un
flujo de 0,5 mL/min.
Antes de proceder con el análisis, las muestras se diluyeron en agua Milli-Q hasta una
concentración de 1 mg/mL de azúcares y se filtraron utilizando un filtro de PVDF de 0,45 µm
(Agilent Technologies Inc.), inyectándose posteriormente 50 µL en el sistema cromatográfico.
Los datos obtenidos se procesaron con el software Agilent ChemStation.
Para la estimación de la Mm y concentración de los distintos carbohidratos se usó calibración
externa. Para ello, se utilizaron muestras de pululanos comerciales (Fluka Analytical) de Mm
conocida (0,342-788 kDa), a concentraciones entre 0,1 y 1,0 mg/mL cada uno. A partir de los
perfiles obtenidos, utilizando el tiempo de retención para la estimación de la Mm y el área de
los picos para las concentraciones y, dada la respuesta exponencial de este tipo de columnas de
exclusión molecular y del detector, se realizó una representación logarítmica en ambos casos,
obteniéndose una relación lineal con R2 ≥ 0,98.
4.5 Determinación de la actividad antioxidante de los POS
El método se fundamenta en que el DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) es un radical coloreado
que absorbe luz a λ = 516 nm y es altamente oxidante. Cuando el DPPH• se añade en un medio
en presencia de un compuesto antioxidante, éste último o bien capta el DPPH• o bien le dona
un átomo de hidrógeno, de forma que lo transforma en una molécula químicamente estable y
deja de ser oxidante. La disminución de radicales de DPPH se puede medir por
espectrofotometría, ya que la forma estable de la molécula tiene un color diferente al radical, y
disminuirá la absorbancia a 516 nm (Antolovich, Prenzler, Patsalides, McDonald & Robards,
2002).
Para este estudio se utilizó el protocolo descrito por Rha et al. (2011), con alguna modificación.
La curva de calibrado se realizó con soluciones de trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina
E) en metanol, a concentraciones de 0,2 a 1,0 mM. El reactivo DPPH• de partida se disolvió en
etanol hasta una concentración 40 mM. Para la preparación de muestras, se hizo una dilución
1:10 en metanol de los hidrolizados optimizados, hasta llegar a una concentración de 2 mg/mL.
En una placa multipocillo se añadieron, por duplicado, 100 µL de muestra o patrón y 100 µL
de solución de DPPH 40 mM. La placa se incubó a temperatura ambiente y protegida de la luz
durante 30 minutos. Tras este tiempo, se realizó la lectura a una λ de 516 nm.
24
4.6 Análisis estadístico
Para complementar el análisis de datos se realizaron ANOVA y test de Tukey (p < 0,05) de
todos los resultados obtenidos.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Actividad hidrolítica de los preparados enzimáticos
Mediante el método de Miller se estimó la actividad hidrolítica de los enzimas utilizando GalA
como patrón, al tratarse del glucósido principal de la cadena de HG de la pectina, y llevando a
cabo la cinética de reacción con la pecina de alcachofa, en las mismas condiciones de pH y
temperatura que se iban a utilizar para la obtención de POS, pero a un tiempo corto para que la
reacción estuviera en la fase lineal. De esta forma, se pudo estimar la actividad hidrolítica
global, que viene dada por los azúcares reductores totales liberados, que pueden ser desde
monosacáridos a grandes fragmentos de pectina, y es debida posiblemente a la presencia de
distintas actividades en los preparados enzimáticos comerciales como poligalacturonasa,
arabinasa o galactasa, al no tratarse de enzimas puros. En la Tabla 3 se muestran los resultados
obtenidos, donde se observa que los enzimas sin purificar presentan mayor actividad hidrolítica;
concretamente en CAN se produce una importante pérdida durante la purificación,
posiblemente porque parte del enzima se haya quedado retenido en la columna de purificación.
A pesar de ello, este paso es necesario dada la gran cantidad de compuestos de baja Mm,
generalmente monosacáridos y polialcoholes, que presentan estas preparaciones enzimáticas y
los cuales pueden interferir en la reacción como sustrato competidor o en los análisis posteriores
de los hidrolizados (Cardelle-Cobas, Martínez-Villaluenga, Sanz & Montilla, 2009).
Tabla 3: Actividad hidrolítica, contenido en proteína y actividad hidrolítica específica de los preparados
enzimáticos comerciales.
ACTIVIDAD
(Ud/g o Ud/mL) PROTEÍNA
(mg/g o mg/mL)
ACTIVIDAD
ESPECÍFICA
(Ud/mg proteína) Sin purificar Purificada
Celulasa A.
niger (CAN) 459,4 ± 39,5a 258,8 ± 56,4b 15,7 ± 1,2a 16,5 ± 3,6a
Pectinex® Ultra
Olio (PUO) 381,2 ± 16,4a,b 309,8 ± 14,2b 11,9 ± 0,2b 26,0 ± 1,2a
a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las dos enzimas estudiadas antes y después de la purificación.
25
A continuación, mediante el método Bradford, se cuantificó la proteína contenida en esos
mismos preparados purificados para poder calcular la actividad específica (Tabla 3). Como se
observa, el contenido en proteína es muy bajo; el resto se podría considerar agentes de carga e
impurezas y disolventes líquidos en el caso de PUO. La ventaja del cálculo de actividad
específica es que nos permite comparar enzimas, ya que la medida se hace independientemente
de la pureza proteica de la preparación, al referirse la actividad a mg de proteína, si bien también
hay que tener presente que no se trata de enzimas puros sino de extractos multienzimáticos, por
lo que esa proteína corresponderá a distintas enzimas.
5.2 Caracterización de los hidrolizados enzimáticos de pectina de
alcachofa
Una vez determinada la temperatura de reacción en base a la información del fabricante y la
experiencia con otros enzimas del mismo género y especie (Al Loman & Ju, 2016; Cardelle-
Cobas, et al., 2009) y conociendo la actividad específica de ambos enzimas, fijamos unos
intervalos de estudio para las variables independientes (pH, tiempo y concentración de enzima)
y, en base a ellos, se construyeron los dos diseños experimentales (cuyas condiciones se recogen
en la Tabla 2 de Materiales y Métodos), se realizaron los ensayos y se procedió a caracterizar
los distintos hidrolizados, como base para la posterior optimización de la obtención de POS.
5.2.1 Liberación de azúcares reductores. Extensión global de la hidrólisis.
Mediante el método de DNS se hizo una estimación preliminar de la intensidad de la hidrólisis
en cada uno de los ensayos experimentales con la finalidad de valorar globalmente las
reacciones. Para facilitar el análisis del conjunto se ha calculado una media de los azúcares
reductores presentes en todos los ensayos experimentales, así como los intervalos de los valores,
expresados como equivalentes de mg de GalA, utilizado en la calibración. Así, se observó que
PUO liberó durante la hidrólisis una media de azúcares reductores de 43,0 ± 14,3 mg/100 mg
de pectina (19,3 ± 0,1 – 58,2 ± 1,7 mg/100 mg); por otro lado, CAN liberó una media de 10,4
± 7,7 mg/100 mg de pectina (0,0 ± 0,2 – 24,8 ± 0,2 mg/100 mg). Se aprecia claramente cómo
en las reacciones con PUO la hidrólisis ha avanzado más que en las reacciones con CAN. Este
resultado era de esperar, ya que, como se ve en las condiciones del diseño experimental, la
cantidad de enzima añadida, expresada como Ud/g de pectina, es considerablemente mayor para
PUO. A la hora de plantear los diseños con ambos enzimas se querían obtener mezclas con
distinto grado de hidrólisis, de forma que los productos de reacción pudieran presentar
características diferentes.
26
Los datos obtenidos con esta técnica, aunque muy básicos, nos dan una primera aproximación
de la extensión de la hidrólisis con ambos enzimas y, aunque este método colorimétrico
generalmente se utiliza para medir la actividad de diferentes enzimas (Martínez, Ruiz-Duenas,
Martínez, del Río & Gutiérrez, 2009), también se ha utilizado para el seguimiento de reacciones
de hidrólisis enzimática de distintos sustratos, como pectina de manzana (Dinnella, Stagni,
Lanzarini & Laus, 1996), de colza (Jeong et al., 2014) o carbohidratos de soja (Al Loman & Ju,
2016), entre otros.
5.2.2 Estudio de la fracción de carbohidratos de baja masa molecular
La fracción de carbohidratos de baja Mm, hasta GP 5, fue analizada por GC-FID. En la Figura
7 podemos observar los diferentes azúcares liberados, entre ellos monosacáridos pécticos
(xilosa, arabinosa, ramnosa, galactosa y GalA), disacáridos, trisacáridos y tetrasacáridos
desconocidos; los pentasacáridos estaban presentes únicamente en algunas muestras
hidrolizadas con CAN y en cantidad mínima.
Figura 7: Perfiles cromatográficos (GC-FID) de muestras de pectina hidrolizadas, (en rojo: ensayo 8 con
CAN; en azul: ensayo 2 con PUO).
Los datos de los análisis por GC se resumen en la Tabla 4. En primer lugar, podemos valorar
globalmente los monosacáridos y oligosacáridos presentes en los hidrolizados. Como se
observa, CAN tiende a liberar mayor cantidad de POS y menor cantidad de monosacáridos que
PUO. Esto, una vez más, coincide con los resultados vistos con anterioridad, y puede ser
27
indicador de que CAN tiene mayor actividad endopoligalacturonasa, por lo que tendría mayor
predisposición a romper enlaces internos, liberando grandes fragmentos de carbohidratos y
oligómeros, pero menos monómeros. En cambio, PUO tendría mayor actividad
exopoligalacturonasa, rompiendo los enlaces glicosídicos de los extremos y liberando GalA.
Aunque CAN se trate de una celulasa, en un trabajo previo (Sabater et al., 2018) se comprobó
que tenía una gran actividad hidrolítica frente a ácido poligalacturónico, y fue esta la causa de
su utilización en este estudio. Por otra parte, Latarullo, Tavares, Maldonado, Leite y Buckeridge
(2016) han descrito que A. niger produce endopoligalacturonasa, en concordancia con nuestros
resultados. En cuanto a PUO, la liberación de GalA se corresponde con la actividad pectin liasa
indicada por el fabricante. Gracias a esta actividad se produce la rotura del enlace α (1-4) de
una molécula de GalA metil-estarificada, dando lugar a oligosacáridos con grupos 4-deoxi-6-
O-metil-α-D-galacto-4-enuronosil en los extremos no reductores (Novozymes, 2015).
Tabla 4: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los carbohidratos de baja Mm presentes en los
hidrolizados enzimáticos. Se representan los valores medios de los 17 ensayos realizados con ambos enzimas
(celulasa de A. niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO)) así como el rango de la concentración (Cc)
expresada en mg/100 mg sólidos y en % respecto al total de compuestos cuantificados.
Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio
Cc % Cc %
Media ±
DE Rango
Media ±
DE Rango
Media±
DE Rango
Media ±
DE Rango
Xilosa 0,5 ± 0,2 0,3 – 1,3 12,5 ± 7,3 2,9 – 25,4 0,6 ± 0,2 0,3 – 1,2 2,6 ± 0,7 1,1 – 4,0
Arabinosa 0,9 ± 0,8 0,0 – 3,1 15,5 ± 9,1 0,0 –30,3 7,0 ± 2,4 0,9 – 9,3 26,6 ± 6,7 10,4 – 36,4
Ramnosa - 0,0 – 0,1 0,0 ± 0,2 0,0 – 0,8 0,9 ± 0,3 0,1 – 1,5 3,4 ± 1,0 1,5 – 5,1
Galactosa 0,6 ± 0,5 0,1 – 1,5 10,8 ± 7,2 2,2 – 22,1 2,5 ± 0,6 1,0 – 3,1 10,0 ± 0,9 8,2 – 12,1
GalA 1,5 ± 1,8 0,1 – 6,1 19,9 ±14,0 4,2 – 47,6 12,7 ± 3,4 4,7–20,2 49,9 ± 4,6 39,0 – 57,6
TOTAL
Monosacáridos 3,5 ± 2,8 0,9 - 11,1 58,8 ±16,9 34,7 – 83,0 23,9 ± 6,2 7,0 – 32,8 92,6 ± 4,4 79,0 – 96,1
Disacáridos 1,6 ± 1,3 0,8 – 5,0 31,1 ±12,9 12,3 – 48,2 1,3 ± 0,4 0,7 – 2,3 5,7 ± 3,5 2,8 – 16,7
Trisacáridos 0,4 ± 0,3 0,2 – 1,3 7,9 ± 3,3 2,6 – 14,4 0,3 ± 0,1 0,2 – 0,5 1,5 ± 1,0 0,8 – 4,1
Tetrasacáridos 0,1 ± 0,1 0,0 – 0,3 2,0 ± 2,0 0,3 – 5,8 0,1 ± 0,0 0,0 – 0,1 0,2 ± 0,1 0,0 – 0,4
Pentasacáridos - 0,0 – 0,1 0,2 ± 0,1 0,0 – 0,5 - - - -
TOTAL POS 2,1 ± 1,7 1,0 – 6,4 41,2 ±16,9 17,0 – 65,3 1,7 ± 0,5 1,0 – 2,9 7,4 ± 4,4 3,9 – 21,0
Por otro lado, aunque con ambos enzimas la abundancia de monosacáridos liberados sigue casi
el mismo orden (GalA > arabinosa > galactosa), la cantidad es mucho mayor con PUO, salvo
28
en el caso de xilosa en el que es casi igual, indicando que la actividad xilanasa de CAN es
superior. Otro aspecto aún más importante es la ausencia de ramnosa en los hidrolizados con
CAN, esto nos estaría indicando que el esqueleto de los dominios RG-I y II quedaría intacto en
estas muestras.
Por otra parte, la cuantificación de los monosacáridos individuales permite analizar con mayor
profundidad la actividad glicolítica de ambos enzimas; para ello, podemos calcular qué
porcentaje de cada monosacárido se ha hidrolizado respecto a su contenido en la pectina
original, caracterizada previamente en el laboratorio (Sabater et al., 2018). Estos resultados
quedan reflejados en la Figura 8, salvo el caso de la xilosa que en la pectina original no fue
determinada. Visualmente, una vez más se confirma que la capacidad glicosidasa de PUO es
mucho mayor que la de CAN, aun considerando que de PUO se utilizaban dosis mayores de
enzima. Además, se puede observar cómo ambos enzimas poseen mayor actividad
galactosidasa y baja especificidad para la liberación de GalA. Quizás esta actividad pueda
parecer mayor que la pectin liasa y poligalacturonasa, pero puede ser debido a que la cantidad
de sustrato (galactosa) disponible sea mucho menor. Esto puede explicar que, en general para
ambos enzimas el GalA haya sido el monómero que menos se ha liberado. CAN apenas actúa
sobre GalA y no hidroliza ramnosa, a diferencia de PUO, que actúa sobre la ramnosa de forma
considerable. En otros estudios se ha comprobado que existía actividad β-galactosidasa en
preparados enzimáticos provenientes del mismo microorganismo, A. aculeatus (Cardelle-Cobas
et al., 2009).
Figura 8: Porcentaje de liberación de cada monosacárido cuantificado, en % con respecto a la pectina
original.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
Arabinosa Galactosa Ramnosa GalA
% li
be
raci
ón
CAN
PUO
29
En cuanto a los POS liberados, en ambos casos la cantidad era muy baja (1,7 - 2,1 mg/100 mg),
siendo principalmente disacáridos, algo de trisacáridos y tetrasacáridos, encontrándose poco
más que trazas de pentasacáridos en algún hidrolizado de CAN. Una posible explicación a esta
baja presencia de POS sería que la técnica de GC-FID no es capaz de detectar oligómeros de
este tipo con GP > 5 y la respuesta del detector disminuye al aumentar el GP, aunque su
presencia en las muestras hidrolizadas sea muy probable. El análisis por la técnica HPSEC-
ELSD permitirá su confirmación.
5.2.3 Distribución de la masa molecular de los POS liberados
Mediante HPSEC-ELSD se estudió la totalidad de carbohidratos obtenidos tras la hidrólisis de
pectina, pudiéndose establecer grupos de carbohidratos según rangos de Mm (Figura 9). Según
podemos observar en ambos perfiles, en todas las muestras se pudieron identificar entre 3 y 5
picos, que corresponden a los rangos de Mm identificados en la Figura 9a para CAN y 9b para
PUO, aunque para su cuantificación se han agrupado todos los fragmentos mayores de 100 kDa,
ya que se consideraban pectina o pectina modificada, no POS.
Según se puede apreciar en la Figura 9 y en las Tablas 5 y 6, los resultados obtenidos para
ambos enzimas son muy diferentes. CAN tiende a formar fragmentos de mayor Mm (100-5
kDa) que representan un promedio del 27,9 ± 5,9% frente al 13,6 ± 2,7% de fragmentos de 5-
0,3 kDa que forma, mientras que PUO tiene tendencia a formar POS de menor Mm (5-0,3 kDa)
con una media del 25,8 ± 3,3% frente al 20,3 ± 5,0% de los comprendidos entre 5 y 100 kDa.
Cabe mencionar que con PUO apenas quedan fracciones de 100 kDa, estando estas presentes
sólo en tres ensayos, uno correspondiente al valor –α de tiempo (0,32 h), otro al +α de pH (7,17)
y el último al –α de enzima (9,3 Ud/g pectina). Por otra parte, este análisis corrobora los datos
obtenidos por GC para los fragmentos con Mm ≤ 0,3 kDa formados con PUO (20,1 ± 4,9%),
mucho más abundantes que con CAN (11,5 ± 0,9%), y que corresponden fundamentalmente a
monosacáridos. Estos datos confirman que en las reacciones llevadas a cabo con PUO la
hidrólisis ha sido mayor, pero también y más importante, que los productos de hidrólisis
obtenidos presentan un patrón de Mm muy distinto, por lo que puede resultar muy interesante
su producción a mayor escala para comprobar si las propiedades que presentan son distintas.
Según los resultados obtenidos con los tres tipos de análisis, si bien son complementarios, han
sido los datos obtenidos mediante HPSEC-ELSD los que han resultado más informativos. Por
este motivo, hemos profundizado en su análisis, considerando para ello la concentración de los
30
POS con Mm inferior a 100 kDa y superior a 0,3 kDa, y se ha estudiado el efecto sobre este
parámetro de las variables independientes estudiadas en los diseños experimentales (Figura 10).
Figura 9: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de muestras de pectina hidrolizadas, (a) ensayo 14 con
CAN; b) ensayo 1 con PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada zona del cromatograma.
31
Tabla 5: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con CAN. Para cada
rango de Mm (indicados en la Figura 9a) se ha calculado la Mm media en kDa, la concentración de
carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los compuestos cuantificados. Los
resultados se expresan como media y desviación estándar entre paréntesis, (n=2).
> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa
Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %
Ensayo
1
675
(230)
10,4
(0,2)
16,6
(0,3)
9,1
(2,1)
28,2
(0,1)
45,1
(0,2)
2,4
(2,6)
12,5
(0,2)
19,9
(0,3)
0,1
(0,1)
11,4
(0,0)
18,3
(0,0)
Ensayo
2
339
(60)
27,1
(0,2)
46,0
(0,3)
7,8
(1,2)
10,7
(0,2)
18,1
(0,3)
4,3
(0,4)
10,7
(0,1)
18,1
(0,1)
0,2
(0,3)
10,4
(0,0)
17,7
(0,0)
Ensayo
3
814
(410)
9,8
(0,2)
13,7
(0,1)
11,5
(0,0)
38,5
(0,5)
53,8
(0,3)
4,5
(0,1)
13,1
(0,4)
18,3
(0,1)
0,2
(0,1)
10,2
(0,0)
14,2
(0,3)
Ensayo
4
598
(117)
11,5
(0,1)
17,9
(0,2)
10,3
(0,6)
29,6
(0,1)
46,0
(0,0)
2,3
(0,2)
12,1
(0,1)
18,8
(0,0)
0,2
(0,0)
11,1
(0,1)
17,2
(0,1)
Ensayo
5
278
(98)
19,1
(0,1)
24,4
(0,2)
9,4
(0,1)
27,8
(0,6)
35,4
(0,5)
4,6
(0,8)
17,7
(0,5)
22,6
(0,1)
0,2
(0,0)
13,8
(0,5)
17,6
(0,1)
Ensayo
6
402
(445)
19,7
(0,0)
25,7
(0,2)
10,4
(1,2)
28,5
(0,2)
37,2
(0,1)
4,0
(0,0)
16,6
(0,3)
21,6
(0,2)
0,1
(0,1)
11,9
(0,1)
15,5
(0,0)
Ensayo
7
630
(136)
12,9
(0,6)
19,6
(0,3)
10,2
(0,2)
31,1
(1,0)
47,2
(1,1)
3,0
(0,6)
11,4
(0,3)
17,3
(0,0)
0,1
(0,1)
10,5
(0,0)
15,9
(0,4)
Ensayo
8
367
(65,3)
11,2
(0,1)
17,2
(0,6)
10,9
(0,8)
28,9
(0,8)
44,6
(0,9)
4,0
(0,1)
13,1
(0,4)
20,2
(0,0)
0,2
(0,0)
11,6
(0,3)
18,0
(0,1)
Ensayo
9
433
(113)
11,0
(0,2)
19,8
(0,1)
37,0
(12,2)
19,7
(0,3)
35,4
(0,1)
4,1
(0,6)
13,0
(0,2)
23,4
(0,0)
0,2
(0,0)
12,0
(0,0)
21,5
(0,3)
Ensayo
10
348
(90)
20,4
(0,2)
25,0
(0,2)
8,4
(1,6)
31,1
(0,4)
38,1
(0,4)
3,4
(0,3)
18,0
(0,5)
22,1
(0,5)
0,2
(0,0)
12,1
(0,2)
14,8
(0,2)
Ensayo
11
230
(121)
19,4
(0,2)
23,6
(0,2)
9,1
(0,2)
30,9
(0,1)
37,4
(0,2)
4,1
(0,0)
19,6
(0,7)
23,7
(0,5)
0,2
(0,1)
12,6
(0,1)
15,3
(0,1)
Ensayo
12
677
(24,0)
13,2
(0,7)
19,1
(0,7)
14,0
(0,1)
31,6
(0,4)
45,8
(0,5)
3,3
(0,1)
13,0
(0,3)
18,8
(0,7)
0,2
(0,0)
11,3
(0,1)
16,3
(0,2)
Ensayo
13
839
(127)
12,2
(0,1)
17,6
(0,1)
16,0
(2,4)
32,2
(0,3)
46,6
(0,5)
4,8
(1,1)
13,3
(0,1)
19,2
(0,2)
0,2
(0,1)
11,6
(0,2)
16,7
(0,0)
Ensayo
14
588
(102)
10,3
(0,1)
16,5
(0,8)
10,2
(0,8)
28,2
(0,9)
45,2
(0,5)
3,9
(0,0)
12,6
(0,7)
20,2
(0,3)
0,2
(0,0)
11,2
(0,2)
18,0
(0,4)
Ensayo
15
627
(36,6)
10,1
(0,0)
16,4
(0,0)
11,6
(1,0)
26,5
(0,2)
42,7
(0,4)
3,8
(0,0)
13,3
(0,0)
21,4
(0,0)
0,2
(0,0)
12,1
(0,0)
19,6
(0,0)
Ensayo
16
710
(35,0)
10,5
(0,1)
19,0
(0,2)
11,2
(4,6)
24,9
(0,0)
45,0
(0,0)
4,1
(0,0)
10,0
(0,1)
18,1
(0,2)
0,2
(0,0)
10,0
(0,0)
18,0
(0,1)
Ensayo
17
630
(23,1)
10,0
(0,1)
16,9
(0,1)
11,1
(0,6)
26,5
(0,4)
44,8
(0,4)
3,7
(0,1)
11,8
(0,1)
19,9
(0,1)
0,2
(0,0)
11,0
(0,0)
18,5
(0,3)
32
Tabla 6: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con PUO. Para cada
rango de Mm (indicados en la Figura 9b) se ha calculado la Mm media en kDa, la concentración de
carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los compuestos cuantificados. Los
resultados se expresan como media y desviación estándar entre paréntesis, (n=2).
> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa
Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %
Ensayo
1 - - -
8,4
(0,4)
22,5
(1,3)
31,0
(0,6)
3,7
(0,0)
29,1
(4,7)
40,0
(1,5)
0,1
(0,0)
21,0
(1,9)
29,0
(1,0)
Ensayo
2 - - -
8,8
(0,2)
23,1
0,3)
34,9
(0,1)
3,6
(0,1)
27,3
(1,2)
41,2
(0,5)
0,1
(0,0)
15,9
(0,2)
23,9
(0,4)
Ensayo
3 - - -
12,2
(1,2)
30,7
(0,2)
38,9
(0,2)
3,7
(0,0)
26,3
(0,4)
33,3
(0,0)
0,1
(0,0)
21,9
(0,2)
27,8
(0,1)
Ensayo
4 - - -
8,2
(0,4)
22,7
(0,1)
34,6
(0,2)
3,6
(0,1)
25,3
(0,1)
38,6
(0,2)
0,1
(0,0)
17,6
(0,1)
26,8
(0,1)
Ensayo
5 - - -
11,3
(0,4)
22,2
(0,1)
28,6
(0,2)
3,5
(0,0)
26,0
(0,4)
33,5
(0,1)
0,1
(0,0)
29,5
(0,4)
37,9
(0,1)
Ensayo
6 - - -
11,1
(3,7)
14,7
(1,7)
20,9
(1,5)
3,5
(0,0)
26,9
(1,1)
38,4
(0,2)
0,1
(0,0)
28,5
(0,4)
40,7
(1,3)
Ensayo
7 - - -
7,7
(1,2)
23,4
(0,3)
35,5
(0,5)
3,6
(0,0)
26,2
(0,3)
39,7
(0,6)
0,1
(0,0)
16,4
(0,0)
24,8
(0,1)
Ensayo
8 - - -
10,0
(0,7)
19,6
(1,4)
27,8
(0,9)
3,6
(0,1)
31,6
(1,2)
44,7
(0,1)
0,1
(0,0)
19,4
(0,1)
27,5
(0,9)
Ensayo
9 - - -
11,5
(4,7)
21,3
(0,1)
31,3
(0,2)
3,5
(0,0)
25,9
(0,3)
38,0
(0,2)
0,1
(0,0)
21,0
(0,3)
30,7
(0,3)
Ensayo
10 - - -
15,3
(4,9)
12,6
(0,4)
22,7
(0,3)
3,7
(0,0)
23,1
(1,1)
41,8
(0,3)
0,1
(0,0)
19,6
(0,8)
35,5
(0,0)
Ensayo
11
113
(3,9)
9,2
(0,1)
13,7
(0,5)
9,9
(0,4)
22,8
(0,5)
34,0
(0,2)
3,7
(0,1)
22,2
(1,4)
33,1
(0,6)
0,2
(0,1)
12,8
(0,7)
19,1
(0,2)
Ensayo
12 - - -
8,6
(1,6)
12,2
(0,1)
19,1
(0,5)
3,6
(0,1)
26,0
(0,6)
40,6
(0,2)
0,1
(0,0)
25,8
(0,7)
40,3
(0,3)
Ensayo
13 - - -
19,8
(3,5)
13,4
(0,5)
22,7
(0,5)
3,7
(0,1)
27,7
(0,2)
46,7
(0,3)
0,1
(0,0)
18,1
(0,2)
30,6
(0,2)
Ensayo
14
94,2
(31,2)*
10,2
(0,0)
14,9
(0,3)
10,2
(1,1)
16,0
(0,2)
23,5
(0,2)
3,8
(0,1)
22,5
(0,8)
32,9
(0,6)
0,1
(0,0)
19,6
(0,3)
28,7
(0,1)
Ensayo
15
99,7
(15,3)*
9,8
(0,0)
15,5
(0,4)
12,8
(0,8)
26,0
(0,5)
41,2
(0,6)
3,7
(0,1)
16,4
(0,7)
26,1
(0,4)
0,2
(0,1)
10,9
(0,3)
17,3
(0,1)
Ensayo
16 - - -
11,3
(3,2)
20,5
(0,4)
30,5
(0,7)
3,8
(0,1)
23,8
(0,0)
35,4
(0,2)
0,1
(0,0)
22,9
(0,2)
34,1
(0,1)
Ensayo
17 - - -
8,6
(0,1)
21,2
(0,1)
31,2
(0,2)
3,7
(0,1)
26,5
(0,2)
39,0
(0,1)
0,1
(0,0)
20,3
(0,2)
29,8
(0,0)
* Valor de Mm fuera del rango correspondiente a su ubicación, clasificado según la distribución global de los picos.
33
En cuanto a las tendencias de hidrólisis en función de cada variable, se observa cómo en el caso
de CAN las tendencias son más lineales, salvo en alguna de las condiciones extremas, mientras
que con PUO no hay tendencias claras. Por lo general, para ambos enzimas se obtiene una
mayor formación de POS a pH bajo, tiempos cortos de reacción y bajas cantidades de enzima.
Estos resultados tienen sentido, teniendo en cuenta que se busca un equilibrio para que la
pectina se hidrolice pero sin excesiva liberación de monosacáridos.
En la Figura 10a y 10d se observa el efecto del pH, en líneas generales, opuesto para ambos
enzimas. Para PUO, la formación de POS a pH extremos (3,8 y 7,2) era más baja probablemente
por una menor actividad del enzima que se ve claramente a pH 7,2, ya que es una de las
condiciones en la que queda algo de pectina sin hidrolizar, mientras que para CAN la liberación
de POS era mayor a pH 3,8 y significativamente inferior a pH 6,5. En los valores centrales
también se observan diferencias significativas: en el caso de CAN la formación de POS
disminuye a medida que el pH aumenta, mientras que para PUO, se observa una mínima
formación de POS en el valor central (pH 5,5), mientras que a pH 4,5 y 6,5 su liberación es
similar. Teniendo en cuenta el tiempo, se ve cómo los extremos axiales (0,32 y 6,19 h) tienen
una distribución lógica. Para PUO a tiempo corto la hidrólisis aún no ha avanzado demasiado
y la cantidad de POS es más alta, aunque queda pectina sin hidrolizar, mientras que a tiempos
largos la hidrólisis ha avanzado en exceso y la fracción más importante es la de Mm < 0,3 kDa;
este efecto es más marcado con CAN. Centrándose en la cantidad de enzima añadida, en el caso
de PUO se da una tendencia lógica, donde una menor cantidad de enzima produce una hidrólisis
de menor intensidad, con presencia de pectina sin hidrolizar y pocos monosacáridos, mientras
que añadiendo grandes cantidades de enzima hay mayor cantidad de monosacáridos; en ambos
casos la cantidad de POS es baja. En el caso de CAN, la tendencia de los valores medios es
semejante, y cuando se analizan los datos de la Tabla 5 se ve que la influencia de la cantidad
de enzima no es clara.
No obstante, aunque se aprecian ligeras diferencias entre las distintas condiciones ensayadas,
éstas no son estadísticamente significativas, poniendo de manifiesto una gran variabilidad entre
los resultados. Esto y la falta de tendencias definidas o intuitivas en los perfiles de hidrólisis en
función de cada variable hacen que el proceso de optimización sea muy complejo. Además, la
formación de POS es un concepto un tanto ambiguo, ya que es difícil establecer el límite entre
lo que se considera POS de alta Mm, pectina modificada, y pectina sin hidrolizar.
34
Figura 10: Gráficos de cajas donde se relacionan las variables estudiadas: pH (a, d), tiempo (b, e) y cantidad
de enzima (c, f) con la producción de POS con masas moleculares comprendidas entre 100 y 0,3 kDa en cada
uno de los 17 ensayos que componen los diseños experimentales para PUO (a, b, c) y CAN (d, e, f). a,b
Diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.
5.3 Optimización de la obtención de POS
Para optimizar la obtención de POS utilizando los dos enzimas, primero se analizó el diseño
mediante RSM y se estudiaron como variables dependientes Y1: POS de Mm en el intervalo de
100 < Mm < 0,3 kDa, determinados por HPSEC-ELSD (mg/g); Y2: POS de GP 2-5,
determinados por GC-FID (mg/g), ambas se maximizaban; e Y3: liberación de monosacáridos
pécticos, que se minimizaban. Sin embargo, dada la complejidad de la optimización del proceso
estudiado, los coeficientes de regresión R2 y R2 ajustado obtenidos eran muy bajos,
comprendidos entre 0,8 y 0,5 para la primera variable e inferiores para Y2 e Y3 (datos no
mostrados) (Tabla 7). Además, se produjeron errores pronunciados en las predicciones del
modelo, medidos por los valores de RMSE, que evidenciaban una baja calidad y exactitud del
ajuste. Probablemente debido a la falta de robustez del modelo, las condiciones de reacción
óptimas indicadas por el mismo correspondían a algunos valores extremos del diseño para pH
y tiempo (Tabla 7), siendo para CAN pH bajo y tiempo largo y para PUO pH alto y tiempo
mínimo; únicamente la cantidad de enzima no se encontraba en los extremos. Estos resultados
35
cuestionan también la validez del modelo, poniendo en duda si se ha alcanzado o no una
verdadera optimización. Por este motivo, se recurrió a un método de regresión más avanzado
como las ANN, que permitan explicar en mayor medida el comportamiento de los enzimas.
En este estudio, en base a los resultados obtenidos para RSM, nos centramos en los datos
facilitados por HPSEC-ELSD, variable Y1, que han resultado más informativos y más
importantes cuantitativamente, considerando que las fracciones de más de 100 kDa son pectina
sin hidrolizar y las de menos de 0,3 kDa son monosacáridos. Por esta razón, son estos los datos
que hemos utilizado para modelizar con las ANN el proceso con ambos enzimas y obtener las
condiciones óptimas de reacción para maximizar la obtención de POS.
Estos modelos se entrenaron con el 70% de los datos (correspondientes a los resultados de los
ensayos que componen cada diseño, incluyendo los duplicados para considerar también el error
de las determinaciones), y se validaron con el 30% como muestras ajenas al modelo. La división
de los datos se realizó al azar. Como se observa en la Tabla 7, los coeficientes R2 de las ANN
respecto a RSM mejoraron, pero la diferencia entre ambos métodos fue mayor para los R2
ajustados. Otro aspecto importante del método ANN es que tiene una parte de validación, que
hace que sea un método mucho más robusto que RSM. Además, se calcularon los valores
RMSE, uno de los parámetros más importantes en un modelo predictivo, y se observó cómo
estos eran mucho menores para ANN.
Tabla 7: Parámetros estadísticos importantes, ajustes y errores de los modelos RSM y ANN. Condiciones
óptimas determinadas mediante cada modelo.
RSM ANN
CAN PUO CAN PUO
ENTRENAMIENTO R2 0,86 0,88 0,99 0,89
R2 ajustado 0,57 0,62 0,98 0,87
RMSE 0,21 0,16 0,02 0,08
VALIDACIÓN R2 - - 0,96 0,91
R2 ajustado - - 0,94 0,85
RMSE - - 0,04 0,09
CONDICIONES ÓPTIMAS
pH 3,8 7,2 4,41 6,86
Tiempo (h) 6,18 0,32 0,9 1,5
Cantidad de enzima
(Ud/g pectina) 47,2 459,7 17,1 520,5
36
El hecho de que para ANN los coeficientes de regresión sean elevados y los errores de
entrenamiento y validación sean similares indica la posibilidad del modelo de generalizarse y,
por tanto, optimizarse. Con este fin, se calcularon todos los rendimientos teóricos del modelo
considerando todas las posibles combinaciones de las tres condiciones de reacción estudiadas
(pH, tiempo y cantidad de enzima). De esta manera, se obtuvieron una serie de gráficos de
superficie que se muestran en la Figura 11. Analizando la información generada, se llegó a la
conclusión de que con las condiciones de reacción que aparecen en la Tabla 7 se obtenían los
rendimientos teóricos máximos. Como se puede ver, y a diferencia de la RSM, para las
condiciones óptimas no fueron seleccionadas condiciones extremas de reacción.
Con el análisis por ANN se lograron mejores ajustes que con RSM, se disminuyó el error de
las predicciones y se puso de manifiesto que en los diseños experimentales los intervalos de
valores elegidos para las variables independientes fueron adecuados. La deseabilidad teórica
para la obtención de POS con ambas enzimas fue superior a 0,99, mientras que la experimental
fue de 0,95 y 0,97 para CAN y PUO, respectivamente. En general, la deseabilidad representa
el valor de las variables independientes sobre la variable dependiente, determinando la
eficiencia del proceso, muy elevada en este caso.
Figura 11: Gráficos de superficie para las ANN utilizadas para modelar el comportamiento de CAN (a, b,
c) y PUO (d, e, f), mostrando la influencia de las variables independientes (tiempo y cantidad de enzima (a,
d), tiempo y pH (b, e) y pH y cantidad de enzima (c, f)) sobre la producción de POS en el intervalo 100 >
Mm > 0,3 kDa.
37
Por último, se estudió la importancia de los distintos factores para la modelización, determinada
mediante un análisis de sensibilidad. En el caso de CAN, se obtuvieron valores relativos de
importancia para cada variable estudiada, que se calcularon sumando los productos de los
coeficientes que conectan la capa de entrada con la capa oculta y la capa oculta con la capa de
salida. Así, se observó que tanto la interacción del pH y la cantidad de enzima, la interacción
del tiempo y la cantidad de enzima como la interacción de los tres factores, presentaban los
coeficientes de importancia más elevados (11,15; 11,62 y 11,18; respectivamente). En cuanto
al efecto de los factores individuales, el más influyente fue la cantidad de enzima, cuya
importancia también se aprecia en la interacción de las variables estudiadas, seguida del tiempo
y el valor de pH como el menos importante. Por otra parte, en la modelización de PUO, los
factores más influyentes fueron la interacción del pH y la cantidad de enzima seguida de la
interacción del tiempo y la cantidad de enzima, así como la cantidad de enzima, con unos
coeficientes de importancia de 53,58; 26,33 y 23,52 respectivamente. De manera similar al caso
anterior, nuevamente se pudo apreciar que el factor menos influyente era el pH. Estos datos
ponen de manifiesto que la cantidad de enzima es el parámetro con mayor relevancia a la hora
de obtener POS utilizando CAN y PUO, así como el efecto de la interacción de este parámetro
con el resto de variables estudiadas, siendo el pH el parámetro que menos influencia ejercía
sobre los modelos.
En general, existen pocos estudios relativos a la optimización de la obtención de POS, pudiendo
reseñarse la producción ácida de POS a partir de mangostán (Gan & Latiff, 2011) utilizando un
diseño experimental analizado por RSM donde los rendimientos fueron inferiores a los de este
trabajo, estando comprendidos entre el 10 y el 25%. El empleo de modelos como las ANN
mejora la capacidad predictiva de los ajustes en comparación con la RSM, con una disminución
importante del error. En el campo de los carbohidratos este método ha sido utilizado para la
modelización de la obtención de mezclas de oligosacáridos a partir de la pulpa de la remolacha
azucarera (Astray et al., 2016). Estos modelos son prometedores dentro de la extracción de
ingredientes funcionales, pudiéndose aplicar a otro tipo de compuestos como a la optimización
de la extracción de resveratrol mediante la combinación de pectinasas y ultrasonidos (Lin et al.,
2016), donde las ANN también permitieron mejorar notablemente la exactitud de los ajustes
frente a la RSM.
5.4 Análisis de los hidrolizados obtenidos en las condiciones óptimas
En cuanto a los resultados de los carbohidratos de baja Mm liberados en las condiciones óptimas
de estos ensayos (Tabla 8) se puede observar que, porcentualmente, CAN tiene mayor tendencia
38
a la formación de POS que PUO, de igual forma que se observaba en los ensayos del diseño
experimental. Aun así, en ninguno de los casos se muestra una gran cantidad de POS. La
explicación a este hecho podría ser que las condiciones de hidrolisis se han optimizado para
una mayor obtención de POS en función de los resultados del HPSEC-ELSD, y no los del GC-
FID, por su menor importancia cuantitativa. En la cromatografía de exclusión molecular se ven
fracciones moleculares de mayor tamaño (el calibrado incluye patrones desde disacáridos
(0,342 kDa) hasta 788 kDa) que las que se pueden analizar por GC; esta técnica sólo nos ha
permitido ver hasta pentasacáridos en algún ensayo, que corresponden a una Mm ≤ 1 kDa, y
son precisamente compuestos entre 100 y 0,3 kDa los que se han maximizado en estos diseños.
En cuanto a los monosacáridos, se puede observar la misma tendencia que en el apartado 5.2.2,
(Tabla 4) con la única excepción de la ausencia de ramnosa también en el hidrolizado con PUO.
Tabla 8: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los hidrolizados optimizados. La concentración de
carbohidratos (Cc) se representa en mg/100 mg de sólidos.
Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio
Cc % Cc %
Media ± DE Media ± DE Media ± DE Media ± DE
Xilosa 0,5 ± 0,0a 32,1 ± 3,6a 0,4 ± 0,0b 1,7 ± 0,1b
Arabinosa 0,2 ± 0,0b 9,9 ± 1,2b 5,7 ± 0,1a 24,2 ± 0,8a
Ramnosa - - - -
Galactosa 0,1 ± 0,1b 8,8 ± 4,1a 1,5 ± 0,0a 6,5 ± 0,0a
Ácido galacturónico 0,5 ± 0,1b 30,0 ± 6,0b 15,7 ± 0,4a 66,2 ± 0,7a
TOTAL
MONOSACÁRIDOS 1,2 ± 0,1b 78,7 ± 0,5b 23,3 ± 0,3a 98,6 ± 0,0a
Disacáridos 0,3 ± 0,0a 20,8 ± 0,4a 0,3 ± 0,0a 1,4 ± 0,0b
Trisacáridos - 0,5 ± 0,1a - 0,1 ± 0,0a
Tetrasacáridos - - - -
Pentasacáridos - - - -
TOTAL POS 0,3 ± 0,0a 21,3 ± 0,5a 0,3 ± 0,0a 1,4 ± 0,0b
a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las concentraciones y los porcentajes de los distintos azúcares
determinados en los hidrolizados con las dos enzimas.
Los resultados del análisis por HPSEC-ELSD, recogidos en la Tabla 9, muestran nuevamente
que CAN hidroliza en menor extensión que PUO, y que la primera forma mayor cantidad de
POS de 5-100 kDa, que pueden ser de gran interés, que el segundo enzima, que libera mayor
cantidad de monosacáridos y POS de tamaño molecular menor a 5 kDa. Si se comparan con el
39
ensayo 3 de CAN y PUO, que fue el que mayor cantidad de POS dio en los diseños
experimentales, se observa un claro aumento en la producción de los que se consideran POS.
Por tanto, se demuestra que las condiciones seleccionadas como óptimas son las adecuadas para
producir una mayor cantidad de POS.
Tabla 9: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los hidrolizados obtenidos en las condiciones
óptimas. Para cada rango de Mm se representa la Mm media en kDa, la concentración de carbohidratos
(Cc) en mg/100 mg y el porcentaje (%) frente al contenido total de carbohidratos cuantificados. Los datos
están representados como valor medio y su desviación estándar (DE) (n=2). a, b Diferencias estadísticamente
significativas entre las masas moleculares, concentraciones y los porcentajes de los distintos fragmentos
determinados en los hidrolizados con las dos enzimas.
Pectina POS Monosacáridos
> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa
Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %
Celulasa de
A. niger
555a
(53,4)
11,2a
(0,0)
12,5a
(0,1)
13,8a
(0,1)
65,9a
(2,1)
73,7a
(2,1) - - -
0,2a
(0,0)
12,3b
(0,2)
13,8b
(0,1)
Pectinex®
Ultra Olio - - -
8,9b
(0,1)
31,1b
(1,2)
35,1b
(0,4)
3,8a
(0,1)
31,2a
(3,7)
35,1a
(1,0)
0,1b
(0,0)
26,4a
(2,5)
29,8a
(0,1)
Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio
ÓPTIMO Ensayo 3 ÓPTIMO Ensayo 3
TOTAL
POS
(mg/100 mg)
65,9 ± 2,1 51,6 ± 1,6 62,4 ± 5,6 57,0 ± 0,9
La Figura 12 muestra los perfiles cromatográficos de los hidrolizados obtenidos con CAN y
PUO en las condiciones óptimas. En ella se pueden apreciar claramente sus diferencias
cualitativas.
40
Figura 12: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de los hidrolizados obtenidos en condiciones óptimas,
(en rojo: CAN; en azul: PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada zona del cromatograma.
5.4.1 Determinación de la actividad antioxidante
Para comprobar si la diferencia que se ha apreciado con los análisis cromatográficos anteriores
se ve reflejada en otras propiedades de los hidrolizados se decidió estudiar la actividad
antioxidante de los mismos por el método del DPPH. Este método es uno de los métodos más
comunes para determinar la actividad antioxidante in vitro. Este tipo de análisis se utiliza
cuando el compuesto potencialmente antioxidante actúa sobre los radicales libres, como
secuestrante o neutralizador.
Mediante este método se determinó la capacidad antioxidante de los POS optimizados. Los
resultados fueron una capacidad antioxidante (valor TEAC) de 97,9 ± 14,0 mg de equivalentes
de trolox por g de POS para CAN y 121,1 ± 1,4 mg de equivalentes de trolox por g de POS para
PUO. La actividad antioxidante de los POS de PUO ha resultado ser algo mayor que la de CAN,
quizás por la mayor cantidad de GalA liberado.
Como numerosos autores, Fissore et al. (2014) indica que la alcachofa es una buena fuente
natural de compuestos antioxidantes como cinarina y otros compuestos fenólicos, y a ellos
atribuye la actividad antioxidante encontrada en los extractos que analiza, coextraídos junto con
pectina e inulina. Tiveron et al. (2012), con un método semejante al utilizado en este trabajo,
determina una actividad antioxidante de 17,5 mg equivalentes de trolox/g de hoja de alcachofa
en polvo, si bien esta es la concentración requerida para reducir la cantidad inicial del radical
DPPH un 50%. Guven, Sensoy, Senyuva y Karakaya (2018) determinan que el incremento de
actividad antioxidante de harina de trigo cuando se adiciona hoja de alcachofa en polvo
corresponde a 63,9 mg equivalentes de trolox/g de hoja de alcachofa en polvo. En cuanto a la
actividad antioxidante de otras pectinas y POS determinadas con el mismo método, Huang, Lu,
41
Wang y Wu (2011) determinan que para la pectina de cítricos con Mm de 353 kDa era de 5 mg
equivalentes de trolox/g de pectina, y este valor se incrementaba hasta 108 mg equivalentes de
trolox/g de POS obtenidos enzimáticamente con una Mm media de 1 kDa. Este incremento de
la capacidad antioxidante estaba positivamente relacionado con la menor Mm de los POS. Por
tanto, al igual que en este último estudio, los POS aquí obtenidos podrían utilizarse como
antioxidantes.
Este trabajo se ha basado en la utilización de dos enzimas, CAN y PUO, seleccionadas en
ensayos previos realizados en el grupo de investigación (Química y Funcionalidad de
Carbohidratos y Derivados) donde se evaluó la utilización de estas enzimas para la obtención
de pectina de alcachofa utilizando distintos preparados enzimáticos comerciales (Sabater et al.,
2018). En dicho trabajo, se determinó de forma aproximada la capacidad pectinolítica de ambos
enzimas, obteniendo resultados que nos llevaron a plantear este estudio.
Aunque es necesario realizar un estudio más exhaustivo sobre las características estructurales
y otras propiedades biológicas de interés de los POS aquí obtenidos, los resultados obtenidos
en este Trabajo Fin de Máster han cumplido con creces sus expectativas al obtener POS
utilizando dos enzimas distintas, CAN y PUO, con altos rendimientos (62 y 66 mg/100 mg de
pectina) y con características estructurales distintas según los resultados obtenidos por GC y
HPSEC, que pueden dar lugar a variaciones en sus propiedades funcionales como es el caso de
las propiedades antioxidantes.
42
6. CONCLUSIONES
- El preparado enzimático celulasa de A. niger (CAN) presenta mayor actividad
endopoligalacturonasa, que Pectinex® Ultra Olio (PUO), con mayor actividad
exopoligalacturonasa.
- Según el análisis de los monosacáridos que liberan ambos enzimas y la Mm de los POS
liberados, es de esperar que las características estructurales de los mismos sean distintas.
- La modelización de los procesos mediante ANN ha permitido determinar las condiciones
óptimas de reacción para obtener el máximo rendimiento de POS para cada uno de los enzimas.
Dichos rendimientos y condiciones fueron, para CAN, 66 mg/100 mg de pectina a pH 4,41, 54
minutos y 17,1 Ud/g pectina, y para PUO 62 mg/100mg de pectina a pH 6,86, 90 minutos y
520,5 Ud/g pectina.
- Los POS obtenidos por CAN tienen mayor masa molecular (un 74% tiene una Mm media de
13,8 kDa) que los obtenidos por PUO (un 35% tiene una Mm media de 8,9 kDa y otro 35% una
Mm media de 3,8 kDa).
- El hidrolizado obtenido en condiciones óptimas con PUO posee mayor poder antioxidante que
el de CAN, posiblemente por la menor Mm de las fracciones formadas.
Dado el interés que plantean los POS aquí obtenidos es recomendable profundizar en su
caracterización. Para ello, deberían fraccionarse los POS según Mm utilizando técnicas de
separación por membranas (ultrafiltración o nanofiltración) y estudiar en las distintas fracciones
su composición monomérica, grado de metilación y la estructura de los compuestos de baja Mm
por GC-FID y MALDI-TOF, así como su capacidad antioxidante y digestibilidad.
43
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