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Métodos de enumeraciónviablesBIOL4029
Dr. Héctor L. Ayala del Río
Determinar la densidad de procariotasen una muestra desconocida
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Enumeración viable
• Principio: crecimiento como indicadorde densidad– Separación de microorganismos en
unidades independientes– Probabilistico
• Medio de Cultivo (sólido o líquido)• Estrategias principales
– Crecimiento y enumeración en platos– El número mas probable (NMP o MPN)
Separación: Diluciones en serie
• Base de todos losmétodos
• Solución salina -- evitarchoque osmótica
• Aspectos técnicos– Procedimientos asépticos– Cambiar pipetas / dilución– Pipetas TD/TC– Mezclar cada tubo– Factor de 10 a diferentes
escalas– Rango amplio
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Como medimos 0.1 ml
Crecimiento y enumeración enplatos
• Crecimiento sobre o dentro del agar• Asumpción básica: cada colonia surge
de un solo microorganismo.• Límites de conteo: 30-300
colonias/plato• Medida: Unidades Formadoras deColonia (ufc)/unidad de materia
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Spread Plate (Plato disperso)
Pour Plate (Plato vertido)
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Pour plate
Filtración en membrana
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Dilución en agar
Rolling chips
“boillingchips” estériles
Rotar placaRemover
asépticamente los“boiling chips”
invertirplaca
muestra
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Ventajas/Desventajas
• Ventajas– Sencillos– Estima células
viables– Sensitividad– Medio selectivo
• Desventajas– 1 col -> célula– Sobrevivencia– Patrón de
crecimiento– Laboriosos– Selectividad medio
de cultivo
El número mas probable(MPN)
• Atributos fisiológicos• Método basado en probabilidad que
requiere:– diluciones– replicación de inoculo– criterio positivos / negativos
• Crecimiento en medio líquido• Mas laborioso
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Factores importantes
• Número de diluciones• Número de replicas• Tamaño del inoculo
MPN en agar10-1
10-2
10-310-4
10
MPN en agar10-1
10-2
10-310-4
• Anotar # de colonias que crecieron y lasque no
Como leer los resultados de elNúmero más probable (MPN)
• Determinar el numero de tubos positivos• Codificar numéricamente• Identificar diluciones con menos de 5 pero > 0• Buscar # en la tabla de MPN• Calcular densidad utilizando correcciones
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Rep
lica 12345
Dilución
5 5 5 5 5 5 2 1 0
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Estimados de densidadutilizando MPN
1. Leer número de la tabla: 69,1482. Identificar factor de dilución en el que
comenzamos a contar: 10-3
3. Volumen del inóculo usado / replica:0.1 ml
1. Factor de dilución 1/0.1 = 1/104. Calculo:
1. 69,148 x 103 x 10 = 6.9 x 108
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Ventajas / Desventajas
• Ventajas– Medio liquido– Selectivo /
Diferencial– Atributos fisiológicos
• Desventajas– Aproximado– ¿Que es un positivo?– Tiempo y material si
no es miniaturizado
ResumenFactores que afectan la
enumeración viable• Tamaño del inoculo• Condiciones de cultivo (medio temperatura)• Tiempo de incubación• Tamaño de las colonias• Diluciones• Patrón de crecimiento del organismo