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Marcadores celulares: radioisótopos, cromóforos, fluoróforos y otros
Métodos y Técnicas de Estudio en Biología Celular
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Radioisótopos: principios generales
•Radioisótopos empleados en biomedicina: 3H, 14C, 13C, 32P, 33P, 35S , 125I, 131I, 24Na
•1 dps = 1 Bq; 60 dpm = 1 Bq; 1 Ci = 37 kBq
•Eficiencia, E = cpm/dpm
Técnicas: autoradiografía (histoquímica, electroforesis), centelleo líquido, contaje gamma, trazadores orgánicos (distribución y metabolización).
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Propiedades de los radioisótopos
3H 14C 35S 32P 125I
T1/2 12.3a* 5730a*87.4d* 14.3d* 60d*Radiación Penetración (aire) 6 mm 24 cm 30 cm 7,2 m > 10 mEscudo No 1 cm 1 cm 1 cm plomo 0.25 mm
(13 mm para 131I)Actividad (Bq) 3·1010 9·108 4·109 1·108 1·107
Limite anual (MBq) 3000 90 80 10 1
*a=años, d=días
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Cromóforos: la absorción
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Ley de Beer-Lambert
I = I0 · 10-c l
Log I0
/I = A = · c · l
T = 100 · (I/I0
)
La densidad óptica (D.O.) es la absorción en us sistema en el que l = 1
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Cromóforos
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Cromóforos: el espectrofotómetro
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Cromóforos intrínsecos
Determinados gruposprostéticos de proteínasactúan como cromóforosintrínsecos. Su espectro característico sirve paraidentificar proteínas.
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Cromóforos intrínsecos
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Fluoróforos: excitación y emisión
La molécula A es fluorescente, mientras B carece de fluorescencia. G denota el estado basal; S el primer estado excitado.
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Esquema del fluorímetro(Formato en L)
Prisma o filtro
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Fluoróforos: ejemplos
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Fluoróforos: Ejemplos
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Medición con Fura-2 de la concentración de Ca2+ en célula de Purkinje.
Ejemplo en microscopia de fluorescencia
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Marcaje de proteínas con anticuerpos fluorescentes. Ejemplo de marcaje con anticuerpos primarios y secundarios
Fluoróforos: Marcaje
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La citometría de flujo es una técnica ampliamente utilizada para separar, clasificar, analizar e investigar las células
Citometría de flujo
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Fluorescencia en la fluidez de membrana
Fluidez y difusión mediante FRAP (Fluorescence Recovery After Fotobleaching)
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Fluorescencia e Interacción entre moléculas (FRET)
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
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Fluorescencia en la fluidez de membrana
Estudio de la fluidez en híbridos ratón-humano
Patching y capping en membranas de leucocitos
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Otros métodos de marcaje
•Oro coloidal•Biotina-Avidina•Marcaje enzimático•Esferas magnéticas•Marcaje de Spin
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Fluorescencia en la fluidez de membrana
EJERCICIO: Describe un experimento en el que uno de los siguientes marcajes sea una buena elección:
1. Marcaje de una proteína con 125I.2. Marcaje de una hormona con 3H.