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1. FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DE INMUNOHISTOQUÍMICA

Es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). La técnica, por la gran especi cidad alta a nidad que tienen los anticuerpos para reconocer moléculas unirse a ellas, permite detectar cantidades ín mas de moléculas presentes en el tejido. La inmensa mayoría de técnicas de inmunohistoquímica pueden aplicarse a tejido jado e incluido en para na con buenos resultados, siempre que la jaci n tisular, su procesado e inclusi n se realicen adecuadamente ya que la utilización de métodos o reactivos inapropiados en el tratamiento tisular previo puede producir pérdidas de antigenicidad que limitarán o impedirán la obtención de resultados ables.

A continuación se expondrán los conceptos básicos que permitirán la compresión de la técnica.

Antígenos: Son aquellas sustancias capaces de producir una reacción inmune. Sus propiedades inmunológicas son: inmunogenicidad (capacidad de producir una respuesta especí ca bien humoral y o celular), antigenicidad (capacidad de combinarse con anticuerpos y o con receptores de células), alergenicidad (capacidad de producir reacción alérgica). La inmunogenicidad viene dada por una serie de factores, es decir, dependerá o bien de la molécula atacada (por ejemplo las proteínas son las más inmunogénicas) o bien del sistema en conjunto (el hombre en este caso; problemas de respuesta inmune).

Epítopos: Son cada uno de los sitios discretos de una macromolécula reconocidos individualmente por un anticuerpo especí co o por un (receptor de linfocitos ) especí co. Son regiones inmunológicamente activas.

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Fundamentos biológicos de inmunohistoquímica

Anticuerpos: La capacidad de reconocimiento especí co de cualquier tipo de molécula o partícula extraña por parte del sistema inmune, es posible gracias a que cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los receptores de los linfocitos ( ), los cuales poseen las cualidades de diversidad, heterogenicidad y procedencia a partir de reordenaciones de genes.

Los tipos de Ig que encontramos el suero son las cinco siguientes ordenadas de mayor a menor concentración en sangre:

1. La IgG atraviesa la vía placentaria. El feto adquiere las primeras inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a menos que se produzca una infección, por lo que sintetizaría IgM. La IgG activa la cascada del complemento por la vía clásica.

2. La IgA se encuentra en la mayor parte de las secreciones corporales, y produce la activación de la cascada del complemento por la vía alternativa.

3. La IgM se encuentra circulante y se encarga de la activación de la cascada del complemento por la vía clásica.

4. La IgD se encuentra como molécula de membrana en los linfocitos B.

5. La IgE aparece en alergias e infecciones por parásitos, siendo indetectable en situaciones normales.

Las inmunoglobulinas se pueden encontrar solubles en sangre o como parte especí ca del complejo de las células B. Están constituidas en su estructura común por dos tipos de cadenas proteicas: pesadas y ligeras, diferenciándose por sus características sicoquímicas, siológicas e inmunológicas.

Las Ig que se encuentran en las membranas de las células B van reconocer al antígeno, es decir anticuerpos secretados por las células plasmáticas procedentes de activación, proliferación y diferenciación de células B. Estos anticuerpos se encuentran en el suero, en los líquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama humoral del sistema inmune especí co, ya que la sola unión antígeno anticuerpo no es su ciente en todos los casos para terminar con él.

En el caso de los receptores de células aparecen sólo como moléculas de membrana de los linfocitos . econocen al antígeno restringido por el complejo mayor de histocompatibilidad o CMH de la célula diana o de la célula presentadora. El CMH son un conjunto de genes presentes en el cromosoma 6 implicados en la presentación de antígenos a las células . Suministran la base de la inmunidad celular especí ca (en el caso de los linfocitos C) y del mecanismo de los linfocitos colaboradores ( H).

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

o p e o antígeno anticuerpo Ag Ac : De ne la unión especí ca entre ambos con el n de inhibir o ralentizar la toxicidad del primero. Se realiza gracias a algunas fuerzas débiles como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van Der Waals, interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La reacción se caracteriza por su especi cidad, rapidez, espontaneidad y reversibilidad.

Antisuero: ambién llamado suero in uno gico, es el suero sanguíneo que contiene anticuerpos policlonales derivados de diferentes líneas de células B.

ara producir un anticuerpo es necesario puri car el antígeno (provocando esta reacción). Lo ideal sería separar una célula que fabricase un tipo determinado de anticuerpo y obtener clones o progenies en medios de cultivo. Esto no es posible debido a la incapacidad de supervivencia de la célula productora de anticuerpos en medio de cultivo. Cada linfocito genera una población celular o clon, genéticamente idénticas (mismo anticuerpo). Sin embargo, en un suero sanguíneo no encontramos un solo tipo de anticuerpos, sino una mezcla heterogénea denominada antisuero o anticuerpos policlonales. Esto es debido a tres razones principalmente:

1. La continua exposición a antígenos hacen que haya siempre un nivel basal de respuesta inmunológica. 2. Los antígenos suelen ir acompañados de impurezas que también producen respuesta inmunológica dando lugar a otros anticuerpos.3. El sistema inmune reconoce al mismo tiempo todos los epítopos que posee un antígeno, dando lugar a distintos anticuerpos para un mismo antígeno.

Antígeno atacado por anticuerpos policlonales

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Fundamentos biológicos de inmunohistoquímica

El problema que se presenta con los Ac policlonales son los inconvenientes que existen en su uso:

La falta de reproductibilidad de resultados, ya que la respuesta inmune varía de unos individuos a otros dentro de una misma especie, e incluso en un mismo individuo en función del momento en que se haga la extracción del suero.

Obtención de cantidades limitadas, que dependen de los lotes de animales inmunizados.

uri cación laboriosa, cuyo objetivo es eliminar los Ac que reaccionan de forma cruzada no especí ca.

Incapacidad para discriminar determinantes antigénicos diferentes dentro de una misma molécula o célula, ya que no pueden diferenciar entre Ag en la membrana de una misma célula.

Para la técnica de inmunohistoquímica, serán necesarios los anticuerpos monoclonales (puros) que sólo podrán obtenerse a través de técnicas in vitro de una célula híbrida llamada ibrido a. El hibridoma es la fusión de linfocitos B productores de anticuerpos y una línea celular de mieloma (células B cancerígenas) que no producen inmunoglobulinas propias y tienen una expectativa de vida in nita. La primera fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o mononucleados) consiste en la selección del antígeno (mediante fusión celular), éstos son puri cados parcialmente, vgr por disgregación sub celular, lavado con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotográ co. Posteriormente, se inyecta al animal experimental con los antígenos seleccionados, esperando que cada linfocito produzca un anticuerpo especí co. Los linfocitos se extraerán del bazo o del torrente sanguíneo, y tendrán un carácter ortal que, al fusionarlo con un mieloma asumen un carácter in ortal. La célula resultante con una nueva carga genómica, guarda su especi cidad en la producción de anticuerpos homogéneos (y únicos, de allí su denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas células, con la rapidez del mieloma.

Los Ac monoclonales poseen las siguientes ventajas frente a los policlonales:

Homogeneidad en el proceso de obtención, consiguiéndose siempre Ac idénticos.

No requiere usar Ag puri cados.Los cultivos pueden proporcionar el Ac de forma ilimitada.

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

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UNIDAD FORMATIVA 2: ASPECTOS TÉCNICOS DE LA

INMUNOHISTOQUÍMICA2. 1. Marcaje inmunohistoquímico

2. 2. Procesamiento en inmunohistoquímica2. 3. Aplicaciones de la histoquímica

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2. ASPECTOS TÉCNICOS DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA

La inmunohistoquímica permite el estudio de tejidos procedentes de biopsias, autopsias y material citológico.

Existen diversos tipos de técnicas cuya indicación va a depender de:

Anticuerpo a utilizar: Mono o policlonal.

Material disponible: resco, congelado o jado en formalina.

Antígenos a estudiar: De super cie o membrana citoplasmáticos o nucleares.

La cuestión más importante va dirigida a la preservación del tejido y de los antígenos.

En general, el proceso histológico siguiendo una serie de pautas para dicha preservación: La jación se suele hacer en formaldehído 4 tamponado a pH .4 (no más de 24 4 horas) y la inclusión en para na (se recomiendan para nas

de bajo punto de fusión, ya que a altas temperaturas se pierde inmunoreacción). La temperatura no debe superar la del ambiente y si se descalci ca la muestra se realizará con ED A.

Será conveniente aplicar alguna forma de jación para proteger el tejido aún cuando se manejen secciones en congelación.

Para ello se habrá de tener en cuenta que:

Los jadores que actúan por precipitación de proteínas dan mejores resultados que los jadores por reticulación o los que contienen oxidantes.

n exceso de jador reduce la inmunoreactividad del tejido.

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

El efecto de cada jador sobre un antígeno puede ser diferente en función de la localización histológica y anatómica de dicho antígeno.

En muestras de gran volumen la jación por inmersión no convence ya que proporciona resultados variables en cuanto a positividad inmunohistoquímica dándose una mayor tinción en las zonas mejor jadas.

Hay ciertos antígenos de super cie o receptores nucleares que no deben jarse ya que puede alterar la muestra. Por ello se debe recurrir a la congelación

o jación breve en acetona, cloroformo o una mezcla de ellos.

La jación debe ser rápida para evitar la autolisis, si esto no fuera posible se puede frenarse el proceso a exponiendo el tejido temperaturas de 4 ºC o en soluciones conservantes.

Para acortar el tiempo de jación puede utilizarse la jación por microondas.

La capacidad inmunoreactiva se conserva bien tras la aplicación de algunos procedimientos rutinarios de decalci cación (eliminación de las sales de calcio tras la jación).

Los criterios más importantes para la decalci caci n son:

1) Eliminación completa de las sales de calcio.2) Ausencia de defectos deletéreos de células, tejido conectivo y sustancia fundamental.3) ue no se inhiban procesos como los de jación y tinción (Walington 1976).

Se suelen utilizar ácidos fuertes como el ácido nítrico pero aplicado a la inmunohistoquímica, acabaría con la inmunoreacción en pocas horas. Por eso se recomienda la utilización de ED A a una concentración de ,5 M, ácido acético acuoso a una concentración al 1 o ácido fórmico al 5 .

Respecto al corte, si el procedimiento de inmunotinción se realiza sobre tejido congelado se harán con el criostato (cortes de 4 - 6 micrómetros), que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas.

A continuación se jan en acetona absoluta a 4º C durante 5 minutos y se vuelven a secar al aire durante 30 minutos.

Si la técnica se va a retrasar en el tiempo, hay que guardar las secciones envueltas en papel de aluminio y con un desecante a 20º C. Después se temperan las secciones a temperatura ambiente sin desechar el envoltorio de papel de aluminio. Cuando esto se consigue se vuelve a repetir el proceso durante aproximadamente 60 minutos y a continuación se realiza una re nación con cloroformo durante 20-30 minutos

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pasándolo por un baño de solución tamponada por último. Los cortes de para na se obtienen de un grosor de 3 - 5 micrómetros y se dejan secar toda la noche en la estufa a 37º C.

El siguiente paso es despara nar cuidadosamente en xileno, para llevar la muestra hasta alcohol absoluto e hidratarla.

Debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar, es frecuente que se desprendan algunos cortes. Por ello se recomienda emplear un adhesivo que je las secciones al portaobjetos, con adhesivos como albúmina de huevo, gelatina o poli L-lisina. La precaución con el adhesivo debe estar presente ya que un exceso de adhesivo puede ser causa del aumento de tinción inespecí ca de fondo.

En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presentan una o varias super cies ligeramente deprimidas donde pueden adherirse los tejidos para realizar la incubación sin que ocurran fenómenos de difusión de los reactivos.

2.1 MARCAJE INMUNOHISTOQUÍMICOPara visualizar el lugar donde se produce la unión antígeno-anticuerpo es necesario

emplear un trazador o marcador. El marcaje inmunohistoquímico se puede realizar con uorocromos (técnicas de inmuno uorescencia), técnicas inmunoenzimáticas, iones metálicos en forma coloidal (técnica de inmuno-oro) o isótopos radioactivos.

La uorescencia es una forma de luminiscencia entendiéndose ésta última como la emisión de la luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica y bajo el efecto de una excitación.

La uorescencia pri aria o auto uorescencia es la propiedad que presentan determinadas sustancias de forma espontánea sin necesidad de ser modi cadas (la lámina elástica de las arterias muestra auto uorescencia en determinadas condiciones).

En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la uorescencia, llamándola uorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tinción histoquímica con sustancias uorescentes llamadas uorocro os o uniendo

uorocromos a antígenos dirigidos a anticuerpos tisulares.

Los uorocromos son moléculas químicas que absorben la luz a una determinada longitud de onda emitiendo otra diferente. Se caracterizan por sus espectros de excitación y emisión que varían según el tipo de uorocromo. Su capacidad de absorber fotones de alta energía procedente de la radiación ultravioleta o del espectro visible provoca una redistribución de los electrones de las moléculas uorescentes, puesta de mani esto por la emisión de una radiación luminosa de longitud de onda distinta aunque dentro del espectro visible.

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenómeno similar al descrito y la liberación de energía se produce de forma gradual, prolongándose la emisión de luz después de cesar la iluminación del objeto, estaremos ante un fenómeno llamado fosforescencia. Hay uorocromos que producen el llamado fen eno de uengc in (se produce por la colisión entre moléculas, ambas con capacidad de uorescencia, disminuyéndose así la intensidad de la uorescencia emitida).

Los uorocromos más utilizados en las técnicas de in uno uorescencia son:

Fluoresceína: Absorbe luz azul y emite uorescencia verde manzana.

oda ina: Absorbe luz verde y emite uorescencia roja anaranjada.

La nueva generación de uorocromos como el alexa úor o los dylight úor son generalmente más fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros de excitación y emisión comparable.

Estas sustancias pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la unión de éstos a sus correspondientes antígenos, por ello esta capacidad es muy útil para visualizar los lugares donde reproduce la reacción Ag-Ac.

La técnica in unoenzi ática se describe como una técnica de inmunoensayo en el que un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable. ambién se le conoce como técnica E I A.

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

El antígeno o anticuerpo estará marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente). Así la reacción Ag-Ac quedará inmovilizada y más fácilmente detectada, añadiendo al nal un sustrato más una sustancia denominada cromógeno, de tal manera que el producto de la reacción actúa sobre el cromógeno dando lugar a un precipitado insoluble, coloreado y cuanti cable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

Dentro de estas técnicas diferenciamos varios reactivos participantes: Ac primario, que es el que se une especí camente al Ag problema del tejido, y Ac secundario o Ac puente, que es el que actúa uniendo el Ac primario con la enzima que actuará como marcador. Estos Ac puente se unen a otros Ac debido a los determinantes antigénicos que presenta actuando a modo de Ag frente a otros Ac, pudiendo de este modo formarse cadenas casi ilimitadas de Ag y Ac.

Hay diferentes tipos de E I A:

Anticuerpos arcados:

E I A directo. E I A indirecto: Es el más utilizado en la detección de anticuerpos. .

E I A sand ic : Heterólogo (HADAS)

Doble (DAS)

Antígeno arcado

E I A co petitivo: Se parte de un anticuerpo poli o monoclonal, frente a un antígeno conocido, que previamente ha sido jado en la placa. Se le denomina de competición porque el suero problema es incubado previamente con el antígeno, antes de incubarlo con el antisuero jado en la placa, y por tanto compite con él. Los pasos siguientes serán los de adición e incubación del conjugado, lavado y nalización con el sustrato y lectura.

odos los tipos de ELISAs citados se pueden resumir en dos grandes grupos:

E I As para detectar antígenos: E I As sánd ic .

Las fases se describen en este orden: un anticuerpo poli o monoclonal antiantígeno suele estar ya jado a la placa. A continuación se incuba con la muestra problema, se añade el conjugado y por último el sustrato. odos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

E I As para detectar anticuerpos: E I As indirectos. Las fases se describen en este orden: El antígeno se pega a la placa (inmovilización del

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

antígeno) y se procede a la adición del suero problema, incubación y lavado, adición del conjugado, incubación y lavado, nalizando con la adición del sustrato, el frenado de la reacción y la lectura.

asos generales de un E I A1. apizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo. 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos. 3. nión del antígeno o anticuerpo especí co al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adición del substrato 9. Unión del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color

Encontramos diferencias entre ambas técnicas ELISAs directas e indirecta estimables de mención, en cuanto a:

Facilidad de realizaci n de la técnica: La indirecta es más fácil ya que en la técnica directa es necesario el uso de un Ac primario especí co para reaccionar con el Ag especí co.

Rapidez: La directa es más rápida porque se utiliza sólo un Ac primario; en la indirecta al entrar en juego el Ac secundario con una etapa adicional de incubación, se alarga el procedimiento de ensayo.

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ensibilidad: La directa es menos sensible porque el Ac primario se etiqueta y esta intervención reduce la inmunoreactividad, algo que no ocurre en la indirecta.

ambién en el método indirecto al utilizar Ac secundarios, el número de epítopos para unirse el Ag es mayor y así se ampli ca la señal y se mejora la sensibilidad.

Esto último puede ser una desventaja en los casos en los que se produce una reacción cruzada del antígeno y el anticuerpo, llevando a error a los resultados. En el método directo este fenómeno no tiene lugar de producirse ya que el uso de un solo Ac no da la opción de reacción cruzada.

La enzima más utilizada es la peroxidasa (se obtiene del rábano), así como la segunda más frecuente es la fosfatasa alcalina.

La perioxidasa se puede emplear tanto unida al Ac primario, lo que sería la técnica directa, como en unos inmunocomplejos llamados PAP (peridoxidasa + Ac anti-peroxidasa) que se unirán a un Ac puente (secundario), en técnica indirecta.

Amiloide del tipo AA marcado con anticuerpo monoclonal anti-AA. Se trata de una reacción positiva de la peroxidasa (colorante unido al anticuerpo anti-AA).

Estos complejos PAP van a actuar como trazadores de la reacción Ag-Ac. Para obtener los Ac especí cos frente a la peridoxidasa, se le inocula previamente al animal, y luego se extraen del suero para someterlos a técnicas in vitro con la peroxidasa. Así se formarán, a través de una reacción de precipitación, los complejos Ac-Ag peroxidasa-antiperoxidasa o complejos PAP.

A continuación se procede al revelado del marcador añadiendo el agua oxigenada (peróxido de hidrógeno), siendo en este caso el sustrato, junto al cromógeno adecuado para esta enzima. La reacción que tiene lugar es al unirse la

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

enzima al sustrato, este libera oxígeno provocando la oxidación del cromógeno y originando un producto insoluble y de color pardo.

En caso de que los tejidos sean muy ricos en peroxidasa endógena se utiliza como trazador la fosfatasa alcalina, para cuyo revelado se utilizan otras sustancias.

Recientemente se han introducido otros métodos de mayor sensibilidad basados en la a nidad que tienen la biotina y la actina, capaces de generar un enlace no inmune, y que se practican sobre tejidos previamente incluidos en para na. En estos métodos los Ag a demostrar tienen que haber sido desnaturalizados en gran medida durante el procesamiento histológico.

La avidina es una glicoproteína de alto peso molecular contenida en la clara del huevo y en la bacteria Streptomyces Avidinii. La molécula posee cuatro regiones hidrofóbicas de unión con la biotina.

Por otro lado la biotina, es una vitamina de bajo peso molecular que se encuentra en la yema del huevo y se conjuga fácilmente con Ac y enzimas marcadoras por ligarse de forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo. Pueden unirse hasta 150 moléculas de biotina por una sola molécula de Ac.

Aunque ambas moléculas pueden unirse fácilmente a Ac y enzimas, la biotina es la que se conjuga antes debido a su pequeño tamaño. Con biotina se puede realizar el marcaje del Ac primario (técnica directa) o del Ac secundario (técnica indirecta).

Bazo. Representa una inmunorreacción para vPRRS (virus del síndrome respiratorio y reproductivo en cerdos) en los macrófagos de la pulpa esplénica. Complejo ABC, contrateñido

con hematoxilina. 200X.

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La fase no inmunológica implica aplicar un complejo de avidina formado por la avidina y un trazador enzimático con lugares de unión a ella. De este modo se puede producir la jación sobre el Ac secundario biotinilado. odo este conjunto de sustancias se conoce como étodo del co plejo avidina biotina A . En resumen, podemos a rmar que un gran número de moléculas de biotina pueden unirse a un Ac dando lugar a una relación trazador Ac muy alta, lo que hace que la sensibilidad de este método sea muy elevada.

Puesto que el producto de la inmunotinción con el ABC y PAP es similar y de similar sensibilidad, algunos autores recomiendan en procedimientos con dobles tinciones o intensi caciones utilizar el PAP y el ABC de elección.

En relación a la técnica in uno oro (ión metálico en forma coloidal), podemos decir como técnica de marcaje, que hace esta función gracias a la propiedad de las partículas de oro para formar, en soluciones salinas, complejos estables con moléculas proteicas. Para conseguir partículas de oro de diferentes tamaños (5 a 20 nm), se manipula el pH de la solución que lo contiene, aunque ya en el mercado existen tamaños predeterminados de partículas de oro coloidal si se mantiene a una temperatura de 4ºC.

En cuanto a la metodología del oro coloidal, hay que tener en cuenta su baja capacidad de penetración en los tejidos y por tanto pueden enmascarar anticuerpos al unirse a jadores como glutaraldehído o tetróxido de osmio. Su aplicación ideal es en tejidos poco jados y cortados con crioultramicrotomos. ambién da buen resultado en tejidos frescos o jados y cortados con vibratomo empleando

ritón x-100 o in 20 en las soluciones de lavado. Actualmente los problemas que sufre la muestra por jadores, detergentes y sometimiento a temperaturas más altas, se están disminuyendo con el uso de resinas sintéticas hidrofílicas que además de polimerizar a bajas temperaturas, no requieren oxidantes ni uso de osmio (provocando menor pérdida de antígenos).

En el caso de bajas concentraciones de antígenos, se puede utilizar la plata que, mediante técnicas de precipitación permiten visualizar las partículas de oro.

ambién otra técnica ampliamente utilizada, es la asociación de proteínas a las partículas de oro coloidal. Algunas de estas proteínas son: proteína A, proteína G, IgG o streptavidina avidina.

El arcaje con is topos radiactivos RIA está basado en una competencia establecida entre la sustancia a cuanti car y las cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo, para unirse a anticuerpos especí cos. Al establecerse esta pugna resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuanti car, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada que va unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre. Esto se hace mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la hormona unida al anticuerpo forma agregados que precipitan fácilmente. Una vez medida la radiactividad se representa una curva con las cantidades de hormona sin marcar y marcada.

En el RIA directo, a la fase sólida se añade una cantidad conocida de anticuerpo. Diferentes concentraciones conocidas de Ag marcado se incuban con una concentración constante de la muestra de la que se desea conocer la concentración del antígeno en cuestión. El RIA de inhibición también sería una técnica competitiva de análisis, pero se diferencia en que lo que se une a la fase sólida es una cantidad ja de antígeno (no de anticuerpo). Para este proceso (inhibición), se incuba una concentración ja de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno.

Existe una técnica no competitiva denominada sand ic , en la cual se une un Ac en cantidades constantes a la fase sólida. ras realizar el bloqueo, se añade el antígeno en concentraciones variables. Después se añadirá un segundo anticuerpo contra el antígeno, pero esta vez marcado.

En la actualidad, cada vez es más frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con isótopos radiactivos con la nalidad de aplicarlo en campos como trazador en determinaciones in vitro de antígenos especí cos, técnicas inmunoradiohistológicas y técnicas de análisis no competitivo. Estas se tomarán como alternativa al RIA en aquellos casos en los que algunas moléculas no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la detección de tumores primarios o metastásicos (in unoescintografía) e incluso la posibilidad de irradiación local de células neoplásicas (in unorradioterapia).

En estos casos citados, se entiende que el anticuerpo podrá ser marcado sin que merme su capacidad inmunoreactiva. El marcaje de proteínas o péptidos con yodo radiactivo (I125 ó I132) puede realizarse por diferentes métodos.

2.2 PROCESAMIENTO EN INMUNOHISTOQUÍMICAEn el siguiente esquema se puede ver un resumen de todo el proceso, que a

continuación se desarrollará:

odas las muestras vendrán acompañadas de una hoja identi cativa y explicatoria del contenido de partida, historia y necesidades así como observaciones si las hubiera. ambién deberán incluirse controles positivos para el anticuerpo solicitado.

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

r ca resumen de la técnica

reparaci n de la uestra: En apartados anteriores está tratado este punto ya que se habló de cómo preparar la muestra para alterar lo menos posible la inmunoreactividad. Es por ello que se citarán los pasos dentro del proceso sin mucho detalle:

Fijaci n: Cada antígeno, dependiendo de su localización histológica y anatómica, podrá jar un producto de forma distinta.

Descalci caci n: Se decía que, habitualmente se utilizaban productos fuertes con ácido nítrico, que hacen poco resistentes a los antígenos. Por tanto, un procedimiento de elección para conservar mejor la

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

inmunorreactividad tisular es la utilización de ED A. El ED A, también llamado ácido etilendiaminotetraacético, es una sustancia utilizada como agente quelante o antagonista de metales pesados, que signi ca que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación octaédrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y en el más importante de los ligandos quelatos pues cuanto más ligandos posea, más estable es.

Inclusi n: El cambio del etanol por acetona y del tolueno o del xileno por cloroformo o benzoato de metilo mejora notablemente la inmunotinción, ya que aumenta la tinción especí ca y disminuye la de fondo.

Cortes y adhesivos: Sobre tejido congelado se obtendrán cortes de 4 a 6 micras que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas, se jan en acetona absoluta a 4ºC durante 5 minutos, y se vuelven a secar al aire otros 30 minutos; mientras que para cortes en para na las secciones serán menos gruesas, entre 2 y 4 micras, y se introducirán en una estufa durante un mínimo de 20 minutos para que el corte de adhiera al portaobjetos. Se hablaba de la facilidad de algunos tejidos que se desprenden por los múltiples lavados que hay que hacer. Cuando se ha realizado digestión con proteasas o mediante calor aún esto se acentúa más, por lo que es aconsejable utilizar adhesivos que jen las láminas seccionadas (ya existen portaobjetos especiales que incluyen la película de adhesivo). Con el n de evitar la difusión de los anticuerpos, se puede utilizar un lápiz con diamante o rotulador especial para cercar la sección de tejido.

revio a la in unotinci n.In unote idores auto áticos: Gracias a las nuevas tecnologías, se

dispone de máquinas que llevan a cabo la inmunotinción de manera automática. Esta modalidad, permite introducir los portaobjetos con las secciones de tejido, previamente etiquetados y con códigos de barras para su identi cación a través de un lector, que permitirá aplicar sobre cada muestra el reactivo correcto. El proceso de la tinción automática es muy laboriosa por la exactitud del trabajo sobre cada una de las muestras y el complejo mecanismo electrónico controlado por ordenador que incluye una fuente térmica propia para el desenmascaramiento antigénico y que supone un gran avance por la reducción de errores durante la realización de la técnica (no se acortan ni se exceden tiempos, temperaturas, cantidades de reactivos, etc.). El siguiente paso tras la nalización de la tinción automática es la deshidratación de las muestras y proceder al montaje de los portaobjetos.

its universales de in unohisto uí ica: Se denomina al conjunto de reactivos utilizados en el proceso de inmunotinción. Hay kits para revelar

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Ac mono o policlonales y se utilizan de forma distinta en función al procedimiento que vaya a utilizarse. Hay muchos laboratorios que están utilizando el multilink (kit universal) cuya aplicación es indistinta a los Ac empleados. El 5 de los kits empleados son los de estreptavidina-biotina-peroxidasa o fosfatasa alcalina. Los kits PAP se están usando menos por la baja intensidad de la tinción y se están sustituyendo por los FAAFA (fosfatasa-antifosfatasa-alcalina) que no cuenta con este hándicap, siendo además muy útil para la tinción de Ag de lábil expresión.La gama de cromógenos para el revelado en inmunotinción es muy amplia.

enetraci n de los reactivos. Detergentes: Los detergentes se utilizan para aumentar la permeabilidad de las membranas y que así los Ac puedan penetrar y así alcancen a los Ag a detectar. Estas sustancias son particularmente rentables cuando se trabaja con células intactas de frotis, improntas y monocapas de cultivos celulares o con cortes gruesos en congelación o incluidos en para na. Se habrá de tener muy en cuenta de qué forma pueden incidir estos productos en el tejido a nivel inmunoreactivo.

lo ueo de la tinci n de fondo: La tinción de fondo se trata de uno de los principales problemas de la técnica inmunohistoquímica. Se de ne como toda tinción que aparece allí donde no debería haberla. Existen dos tipos de tinción de fondo:

Especí cas: Se pueden deber: 1) A la presencia del Ag bajo estudio, en lugares distintos a donde se quiere detectar; 2) por la existencia en el antisuero primario de Ac frente a Ag distintos al que se quiere determinar (problema prácticamente inexistente cuando se utilizan Ac policlonales de buena calidad o Ac monoclonales). 3) ambién por atrapamiento pasivo del Ag o difusión del mismo hacia lugares donde habitualmente no se encuentra. Estos errores ocurren normalmente por problemas con la jación (se retrasa o es inadecuada), o cuando existen áreas extensas de necrosis e in ltrado in amatorio. Inespecí cas: La forma de tinción de fondo inespecí ca más común

es la uni n no in unol gica del Ac con ciertos componentes de los tejidos debido a fuerzas hidrofóbicas y electroestáticas. Habitualmente es el Ac primario el que proporciona los niveles más altos de tinción de fondo inespecí ca.

El bloqueo de tinción de fondo se realiza incubando los cortes con un anticuerpo que no inter era con el Ac primario o usando el Ac primario a altas diluciones lo más altas posibles y añadiendo bloqueantes proteicos de la tinción a utilizar. odo ello con el objetivo de inhibir la unión no inmune a moléculas que poseen los Ac.

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

lo ueo de la actividad enzi ática end gena: Se trata de un método por el que se consigue inhibir la actividad enzimática de la enzima que se va a utilizar como marcador con el n de que no reaccione con el sustrato por a nidad (muchas de ellas se encuentran de forma endógena en los tejidos). Si no se bloquea esta actividad, se induciría a error por la obtención de falsos positivos. El método más usado para este bloqueo es la incubación de las secciones antes del proceso inmunológico, aplicando algún agente bloqueante especí co en cada caso.

Desen ascara iento antigénico o recuperaci n antigénica: Los tejidos llegan casi todos al laboratorio jados en formalina e incluidos en para na. Las estructuras tridimensionales de las proteínas tisulares se alteran en grado variable durante este proceso. Algunos antígenos tisulares (epítopes) son resistentes a la jación con formol e inclusión en para na y son reconocidos por anticuerpos especí cos. Otros epítopes pierden su reactividad antigénica después de estos procesos de rutina. La continua práctica con anticuerpos nuevos ha mejorado el proceso inmunohistoquímico y el uso de pretratamientos proteolíticos (que suelen dejar un fondo de tinción mayor y favorecen el desprendimiento del tejido) consiguiendo una mejor conservación de la capacidad inmunoreactiva. Aún así, el éxito mayor de resultados se ha obtenido con métodos de pretratamiento con calentamiento de los cortes histológicos (incubación en torno a los 100ºC) que desenmascaran los epítopes, mejorando ostensiblemente los resultados del proceso. Como se ha mencionado, la jación en soluciones que contengan formaldehído pueden causar reacciones cruzadas en las proteínas y la inclusión en para na alterar la forma de las proteínas. Es por ello que en el proceso de recuperación antigénica se revierten algunos de estos problemas, rompiendo las uniones cruzadas, restaurando la conformación de epítope antígeno y removiendo los iones clásicos con citrato. Los buffer (o tampones) para la recuperación antigénica, por su composición y pH son utilizados en los métodos de recuperación antigénica junto con métodos de calor siendo cruciales para obtener buenos resultados (buffer citrato 0.01 mol L con pH 6.0 y buffer tris ED A, pH 9.0). A continuación se describirán los étodos de recuperaci n antigénica:

- Digesti n enzi ática: El pretratamiento de los cortes histológicos jados en formalina e incluidos en para na con distintas enzimas

proteolíticas refuerza o mejora la reactividad inmunohistoquímica de ciertos antígenos. Los procesos varían de acuerdo a los laboratorios, la

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

jación de los tejidos, el tipo de anticuerpo y los antígenos estudiados. Algunos de los pretratamientos enzimáticos más utilizados son el de tripsina, pronasa, y pepsina. En estos procedimientos las láminas tendrán que estar pretratadas con adhesivos y los cortes despara nados y rehidratados.

Método de pretratamiento con tripsina Cubrir los cortes con solución de trabajo de tripsina. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados

C por 20-40 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la jación en formol y el antígeno en estudio. Recomendamos tripsina al

0.1 durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Detener la reacción lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.

Método de pretratamiento con pronasa Cubrir los cortes con solución de trabajo de pronasa. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados

C por 5-10 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la jación en formol y el antígeno en estudio. Recomendamos pronasa, 0.01 durante 5-10 minutos a temperatura

ambiente. Detener la reacción lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.

- orno de icroondas: Se utiliza un horno de microondas doméstico de 750- 00 atios con plato giratorio. Hay que utilizar coplins o gradillas de cristal o plástico para microondas así como láminas pre-tratadas con adhesivo. Antes de comenzar hay que despara nar y rehidratar los cortes.

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

Método de pretratamiento con pepsina Cubrir los cortes con solución de trabajo de pepsina precalentada

a 37ºC Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados

C por 10-30 minutos. La incubación óptima depende del tiempo de la jación en formol y el antígeno en estudio. Detener la reacción lavando con agua destilada. Bloquear peroxidasa endógena y colocar los cortes en agua destilada Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.

Método de horno de microondas Coloque las láminas en la gradilla y rellene los espacios vacíos con

láminas en blanco. Llene el recipiente contenedor con 200 mL de buffer de recuperación

antigénica e introduzca la gradilla con las láminas. Cubra el contenedor para minimizar la evaporación. Coloque el contenedor en el centro del horno. Caliente los cortes

a 2x7 minutos. Rellene el contenedor con 50 mL de agua destilada entre los dos tratamientos. Los cortes no se pueden secar durante el proceder. Después del segundo tratamiento retire el contenedor del horno y

mantenga los cortes en el buffer a temperatura ambiente durante 15-20 minutos para su enfriamiento. Lavar en agua destilada. Bloquee la peroxidasa endógena y coloque las láminas en agua

destilada. Enjuagar en BS o PBS. Continúe con la técnica de inmunohistoquímica.

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Método de calentamiento con vapor Llene el depósito de la base con agua destilada a temperatura

ambiente. Coloque la rejilla de la base Coloque la cámara vaporizadora sobre la rejilla Llene el contenedor de incubación con 200 mL del buffer de

recuperación antigénica Coloque la tapa de la cámara de vaporizar. Ponga el timer por 75 minutos. El equilibrio entre el baño y la

cámara de incubación a 95ºC toma unos 45 minutos Remueva la tapa de la cámara y coloque las láminas en el buffer ya

precalentado. Vuelva a cubrir la cámara Incube durante 20-40 minutos Retire de la cámara vaporizadora el contenedor del buffer y las

laminas Enfriar las laminas por 20 minutos a temperatura ambiente Enjuague en agua destilada Bloquear peroxidasa endógena y colocar las laminas en agua

destilada Enjuagar en BS o PBS Continuar con la técnica de inmunohistoquímica.

- lla a presi n: Se requiere un vaporizador (steamer) doméstico y las láminas han de estar pre-tratadas con silano u otro adhesivo.

a in unotinci n propia ente dichaDiluciones de los anticuerpos lavados e incubaciones: Cuando se

diluye por primera vez un Ac o, aunque sea conocido, si se usa por primera vez sobre un tejido problema, hay que hacer pruebas de ensayo para evitar errores posteriores como falsos negativos o tinción de fondo. Por eso hay que elegir la dilución correcta a n de obtener una tinción óptima. El objetivo irá encaminado a evitar que el diluyente no se evapore durante el proceso de incubación y que el anticuerpo no unido al antígeno se elimine por completo antes de la incubación siguiente. Respecto a la

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Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica

evaporación de diluyente, se evita incubando el tejido en un ambiente húmedo (cámaras de incubación). La aplicación de calor también va a in uir en la unión Ac-Ag, así que si la incubación es corta se hace a temperatura ambiente y si es larga se hace a temperaturas constantes de unos 4ºC. Para eliminar el antisuero no unido, se utilizan soluciones tamponadas (usualmente el BS). Primero se lavan las secciones de tejido para extraer el exceso de antisuero y después se cubre con el tampón elegido para enjuagarlas.

Coloraciones de contraste: A n de reconocer mejor los tejidos se emplean coloraciones (cromógenos) para diferir las áreas tisulares inmunoteñidas de las que no lo han sido. En el apartado de tinciones generales están descritas.

Controles: Los controles se realizan para asegurarse que no hayan falsos negativos o positivos. Una tinción inmunohistoquímica especí ca se de ne con los siguientes pará etros:

1. No hay tinción si se excluye el Ac primario.2. Se inhibe la tinción si se absorbe el anticuerpo primario con el antígeno frente al cual se ha obtenido, pero no con otros.

Es por todo esto que para la obtención de un buen desarrollo de la técnica hay que realizar controles distintos que se explican a continuación:

- Los negativos incluyen una omisión del Ac primario o la sustitución del mismo por suero no inmune o solución isotípica. Estas sustancias alternativas (no inmunes) no van a reconocer al Ag a estudiar, pero sí serán reconocidas por el Ac secundario o puente. Se utiliza el mismo tejido que para el control positivo y si el resultado es positivo será debido a una jación inespecí ca. - Los controles positivos, se llevan a cabo utilizando una sección de tejido que incluya el Ag a demostrar de forma que si el resultado es negativo la causa es un defecto de jación o un error en el procedimiento. Es el de uso más extendido y se utiliza en todas las preparaciones. - El control de absorci n consiste en demostrar que desaparece la inmunorreactividad una vez el Ac primario con el Ag se hallan unido. Se utiliza para valorar nuevos Ac. No es una técnica de control que se haga muy rutinariamente.

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MÓDULO 7: TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Por último la técnica de blo ueo consiste en inhibir la unión de los distintos elementos utilizados según si la técnica es directa (Ac primario con Ac conjugado) o indirecta (Ac puente con el complejo PAP por ejemplo). El bloqueo se consigue realizando una incubación extra con Ac del mismo tipo de los marcados.

Volviendo al objetivo principal de los controles para detectar falsos negativos o positivos, las causas de los falsos negativos pueden ser:

- Enmascaramiento de los antígenos.- Desnaturalización de los antígenos por el calor, haciendo que sean irreconocibles por los Ac.- Errores en el procedimiento técnico.

Y las de los de falsos positivos:

- Presencia de peroxidasa endógena, por una mala inhibición de la misma (incorrecto desbloqueo enzimático).- Reacciones cruzadas inespecí cas entre Ag y Ac, de forma que algunos Ac pueden reaccionar con Ag parecidos a los que se estudian y, sobre todo, la posibilidad de una jación química no inmune entre los Ac y la colágena del tejido conectivo.

2.3 APLICACIONES DE LA HISTOQUÍMICANo cabe duda que la posibilidad que ofrece esta técnica de localizar componentes

tisulares in situ, contribuye a un importante avance en el conocimiento siopatológico siendo especialmente útil en el campo de la oncología (para la

clasi cación de algunas neoplasias con alto grado de anaplasia o de metástasis de origen incierto). ambién se utiliza para el estudio del rechazo de trasplantes de órganos, enfermedades autoinmunes y alérgicas.

El espectro de anticuerpos utilizados hoy día (comercializados), van en crecimiento. Aquí podemos ver algunos:

Ejemplos de marcadoresinm nohistoquímicosAnticuerpo Células/antígenos detectadosCD1a Célula de Langerhans CD4 Linfocito de auxilio CD8 Linfocito citotóxico CD30 Célula de Reed-Sternberg CD45 Leucocitos

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CD68 Macrófagos S100 Células de Sch ann HMB-45 Melanocitos AE1 Citoqueratinas de bajo peso molecular AE3 Citoqueratinas de alto peso molecular DESMINA Células musculares GFAP Glía CEA Antígeno carcino-embrionario AFP Alfa-fetoproteína REN Receptores nucleares de estrógenos VIM Sarcomas