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Tesis Doctoral
Interacción de la inmunoglobulinas G deInteracción de la inmunoglobulinas G depacientes con Esclerosis Lateral Amiotróficapacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica
con la placa neuromuscular y su relacióncon la placa neuromuscular y su relacióncon los canales de calcio de tipo P/Qcon los canales de calcio de tipo P/Q
González, Laura Elisabeth
2012-03-27
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
González, Laura Elisabeth. (2012-03-27). Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes conEsclerosis Lateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales decalcio de tipo P/Q. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
González, Laura Elisabeth. "Interacción de la inmunoglobulinas G de pacientes con EsclerosisLateral Amiotrófica con la placa neuromuscular y su relación con los canales de calcio de tipoP/Q". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2012-03-27.
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Fisiología y Biología Molecular
Interacción de las Inmunoglobulinas G de
pacientes con Esclerosis Lateral Amiotrófica con
la placa neuromuscular y su relación con los
canales de calcio de t ipo P/Q
Tesis presentada para optar al t ítulo de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área Ciencias Biológicas
Lic. Laura Elisabeth González
Director de Tesis: Dr. Osvaldo Daniel Uchitel.
Director Asistente: Dra. Mónica Lidia Kot ler.
Consejero de Estudios: Dr. Dante Agust ín Paz.
Lugar de t rabajo: Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencia,
CONICET - UBA.
Buenos Aires, Marzo 2012.
I nteracción de las I nm unoglobulinas G de pacientes con Esclerosis Latera l
Am iot róf ica con la placa neurom uscula r y su re lación con los cana les de
ca lcio de t ipo P/ Q
La Esclerosis Lateral Am iot rófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerat iva de
motoneuronas. Se encuent ra mayormente asociada a una forma esporádica de
et iología desconocida. Num erosas evidencias favorecen a la auto- inm unidad com o
uno de los potenciales cont r ibuyentes a esta patología.
Para estudiar los posibles ant ígenos que interactúan con las I gGs de
pacientes con ELA esporádica ( I gGs-ELA) , evaluam os su inmuno- react ividad hacia
la placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquellos
carentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+ ) de t ipo P/ Q
(CaV2.1) . Las I gGs-ELA m ost raron una importante react ividad hacia la PNM de
ratones CaV2.1+ / + e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa m iniatura
(MEPPs) . Ambos parám etros dism inuyeron significat ivamente al evaluar tej ido de
anim ales CaV2.1 - / -. Ensayos de inm uno-precipitación y western blot indican que el
blanco de los ant icuerpos no sería el canal m ism o sino una proteína asociada.
Estudios de proteóm ica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble de
cerebro-1) com o un candidato a evaluar en form a más detallada en fututos
ensayos.
Nuest ros resultados adicionan evidencias a favor de la auto- inmunidad como
uno de los posibles m ecanismos cont r ibuyentes a la patología de ELA. También
sugieren que los auto-ant icuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúan
con proteínas cuya presencia en la PNM dism inuye cuando los canales de Ca2+ de
t ipo P/ Q se encuent ran ausentes.
Palabras clave: Esclerosis Lateral Am iot rófica, canales de calcio, auto-ant icuerpos,
placa neurom uscular, auto- inm unidad.
I nteract ion of I m m unoglobulins G fr om Am yot rophic Latera l Sclerosis
pat ients w ith the neurom uscular junct ion and it s re la t ionship w ith the
P/ Q- type ca lcium channels
Am yot rophic Lateral Sclerosis (ALS) is a m otoneuron neurodegenerat ive disease. I t
is pr imarily associated with a sporadic form of unknown et iology. Several pieces of
evidence favor auto- immunity as a potent ial cont r ibutor to this pathology.
To gain understanding concerning possible ant igens interact ing with I gGs
from sporadic ALS pat ients (ALS- I gGs) , we studied immuno- react ivity against the
neurom uscular junct ion (NMJ) of m ice with and without the pore- form ing subunit of
the P/ Q- type calcium (Ca2+ ) channel (CaV2.1) . ALS- I gGs showed a st rong react ivity
against NMJs of WT diaphragm s and increased the m iniature end-plate potent ial
(MEPP) frequency. Both parameters were significant ly dim inished when evaluat ing
t issue from CaV2.1 - / - animals. I mmuno-precipitat ion and western blot assays
indicate that ant ibody target would not be the channel it self but an associated
protein. Proteom ic studies suggest BASP-1 (brain acid soluble protein-1) as a
candidate to evaluate in m ore detail in future assays.
Our findings add further evidence support ing auto- im m unity as one of the
possible m echanism s cont r ibut ing to ALS pathology. They also suggest that serum
auto-ant ibodies in a subset of ALS pat ients would interact with NMJ proteins down-
regulated when P/ Q- type Ca2+ channels are absent .
Keywords: Amyot rophic Lateral Sclerosis, calcium channels, auto-ant ibodies,
neurom uscular junct ion, auto- im m unity.
T Å|á ÑtwÜxá
“Hay una fuerza motriz más poderosa que
el vapor, la electricidad y la energía atómica:
la voluntad”
Albert Einstein
“Pero, a pesar de todo, no cambiaría mi suerte por la de ningún médico
porteño. La gran ciudad no puede brindar la serenidad, la paz, el contento
que ofrece la cordillera. ¿Puede esta pálida mole de piedras ofrecerme algo
comparable a mis montañas, a mis picos coronados de nieves eternas, a mis
arroyos caudalosos, a mis pobres araucanos?”
Dr. Rodolfo Kössler
Agradecimientos
A m is padres y a m i herm ano, por haberm e enseñado que vale la pena
esforzarse y sacrificarse por lo que uno cree, por haberm e inculcado valores
tan im portantes com o la honest idad, la sinceridad y el respecto. Gracias Pa
por haber sido un Gran Hom bre que siem pre procuró por su fam ilia y sus
am igos. A pesar de tu ausencia m e reconforta saber que, de estar con
nosot ros ahora, te sent ir ías m uy orgulloso de tus hij os. Siem pre serás la luz
que ilum ina m i cam ino.
A m i Director, Osvaldo Uchitel, por haberm e recibido en su laborator io y
haberm e perm it ido llevar adelante esta tesis bajo su constante supervisión,
guía y apoyo.
A m i co-Directora, Mónica Kot ler, por seguir colaborando con m i desarrollo
profesional y hum ano; y por haber realizado un constante aporte de
conocim ientos y experiencia para concretar este t rabajo de tesis.
A Francisco Urbano, por su gran calidez hum ana y por haber sido una
fuente inagotable de conocim ientos, sent ido del humor, apoyo m oral y
consejos.
A Euge y Hernán Mart ín, Cari Weissm ann, Mariano Di Guilm i y Pauli Felm an,
por su invaluable am istad, que estoy segura va a durar toda la vida, y por
las incontables tardes de m ates y bizcochitos.
A m is am igos del alm a, por estar siem pre para com part ir m om entos buenos
y no tan buenos: Pau, Shir, Mart i, Maru, Vivi, Ro, Mart ín, Mariana, Lu, Vero,
Gus.
A la gente linda del labo con la cual tuve el pr ivilegio de com part ir estos
años, por haber hecho que fuera un placer para m í ir a t rabajar todos los
días: Cari, Euge, Lucas, FU, Marian, Pau, Hernán, Vero, Joaco, Bel, Car lota,
Mauricio, Ayelén, Nat i, Fernando, Augusto, Noelia, Dani, Roberto, Ram ona.
A Terry Snutch y su grupo (Esperanza, Kirk, Stuart , Karen, John, Lawrence,
Cynthia) , no solo por haberm e ayudado enorm em ente con algunos
resultados de esta tesis, sino por haber hecho m i estadía en Vancouver una
experiencia tan enriquecedora com o m em orable.
A las personas que han pasado por el labo y con las cuales tuve la suerte de
com part ir m uy agradables m om entos: Paula, Elisa, Andrés, Barbi, Yani,
I tat í, Eugecita, Karen, Antonella.
Al Dr. Reisin y su grupo de colaboradores en el Hospital Británico, por
haberm e provisto de las m uest ras de suero, pero m ás im portante, por la
incansable lucha que em prenden todos los días cont ra una enferm edad tan
devastadora y cruel com o es la Esclerosis Lateral Am iot rófica.
Al grupo de la Unidad de Proteóm ica y Bioquím ica Analít ica del I nst ituto
Pasteur de Montevideo (Carlos Cerveñansky, Rosario Durán y Analía Lim a) ,
por haberm e perm it ido realizar los experim entos de espect rom et ría de
m asa gracias a su colaboración.
A Rafa Pagani y Elisa Filevich, por haberm e ayudado enorm em ente con el
com ienzo de m is experim entos.
A todas las personas que desinteresadam ente colaboraron para poder llevar
adelante este t rabajo, ya sea con sus conocim ientos o con préstam o de
react ivos o equipos.
A Viviana Sánchez por haberm e ayudado con la purificación de
sinaptosom as.
Al CONI CET y a la ANPCyT, por haber aportado el financiam iento que m e
perm it ió desarrollar m is tareas de invest igación.
A la I BRO, SfN y EMBO, por haberm e posibilitado part icipar de cursos y
congresos que no solo representaron un crecim iento profesional sino
tam bién personal, donde pude conocer gente increíble y lugares
ext raordinarios.
A m i abuela Om a, por haber sido una inspiración en vida y seguir guiando
m i cam ino desde donde sea que esté. Gracias por haberm e t ransm it ido tu
am or por los libros y haberm e convert ido en una rat ita de biblioteca.
A m is dos solcitos, Pepa y Chiki, por alegrar cada día de m i existencia y
hacerm e recordar qué cosas son realm ente im portantes en la vida (esas
cosas que solem os olvidar con tanta frecuencia…).
A todos aquellos seres que m e inspiran día a día a ser una m ejor persona, y
m e ayudan a valorar las cosas sim ples y herm osas que nos ofrece la vida.
Índice
1 - Abrevia turas ….……………..…………………………………...……………………... 2
2 - I nt roducción ….…………………………………………………..…………………….
5
2.1 - Esclerosis Lateral Amiotrófica ……………………………………………………... 5
5
7
9
9
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21
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2.1.1 - Características clínicas y diagnóstico ………….……………………...
2.1.2 - Etiología …………………………………………………………………..
2.1.3 - Tratamiento ……………………………………………………………….
2.1.4 - Mecanismos auto-inmunes ………………….……….……………..…..
2.2 - Sistema motor ………………………………………………………………………..
2.2.1 - Médula espinal …………………………………………………………..
2.2.2 - Corteza cerebral …………………………………………………………
2.2.3 - Cerebelo y ganglios basales.…………………………………………...
2.3 - Unión neuromuscular.........................................................................................
2.3.1 - Estructura de la unión neuromuscular…………………………………
2.3.2 - Transmisión sináptica neuromuscular…………………………………
2.3.3 - Liberación espontánea de neurotransmisor…………………………..
2.4 - Canales de Ca2+ dependientes de voltaje …..…..….…………………………….
3 - Objet ivos …..……………………………………………………………………………...
30
4 - Mater ia les y Métodos ….…………………………………………………...…….
32
4.1 - Materiales …………………………………………………………………………..... 32
32 4.1.1 - Reactivos………………………………………………………………….
4.1.2 - Líneas de ratones………………………………………………………..
4.1.3 - Muestras de suero humano ….………………………………………...
4.2 - Métodos……………………………………………………………………………….
4.2.1 - Manejo de animales………………………………………….…………..
4.2.2 - Genotipado de ratones ……….…………………………………………
4.2.3 - Purificación de Inmunoglobulinas G……………………………………
4.2.4 - Ensayo de ELISA …..……………….……………………….…………..
4.2.5 - Registros intracelulares.……………………………….………………..
4.2.6 - Inmuno-fluorescencia de PNM…...........……...…………………….....
4.2.7 - Inmuno-fluorescencia de médula espinal, corteza cerebral y
cerebelo …………………………………………………………………………..
4.2.8 - Análisis de inmuno-fluorescencia y procesado de imágenes.………
4.2.9 - Preparación de sinaptosomas…………………………………………..
4.2.10 - Obtención de extractos totales de cerebelo y músculo..….………..
4.2.11 - Purificación de rafts….…………………………………………………
4.2.12 - Cultivo de células y transfección/inducción ….……….……………..
4.2.13 - Determinación de la concentración de proteínas……………………
4.2.14 - Ensayo de inmuno-precipitación ……….………………..…………..
4.2.15 - Electroforesis en gel de una dimensión y western blot …...….……
4.2.16 - Electroforesis en gel de dos dimensiones….………………………..
4.2.17 - Espectrometría de masa e identificación por mapeo peptídico…...
4.2.18 - Análisis estadístico ……………….……………………………………
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52 5 - Resultados .………………………………………………………………………………
5.1 - Los anticuerpos de ELA aumentan la actividad sináptica espontánea e
interactúan con la PNM de ratón …………………..…………….………………………
52
5.2 - Reactividad de las IgGs-ELA contra la PNM de los ratones CaV2.1-/- y
CaV2.2-/-......................................................................................................................
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61
64
75
75
80
84
86
93
5.3 - Funcionalidad de las IgGs-ELA en la actividad espontánea de la PNM de los
ratones CaV2.1-/-……………………………………………………..……………………..
5.4 - Estudio de la inmuno-marcación de las IgGs-ELA en cerebelo, corteza
cerebral y médula espinal.………………………………………………………………...
5.5 - Correlación entre la modulación sináptica y la inmuno-reactividad tisular..…...
5.6 - Efecto de la deleción de CaV2.1 sobre la reactividad de las IgGs-ELA hacia el
sistema nervioso central……………………………………..……………………………
5.7 - Análisis de la interacción de las IgGs-ELA con la subunidad α1 del canal de
Ca2+ de tipo P/Q y otras proteínas presinápticas .………......…………..…..………...
5.8 - Análisis comparativo de la interacción de las IgGs-ELA con las proteínas
sinápticas de los ratones CaV2.1+/+ y CaV2.1-/-……………….…………………………
5.9 - Proteómica comparativa de las proteínas sinápticas de los ratones CaV2.1+/+
y CaV2.1-/-………………………………..………………………………………………….
5.10 - Interacción de las IgGs-ELA con la proteína BASP-1…….……….…………...
6 - Discusión .……………………………………………………………………….………..
6.1 - Placa neuromuscular………………………………...………………………………
97
97
99
100
6.2 - Sistema nervioso central……………………………………..……………………..
6.2.1 - Médula espinal..…………………………………………………………….
6.2.2 - Cerebelo……………………………………………………………………..
6.2.3 - Corteza cerebral…………………………………………………………….
6.2.4 - Astrocitos…………………………………………………………………….
6.3 - Canales de Ca2+ de tipo P/Q y N………………………………...………..……….
6.4 - Otras proteínas presinápticas………………………….…………………………...
6.5 - Proteómica comparativa de la sinapsis CaV2.1+/+ y CaV2.1-/-…………………...
6.5.1 - Metabolismo energético........................................................................
6.5.2 - Citoesqueleto........................................................................................
6.5.3 - Señalización de Ca2+............................................................................
6.5.4 - Exocitosis..............................................................................................
6.5.5 - BASP-1.................................................................................................
6.6 - Perspectivas futuras…………………………………………………………………
6.7 - Conclusiones generales……………………………………………………………..
7 - Referencias Bibliográficas ........................................................................
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AAbbrreevviiaattuurraass
1 - Abreviaturas
2D-DI GE Two-dim ensional difference gel elect rophoresis (elect roforesis bidim ensional diferencial en gel)
ADN Ácido desoxi- r ibonucleico ALS Am yot rophic Lateral Sclerosis (Esclerosis Lateral
Am iot rófica) ARN Ácido r ibonucleico ATP Adenosina t r ifosfato BASP Brain acid soluble protein (proteína ácida soluble de
cerebro) BSA Bovine seroalbum in ( seroalbúm ina bovina) Ca2+ Calcio CAP Cytoskeleton-associated protein (proteína asociada al
citoesqueleto) CCDV Canal de Ca2+ dependiente de voltaje CE Cont rol enferm o CS Cont rol sano DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (m edio m odificado
Dulbecco’s Eagle’s) DTT Dit iot reitol EDTA Ethylenediam inetet raacet ic acid (ácido et ilendiam intet ra-
acét ico) ELA Esclerosis Lateral Am iot rófica FI TC Fluorescein isothiocyanate ( isot iocianato de fluoresceína) GFAP Glial fibr illary acidic protein (proteína glial fibr ilar acídica) HRP Horseradish peroxidase (peroxidasa de rábano) I gG I nm unoglobulina G/ I m m unoglobulin G I gGs-ELA I gGs de pacientes con ELA esporádica I TRAQ I sobaric pept ide tags for relat ive and absolute
quant ificat ion (m arcaje isobárico para cuant ificación relat iva y absoluta)
2
1 - Abreviaturas
3
MALDI Matrix-assisted laser desorpt ion ionizat ion ( ionización por
desorción laser asist ida por m at r iz) MARCKS Myristoylated alanine- r ich C-kinase subst rate ( sust rato de
quinasa C r ico en alanina, m ir istoilado) MEPP Miniature end-plate potent ials (potenciales de placa
m iniatura) MS Mass spect rom et ry (espect rom etría de m asa) NAP Neuronal axonal m em brane protein (proteína neuronal
axonal de m em brana) NeuN Neuronal nuclei (ant ígeno neuronal nuclear) NMDA N-m et il-D-aspartato NMJ Neurom uscular junct ion (placa neurom uscular) OPD O-phenylenediam ine (o- fenilendiam ina) P Edad post -natal de anim ales (en días) p Probabilidad estadíst ica PBS Phosphate-buffered saline (buffer fosfato salino) PNM Placa neurom uscular RI PA Radio- im m uno-precipitat ion assay (ensayo de radio-
inm uno-precipitación) RN Ringer’s norm al solut ion ( solución normal de Ringer) SFB Suero fetal bovino SNARE Soluble N-ethylm aleim ide sensit ive factor at tachm ent
protein receptor ( receptor del factor de la proteína de fusión sensible a N-et ilm aleim ida soluble)
TME Tris-MgCl2-EGTA TMR Tet ram et ilrodam ina TOF Tim e of flight ( t iem po de vuelo) WT Wild- type ( salvaje)
IInnttrroodduucccciióónn
2 - Introducción
2 .1 - Esclerosis Latera l Am iot róf ica
La Esclerosis Lateral Am iot rófica (ELA) es una de las enferm edades de
m otoneurona m ás com unes en la edad adulta y desafortunadam ente, una
de las m ás devastadoras.
2.1.1 - Característ icas clínicas y diagnóst ico
La prim era descripción de ELA com o un síndrom e de pérdida m uscular
progresiva fue realizada por Charcot en 1874 (Rowland 2001) m ediante el
análisis de las característ icas clínicas y patológicas de la enferm edad. De
esta cont r ibución se desprende que uno de los rasgos m ás destacados de
ELA -y que en parte da or igen a su nom bre- es la degeneración del t racto
cort icoespinal com o resultado de la m uerte neuronal. Ot ra part icular idad de
esta enferm edad es que afecta m ayorm ente al subt ipo neuronal
responsable de llevar a cabo los m ovim ientos, las motoneuronas o neuronas
m otoras.
En térm inos generales, la m anifestación clínica de ELA se produce a
m ediados de la vida adulta, alrededor de los 45-60 años de edad. La
sintom atología incluye una serie de m anifestaciones que se presentan en
diferentes regiones del cuerpo según el sit io de iniciación de la
neurodegeneración, el grado de com prom iso del eje neural y el estadío de
la enferm edad. Al m om ento de realizar el diagnóst ico, el paciente debe
presentar síntom as que evidencien tanto com prom iso de las m otoneuronas
superiores (espast icidad, hiper- reflexia) com o de las infer iores
( fasciculaciones, hipotonía, debilidad y at rofia m uscular; Rowland 1998) . La
latencia ent re el inicio de los síntom as y el diagnóst ico se debe en gran
5
2 - Introducción
m edida al aum ento en la certeza de este últ im o al com probar el avance de
la enferm edad hacia regiones m ás distales.
Uno de los cr iter ios m ás am pliam ente ut ilizados para el diagnóst ico
de ELA es el establecido por la Federación Mundial de Neurología, conocido
com o el cr iter io de El Escorial (Brooks 1994) . En base a este cr iter io los
pacientes son diagnost icados y clasificados en diferentes categorías de
acuerdo a niveles crecientes de certeza (ELA sospechada, posible, probable
y definida) . En esta guía el diagnóst ico de ELA se define a part ir de signos
de com prom iso de m otoneuronas infer iores (por m edio de exám enes
clínicos y evaluaciones elect rofisiológicas o neuropatológicas) asociados a
evidencias clínicas de daño a m otoneuronas superiores. Tam bién resulta
necesario descartar (por análisis elect rofisiológicos, bioquím icos y
patológicos) la posibilidad de ocurrencia de ot ras enferm edades
neurológicas que puedan explicar la degeneración de las neuronas m otoras,
com o la at rofia m uscular progresiva, la neuropat ía m otora m ult ifocal o la
am iot rofía post -polio.
La patología presenta un desarrollo progresivo pero relat ivam ente
rápido y culm ina con la parálisis m uscular debida a la degeneración
m otoneuronal. En los Estados Unidos, su incidencia en la población es de
alrededor de 2 casos por cada 100.000 personas por año, y dada su alta
letalidad, su prevalencia es de 4-6 casos por cada 100.000 habitantes
(Mitchell y Borasio 2007) . Sin em bargo, estas cifras claram ente subest im an
el im pacto que puede llegar a tener la enferm edad, ya que se ha calculado
que el r iesgo de padecer ELA es de aproxim adam ente 1 en 400 (Johnson et
al. 2006) . En la m ayoría de los pacientes, el com prom iso de los m úsculos
respirator ios lleva al deceso del individuo afectado, con una supervivencia
6
2 - Introducción
m edia de ent re 2 y 5 años poster iores al diagnóst ico (William s y Windebank
1991) .
2.1.2 - Et iología
La sintom atología que se presenta en los pacientes con ELA se debe
principalm ente a la degeneración de las células de Betz residentes en la
corteza m otora pr im aria y las m otoneuronas infer iores del tallo cerebral y el
asta vent ral espinal (Bruijn et al. 2004) .
A nivel patológico, es frecuente observar en m uest ras de m édula
espinal provenientes de autopsias, la ocurrencia de at rofia m otoneuronal,
junto con un ensancham iento del pericarion y de los axones proxim ales.
Tam bién es posible detectar en el som a y axones de células en proceso de
degeneración la presencia de cuerpos de Bunina, esferoides y fibras de
m aterial ubiquit inado (Brown et al. 2000) .
Dado que la degeneración y m uerte de las m otoneuronas es tanto un
evento cent ral com o determ inante en cuanto al punto final de la
enferm edad, siem pre se ha hipotet izado que los m ecanism os responsables
de todo el proceso patológico de ELA deberían originarse en estas células.
Sin em bargo, estudios recientes han postulado que ot ros t ipos celulares,
adem ás de las m otoneuronas, podrían estar involucrados en el inicio de la
enferm edad (Di Giorgio et al. 2007; Nagai et al. 2007) . Dichos t rabajos
destacan el rol de las células gliales (y en part icular, de los ast rocitos) en el
proceso de degeneración m otoneuronal en ELA, sugir iendo una posible
cont r ibución de t ipos celulares no neuronales a la patología.
La m ayoría de los casos de ELA (90 % ) se presenta de una m anera
esporádica no asociada a una histor ia fam iliar de la enferm edad, y cuya
7
2 - Introducción
et iología perm anece hasta el m om ento desconocida. Sin em bargo, varios
m ecanism os han sido propuestos com o potenciales agentes cont r ibuyentes
a la patogénesis de ELA. Ent re ellos se puede m encionar el daño oxidat ivo
(Bowling et al. 1993; Niebroj -Dobosz et al. 2004) , la disfunción m itocondrial
(Menzies et al. 2002) , los m ecanism os auto- inm unes (Appel et al. 1993;
Pagani et al. 2006) , las anorm alidades en el citoesqueleto, el agregado de
neurofilam entos (Xu et al. 1993; Mendonca et al. 2005) , la alteración en el
t ransporte axonal y la excitotoxicidad por desregulación del t ransporte de
glutam ato (Rothstein et al. 1992; Bruijn et al. 2004; Van Den Bosch et al.
2006) . Es im portante destacar que los fenóm enos arr iba m encionados no
son m utuam ente excluyentes. De hecho, es cada vez más com ún la visión
de ELA no com o una patología de causa única, sino com o un síndrom e con
varios m ecanism os m oleculares potencialm ente cont r ibuyentes a la
neurodegeneración. Ot ro aspecto que podría aum entar esta com plej idad es
la existencia de factores de r iesgo am bientales y genét icos que se cree
juegan un papel im portante en la predisposición a la enferm edad (Sim pson
y Al-Chalabi 2006) .
El restante 10 % de los pacientes evidencia alguna form a fam iliar con
una clara herencia m endeliana que responde a m utaciones en una serie de
genes, siendo los m ás relevantes SOD1, FUS y TARDBP (Gros-Louis et al.
2006; Valdmanis et al. 2009) . Algunas de estas m utaciones se m anifiestan
fenot ípicam ente por un síndrom e que es clínicam ente indist inguible de la
form a esporádica de ELA, por lo que se cree que am bas variantes deben
com part ir hasta cierto punto m ecanism os patológicos.
8
2 - Introducción
2.1.3 - Tratam iento
Si bien durante los últ im os años se han producido grandes avances sobre la
patofisiología de ELA -especialm ente en lo que respecta a las variantes
fam iliares- y se han ensayado num erosos protocolos clínicos en pacientes,
no existen actualm ente t ratam ientos efect ivos para detener o ret rasar
significat ivam ente la progresión de la enferm edad. La única droga aprobada
en los Estados Unidos para el t ratam iento de ELA es r iluzole, un inhibidor de
la liberación de glutam ato, cuyo efecto sobre el avance de la enferm edad es
tanto m odesto com o am pliam ente discut ido (Bensim on et al. 1994;
Lacom blez et al. 1996) .
2.1.4 - Mecanism os auto- inm unes
Existen num erosas evidencias que avalan la part icipación de los
m ecanism os auto- inm unes en la degeneración de las neuronas m otoras en
ELA. En prim era instancia, se han encont rado desórdenes auto- inm unes en
los pacientes con esta enferm edad (Appel et al. 1986) j unto con auto-
ant icuerpos sér icos cont ra gangliósidos (Pest ronk et al. 1989) ,
neurofilam entos (Courat ier et al. 1998) y los canales de Ca2+ dependientes
de voltaje (CCDVs; Sm ith et al. 1992) . Adicionalm ente, se han detectado en
m uest ras de los individuos afectados y en m odelos anim ales, infilt rados
espinales y cort icales de células inflam atorias (Appel et al. 1986; Engelhardt
y Appel 1990; Troost et al. 1990; Kawam ata et al. 1992; Engelhardt et al.
1993; Alexianu et al. 2001; McGeer y McGeer 2002) , así com o tam bién
depósitos de I gGs en el ret ículo endoplásm ico y en m icrotúbulos de
m otoneuronas (Engelhardt y Appel 1990; Engelhardt et al. 2005) . Sin
em bargo, la presencia y relevancia de tales auto-ant icuerpos ha sido y
9
2 - Introducción
sigue siendo m ot ivo de m ucha cont roversia (Drachm an y Kuncl 1989;
Drachm an et al. 1995; Arsac et al. 1996) .
Por ot ro lado, se sabe que la inoculación de cobayos con
hom ogenatos espinales de bovino lleva a la dest rucción de las
m otoneuronas superiores e infer iores (Engelhardt et al. 1990; Xu et al.
2009) , asem ejándose hasta cierto punto a la variante hum ana de ELA en lo
que respecta a la presencia de ant icuerpos en las motoneuronas y células
inflam atorias (Appel et al. 1991) . Tam bién se observó que la t ransferencia
pasiva de las I gGs provenientes de pacientes con ELA (Uchitel et al. 1992a)
o de anim ales previam ente inm unizados con las m otoneuronas bovinas
purificadas (Appel et al. 1991) , inducía una disfunción neurom uscular en
ratones inyectados. En este últ im o caso, los ant icuerpos hum anos pudieron
ser detectados en el som a de las neuronas m otoras y en los term inales
nerviosos (Fratantoni et al. 1996; Engelhardt et al. 2005) .
En lo que respecta a estudios in vit ro, se ha detectado la inducción de
apoptosis por parte de las I gGs-ELA en cult ivos de rodajas de m édula
espinal y en líneas celulares de m otoneuronas, presum iblem ente debido a
un increm ento en la concent ración int racelular de Ca2+ (Dem est re et al.
2005; Sm ith et al. 1994) . A nivel de la placa neurom uscular (PNM), se
observó que la pre- incubación de preparaciones de músculo con las I gGs-
ELA est im ulaba la act ividad sinápt ica espontánea y asincrónica (Uchitel et
al. 1988; Uchitel et al. 1992a; Pagani et al. 2006) , el influjo de Ca2+ (Mosier
et al. 1995) y la inducción de vías de señalización que llevaban a la
liberación de Ca2+ desde los depósitos int racelulares (Pagani et al. 2006) .
Este efecto m odulador sobre la liberación espontánea de acet ilcolina
10
2 - Introducción
tam bién ha sido detectado en ratones injectados int raper itonealm ente con
I gGs-ELA (Muchnik et al. 2002) .
2 .2 - Sistem a m otor
Los m ovim ientos, ya sean voluntarios o involuntarios, se producen por
pat rones espaciales y tem porales de cont racciones musculares orquestados
por el cerebro y la m édula espinal. Éstos involucran tanto los circuitos que
posibilitan los m ovim ientos reflejos elem entales com o aquellos que
organizan los pat rones int r icados de act ividad neural responsables de las
acciones m otoras voluntarias m ás com plicadas.
En últ im a instancia, todos los m ovim ientos producidos por la
m usculatura esquelét ica son inducidos por las m otoneuronas infer iores de la
m édula espinal y el tallo cerebral, que inervan directam ente dicha
m usculatura. Estas neuronas se encuent ran cont roladas en form a directa
por los circuitos locales dent ro de la m édula espinal y el tallo cerebral, que
coordinan los grupos individuales de m úsculos. Las neuronas m otoras
infer iores tam bién están sujetas a una regulación mayorm ente indirecta
llevada a cabo por las m otoneuronas superiores, que form an parte de los
circuitos cerebrales m ás altos responsables de la coordinación de secuencias
com plejas de m ovim iento (Grillner y Wallen 1985) . Ot ros circuitos de
regulación m otora especialm ente im portantes residen en los ganglios
basales y el cerebelo, los cuales m odulan a las m otoneuronas superiores y
así aseguran que los m ovim ientos se realicen con una im portante precisión
tem poral y espacial (DeLong y St r ick 1974) .
11
2 - Introducción
Los circuitos neurales responsables del cont rol del m ovim iento
pueden ser divididos en cuat ro sub-sistem as dist int ivos pero altam ente
interact ivos (Figura 2 .1 ) , cada uno de los cuales realiza una cont r ibución
part icular al cont rol m otor (Purves et al. 2004) .
2.2.1 - Médula espinal
El pr im ero de estos sub-sistem as está com puesto por el circuito local dent ro
de la m ateria gr is de la m édula espinal, junto con el circuito análogo
ubicado en el tallo cerebral.
La m édula espinal cont iene una región cent ral de sustancia gr is
form ada en su m ayoría por los cuerpos celulares de las neuronas que la
const ituyen, sum ada a una región perifér ica de sustancia blanca const ituida
por los axones. Los som as de las m otoneuronas residen en la parte vent ral
de la sustancia gr is, tam bién conocida com o asta vent ral (Figura 2 .2 ) .
Las células relevantes para el cont rol m otor son las m otoneuronas
infer iores ( las cuales envían sus axones desde el tallo cerebral y la m édula
espinal hacia m úsculos esquelét icos de la cabeza y el cuerpo,
respect ivam ente) y las neuronas del circuito local ( las cuales com prenden la
m ayor fuente de inputs sinápt icos para las m otoneuronas infer iores) .
Las neuronas m otoras que inervan los m úsculos individuales se
encuent ran agrupadas en núcleos m otores organizados en colum nas
longitudinales que abarcan varios segm entos espinales. Las m otoneuronas
que sinaptan con los m úsculos proxim ales se localizan m edialm ente en la
m édula espinal, m ient ras que las que inervan los m úsculos m ás distales se
ubican en las regiones progresivam ente m ás laterales.
12
2 - Introducción
13
Figura 2 .1 : Organización de las est ructuras neura le s involucradas en e l cont rol del m ovim iento. Los cuat ro sub-sistem as que se muest ran en el esquema (circuitos locales de la m édula espinal y el tallo cerebral, vías modulatorias descendientes, ganglios basales y cerebelo) realizan aportes esenciales y dist int ivos al cont rol de la act ividad motora. Reproducido de Purves et al. 2004.
Toda la inform ación para la generación del m ovim iento, ya sea reflejo
o voluntario, es en últ im a instancia t ransm it ida hacia el m úsculo a t ravés de
la act ividad de las neuronas m otoras infer iores. Por su parte, las neuronas
del circuito local reciben inputs sensoriales y proyecciones descendentes de
cent ros neurales de m ayor jerarquía. De esta m anera, el circuito por ellos
form ado provee la coordinación ent re diferentes grupos m usculares
necesaria para la generación de m ovim ientos organizados.
2 - Introducción
14
Figura 2 .2 : Est ructura interna de la m édula espina l . Sección t ransversa de la médula espinal de ratón (P56, t inción de Nissl) m ost rando las diferentes regiones que la componen como así también las motoneuronas infer iores (cabezas de flecha rojas) . I mágenes ext raídas de Allen Brain At las (www.brain-m ap.org) .
Desde el punto de vista m orfológico, m etabólico y molecular, las
m otoneuronas presentan una serie de característ icas que las diferencian del
m odelo clásico de neurona. En prim er lugar, las m otoneuronas son células
de gran tam año, con un diám et ro som át ico de ent re 50 y 60 μm , y procesos
axonales considerablem ente extensos, algunos de los cuales pueden llegar a
m edir hasta un m et ro en hum anos. Com o consecuencia de estas
part icular idades anatóm icas, se presum e que las m otoneuronas poseen una
elevada dem anda de energía acoplada a una alta tasa m etabólica, lo cual
requiere de una elevada act ividad m itocondrial para sat isfacer estos
requerim ientos (Shaw y Egget t 2000) .
Adem ás, debido a la extensa red axonal que las caracter iza, las
neuronas m otoras precisan de una est ructura citoesqueletar ia im portante,
2 - Introducción
hecho que se ve reflejado en su alto contenido de neurofilam entos
com parado con ot ros t ipos neuronales (William son et al. 1998) .
Ot ro aspecto im portante es la elevada expresión de una versión del
receptor de glutam ato altam ente perm eable a Ca2+ (Carr iedo et al. 1996) .
En consecuencia, las m otoneuronas resultan part icularm ente vulnerables a
la excitotoxicidad m ediada por glutam ato y su consecuente sobre-carga de
Ca2+ .
Por últ im o, las neuronas m otoras m uest ran t radicionalm ente una baja
expresión de proteínas buffer de Ca2+ presentes en el citoplasm a, com o
parvalbúm ina y calbindina (Alexianu et al. 1994) . Estas y ot ras
m acrom oléculas, junto con organelas com o el ret ículo endoplásm ico y la
m itocondria, form an parte del sistem a de regulación de Ca2+ que opera en
form a constante para m antener niveles int racelulares bajos de este ión. De
aquí se deduce que las m otoneuronas t ienen una capacidad de regulación
de Ca2+ m uy lim itada y son considerablem ente sensibles a cualquier proceso
que induzca una acum ulación excesiva de Ca2+ en la célula.
Se cree que todos estos factores cont r ibuyen a la alta y select iva
vulnerabilidad que presentan este t ipo de neuronas espinales a la injur ia
asociada a ELA, representando factores de r iesgo im portantes para los
procesos patológicos involucrados en esta enferm edad.
2.2.2 - Corteza cerebral
El segundo sub-sistem a m otor está const ituido por las neuronas m otoras
superiores que residen en el tallo y la corteza cerebral y cuyos axones
descienden para sinaptar sobre las neuronas del circuito local o, m ás
raram ente, sobre las m otoneuronas infer iores en form a directa.
15
2 - Introducción
La corteza es la parte m ás superficial del encéfalo y representa la
porción m ás grande de m ateria gr is del cerebro. Posee una organización
horizontal en capas ( lám inas) que cont ienen diferentes t ipos de neuronas.
El núm ero de capas y su organización difieren según la región del cerebro
que se t rate y de esta m anera dan lugar a la separación de la corteza en
áreas funcionales (Nolte 2001) . La m ayoría de estas regiones está
com puesta por hasta seis capas de células neuronales, part iendo de la m ás
superficial (capa I ) hacia la m ás interna (capa VI ) .
Las vías de las neuronas m otoras superiores que se or iginan en la
corteza cerebral son esenciales para la iniciación voluntar ia de los
m ovim ientos y para la coordinación de los pat rones com plejos en los
m ovim ientos avanzados. En part icular, las proyecciones descendentes de
las áreas cort icales del lóbulo frontal (corteza m otora pr im aria, corteza
prem otora lateral y m edial) son claves para la planificación, la iniciación y la
dirección de una secuencia de m ovim ientos voluntarios. Cada área proyecta
directam ente sobre la m édula espinal a t ravés del t racto cort icoespinal, e
indirectam ente por m edio de los sistem as m otores del tallo cerebral.
Las neuronas m otoras superiores ubicadas en el tallo cerebral son
responsables de la regulación del tono m uscular y de la or ientación de los
ojos, la cabeza y el cuerpo en base a la inform ación sensorial que reciben
(vest ibular, som át ica, audit iva y visual) . De esta m anera, su cont r ibución
resulta crít ica para los m ovim ientos básicos de m archa y para el cont rol de
la postura (Purves et al. 2004) .
La corteza de los hum anos y ot ros m am íferos se encuent ra
est ructurada en form a lam inar, con cada lám ina cort ical presentando una
serie de característ icas funcionales y anatóm icas dist int ivas. Las células
16
2 - Introducción
piram idales de la capa cort ical V de la corteza m otora pr im aria - tam bién
conocidas com o células de Betz- son las m otoneuronas superiores.
2.2.3 - Cerebelo y ganglios basales
Los restantes sub-sistem as involucrados en el cont rol m otor son circuitos
com plejos que no t ienen un acceso directo ni a las neuronas del circuito
local ni a las m otoneuronas infer iores. En su lugar, estas est ructuras
cont rolan el m ovim iento por regulación de la act ividad de las neuronas
m otoras superiores.
Antes de que una señal m otora descienda desde la corteza hacia el
tallo cerebral y la m édula espinal, varios cent ros cort icales y sub-cort icales
( incluyendo los ganglios basales y el cerebelo) han ejercido su influencia
sobre la corteza m otora para dar form a a esa señal descendiente final.
Tanto el cerebelo com o los ganglios basales llevan a cabo esta regulación a
t ravés del tálam o, afectando de esta m anera la act ividad de las vías
descendientes del t racto córt ico-bulbar y córt ico-espinal que se or iginan en
las áreas m otoras y pre-m otoras (Groenewegen 2003) .
El m ás grande de estos sub-sistem as es el cerebelo, el cual se
encuent ra ubicado sobre la cara dorsal de la protuberancia. El cerebelo
actúa a t ravés de vías eferentes hacia las m otoneuronas superiores
detectando la diferencia ent re las órdenes m otoras descendentes y la acción
m otora resultante, tam bién conocida com o “error m otor” . El cerebelo usa
esta inform ación sobre discrepancias para efectuar reducciones en t iem po
real y a largo plazo en estos errores m otores y de esta m anera m ejorar la
agudeza de los m ovim ientos.
17
2 - Introducción
El últ im o de los sub-sistem as m otores está com puesto por un grupo
de est ructuras, conocidas colect ivam ente com o ganglios basales, que se
encuent ran em bebidas en las zonas m ás profundas del cerebro anter ior.
Ent re estas regiones sub-cort icales se puede m encionar el est r iado, el globo
pálido, el núcleo sub- talám ico y la sustancia nigra. Los ganglios basales
suprim en los m ovim ientos no deseados y preparan a los circuitos de
m otoneuronas superiores para la iniciación de una acción m otora. Los
ganglios basales reciben inputs de todas las áreas cort icales y proyectan a
t ravés del tálam o a regiones de la corteza frontal relacionadas con la
planificación de los m ovim ientos (Purves et al. 2004) .
2 .3 - Unión neurom uscular
El axón de la neurona m otora se divide en la zona cercana al m úsculo y
em ite ent re 20 y 100 ram ificaciones, cada una de las cuales inerva una fibra
m uscular individual. El conjunto form ado por el term inal m otor y todas las
fibras m usculares por él contactadas se denom ina unidad m otora (Purves et
al. 2004) .
2.3.1 - Est ructura de la unión neurom uscular
La unión o PNM de vertebrados (Figura 2 .3 ) se encuent ra form ada por
regiones específicas de t res t ipos celulares dist int ivos: la neurona m otora
(com ponente pre-sinápt ico) , la fibra m uscular (com ponente post -sinápt ico)
y la célula de Schwann (Ogata 1988) . La principal característ ica de esta
est ructura es la alta especialización de las porciones sinápt icas de dichos
t ipos celulares, ya que cont ienen un gran núm ero de organelas y m oléculas,
18
2 - Introducción
19
Figura 2 .3 : Est ructura de la plac a neurom uscular de ver tebrados. En el esquema se muest ra un term inal motor inervando una fibra muscular. A la derecha se observa un term inal cortado en forma t ransversal. Cada placa neurom uscular consiste en el term inal nervioso presinápt ico desde donde se libera el neurot ransm isor (acet ilcolina) , la hendidura sinápt ica, el área post -sinápt ica en el músculo conteniendo el receptor de acet ilcolina y la envoltura de la célula de Schwann. I magen ext raída de Sanes y Lichtman 1999 y ht tp: / / www.biologycorner.com/ anatomy/ muscles/ notes_muscles.htm l.
que a su vez se encuent ran poco representadas en las regiones ext ra-
sinápt icas.
El term inal nervioso m otor se encuent ra especializado en el proceso
de liberación. El m ism o posee num erosas vesículas sinápt icas (de
aproxim adam ente 50 nm de diám et ro) conteniendo el neurot ransm isor,
acet ilcolina, junto con una alta densidad de m itocondrias, las cuales
proveen la energía necesaria para la síntesis y la liberación del
neurot ransm isor. El agrupam iento de las vesículas sinápt icas en la m itad del
term inal que está en contacto con la fibra m uscular refuerza la idea de
polar ización de esta est ructura. La m ayoría de las vesículas sinápt icas se
localizan en determ inadas regiones de la m em brana pre-sinápt ica conocidas
com o zonas act ivas, en las cuales las vesículas se fusionan con la
2 - Introducción
m em brana del term inal y liberan su contenido hacia la hendidura sinápt ica.
Por su parte, las porciones pre- term inales poseen un escaso núm ero de
vesículas y m itocondrias junto con una ausencia de zonas act ivas, pero se
encuent ran enriquecidas en m icrotúbulos y neurofilam entos (Yee et al.
1988) .
La m em brana post -sinápt ica se especializa en responder de una
m anera rápida y eficiente a la liberación del neurot ransm isor desde el
term inal nervioso. Por debajo del term inal sinápt ico la m em brana m uscular
posee ligeras depresiones e invaginaciones m ás m arcadas que com ponen
los pliegues post -sinápt icos, los cuales se ubican en form a directam ente
opuesta a las zonas act ivas y se adent ran en la fibra m uscular una distancia
de hasta 1 μm . En las crestas de dichos pliegues hay una alta concent ración
de receptores de acet ilcolina (m ás de 10.000 m oléculas/ μm 2) , la cual decae
en form a acentuada (a aproxim adam ente 10 m oléculas/ μm 2) en las
regiones ext ra-sinápt icas (Salpeter et al. 1988) . Desde su parte
citoplasm át ica el receptor de acet ilcolina se encuent ra asociado a un
com plejo aparato citoesqueletar io que genera y m ant iene dicha dist r ibución
diferencial.
La célula de Schwann que rodea al term inal m otor cum ple la función
de aislar lo del m edio ext racelular y proveer factores t róficos. Adem ás,
presenta característ icas m orfológicas y bioquím icas que la dist inguen del
ot ro t ipo de célula de Schwann reportado, el productor de la vaina de
m ielina que recubre el axón m otor desde el som a neuronal hasta la zona
pre- term inal (Mirsky y Jessen 1996) .
Ot ro com ponente im portante de la PNM es la denom inada lám ina
basal. Dicha est ructura se ext iende a lo largo del espacio ent re la fibra
20
2 - Introducción
m uscular y el term inal sinápt ico, y se proyecta hacia el inter ior de los
pliegues post -sinápt icos. De esta m anera, form a parte de una fracción
im portante de la hendidura sinápt ica presente en la PNM. Los com ponentes
m ayoritar ios de la lám ina basal del m úsculo son sim ilares a los encont rados
en la lám ina basal de ot ras zonas del cuerpo: colágeno I V, lam inina,
entact ina y proteoglicanos. Sin em bargo, las porciones sinápt icas y ext ra-
sinápt icas de la lám ina basal expresan isoform as part iculares. La lám ina
basal tam bién cont iene una isoform a de acet ilcolinesterasa ( la enzim a
responsable de la degradación del neurot ransm isor) anclada a colágeno,
glicoconjugados y proteínas de señalización com o agrina y neurregulina
(Sanes y Lichtm an 1999) .
Desde el punto de vista inm unológico, un aspecto im portante a tener
en cuenta es que la PNM es el único com ponente del sistem a m otor que se
encuent ra por fuera de la barrera hem ato-encefálica. De esta m anera, el
term inal m otor const ituye una est ructura part icularm ente vulnerable a la
acción del sistem a inm une y sus ant icuerpos, representando un blanco
tem prano en diversas enferm edades auto- inm unes (Lang y Vincent 2009) .
2.3.2 - Transm isión sinápt ica neurom uscular
La llegada del im pulso nervioso (potencial de acción) al term inal del axón
m otor genera un cam bio en el potencial de m em brana celular
(despolar ización) que induce la apertura de los CCDVs. La ent rada de Ca2+
al term inal a t ravés de estos canales inicia un proceso com plejo que culm ina
con la fusión de las vesículas sinápt icas a la m em brana celular y la poster ior
liberación de acet ilcolina hacia la hendidura sinápt ica (Purves et al. 2004) .
Este proceso se conoce con el nom bre de exocitosis.
21
2 - Introducción
Una vez liberado, el neurot ransm isor difunde a t ravés de la hendidura
sinápt ica e interactúa con el receptor de acet ilcolina en la m em brana post -
sinápt ica. Dicha interacción prom ueve el influjo de sodio a t ravés del
receptor y de esta m anera induce una despolar ización en la zona de la PNM
conocida com o potencial de placa evocado (Takeuchi y Takeuchi 1960) . Esta
despolar ización act iva a los canales de sodio dependientes de voltaje
presentes en la base de los pliegues post -sinápt icos de la fibra m uscular
(Flucher y Daniels 1989) e inicia una potencial de acción propagado que
culm ina en la cont racción del m úsculo (Aidley 1989) .
2.3.3 - Liberación espontánea de neurot ransm isor
En todas las sinapsis quím icas, la com unicación ent re células se encuent ra
m ediada por la liberación cont rolada de neurot ransm isor en respuesta a la
llegada de un potencial de acción. Sin em bargo, en ausencia de
est im ulación neuronal, la liberación de neurot ransm isor todavía puede
ocurr ir de m anera espontánea, com o fue dem ost rado por pr im era vez en
experim entos realizados en la PNM (Fat t y Katz 1952) .
Los potenciales de placa m iniatura (MEPPs) o “m inis” que se regist ran
en ausencia de im pulsos nerviosos, representan la fusión de una única
vesícula sinápt ica con el term inal presinápt ico, liberando de esta m anera
una cant idad de neurot ransm isor conocida com o cuanto. En la PNM, estas
respuestas pueden observarse com o una despolar ización de pequeña
am plitud en la fibra m uscular y con una frecuencia de unos pocos a varias
decenas de eventos por m inuto.
Se sabe que este proceso se encuent ra est recham ente regulado por
el nivel de Ca2+ citosólico, al igual que por el Ca2+ ext racelular (Hubbard et
22
2 - Introducción
al. 1968; Llano et al. 2000; Angleson y Betz 2001) , presentando una
dependencia a este ión práct icam ente lineal (Lou et al. 2005; Sun et al.
2007) . Por lo tanto, se deduce que un aum ento en la frecuencia de
liberación basal de acet ilcolina es un reflejo del increm ento en la
concent ración int racelular de Ca2+ . Esto tam bién im plica que cualquier
est ím ulo despolar izante que act ive a los canales de Ca2+ sensibles al
voltaje, com o una solución de alto potasio, prom overá la liberación
espontánea (Takeuchi y Takeuchi 1961) . Tam bién se ha encont rado que
este t ipo de liberación posee un com ponente independiente de Ca2+ (Katz et
al. 1996; Losavio y Muchnick 1997) .
En térm inos generales, evidencias recientes sugieren que la liberación
espontánea de neurot ransm isor jugaría un rol im portante en la m aduración
y estabilidad de las redes sinápt icas y en la regulación de la síntesis de
proteínas dendrít icas (Chung y Kavalali 2006; Wasser y Kavalali 2009) .
2 .4 - Canales de Ca 2 + dependientes de volta je
Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (CCDVs) com prenden una
fam ilia de proteínas t ransm em brana que cont rolan la ent rada de Ca2+ en
respuesta a una despolar ización de la m em brana plasm át ica y regulan
procesos com o la cont racción m uscular, la secreción vesicular, la
neurot ransm isión y la expresión génica (Cat terall 2000) . Cada canal está
form ado por un com plejo m ult im érico que incluye a las subunidades α1, β, γ y α2δ (Figura 2 .4 ; Ar ikkath y Cam pbell 2003; Cat terall et al. 2005) .
23
2 - Introducción
24
Figura 2 .4 : Topología de m em brana, interacción de s ubunidades y dom inios est ructura les de los CCDVs. Los CCDVs están com puestos por la subunidad α1 formadora del poro y las subunidades accesorias α2δ, β y γ. Los com ponentes α2δ y γ poseen dom inios t ransmembrana, m ient ras que la subunidad β es est r ictamente int racelular. Las t res subunidades accesorias interactúan directam ente con la subunidad α1, m ient ras que no se han reportado interacciones ent re las subunidades accesorias. Modificado de Arikkath y Campbell 2003.
La subunidad α1 es el polipépt ido m ás grande de los que com ponen el
canal de Ca2+ (190-250 kDa) y com prende est ructuras com o el poro de
conducción, los sensores de voltaje y el aparato de apertura, al igual que la
m ayoría de los sit ios conocidos de regulación de la act ividad por segundos
m ensajeros, drogas y toxinas. Por este m ot ivo, es la subunidad que
determ ina en m ayor m edida las propiedades biofísicas y farm acológicas del
canal (Dolphin 2009) . La subunidad α1 (Figura 2 .5 ) está form ada por
2 - Introducción
25
Figura 2 .5 : Est ructura de la subunidad α1 . En el diagrama se representan los cuat ro dom inios t ransmembrana homólogos ( I - I V) así como también los seis segmentos S que com ponen cada dom inio de la subunidad α1 (1-6) . Modificado de Cat terall et al. 2005.
alrededor de 2000 am inoácidos organizados en cuat ro dom inios hom ólogos
(dom inios I - I V) . Cada dom inio consiste en seis α hélices t ransm em brana
(S1 a S6) y un loop ent re los segm entos S5 y S6 asociado a la m em brana.
Los segm entos S1 a S4 conform an el m ódulo responsable de sensar el
voltaje, m ient ras que los segm entos S5, S6 y el loop ubicado ent re ellos
com ponen el poro propiam ente dicho. Los grandes segm entos int racelulares
del canal funcionan com o plataform a de señalización para la regulación de
la neurot ransm isión dependiente de Ca2+ (Cat terall y Few 2008) .
La subunidad β es una proteína hidrofílica de 50-65 kDa y es el único
com ponente del canal que es com pletam ente int racelular. Por su parte, el
com plejo α2δ es codificado por un único gen cuyo producto es clivado post -
t raduccionalm ente pero perm anece unido por puentes disulfuro dando lugar a la proteína m adura. Una tercera subunidad accesoria -conocida
com o γ- está com puesta por cuat ro segm entos t ransm em brana y está
2 - Introducción
presente tanto en m úsculo esquelét ico com o en corazón y cerebro (Cat terall
y Few 2008) .
Las subunidades accesorias t ienen una influencia importante en la
función del canal de Ca2+ (Dolphin 2003; Hofm ann et al. 1999) . La
subunidad β aum enta de m anera im portante la expresión de la subunidad α1
en la m em brana plasm át ica y m odifica la cinét ica del canal así com o
tam bién la dependencia de la act ivación e inact ivación con el voltaje
(Cat terall y Few 2008) . El com plejo α2δ tam bién increm enta la expresión de
la subunidad α1 en la m em brana, pero t iene efectos m enores y m enos
consistentes sobre la cinét ica y la dependencia de la apertura del canal con
el voltaje (Davies et al. 2007) . En térm inos generales la subunidad γ no
influencia la expresión del canal de Ca2+ en la m em brana, salvo en algunos
casos donde provoca una m arcada reducción en el número de m oléculas en
m em brana. El rol funcional de la subunidad γ no se encuent ra bien definido,
aunque se cree que part icipa en la m odulación de las propiedades biofísicas
del canal (Arikkath y Cam pbell 2003) .
A pesar de que las subunidades accesorias m odulan las propiedades
funcionales de los com plejos de canales de Ca2+ , la diversidad farm acológica
y fisiológica de estos canales se debe en m ayor m edida a la existencia de
m últ iples subunidades α1 (Cat terall y Few 2008) .
Una am plia serie de isoform as han sido reportadas para la subunidad
α1, las cuales provienen tanto de la t ranscripción de num erosos genes com o
del splicing alternat ivo de los m ism os. La com binación de estas diferentes
variantes posibilita la form ación de canales con diversas propiedades
biofísicas y farm acológicas, según se puede observar en la Tabla 2 .1 . Las
corr ientes L, P/ Q, N y R se clasifican com o corr ientes de alto voltaje de
26
2 - Introducción
Tabla 2.1 : Función farmacológica y fisiológica de los CCDVs *.
subunidad α1 corriente nomenclatura
antigua
bloqueantes localización función celular nomenclatura específicos
actual
α1S CaV1.1 músculo esquelético, túbulos transversos
acoplamiento excitación-contracción
α1C CaV1.2
miocitos cardíacos, miocitos del músculo liso,
células endócrinas, cuerpos neuronales, dendritas proximales
acoplamiento excitación-contracción, liberación
hormonal, regulación de la transcripción, integración
sináptica
α1D CaV1.3
cuerpos neuronales, dendritas proximales, células endócrinas,
miocitos del atrio cardíaco y células marcapaso, células de la cóclea
liberación hormonal, regulación de la transcripción, integración sináptica, marcapaso cardíaco,
audición, liberación de neurotransmisores de células
sensoriales
L
α1F CaV1.4
células bipolares y bastones retinales, médula espinal, glándula adrenal,
mastocitos
dihidropiridinas, fenilalquilaminas, benzotiacepinas
liberación de neurotransmisores de
fotorreceptores
P/Q α1A CaV2.1 terminales nerviosos y
dendritas, células neuroendócrinas
ω-Agatoxina IVA
liberación de neurotransmisores, transientes de Ca2+ dendrítico, liberación
hormonal
N α1B CaV2.2 terminales nerviosos y
dendritas, células neuroendócrinas
ω-Conotoxina GVIA
liberación del neurotransmisor, transientes de Ca2+ dendrítico,
liberación hormonal
R α1E CaV2.3 cuerpos celulares
neuronales y dendritas SNX-482 disparos repetitivos, transientes
de Ca2+ dendrítico
α1G CaV3.1 cuerpos neuronales y dendritas, miocitos del músculo liso y cardíaco
marcapasos, disparos repetitivos
α1H CaV3.2 cuerpos neuronales y dendritas, miocitos del músculo liso y cardíaco
marcapasos, disparos repetitivos
T
α1I CaV3.3 cuerpos neuronales y
dendritas
Mibefradil
marcapasos, disparos repetitivos
* Información ext raída de Brogden y Markham 1997, St rock y Diverse-Pierluissi 2004 y Cat t eral l et al . 2005.
act ivación -dado el requerim iento de est ím ulos despolar izantes fuertes para
la apertura del canal- m ient ras que las T se conocen com o corr ientes de
bajo voltaje de act ivación.
Tanto en la PNM de los m am íferos com o en las sinapsis del sistem a
nervioso cent ral, la liberación evocada de neurot ransm isores en respuesta
al influjo de Ca2+ se encuent ra m ediada principalm ente por los CCDVs de
t ipo P/ Q (Prot t i et al. 1991; Llinas et al. 1992; Uchitel et al. 1992b; Katz et
al. 1997; I wasaki y Takahashi 1998) . De esta m anera, las señales de Ca2+
27
2 - Introducción
28
generadas por los canales gat illan la t ransm isión sinápt ica a t ravés de un
cont rol de la fusión de vesículas con la m em brana plasm át ica de los
term inales nerviosos. Por ot ro lado, se ha encont rado que la act ividad de los
canales de t ipo N es crít ica para la t ransm isión sinápt ica durante los
estadíos m ás tem pranos del desarrollo y en anim ales que carecen de la
subunidad CaV2.1 (Rosato Sir i y Uchitel 1999; Urbano et al. 2003) . En lo
que respecta al canal de t ipo L, se ha sugerido que su presencia en la PNM
(Urbano y Uchitel 1999) podría m odular el reciclado rápido de las vesículas
conteniendo acet ilcolina (Perissinot t i et al. 2008) .
OObbjjeettiivvooss
3 - Objetivos
30
Nuest ra invest igación se encuent ra or ientada a dilucidar los m ecanism os de
acción de los ant icuerpos de ELA posit ivos ( I gGs-ELA) , es decir, las I gGs
capaces de unirse a la PNM e inducir una potenciación sinápt ica.
En el presente t rabajo se plantearon los siguientes objet ivos específicos:
• Determ inar si las I gGs-ELA t ienen la capacidad de interactuar con la PNM
del m úsculo diafragm a de ratón y m odular su frecuencia espontánea de
liberación de acet ilcolina.
• Estudiar la react ividad de las I gGs-ELA hacia ot ras est ructuras neurales
relevantes para la patología de la enferm edad, com o la m édula espinal,
la corteza cerebral y el cerebelo.
• Dilucidar el rol que juegan los canales de calcio en esta interacción, para
lo cual se procedió a:
o Evaluar la react ividad y funcionalidad de los ant icuerpos en un
m odelo de ausencia del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y ot ro de ausencia
del canal de t ipo N.
o Analizar posibles interacciones ent re las I gGs-ELA y el canal de t ipo
P/ Q, así com o tam bién con ot ras proteínas presentes en los
term inales sinápt icos.
o I nvest igar los posibles cam bios en la expresión de proteínas
sinápt icas en dicho m odelo de deleción del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q.
MMaatteerriiaalleess yy MMééttooddooss
4 - Materiales y Métodos
4 .1 - Mater ia les
4.1.1 - React ivos
Todos los react ivos em pleados fueron de grado analít ico y adquir idos en
Sigm a-Aldrich (St . Louis, Missouri, USA) , salvo indicación cont rar ia. El
detalle de los ant icuerpos em pleados se m uest ra en la Tabla 4 .1 . Las
colum nas de agarosa-proteína G HiTrap fueron obtenidas de GE Healthcare
Bio-Sciences AB (Uppsala, Suiza) .
Para preparar todas las soluciones se ut ilizó agua ult rapura de calidad
m illi-Q, con una resistencia cercana a 18 MΩ.cm , obtenida a part ir de un
deionizador Barnstead (Therm o Scient ific, USA) . Las soluciones m adre de
las drogas fueron preparadas con agua para crom atografía iónica (Sigm a-
Aldr ich, USA) .
4.1.2 - Líneas de ratones
Para todos los experim entos, el tej ido fue ext raído de los anim ales
correspondientes a t res líneas m urinas diferentes: Swiss (m achos, P> 30) ,
línea carente de CaV2.1 sv129 (m achos y hem bras, P16-P23) y línea carente
de CaV2.2 C57BL/ 6 (m achos, P18) . Los anim ales de estas últ im as dos líneas
fueron donados por el Dr. Shin Hee-Sup, del I nst ituto Coreano de Ciencia y
Tecnología (Seul, República de Corea) . Los ratones de la línea Swiss fueron
adquir idos en el bioter io de la Facultad de Farm acia y Bioquím ica de la
Universidad de Buenos Aires.
32
4 - Materiales y Métodos
Tabla 4.1 : Información sobre los anticuerpos empleados en este trabajo.
Especie Empresa/ Laboratorio Nº Dilución Ant icuerpo
product ora (país de orígen) cat álogo ut i l izada
Ant i-CaV2.1 conej o Laboratorio Dr. Snut ch
(Canadá) BC229 1:10.000
Ant i-GAD65/ 67 conej o Sigma (USA) G5163 1:500 Ant i-GFAP conej o Sigma (USA) G9269 1:500 Ant i-NeuN rat ón Mil l ipore (USA) MAB377 1:500 Ant i-sinaptof isina rat ón Sigma (USA) S5768 1:400 Ant i-sinaptotagmina I conej o Alomone (Israel) ANR-003 1:500
Ant i-sinaptobrevina II rat ón Laboratorio Dr. Jahn
(Alemania) CL69.1 1:500
Ant i-sint axina 1A conej o Synapt ic Systems
(Alemania) 110302 1:1.000
Ant i-IgGhumano-FITC cabra Cappel (Países Baj os) 1201-0081 1:2.000 Ant i-IgGconej o-TMR cabra Molecular Probes (USA) T2769 1:1000 Ant i-IgGrat ón-TMR cabra Sigma (USA) T5393 1:100
Ant i-IgGhumano-HRP cabra Sant a Cruz Biot echnology
(USA) sc-2453 1:1.000
Ant i-IgGrat ón-HRP burro Sant a Cruz Biot echnology
(USA) sc-2314 1:1.000
Ant i-IgGconej o-HRP cabra Sant a Cruz Biot echnology
(USA) sc-2004 1:1.000
4.1.3 - Muest ras de suero hum ano
Los pacientes fueron diagnost icados con ELA esporádica de acuerdo al
cr iter io de El Escorial (Brooks, 1994) . Todos los individuos part icipantes
dieron su consent im iento escrito para form ar parte del estudio y el
protocolo aplicado fue aprobado por la Junta de Revisión I nst itucional del
Hospital Br itánico de Buenos Aires.
La edad al m om ento del diagnóst ico se encont raba com prendida en el
rango de 59 a 76 años (prom edio: 64,6 años) , con una proporción de sexos
de 6: 2 (H: M) . Seis pacientes evidenciaron un com ienzo espinal de la
patología, m ient ras que el resto m ost ró un inicio bulbar. Todos los
parám etros clínicos evaluados en cada paciente con ELA (Escala Funcional,
Escala Norr is, Escala Ashworth, Escala MRC) presentaron valores sim ilares
33
4 - Materiales y Métodos
(Tabla 4 .2 ) . La exclusión de form as genét icas de la enferm edad se basó en
la histor ia fam iliar de cada paciente.
Los cont roles enferm os (CE; n = 7; 4 m ujeres; edad prom edio: 56,0
años) com prendieron personas con el síndrom e m iasténico de Lam bert -
Eaton (un desorden auto- inm une contra CCDVs, CE1) , m iastenia gravis
(una enferm edad auto- inm une cont ra los receptores de acet ilcolina, CE2) ,
síndrom e de Charcot -Marie-Tooth (enferm edad de m otoneurona puram ente
genét ica que involucra la dest rucción de la vaina de m ielina, CE3) , form as
fam iliares de ELA (CE4-6) y neuropat ía m otora m ult ifocal con bloqueo de la
conducción (enferm edad auto- inm une cont ra la vaina de m ielina, CE7) .
Los cont roles sanos (CS; n = 3; 2 m ujeres; edad prom edio: 36,7
años) incluyeron sujetos sin ninguna evidencia de enferm edad neurológica.
Las m uest ras de sangre fueron colectadas al m om ento de realizar la
evaluación clínica. El suero fue separado por cent r ifugación y conservado a
-80 °C hasta su poster ior procesam iento.
4 .2 - Métodos
4.2.1 - Manejo de anim ales
Los ratones fueron t ratados de acuerdo a las guías nacionales para el t rato
hum ano de los anim ales de laborator io de la Universidad de Buenos Aires,
las cuales son com parables con las de los I nst itutos Nacionales de Salud
(NI H) de Estados Unidos. Se realizaron todos los esfuerzos posibles para
reducir el núm ero de anim ales ut ilizados, así com o tam bién su sufr im iento.
34
4 - Materiales y Métodos
Tabla 4.2: Parámetros clínicos de los pacientes con ELA esporádica incluidos en el estudio.
Escalas
Pacient e Edad
(años) Sexo ELA CFV
EF1 MRC2 Norris3 Ashwort h4
Tiempo Tasa de
progresión5 progresión (meses)
ELA1 66 M D A 22 136 49 7 4,50 4 ELA2 70 F D N ND ND ND ND ND 12 ELA3 67 M D N 33 149,5 68 1 0,58 12 ELA4 62 M Pr A 32 174 82 7 0,44 18 ELA5 70 F D N 30 ND 66 5 0,33 30 ELA6 77 M Ps A 35 162 67 3 0,08 60 ELA7 59 M D N 31 154,5 80 5 0,50 18 ELA8 67 M D N 28 138 61 9 0,50 24
Abreviat uras M: mascul ino, F: femenino, D: def inido, Pr: probable, Ps: posible, CFV: capacidad de fuerza vit al , A: anormal, N: normal, EF: escala funcional (en inglés, ALSFR), ND: no disponible, MRC: escala para fuerza muscular. 1 Rango: 0 a 40 (normal) 2 Rango: 0 a 190 (normal) 3 Rango: 0 a 99 (normal) 4 Rango: 0 (normal) a 36
5 Calculada con los valores de EF de la siguient e manera: )(
40
mesest
EF
progresión
−
4.2.2 - Genot ipado de ratones
La determ inación del genot ipo de los anim ales se llevó a cabo m ediante la
técnica de PCR m ult iplex (Opt icon Cycler, MJ Research, USA) , part iendo de
m aterial colectado por biopsias. Las m uest ras de ADN fueron purificadas
con el kit DNeasy Tissue (Qiagen I nc., Valencia, California, USA) luego de la
digest ión del tej ido con proteinasa K (2 m g/ m L) durante 15 h a 56 °C.
A cont inuación se detalla la secuencia de los pr im ers ut ilizados:
CaV2.1 forward: 5´ -CCAGCTTGAGTGGCCGCAGCACACG-3´
CaV2.1+ / + reverse: 5´ -ATAATAAGTCACCTCTGGTTCTAAAG-3´
CaV2.1 - / - reverse: 5´ -CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3´
CaV2.2 forward: 5´ -TGGCACCTTATGCCTTGCACGGTGCCTGCG-3´
CaV2.2+ / + reverse: 5´ -GGTCGAGATGGCTTGCGGGACCCGTTGGGA-3´
CaV2.2 - / - reverse: 5´ -GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT-3´
35
4 - Materiales y Métodos
El protocolo de am plificación em pleado fue el siguiente:
Genot ipado de CaV2.1:
• 95 °C 3 m in
• 95 °C 30 seg, 55 °C 30 seg, 72 °C 30 seg (35 ciclos)
• 72 °C 5 m in
Genot ipado de CaV2.2:
• 94 °C 2 m in
• 94 °C 20 seg, 58 °C 20 seg, 72 °C 40 seg (35 ciclos)
• 72 °C 7 m in
Los productos de PCR fueron separados m ediante una elect roforesis
en gel de agarosa (1 % p/ v) conteniendo brom uro de et idio (1 μg/ m L) . Las
bandas fueron analizadas de acuerdo a su tam año esperado: 240 pb para
CaV2.1+ / + , 390 pb para CaV2.1 - / -, 460 pb para CaV2.2+ / + y 580 pb para
CaV2.2 - / -. Para est im ar dicho tam año se em pleó el m arcador 1 kb Plus DNA
Ladder ( I nvit rogen, Carlsbad, California, USA) .
4.2.3 - Pur ificación de I nm unoglobulinas G
Todos los procedim ientos fueron realizados a 4 °C. Las m uest ras de suero
fueron cent r ifugadas a 12.000 g durante 10 m in y el sobrenadante se
som et ió a un fraccionam iento con sulfato de am onio hasta una
concent ración final de 50 % p/ v. La solución fue m antenida bajo agitación
durante 60 m in y luego cent r ifugada a 12.000 g durante 30 m in. El pellet
resultante se resuspendió en buffer fosfato de sodio 20 m M pH 7 y
36
4 - Materiales y Métodos
posteriorm ente se dializó cont ra la m ism a solución durante 16 h em pleando
una m em brana de celulosa de 12 kDa de poro.
El aislam iento de las I gGs se llevó a cabo por m edio de una
crom atografía de afinidad con una colum na de Proteína G-agarosa y buffer
fosfato 20 m M com o agente de lavado. Los ant icuerpos fueron eluídos con
glicina 0,1 M pH 2,7 y la acidez neut ralizada con Tris-HCl 1 M pH 9. Las
fracciones aisladas fueron dializadas cont ra el buffer fosfato salino (PBS;
buffer fosfato de sodio 10 m M, NaCl 150 m M, KCl 3 m M) pH 7,4 durante 5 h.
La concent ración de las I gGs fue est im ada por el análisis de
absorbancia de los eluídos a 280 nm , teniendo en cuenta la absort iv idad
m olar de las I gGs hum anas.
El chequeo de las fracciones purificadas se realizó m ediante una
elect roforesis en gel de poliacr ilam ida en condiciones desnaturalizantes y
posterior t inción del gel con azul de Coom assie. Las alícuotas fueron
conservadas a -20 °C.
4.2.4 - Ensayo de ELI SA
Para la cuant ificación de las I gGs de las m uest ras de suero se ut ilizó un
ensayo de ELI SA sandwich (Bethyl Laborator ies, Montgom ery, Texas, USA) ,
siguiendo las recom endaciones del fabricante. Se ut ilizaron placas de 96
pocillos Maxisorp (Nunc, Roskilde, Dinam arca) y se realizó la cobertura con
el ant icuerpo de captura (ant i- I gGhum ano) durante 15 h a 4 º C. Las m uest ras
y el pat rón se diluyeron en Tris-HCl 50 m M pH 8, NaCl 140 m M, BSA 1%
p/ v y Tween-20 0,05 % v/ v. El ant icuerpo de detección (acoplado a
peroxidasa de rábano) fue ut ilizado a una dilución 1: 10.000 y com o sust rato
para la m edición de act ividad se em pleó o- fenilendiam ina (OPD) a una
37
4 - Materiales y Métodos
concent ración de 0,5 m g/ m L, junto con H2O2 0,03 % v/ v. Luego de una
incubación a tem peratura am biente durante 30 m in, se realizó la lectura de
la absorbancia a 450 nm .
La est im ación de la concent ración de las I gGs se llevó a cabo -de
acuerdo a la sugerencia del proveedor- por ajuste de los datos a una curva
logíst ica de cuat ro parám etros, previa t ransform ación de las
concent raciones a escala logarítm ica, por m edio del software Sigm aPlot 10
(Systat Software I nc., Chicago, I llinois, USA) .
4.2.5 - Regist ros int racelulares
Los ratones fueron anestesiados con una sobredosis int raperitoneal de
t r ibrom oetanol 2 % (0,3 m L/ 10 g peso) , exsanguinados por la vena yugular
y eutanizados por decapitación. La disección del m úsculo diafragm a se llevó
a cabo en cajas de Pet r i cubiertas con Sylgard (Dow Corning, Midland,
Michigan, USA) conteniendo solución norm al de Ringer (RN; NaCl 137 m M,
KCl 5 m M, CaCl2 2 m M, MgSO4 1 m M, NaHCO3 12 m M, Na2HPO4 1 mM y
glucosa 11 m M, pH 7,2-7,4) , burbujeada cont inuam ente con O2 95 % / CO2
5 % .
Todos los procedim ientos fueron realizados a tem peratura am biente
(20-23 °C), salvo indicación cont rar ia. Algunos de estos experim entos
fueron realizados en colaboración con Lucas Vat t ino.
La preparación de nervio frénico-diafragm a fue colocada en una
cám ara de regist ro (volum en: 1 m L) e incubada con las I gGs purificadas de
pacientes o cont roles sanos durante 4 h en una atm ósfera hum idificada. Los
ant icuerpos fueron diluidos en RN hasta una concent ración final de 0,4
38
4 - Materiales y Métodos
m g/ m L. Para testear el efecto de las inm unoglobulinas se ut ilizó en form a
aleator ia tanto el hem i-diafragm a derecho com o el izquierdo.
La frecuencia de MEPPs fue determ inada en ausencia de tet rodotoxina
(act ividad espontánea) , antes y después del período de incubación, por
m edio de regist ros int racelulares. Para ello se em plearon m icroelect rodos de
vidr io conteniendo KCl 3 M ( resistencia: 20-30 MΩ) y se realizaron regist ros
de 2-5 m in de duración, adquir idos de un m áxim o de 15 fibras por anim al,
em pleando al m enos 3 ratones por t ratam iento.
El procedim iento de adquisición se llevó a cabo de la m anera
descripta previam ente (Pagani et al. 2006) . Los datos fueron alm acenados
en un disco duro para su poster ior análisis usando el software apropiado
(Axoscope 9.0 y Clam pfit 9.0, Axon I nst rum ents, Foster City, California,
USA) . Para realizar las com paraciones de datos y confección de gráficos se
em pleó el software Sigm aPlot 10.0 integrado con Sigm aStat 3.5 (Systat
Software I nc., Chicago, I llinois, USA) .
4.2.6 - I nm uno- fluorescencia de PNM
La eutanización de los anim ales y la disección se llevó a cabo según lo
descripto anteriorm ente. Los m úsculos disecados se fij aron con
paraform aldehído 4 % p/ v a 4 °C, se perm eabilizaron con Tritón-X100 1 %
v/ v y se cr iopreservaron en sacarosa 30 % p/ v a 4 º C. Com o m edio de
inclusión se em pleó OCT4583 TissueTek (Sakura, Tokyo, Japón) y se
obtuvieron secciones de tej ido de 40 μm em pleando un cr ióstato (ETR2248,
Reichert -Jung, Bensheim , Alem ania) . Dichas secciones fueron m ontadas en
portaobjetos cubiertos de gelat ina y guardadas a -20 °C. Para reducir la
señal de fondo de las fibras m usculares, los preparados de m úsculo
39
4 - Materiales y Métodos
diafragm a fueron cortados de m anera tangencial y en consecuencia, las
PNMs por lo general no m ost raron la form a t ipo pretzel que las caracter iza.
Los cortes de tej ido fueron perm eabilizados con Tr itón-X100 0,05 %
v/ v y poster iorm ente bloqueados con seroalbúm ina bovina (BSA) 3 % p/ v y
suero norm al de cabra 5 % v/ v, durante 30 m in. Al finalizar el bloqueo, se
incubaron las secciones con las I gGs purificadas de pacientes o individuos
cont roles, en las diluciones apropiadas (1: 10-1: 100) durante 16-20 h a 4
°C. Com o agente diluyente se ut ilizó PBS conteniend o BSA 3 % p/ v, suero
norm al de cabra 5 % v/ v, L- lisina 0,1 M y Tritón X-100 0,075 % v/ v. La
unión del ant icuerpo pr im ario se reveló ut ilizando un ant icuerpo ant i-
I gGhum ano acoplado a isot iocianato de fluoresceína (FI TC) en una dilución
1: 2.000. La co- t inción de los cortes con α-bungarotoxina (0,25 μg/ m L)
conjugada a tet ram et ilrodam ina (TMR) nos perm it ió ident ificar la PNM a
t ravés de su alta afinidad por el receptor post -sinápt ico de acet ilcolina.
Luego de exhaust ivos lavados con PBS, las secciones de m úsculo fueron
m ontadas en PBS: glicerol (1: 1) , cubiertas con cubreobjetos y selladas con
esm alte de uñas.
Para chequear las uniones no específicas y la auto- fluorescencia, se
incluyeron cont roles por om isión de α-bungarotoxina, ant icuerpos prim arios
(cont rol de isot ipo) o secundarios.
4.2.7 - I nm uno- fluorescencia de m édula espinal, corteza cerebral y cerebelo
Los ratones anestesiados con t r ibrom oetanol fueron perfundidos
t ranscardíacam ente con PBS seguido de una solución de paraform aldehído 4
% p/ v en sacarosa 4 % p/ v, luego de com probar la pérdida del reflejo
pupilar y plantar de las ext rem idades. Con posterior idad a la disección
40
4 - Materiales y Métodos
com pleta del cerebro, cerebelo y m édula espinal, el tej ido fue fij ado
adicionalm ente en la m ism a solución durante 2-4 h a 4 º C. Los cortes de
50-150 μm se obtuvieron con un vibrátom o I ntegraslice 7550PSDS
(Cam pden I nst rum ents, Loughborough, Reino Unido) y se perm eabilizaron
con Tritón X-100 1 % v/ v durante 30 m in. La incubación con las I gGs
purificadas de los pacientes o los individuos cont roles (0,2 m g/ m L) se llevó
a cabo durante 16-20 h a 4 °C, ut ilizando com o agente diluyente PBS con
BSA 3 % p/ v, suero norm al de cabra 5 % v/ v, L- lisina 0,1 M y Tritón X-100
0,075 % v/ v. La unión del ant icuerpo pr im ario fue detectada em pleando un
secundario ant i- I gGhum ano acoplado a FI TC, en una dilución de 1: 2.000.
Para la inm uno-m arcación de la m édula espinal, se analizaron las
secciones lum bares y toráxicas debido al gran tam año de las células
residentes en estas regiones. Las m otoneuronas infer iores fueron
detectadas por su m orfología y localización en el asta vent ral. El área
cort ical m otora pr im aria fue ident ificada en las rodajas con ayuda de un
at las de cerebro de ratón (Paxinos y Franklin 2001) , m ient ras que las
m otoneuronas fueron reconocidas por su m orfología y tam año. Las
neuronas de Purkinje fueron ident ificadas dent ro de las secciones
cerebelares por su m orfología dist int iva. En todos los casos previos, se
ut ilizó una cont ra- t inción con ioduro de propidio (3 μM, 60 m in) para
facilitar la dist inción m orfológica de las diferentes poblaciones celulares. En
el caso del tej ido fij ado, el ioduro de propidio t iñe tanto el citoplasm a com o
el núcleo de las células debido a su afinidad general por los ácidos
nucleicos.
41
4 - Materiales y Métodos
En form a análoga a lo descripto anter iorm ente, también se realizaron
co- t inciones de tej ido em pleando los m arcadores m encionados en la sección
Resultados y descriptos en la Tabla 4 .1 .
4.2.8 - Análisis de inm uno- fluorescencia y procesado de im ágenes
La m arcación inm uno- fluorescente se analizó con un m icroscopio confocal
FV300 (Olym pus Opt ical Co., Tokio, Japón) , equipado con un sistem a de
adquisición de im ágenes y el software Fluoview 3.3 (Olym pus Opt ical Co.,
Tokio, Japón) . Las secciones fueron escaneadas en form a secuencial con un
laser de argón (λ: 488 nm ) y helio-neón (λ: 543 nm ) , para reducir el
bleeding- through de las señales fluorescentes. Tanto la intensidad de los
láseres com o la configuración de cada fotom ult iplicador (voltaje, ganancia y
offset ) se m antuvieron constantes en cada experim ento.
Para el análisis de los cortes de PNM m ontados en portaobjetos, se
ut ilizó un objet ivo PlanApo 60x Olym pus de inm ersión en aceite (apertura
num érica: 1,4) , m ient ras que las rodajas fueron fotografiadas con un
objet ivo LUMplanFL 60x Olym pus de inm ersión en agua (apertura num érica:
0,9) o un UplanFL 20x Olym pus seco (apertura num érica: 0,5) .
Se procedió a colectar para cada canal un total de 10 planos
confocales a intervalos de 1 μm , los cuales fueron subsecuentem ente
analizados con el software I m ageJ 1.42 (Nat ional I nst itutes of Health,
Bethesda, Maryland, USA) . La cuant ificación de la intensidad de
fluorescencia se llevó a cabo por m edición del valor de gr is m edio de por lo
m enos 15 células o PNMs de 2-3 anim ales, luego de la sust racción de la
señal de fondo. Para el caso de las preparaciones de m úsculo, la región de
42
4 - Materiales y Métodos
interés se eligió en base a la señal de α-bungarotoxina. Los valores m edios
de gr is se norm alizaron al cont rol de isot ipo.
4.2.9 - Preparación de sinaptosom as
La purificación de las fracciones crudas de m em brana y sinaptosom as se
llevó a cabo según el protocolo de Gray y Whit taker (1962) .
El cerebelo de ratón fue disgregado con un hom ogenizador de
vidr io- teflón t ipo Dounce, en solución fr ía de Tris-HCl 50 m M pH 7,4
conteniendo sacarosa 0,32 M y EDTA 10 μM ( relación g tej ido: m L sacarosa
1: 10) . Los hom ogenatos fueron cent r ifugados a 1.000 g durante 10 m in a 4
º C y el sobrenadante resultante se cent r ifugó a 17.000 g durante 55 m in a
4 º C. Los pellets fueron resuspendidos en buffer RI PA (Tris-HCl 50 m M pH
8,0, NaCl 150 m M, NP-40 1 % v/ v, SDS 0,1 % p/ v y deoxicolato de sodio
0,5 % p/ v) , suplem entado con los inhibidores de proteasas apropiados
(EDTA 10 μM, PMSF 2 m M, aprot inina 10 μg/ m L, leupept ina 100 μM y
pepstat ina 1 μg/ m L) y em pleados en los experim entos de inm uno-
precipitación. Este ext racto representó la fracción cruda de m em branas.
Alternat ivam ente, se cont inuó con la purificación de sinaptosom as. El
pellet de la últ im a cent r ifugación se resuspendió en solución de sacarosa
0,32 M y se sem bró en un gradiente discont inuo de sacarosa com puesto por
dos fases (1,2 M - 0,8 M) . El fraccionam iento se realizó por cent r ifugación a
112.500 g durante 2 h. Los sinaptosom as se colectaron de la interfase de
sacarosa 1,2 M - 0,8 M y se concent raron por cent r ifugación a 100.000 g
durante 60 m in, para luego liofilizarse. Las m uest ras fueron luego
preparadas para su separación por elect roforesis en dos dim ensiones.
43
4 - Materiales y Métodos
4.2.10 - Obtención de ext ractos totales de cerebelo y m úsculo
Para la preparación del ext racto total de cerebelo, el tej ido fue disgregado
m ecánicam ente en presencia de buffer RI PA (suplem entado con inhibidores
de proteasas) , por m edio de un hom ogenizador t ipo Dounce.
Por su parte, el tej ido m uscular disecado de los m iem bros infer iores
fue pulverizado en presencia de N2 líquido ut ilizando un m ortero de
porcelana. El polvo resultante se solubilizó en buffer RI PA suplem entado con
inhibidores de proteasas.
En am bos casos, dada la alta viscosidad de la solución resultante, se
incluyó en el proceso de solubilización un paso ext ra de sonicado. Para ello
se em pleó un equipo Fisher Sonic Dism em brator m odelo 500 (Fisher
Scient ific, Loughborough, Reino Unido) , siguiendo un protocolo de 3 ciclos
de 5 segundos cada uno, a una intensidad de 20 % del m áxim o.
4.2.11 - Purificación de rafts
La obtención de las fracciones enriquecidas en proteínas de rafts se realizó
según el protocolo descripto en Maekawa et al. 1999.
Brevem ente, los ext ractos de cerebelo fueron obtenidos por
disgregación m ecánica en buffer TME (Tr is-HCl 10 m M pH 7,5, MgCl2 1 m M,
EGTA 1 m M) conteniendo Tritón-X100 2 % v/ v ( relación g tej ido: m L TME
1: 10) . A este hom ogenato se adicionó una alícuota de solución de sacarosa
2,4 M a fin de lograr una concent ración final de 0,8 M. La m uest ra se colocó
en el fondo de un gradiente discont inuo de sacarosa, seguido de una capa
de sacarosa 0,7 M (en TME) y ot ra de buffer TME. La separación se realizó
por cent r ifugación a 70.000 g durante 6 h a 4 °C. La banda ubicada en la
interfase ent re la capa de TME y sacarosa 0,7 M fue colectada y
44
4 - Materiales y Métodos
resuspendida en buffer TME conteniendo Tritón-X100 1 % v/ v. Luego de
una cent r ifugación a 100.000 g durante 1 h a 4 °C, el pellet se guardó a -80
°C para su posterior solubilización con buffer RI PA suplem entado con
inhibidores de proteasas.
4.2.12 - Cult ivo de células y t ransfección/ inducción
Las células em brionar ias de r iñón hum ano HEK293 (pasajes: 18-26, núm ero
de catálogo ATCC: CRL-1573) fueron m antenidas por pasajes seriados en
botellas de cult ivo de 75 cm 2 de área. Las células fueron crecidas en m edio
Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM) conteniendo L-glutam ina 4 m M, glucosa
4,5 g/ L, pir idoxina-HCl 4 m g/ L y piruvato de sodio 110 m L/ L, y
suplem entado con suero fetal bovino (SFB, Gibco, USA) 10 % v/ v
( inact ivado por calor) , en una estufa hum idificada m antenida a 37 °C y en
una atm ósfera com puesta por CO2 5 % y aire 95 % .
El subcult ivo de las células se realizó por incubación con t r ipsina-
EDTA (ácido et ilendiam intet ra-acét ico) 0,25 % p/ v seguida de una
inact ivación de la proteasa por adición de DMEM conteniendo SFB y
resem brando en botellas de cult ivo de 25 cm 2 de área. Para las
t ransfecciones se em plearon cult ivos con una confluencia del 50 % y se
ut ilizó la técnica de liposom as cat iónicos, con el react ivo Lipofectam ina 2000
( I nvit rogen, Carlsbad, California, USA) , siguiendo las inst rucciones del
proveedor.
La expresión del cDNA de la subunidad CaV2.1 hum ana, la β2a de rata
y la α2δ2 de rata se llevó a cabo en el vector pcDNA3.1Zeo(+ ) ( I nvit rogen,
Carlsbad, California, USA) . Treinta y seis horas luego de la t ransfección, se
45
4 - Materiales y Métodos
procesaron las células para los experim entos de inm uno-precipitación o
western blot , según se indica m ás adelante.
La línea celular inducible T- rex 293 (pasajes: 9-12) , der ivada de la
HEK293, se ut ilizó com o un m odelo de expresión estable de las subunidades
del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q. El cult ivo se realizó en form a esencialm ente
sim ilar al descr ipto previam ente, salvo por la adición al m edio de
am inoácidos no esenciales (1 % p/ v) , y 24 h previo a la inducción, de los
agentes de selección blast icidina (10 μg/ m L) , zeocina (200 μg/ m L) e
higrom icina B (150 μg/ m L) .
El vector ut ilizado en este caso fue el pcDNA5/ TO ( I nvit rogen,
Carlsbad, California, USA) , el cual cont iene un elem ento de respuesta a
tet raciclina que fue em pleado para dir igir la expresión del cDNA de la
subunidad CaV2.1 de rata. Las subunidades accesorias β2a y α2δ2 fueron
expresadas en el plásm ido pBudCE4.1 ( I nvit rogen, Carlsbad, California,
USA) . Las células fueron lisadas 48 h luego de la inducción con tet raciclina
(1,5 μg/ m L) . En am bos casos, la lisis se llevó a cabo en form a m ecánica
ut ilizando agujas de diám et ro interno decreciente (26-29 G) . La m ism a se
realizó en buffer conteniendo NP-40 (Tr is-HCl 50 m M pH 7,4, NP-40 0,5 %
v/ v, NaCl 150 m M y EDTA 50 m M) suplem entado con inhibidores de
proteasas para los ensayos de inm uno-precipitación o en buffer Laem m li
(Tr is-HCl 62,5 m M pH 6,8, SDS 2 % p/ v, azul de brom ofenol 0,01 % p/ v, β-
m ercaptoetanol 2 % v/ v y glicerol 10 % v/ v) para la elect roforesis seguida
de western blot .
46
4 - Materiales y Métodos
4.2.13 - Determ inación de la concent ración de proteínas
En todos los casos, la solubilización de las proteínas fue seguida por una
cent r ifugación de 20 m in a 21.500 g para separar el m aterial no
resuspendido.
La m edición de la concent ración de proteínas se llevó a cabo según el
m étodo descr ipto por Bradford (1976) , ut ilizando seroalbúm ina bovina com o
proteína pat rón.
4.2.14 - Ensayo de inm uno-precipitación
Una cant idad de proteínas de ent re 100 y 250 μg se incubaron durante 16 h
con los ant icuerpos y 60 μl de bolitas de agarosa con proteína G (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) , en un agitador rotat ivo a
4º C. Las bolitas de agarosa se lavaron con un buffer de lisis conteniendo
NP-40 (Tris-HCl 50 m M pH 7,4, NP-40 0,5 % v/ v, NaCl 150 m M y EDTA 50
m M) y los com plejos proteicos que interactuaron con los ant icuerpos fueron
eluídos con buffer Laem m li.
Los inm uno-precipitados fueron analizados por elect roforesis en
condiciones desnaturalizantes seguida de western blot . Una alícuota del
lisado em pleado originalm ente para el ensayo se corr ió en paralelo para
chequear la presencia de las proteínas analizadas ( input ) . Alternat ivam ente,
la fracción de proteínas inm uno-precipitadas se separó por elect roforesis y
posteriorm ente se procedió a la t inción del gel con nit rato de plata,
ut ilizando un protocolo com pat ible con espect rom etría de m asa (Vorum )
ext raído de Mortz et al. 2001.
47
4 - Materiales y Métodos
4.2.15 - Elect roforesis en gel de una dim ensión y western blot
Los western blots se llevaron a cabo de acuerdo a procedim ientos standard.
Los lisados celulares se resolvieron por elect roforesis en gel de
poliacr ilam ida (a un voltaje constante de 120 V) y se t ransfir ieron a
m em branas de nit rocelulosa (Am ersham Hybond ECL, GE Healthcare,
Piscataway, USA) , aplicando un voltaje constante de 100 V durante 60 m in.
Los sit ios de unión inespecífica fueron bloqueados con leche en polvo
descrem ada 2 % en PBST (PBS conteniendo Tween-20 0,2 % ) durante 90
m in a tem peratura am biente.
Las m em branas fueron incubadas durante 16 h a 4 °C con los
ant icuerpos pr im arios m encionados en la sección Resultados, seguido de
una incubación con los ant icuerpos secundarios correspondientes acoplados
a la peroxidasa de rábano. Todos los ant icuerpos fueron diluidos en PBST
conteniendo leche en polvo descrem ada 2 % . Las bandas inm uno- react ivas
fueron detectadas por em isión de quim iolum iniscencia ut ilizando el kit
I m m obilon Western (Millipore, Biller ica, Massachuset ts, USA) y el analizador
de im ágenes LAS-1000 plus (Fuj ifilm , Tokio, Japón) .
4.2.16 - Elect roforesis en gel de dos dim ensiones
Las m uest ras de sinaptosom as liofilizadas se resuspendieron en solución de
m uest ra para 2D (urea 7 M, t iourea 2 M, CHAPS 4 % ) y la concent ración
proteica se determ inó con el kit 2D-Quant (GE Healthcare, Piscataway,
USA) . La carga de las m uest ras en las t iras ut ilizadas en la pr im era
dim ensión ( I PG St r ips 3-10; GE Healthcare, Piscataway, USA) se realizó por
rehidratación pasiva durante toda la noche.
48
4 - Materiales y Métodos
El isoelect roenfoque se llevó a cabo según el siguiente esquem a: 30
m in a un voltaje constante de 300 V, 30 m in a un gradiente de voltaje
300-1.000 V, 80 m in a un gradiente de voltaje 1.000-5.000 V, term inando
con un voltaje constante de 5.000 V hasta com pletar 2.000 V h.
Las t iras con m uest ras enfocadas se equilibraron en un buffer Tr is
(Tris-HCl 75 m M pH 8,8, urea 6 M, glicerol 29,3 % , SDS 2 % , azul de
brom ofenol 0,002 % ) conteniendo DTT 10 m g/ m L (para reducir los puentes
disulfuro) y subsiguientem ente, iodoacetam ida 25 m g/ m L (para alquilar
grupos t ioles) .
La segunda dim ensión se realizó en un gel de poliacr ilam ida 12,5 %
en condiciones de corr iente constante (10 m A por gel) . Al term inar la
corr ida, los geles fueron teñidos empleando el protocolo de Coom assie
coloidal.
4.2.17 - Espect rom etría de m asa e ident ificación por m apeo pept ídico
Las proteínas a ser ident ificadas fueron escindidas del gel y digeridas con
t r ipsina (10 m g/ m L en NH4HCO3 25 m M) a 37 °C durante toda la noche. Los
pépt idos resultantes fueron ext raídos del gel con acetonit r ilo 60 % en ácido
t r if luoroacét ico 0,2 % , concent rados con bom ba de vacío y desalados con
una m icro-colum na C18 de fase reversa (OMI X Pippete t ips, Varian) . La
elución de los pépt idos se realizó directam ente con la solución de m at r iz
(ácido α- ciano-4-hidroxi-cinam ínico en acetonit r ilo 60 % y ácido
t r ifluoroacét ico 0,2 % ) .
Los espect ros de m asa de la m ezcla de digest ión fueron adquir idos
con un equipo MALDI -TOF-TOF m odelo 4800 de Applied Biosystem s
(Carlsbad, California, USA) , en un t rabajo en colaboración con los Drs.
49
4 - Materiales y Métodos
50
Carlos Cerveñansky, Rosario Durán y Analía Lim a (Unidad de Proteóm ica y
Bioquím ica Analít ica, I nst ituto Pasteur, Montevideo, Uruguay) . Para ello se
ut ilizó el espect róm etro de m asa en m odo reflector y se calibró
externam ente con pépt idos pat rones. Para la obtención de los espect ros de
MS/ MS se em pleó la herram ienta de disociación inducida por colisión.
Las proteínas fueron ident ificadas por búsqueda en la base de datos
NCBI nr con los valores de m / z y ut ilizando el program a MASCOT
(ht tp: / / www.m at r ixscience.com ) . Los parám et ros de búsqueda fueron los
siguientes:
• Tolerancia de m asa isotópica: 0,05 Da.
• Tolerancia de m asa fragm entada: 0,25 Da.
• Modificación fij a: carbam idom et ilación de cisteínas.
• Modificación var iable: oxidación de m et ioninas.
• Tolerancia de fragm entos t r ípt icos no encont rados: 1.
4.2.18 - Análisis estadíst ico
Los resultados se expresaron y graficaron com o valores de m edia ± error
standard de la m edia. Las diferencias ent re los grupos experim entales
fueron analizadas con el test no param ét r ico Mann-Whitney Rank Sum ,
m ient ras que el análisis de correlación ent re los datos se llevó a cabo con el
coeficiente de Spearm an. Para ello se em pleó el software Sigm aStat 3.5
(Systat Software I nc., Chicago, I llinois, USA) . Un valor de p m enor o igual a
0,05 fue considerado estadíst icam ente significat ivo.
RReessuullttaaddooss
5 - Resultados
5 .1 - Los ant icuerpos de ELA aum entan la act iv idad sinápt ica
espontánea e interactúan con la PNM de ra tón
En una prim era instancia determ inam os la concent ración de las I gGs en las
m uest ras de suero de pacientes con ELA por m edio de un ensayo de ELI SA
sandwich, ut ilizando un kit com ercial (Figura 5 .1 A ) . En form a paralela
analizam os las m uest ras provenientes de suero de los individuos norm ales
(CS) y de los pacientes con enferm edades neurológicas dist intas de ELA
esporádica (CE) , algunas de las cuales incluían form as hereditar ias de la
enferm edad (CE4-6) y ot ros desórdenes auto- inm unes (CE1-2 y CE7) .
Com o se observa en la Figura 5 .1 B , los valores de la cuant ificación de las
I gGs de los pacientes esporádicos m ost raron niveles dent ro del rango
encont rado para los individuos sanos (3,73-11,29 m g/ m L) , no
diferenciándose en form a significat iva de éstos (p> 0,05) . El m ism o pat rón,
aunque m as hom ogéneo, se pudo observar para el caso de los CE. La
agrupación de los datos según cada categoría tam poco reveló m ayores
diferencias, excepto en el caso de las m uest ras ELA6-8, que m ost raron una
concent ración de ant icuerpos significat ivam ente m ayor que las ELA1-5
(Figura 5 .1 B ; recuadro interno; p< 0,01) , aunque no resultó diferente a la
encont rada en los CS (p> 0,05) . La razón por la cual los datos de ELA fueron
com binados de esta m anera se com prenderá m as adelante.
Con el fin de estudiar si las I gGs-ELA purificadas de la serie de
pacientes incluidos en este estudio eran capaces de m odificar la frecuencia
de MEPPs, realizam os incubaciones de preparaciones de m úsculo diafragm a
de ratón con estos ant icuerpos. Poster iorm ente analizam os la tasa de
liberación espontánea de acet ilcolina por m edio de regist ros int racelulares
de las fibras m usculares.
52
5 - Resultados
53
Figura 5 .1 : Ensayo de ELI SA sandw ich pa ra la cuant if icación de las I gGs en e l suero hum ano. Se ut i l izó un kit comercial (Human IgG ELISA Quant it at ion Kit , Bethyl Laboratories, USA) para la det erminación de los niveles de ant icuerpo en cada muest ra de suero. La det ección se real izó mediant e la medición espect rofot omét rica de la act ividad de la enzima peroxidasa de rábano, empleando el sust rat o OPD (λabsorbancia: 450nm).
5 - Resultados
A) Gráf ico representat ivo de la curva de cal ibración ut i l izada para la est imación de la concent ración de las IgGs en cada muest ra. También se muest ra la ecuación del aj ust e de los dat os y los valores medios y errores de los parámet ros, al igual que la bondad de dicho aj ust e (R2). B) Gráf ico de barras most rando los valores obt enidos para t odas las muest ras. El recuadro int erno se elaboró a part ir de la combinación de t odos los dat os, además de separar las muest ras de ELA en dos grupos (ELA1-5 y ELA6-8). # p<0,01 vs ELA1-5. Los números en la part e inferior indican la cant idad t otal de datos promediados. Barras blancas = cont roles sanos (CS), barras grises = cont roles enfermos (CE), barras negras = pacient es con ELA.
Com o se puede observar en la Figura 5 .2 , cinco de las m uest ras de
ELA (63 % ) presentaron una clara tendencia a aum entar significat ivam ente
la frecuencia de potenciales m iniatura (p< 0,05 com parando frecuencia
inicial versus final) , part iendo de una condición basal de 30 MEPPs/ m in. Los
valores encont rados luego de 4 h de incubación con estas m uest ras fueron
ent re 2 y 5 veces m ayores a los iniciales.
Este efecto estuvo com pletam ente ausente en aquellos experim entos
donde se ut ilizó RN, o I gGs de los cont roles sanos o enferm os (p> 0,05
com parando la frecuencia inicial versus final) . Esta ausencia de efecto
tam bién fue observada en las t res m uest ras restantes de las I gGs-ELA
analizadas, las cuales fueron incapaces de aum entar la act ividad sinápt ica
espontánea por encim a de los niveles basales iniciales (p> 0,05 com parando
frecuencia inicial versus final) . Las diferencias observadas se hicieron m ás
m arcadas al agrupar los datos, especialm ente ent re ELA1-5 y ELA6-8
(Figura 5 .2 B ; recuadro interno) .
54
5 - Resultados
55
Figura 5 .2 : Regist ros de MEPPs de preparaciones de m úsculo dia fragm a de ra tón. Los músculos fueron incubados con RN o ant icuerpos purif icados de pacient es. A) Regist ros int racelulares representat ivos adquiridos ant es (t =0h) o después (t =4h) de la incubación. B) Cuant if icación de la f recuencia de MEPPs relat iva al comienzo del experiment o. * p<0,05 y ** p<0,001 comparando las f recuencias iniciales y f inales de MEPPs. El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,01 vs CS, ** p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de PNMs est udiadas en cada condición experimental. Barra blanca = RN, barras gris claro = CS, barras gris oscuro = CE, barras negras = ELA.
5 - Resultados
Para obtener una m ejor com prensión de el/ los sit io/ s de acción de
estos ant icuerpos, llevam os a cabo un estudio de inm uno- fluorescencia
indirecta, em pleando las I gGs de pacientes con ELA o individuos cont roles
com o ant icuerpos pr im arios, adem ás de ut ilizar α-bungarotoxina acoplada a
tet ram et ilrodam ina com o un m arcador post -sinápt ico de la PNM.
I nteresantem ente, las m ism as m uest ras de los pacientes con ELA que
produjeron una potenciación sinápt ica, tam bién presentaron react ividad
cont ra la PNM de diafragm a de ratón (Figuras 5 .3 y 5 .4 ; p< 0,05
com parando ELA versus cont rol de isot ipo) . Las intensidades de
fluorescencia en estos casos resultaron ser ent re 3 y 22 veces m ayor a las
encont radas en los cont roles sanos (Figuras 5 .3 y 5 .4 ; p< 0,05
com parando ELA versus CS) . Com o se m uest ra en el recuadro de la Figura
5 .4 A , los datos agrupados tam bién m ost raron diferencias m arcadas.
Por ot ro lado, la inm uno- react ividad de las restantes I gGs-ELA no
resultó significat ivam ente diferente a la señal de fondo (Figura 5 .4 ;
p> 0,05 com parando ELA versus el cont rol de isot ipo) ni a los cont roles
sanos (p> 0,05 com parando ELA versus CS) , excepto cuando se
consideraron en conjunto. En este últ im o caso sí se observaron diferencias
estadíst icam ente significat ivas (p< 0,05 com parando ELA6-8 versus CS) .
56
5 - Resultados
57
Figura 5 .3 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de ra tón . Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de rat ón fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacientes con ELA, CS o CE. La visual ización del ant icuerpo primario se real izó con un ant icuerpo secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC. Como marcador post -sinápt ico de la PNM se ut i l izó α-bungarotoxina conj ugada a TMR (RAch, recept or de acet i lcol ina). Se muest ran micrograf ías confocales represent at ivas del t ej ido inmuno-marcado. Las fot os en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aumento = 600X.
Mient ras que la m ayoría de las m uest ras cont roles perm anecieron
dent ro de los niveles de unión no específicos (p> 0,05 com parando las
m uest ras cont roles versus el cont rol de isot ipo) , dos de los seis cont roles
enferm os evidenciaron resultados posit ivos en este ensayo de inm uno-
m arcación (Figura 5 .4 ; p< 0,01 CE1 y CE2 versus el cont rol de isot ipo o
CS) . Curiosam ente estos ant icuerpos fueron purificados del suero de los
5 - Resultados
58
Figura 5 .4 : Medición de la inm uno- f luorescencia de PNM de ra tón. Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,05 vs CS, ** p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de PNMs est udiadas en cada condición experiment al (N=7 animales).
pacientes que padecían enferm edades auto- inm unes dir igidas cont ra los
com ponentes de la PNM, com o son el síndrom e m iasténico de Lam bert -
Eaton (CE1) y la m iastenia gravis (CE2) .
Un aspecto im portante que debe recalcarse es la falta de efecto
elect rofisiológico y unión a la PNM en todos los casos de ELA fam iliar
analizados (Figuras 5 .2 y 5 .4 ; CE4-6) . En este sent ido, todas las m uest ras
purificadas de los pacientes con la variante hereditar ia se com portaron de
form a esencialm ente sim ilar a los cont roles sanos (p> 0,05 com parando
CE4, CE5 o CE6 versus CS) .
5 - Resultados
5 .2 - React iv idad de las I gGs- ELA cont ra la PNM de los ra tones
CaV2 .1 - / - y Ca V2 .2 - / -
Existe una am plia variedad de evidencias que sugieren una asociación ent re
las I gGs-ELA y los CCVDs de t ipo P/ Q (Llinas et al. 1993; Sm ith et al. 1994;
Carter y Mynlieff 2003; Pagani et al. 2006) . Teniendo en cuenta estos
antecedentes, junto con la interacción específica que algunas I gGs-ELA
m ost raron hacia la PNM de ratón en el presente estudio, nos propusim os
evaluar si la ausencia de la subunidad α1 del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q o N
podía m odificar la unión de los ant icuerpos de ELA a esta est ructura
neuronal.
Com o se m uest ra en la Figura 5 .5 , las I gGs-ELA no evidenciaron una
interacción apreciable hacia los m úsculos diafragm a de ratones carentes de
la subunidad α1 específica del canal de Ca2+ t ipo P/ Q (p< 0,001 com parando
los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) . En estos casos, los valores de
intensidad de fluorescencia en los ratones carentes de la subunidad α1A no
resultaron estadíst icam ente diferentes de los obtenidos con los individuos
cont roles (Figura 5 .5 B ; p> 0,05 com parando ELA versus CS) . Esta m arcada
dism inución en la interacción de las I gGs-ELA tam bién puede apreciarse en
el recuadro de la Figura 5 .5 B , el cual m uest ra los datos organizados en
grupos.
En cont raste con estos resultados, los ant icuerpos de los CE que
m ost raron afinidad por la PNM de los ratones WT (Figura 5 .4 ; CE1 y CE2)
tam bién interactuaron con las secciones de m úsculo de los ratones CaV2.1 - / -
(Figura 5 .5 B ; p> 0,05 com parando los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) .
59
5 - Resultados
60
Figura 5 .5 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de los ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q. Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de los ratones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron expuestas a las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios se det erminó según lo especif icado ant eriorment e. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de la PNM. Las fot os en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Det erminación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05 y ** p<0,001 comparado con los músculo WT, respect ivament e. El número de PNMs anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 16 y 30 (N=5 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,001 vs CaV2.1+/ +).
5 - Resultados
Adicionalm ente, la diferencia en la react ividad m encionada
anteriorm ente no fue detectada al com parar los m úsculos de los ratones WT
y aquellos carentes del canal de Ca2+ de t ipo N (Figura 5 .6 ) . La interacción
de los ant icuerpos ELA con la PNM m ost ró sim ilares niveles para am bos
genot ipos (p> 0,05 com parando los anim ales CaV2.2+ / + versus CaV2.2 - / -) ,
salvo en el caso de las m uest ras ALS5 y ALS7 que exhibieron un pequeño
aum ento (p< 0,001 para ELA5 y p< 0,05 para ELA7, com parando los
anim ales CaV2.2+ / + versus CaV2.2 - / -) . La agrupación de los datos m ost ró un
increm ento discreto pero significat ivo en la fluorescencia de las m uest ras
ELA1-5 en el tej ido t ransgénico (Figura 5 .6 B ; recuadro interno; p< 0,05
com parando los anim ales WT versus CaV2.2 - / -) . Adicionalm ente, ninguno de
los CE que reaccionó cont ra los term inales de los anim ales WT m odificó su
nivel de unión en ausencia de la subunidad CaV2.2 (Figura 5 .6 B ; CE1 y
CE2; p> 0,05 com parando los anim ales WT versus CaV2.2 - / -) .
5 .3 - Funciona lidad de las I gGs- ELA en la act iv idad espontánea de la
PNM de los ra tones Ca V2 .1 - / -
Con el objet ivo de evaluar la relevancia funcional de la dism inución
encont rada en la interacción de las I gGs-ELA con la PNM de los ratones
CaV2.1 - / -, testeam os el efecto de los ant icuerpos en la act ividad sinápt ica
espontánea de los m úsculos de los ratones norm ales y carentes de la
subunidad form adora del poro. Desafortunadam ente, debido a la escasez de
m uest ra, no pudim os incluir en este estudio todas las I gGs-ELA ensayadas
previam ente.
61
5 - Resultados
62
Figura 5 .6 : I nm uno- f luorescencia de la PNM de los ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo N. Las secciones (40 μm) de músculo diaf ragma de los ratones CaV2.2-/ - o WT (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios se det erminó según lo especif icado ant eriorment e. A) Fotos represent at ivas de la PNM. Los paneles en la úl t ima columna muest ran las imágenes superpuest as. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05 y ** p<0,001 comparando con los músculos WT. El número de placas anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 15 y 25 (N=4 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,05 vs CaV2.2+/ +).
5 - Resultados
Luego de un período de incubación de 4 h, la m itad de las m uest ras
analizadas increm entaron significat ivam ente la liberación de acet ilcolina de
los term inales WT, llevando la frecuencia de act ividad espontánea a valores
ent re 40 y 60 veces m ayores a los iniciales (Tabla 5 .1 ; p< 0,001
com parando los anim ales CaV2.1+ / + versus CaV2.1 - / -) . A pesar de que los
preparados de m úsculo de los ratones de la línea sv129 resultaron ser m ás
sensibles al efecto de los ant icuerpos que los correspondientes a Swiss
(Figura 5 .2 B ) , es im portante destacar que am bos resultados están
esencialm ente en concordancia.
I nteresantem ente, aquellos ant icuerpos que prom ovieron un
increm ento en la tasa de liberación de neurot ransm isor en la PNM no fueron
capaces de aum entar la frecuencia de MEPPs por encim a de los valores
iniciales en los m úsculos de los ratones CaV2.1 - / - (Tabla 5 .1 ; p< 0,001
com parando los anim ales WT y CaV2.1 - / -) . Sin em bargo, todos los
preparados de los ratones nulos para la subunidad CaV2.1 retuvieron su
habilidad de responder a un est ím ulo despolar izante (KCl 15 m M)
increm entando significat ivam ente su frecuencia de act ividad espontánea
luego de un período de incubación de 10 m in (Tabla 5 .2 ; p< 0,001
com parando la frecuencia de KCl con la inicial y la de 4 h) .
63
5 - Resultados
Tabla 5.1 : Frecuencia de MEPPs normalizada al comienzo del experimento, luego de 4 h de incubación con las IgGs-ELA indicadas. Ent re parént esis se det al la el número de f ibras anal izadas (provenient es de 4 animales por genot ipo).
genot ipo
CaV2.1+/ + CaV2.1-/ -
0 h 4 h 0 h 4 h ELA2 1,00±0,09 (28) 45±11† (17) 1,00±0,09 (23) 0,79±0,07* (20) ELA5 1,00±0,09 (19) 59±8† (17) 1,00±0,08 (23) 0,73±0,07* (21) ELA7 1,00±0,07 (39) 0,70±0,05 ( 33) 1,0±0,1 (21) 0,78±0,09 (20)
Pac
ien
te
ELA8 1,0±0,4 (23) 0,54±0,07 (19) 1,0±0,1 (15) 1,0±0,2 (14)
† p<0,001 vs f recuencia inicial
* p<0,001 vs f recuencia de CaV2.1+/ + Tabla 5.2 : Frecuencia de MEPPs de músculo diaf ragma CaV2.1-/ - al comienzo del experiment o y luego de una incubación secuencial de 4 h con la IgG-ELA5 y 10 min con una solución de KCl 15 mM. Ent re parént esis se det al la el número de f ibras anal izadas (provenient es de 2 animales).
0 h 4 h KCl 15 mM
ELA5 1,00±0,08 (7) 0,9±0,1 (7) 69±14* (7)
* p<0,001 vs f recuencia inicial y 4 h
5 .4 - Estudio de la inm uno- m arcaci ón de las I gGs- ELA en cerebelo,
cor teza cerebra l y m édula espina l
Para caracter izar en m ayor detalle la react ividad de los ant icuerpos de ELA
ut ilizando ot ros sust ratos neuronales relevantes para la patofisiología de la
enferm edad, realizam os ensayos de inm uno- fluorescencia en cortes de
m édula espinal y corteza cerebral de ratones.
La gran m ayoría de los ant icuerpos de los pacientes con ELA
presentaron una afinidad significat iva hacia las est ructuras m otoneuronales
del asta vent ral, especialm ente hacia el citoplasm a celular (Figura 5 .7 ) .
Esto llevó a que los datos agrupados tam bién resultaran significat ivam ente
m ás elevados com parados con los CS (Figura 5 .7 B ; recuadro interno) .
64
5 - Resultados
Algunos ant icuerpos revelaron adem ás capacidad de unión a los
com ponentes nucleares, com o puede observarse para ELA5 (Figura 5 .7 A ) .
El pat rón obtenido en la m édula espinal, sin em bargo, no resultó
sim ilar al hallado en los cortes de m úsculo diafragm a, ya que tanto las
m uest ras que reaccionaron con la PNM com o las que no lo hicieron,
exhibieron interacción con las neuronas m otoras. Este resultado se ve
reflejado en la separación de los datos en estos dos grupos (Figura 5 .7 B ;
recuadro interno) . Sin em bargo, existe una tendencia significat iva de las
m uest ras ELA6-8 a presentar una m enor react ividad hacia las
m otoneuronas infer iores respecto de las ELA1-5, comportam iento que ya se
había apreciado en la PNM, con diferencias m as acentuadas.
En cuanto a los cont roles sanos, todas las m uest ras evaluadas
m ost raron niveles de inm uno- react ividad dent ro de los valores basales.
Por su parte, los ant icuerpos de cuat ro CE exhibieron diferencias respecto
de los CS, con valores ya sea por encim a (CE1, CE3 y CE7) o por debajo de
estos últ im os (CE2) , haciendo que los CE sean en form a colect iva
significat ivam ente m as elevados (Figura 5 .7 B ; recuadro interno) .
Al analizar la unión de los ant icuerpos a las rodajas conteniendo la
corteza m otora pr im aria de ratón, ninguna de las m uest ras de los pacientes
con ELA o los individuos cont roles exhibió una afinidad por el tej ido m ayor a
la unión no específica presente en el cont rol de isot ipo ( resultados no
m ost rados) .
65
5 - Resultados
66
Figura 5 .7 : I nm uno- f luorescencia de la m édula espin a l. Las secciones (150 μm) de médula espinal de los rat ones fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacientes con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios fue revelada usando un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC. A) Imágenes representat ivas de las mot oneuronas resident es en el asta vent ral de la médula espinal. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las mot oneuronas, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 y ** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,001 vs CS y # p<0,01 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de células est udiadas en cada condición experiment al (N=5 animales). Barras blancas = CS, barras grises = CE, barras negras = ELA.
5 - Resultados
Un análisis sim ilar en los cortes de cerebelo reveló que la m ayoría de
las I gGs-ELA m ost raron afinidad por los ant ígenos presentes en las células
de Purkinje (Figura 5 .8 ; p< 0,05 com parando ELA versus el cont rol de
isot ipo) . Este pat rón dio lugar a que los datos de ELA agrupados (ya sea en
su totalidad o separados en ELA1-5 y ELA6-8) resultaran significat ivam ente
m ayores a los cont roles sanos (Figura 5 .8 B ; recuadro interno) . Por su
parte, el grupo ELA6-8 tam bién evidenció un aum ento considerable respecto
al ELA1-5. La m ayor parte de las m uest ras evidenciaron afinidad
principalm ente hacia los com ponentes som át icos de estas neuronas (Figura
5 .8 A ; ELA3 y ELA7) , m ient ras que ot ras m ost raron unión hacia ant ígenos
pr incipalm ente nucleares (ELA5) o cont ra am bos en diferente grado (ELA2 y
ELA8) . La inm uno- react ividad hacia las células residentes en las capas
m olecular y granular del cerebelo fue considerablemente m enor a la
encont rada hacia las neuronas de Purkinje, excepto para la m uest ra ELA5
donde se pudo apreciar una generalizada t inción de los núcleos celulares.
Adem ás, para el caso de ELA3 se observó una unión de los ant icuerpos
hacia com ponentes citoplasm át icos de las células de la capa m olecular y
granular.
67
5 - Resultados
68
Figura 5 .8 : I nm uno- f luorescencia de cerebelo. Los cort es (150 μm) de cerebelo de los ratones se incubaron con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La presencia de los ant icuerpos primarios fue revelada usando un ant icuerpo ant i-IgGhumano acoplado a FITC. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de las neuronas de Purkinj e. M y G denot an las capas cerebelares molecular y granular, respect ivament e. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Det erminación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las células de Purkinj e, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,05, ** p<0,01 y *** p<0,001 comparando con los CS. El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os (* p<0,001 vs CS y # p<0,001 vs ELA1-5). El número dent ro de las barras indica la cant idad de células est udiadas en cada condición experimental (N=7 animales). Barras blancas = CS, barras grises = CE, barras negras = ELA.
5 - Resultados
Por su parte, ninguno de los cont roles sanos reveló una unión
apreciable a las est ructuras cerebelares (Figura 5 .8 ; p> 0,05 com parando
los cont roles sanos versus el cont rol de isot ipo) , m ient ras que dos de las
m uest ras de CE (CE1 y CE7) interactuaron significat ivam ente con los
ant ígenos de esta est ructura. Para el caso de CE1, esta interacción se
produjo tanto hacia com ponentes nucleares com o citoplasm át icos (Figura
5 .8 A ) , m ient ras que CE7 evidenció afinidad m ayorm ente por estos últ im os
( resultado no m ost rado) .
Realizando un estudio m ás detallado sobre el t ipo celular hacia el cuál
los ant icuerpos estaban reaccionando, encont ram os que algunas de las
m uest ras presentaron afinidad por ast rocitos, tanto en la m édula espinal
(Figura 5 .9 A , ELA1) com o en cerebelo (Figura 5 .9 B , ELA1) . Esta
característ ica se hizo evidente por la elevada co- localización de la señal de
las I gGs-ELA con la del m arcador ast rocít ico GFAP (proteína glial fibr ilar
acídica) . Sin em bargo, la presencia de estos ant icuerpos ant i-ast rocitos no
fue un fenóm eno generalizado, com o se m uest ra en la Figura 5 .9 para el
caso de ELA2. En los cortes espinales tam bién pudo apreciarse unión de los
ant icuerpos de ELA a ot ros t ipos celulares.
69
5 - Resultados
70
Figura 5 .9 : I nm uno- react iv idad de I gGs- ELA hacia as t rocitos. Las rodaj as (50 μm) de t ej ido de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) j unt o con un ant icuerpo específ ico cont ra una prot eína ast rocít ica, GFAP (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGconej o unido a TMR, respect ivament e. En la últ ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. Barra: 20 μm. Aument o = 600X. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de cort es de médula espinal lumbar, en la región correspondient e a la sust ancia blanca próxima a las neuronas motoras. B) Imágenes t omadas de secciones de cerebelo, en la zona de sust ancia blanca (SB) ubicada ent re dos capas de células granulares (G).
5 - Resultados
En lo que respecta a la inm uno- react ividad hacia neuronas del asta
vent ral, encont ram os que no todas las m otoneuronas m arcadas con el
ant icuerpo ant i-NeuN (una proteína neuronal nuclear) unieron I gGs de
pacientes con ELA (Figura 5 .1 0 A , células rojas en la últ im a colum na) . Sin
em bargo, la localización de estas m otoneuronas NeuN+ I gG-ELA- no m ost ró
ninguna preferencia por regiones vent ro-m ediales o vent ro- laterales
(Figura 5 .1 0 B ) , encont rándose a todo lo largo del eje m edio- lateral.
Tam bién pudo observarse que los ant icuerpos de pacientes t iñeron ot ros
t ipos celulares no neuronales de tam año relat ivam ente m enor (Figura
5 .1 0 A , células verdes en la últ im a colum na) .
Tam poco se encont ró ninguna dist r ibución preferencial de las células
NeuN+ I gG-ELA- en ot ras regiones espinales (com o la m édula toráxica) , ni
correlación de la intensidad de m arca de las I gGs hum anas con niveles de
expresión de proteínas buffers de Ca2+ com o parvalbúm ina o calbindina
( resultados no m ost rados) .
El m ism o t ipo de estudio realizado sobre cortes de cerebelo reveló
una m arca general de las I gGs-ELA hacia neuronas granulares (Figura
5 .1 1 , capa granular) , con diferentes grados de inm uno- react ividad ent re
m uest ras. En esta capa de la corteza cerebelar tam bién se observó una
t inción m uy evidente hacia células NeuN- (Figura 5 .1 1 , capa granular,
flechas) , que sin em bargo m ost raron una im portante expresión del
m arcador de neuronas GABAérgicas GAD65/ 67 (Figura 5 .1 2 , capa granular,
flechas) . Por su parte, la m arca de I gGs-ELA en la capa m olecular se
encont ró asociada tanto al som a de células NeuN+ (Figura 5 .1 1 , capa
m olecular) com o a procesos de neuronas GABAérgicas (Figura 5 .1 2 , capa
m olecular) .
71
5 - Resultados
72
Figura 5 .1 0 : I nm uno- react iv idad de I gGs- ELA hacia m otoneuronas infer iores. Las secciones (50 μm) de médula espinal lumbar de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA j unt o con un ant icuerpo cont ra un marcador neuronal nuclear, NeuN. La det ección de los ant icuerpos primarios se l levó a cabo con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGrat ón conj ugado con TMR, respect ivament e. A) Micrograf ías confocales representat ivas de la zona del ast a vent ral . En la úl t ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. Barra: 20 μm. Aument o = 600X. B) Imágenes t omadas a menor aumento que en A correspondient e a t oda la región del ast a vent ral . En la misma se encuent ra delimit ado el borde de la sust ancia gris (l ínea punt eada) y se especif ica la orient ación del cort e (L = lat eral, V = vent ral). Se muest ra solament e la superposición de la señal de los canales verde y roj o. Barra: 50 μm. Aument o = 200X.
5 - Resultados
73
Figura 5 .1 1 : I nm uno- f luorescencia de I gGs- ELA y neu ronas cerebelares. Las rodaj as (50 μm) de t ej ido de rat ones CaV2.1+/ + (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) y con un ant icuerpo cont ra NeuN (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGrat ón unido a TMR, respect ivamente. En la últ ima columna se muest ra la superposición de ambos canales. En las micrograf ías correspondient es a la capa granular se señalan con f lechas aquel las células NeuN-negat ivas marcadas con las IgGs-ELA, mient ras que en los panales inferiores se denot an células doble posit ivas. Barras: 20 μm. Aument o = 600X.
5 - Resultados
74
Figura 5 .1 2 : I nm uno- react iv idad de I gGs- ELA hacia i nterneuronas cerebelares. Las secciones (50 μm) de cerebelo de los rat ones salvaj es (P18) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de pacient es con ELA (primera columna) y con un ant icuerpo cont ra un marcador de neuronas GABAérgicas, GAD65/ 67 (segunda columna). La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó con un secundario ant i-IgGhumano acoplado a FITC y un ant i-IgGconej o unido a TMR, respect ivament e. En la úl t ima columna se muest ra la superposición de los canales. En las fot os de la capa granular se marcan con f lechas aquel las int erneuronas GABAérgicas (GAD-posit ivas) con una señal signif icat iva de IgGs-ELA. Barra: 20 μm. Aument o = 600X.
5 - Resultados
5 .5 - Corre lación ent re la m odul ación sinápt ica y la inm uno-
react iv idad t isular
Realizando un estudio involucrando todos los parám etros analizados hasta
el m om ento se encont ró que exist ía una correlación significat iva ent re el
grado de unión de los ant icuerpos ELA a la PNM y tanto la frecuencia de
potenciales m iniatura (Figura 5 .1 3 A ) com o el grado de t inción de las
m otoneuronas espinales (Figura 5 .1 3 B ) . Esta correlación estuvo ausente al
realizar la com paración con la inm uno- react ividad en las neuronas de
Purkinje (Figura 5 .1 3 C ) . Por ot ro lado, no se encont ró relación al analizar
una posible asociación ent re la m odulación sinápt ica y la interacción de las
I gGs-ELA con el tej ido cerebelar (Figura 5 .1 3 E ) o espinal (Figura 5 .1 3 F ) .
Estos últ im os parám etros tam poco m ost raron un com portam iento sim ilar al
ser analizados por el test de correlación (Figura 5 .1 3 D ) .
5 .6 - Efecto de la deleción de Ca V2 .1 sobre la react iv idad de las
I gGs- ELA hacia e l sistem a nervioso cent ra l
Nuest ro próxim o paso consist ió en establecer si la interacción de los
ant icuerpos de ELA con las est ructuras neurales cent rales m encionadas
previam ente dependía de la presencia de la subunidad CaV2.1, com o había
sido apreciado en los experim entos con la PNM (Figura 5 .5 ) , o si se t rataba
de un fenóm eno solo presente en los term inales m otoneuronales.
75
5 - Resultados
76
Figura 5 .1 3 : Corre lación ent re la inm uno- react iv ida d y la inducción sinápt ica. En los gráf icos se muest ra la relación ent re la f recuencia de pot enciales miniat ura (MEPPs) y la int ensidad de f luorescencia en t odas las est ruct uras neuronales est udiadas. En el ext remo superior derecho de cada recuadro se det al la el valor del coef icient e de correlación de Spearman (r) j unt o con su signif icancia est adíst ica (p). El anál isis de correlación comprendió los datos de t odos los pacient es ELA, excepto en A donde se excluyó el punt o señalado con el ast erisco. En A y B (las únicas correlaciones signif icat ivas) se incluyó además el aj ust e l ineal de los datos (l ínea cort ada). Los dat os para la confección de los gráf icos fueron ext raidos de las Figuras 5.2B, 5.4, 5.7B y 5.8B.
5 - Resultados
La ausencia de la subunidad α1 que part icipa en la form ación del poro
del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q no m odificó en form a apreciable los niveles de
inm uno-m arcación en las rodajas de tej ido espinal, com o puede observarse
en la Figura 5 .1 4 . La única excepción fue la m uest ra ELA6, la cual m ost ró
una m ayor interacción hacia las m otoneuronas infer iores de los anim ales
t ransgénicos (Figura 5 .1 4 B ) .
Por ot ro lado, si bien la intensidad de m arca obtenida en estos
ensayos es m enor en com paración con los experim entos realizados con la
línea Swiss (Figura 5 .7 ) , el grupo de las m uest ras que presentó
ant icuerpos cont ra com ponentes m otoneuronales en ambos casos es
esencialm ente idént ico.
Con respecto a los ensayos realizados en cerebelo, no se encont ró
una diferencia m arcada ent re los ratones salvajes y los carentes de la
subunidad CaV2.1 (Figura 5 .1 5 ) . Sin em bargo, sí se encont ró una
interacción con el anim al t ransgénico significat ivam ente m ayor para el caso
de la m uest ra ELA7 (Figura 5 .1 5 B ) , hecho que cont r ibuyó a que el grupo
no react ivo hacia la PNM m ost rara un ligero increm ento en su unión al som a
de las neuronas de Purkinje (Figura 5 .1 5 B ; recuadro interno) .
Adicionalm ente, los ant icuerpos purificados del CS3 evidenciaron un ligero
decrem ento en su unión al tej ido cerebelar de los anim ales CaV2.1 - / -
(Figura 5 .1 5 B ) .
77
5 - Resultados
78
Figura 5 .1 4 : I nm uno- f luorescencia de m édula espina l de los ra tones carentes del cana l de Ca 2 + t ipo P/ Q. Los cort es (150 μm) de la médula espinal de los rat ones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron incubados con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó según lo descript o ant eriorment e. A) Imágenes representat ivas de las mot oneuronas resident es en el asta vent ral de la médula espinal. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las motoneuronas espinales, normal izada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 comparado con WT. El número de células anal izadas en cada condición experiment al varió ent re 15 y 24 (N=4 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los dat os.
5 - Resultados
79
Figura 5 .1 5 : I nm uno- f luorescencia de cerebelo de ra tones carentes del canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q. Las rodaj as (150 μm) de cerebelo de los ratones CaV2.1-/ - o WT (P16-23) fueron incubadas con las IgGs purif icadas de los pacient es con ELA, CS o CE. La det ección de los ant icuerpos primarios se real izó según lo descript o ant eriormente. A) Micrograf ías confocales represent at ivas de las neuronas de Purkinj e. M y G denot an las capas cerebelares molecular y granular, respect ivament e. Barra: 25 μm. Aument o = 600X. B) Cuant if icación de la int ensidad de f luorescencia en el soma de las células de Purkinj e, normalizada al cont rol de isot ipo. * p<0,01 y ** p<0,001 comparado con WT. El número de células anal izadas en cada condición experimental varió ent re 15 y 39 (N=5 animales). El recuadro int erno muest ra la combinación de los datos (* p<0,05 vs CaV2.1+/ +).
5 - Resultados
Cabe destacar que en térm inos generales, el pat rón de unión
obtenido hacia el tej ido cerebelar de los anim ales salvajes fue sim ilar al
observado anter iorm ente en los ratones de la cepa Swiss (Figura 5 .8 ) . La
t inción observada con las m uest ras de ELA, sin em bargo, resultó m ás
hom ogénea en térm inos de intensidad, en cont raste con la m arcada
diferencia existente ent re las m uest ras react ivas hacia la PNM y las no
react ivas, encont rada en los pr im eros experim entos.
5 .7 - Análisis de la interacción de las I gGs- ELA con la subunidad α1
de l canal de Ca 2 + de t ipo P/ Q y ot ras proteínas presinápt icas
Dada la correlación sustancial encont rada ent re la expresión de la
subunidad α1 del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y tanto la unión com o la
m odulación sinápt ica ejercida por los ant icuerpos de ELA sobre la PNM,
decidim os evaluar una posible interacción directa de dichas I gGs con las
subunidades del canal de Ca2+ .
Para ello ut ilizam os la línea celular HEK293, un sistem a de expresión
heterólogo m uy ut ilizado en neurobiología (Thom as y Sm art 2005) .
Transfectam os las células con las subunidades CaV2.1, β2a y α2δ, y
analizam os los lisados celulares por western blot en búsqueda de
react ividad cont ra alguna banda que co-m igrara con la subunidad CaV2.1.
El análisis de las m em branas reveló que ninguna de las m uest ras
evaluadas m ost ró afinidad hacia la subunidad form adora del poro, al m enos
en las condiciones desnaturalizantes en las que se llevó a cabo el ensayo
(Figura 5 .1 6 A ) . Por su parte, com o m uest ra la Figura 5 .1 6 B , algunas de
las I gGs-ELA reaccionaron con una proteína desconocida cuyo peso
m olecular era en principio sim ilar al correspondiente para la subunidad α2δ
80
5 - Resultados
81
Figura 5 .1 6 : I nteracción de los an t icuerpos de ELA con e l canal P/ Q t ransfectado. Las células sobre-expresaron solo las subunidades accesorias (β2a y α2δ2, -) o el canal P/ Q int acto (CaV2.1, β2a y α2δ2, +). Las int eracciones con los ant icuerpos de ELA se evaluaron 36 h post -t ransfección. A) y B) West ern blot de los l isados de células HEK293 t ransfect adas (+, -) o no t ransfect adas (NT). Las membranas fueron incubadas con los ant icuerpos de los pacient es ELA (1:500) o con un ant icuerpo policlonal de conej o ant i-CaV2.1 (1:10.000) como cont rol de la expresión. En B se exhibe la misma membrana en una región de peso molecular diferent e a la most rada en A. C) Ensayo de inmuno-precipit ación de células HEK293 t ransfect adas, ut i l izando las IgGs-ELA o un ant icuerpo ant i-CaV2.1 como cont rol posit ivo. Una al ícuot a del l isado original (40 μg) fue corrida en el mismo gel para chequear la correct a expresión de la subunidad CaV2.1 (input ). También se anal izó en paralelo un cont rol negat ivo por omisión de los ant icuerpos (bol it as).
(m asa est im ada: 130 kDa) . Debido a que dicha banda tam bién fue
detectada en las células no t ransfectadas, se desest im ó su posterior
estudio.
Paralelam ente ut ilizam os una aproxim ación diferente para invest igar
la posibilidad de que los ant icuerpos de ELA interactuaran directa o
indirectam ente con el canal de Ca2+ , realizando ensayos de inm uno-
precipitación con los ext ractos de células t ransfectadas con las subunidades
de dicho canal.
5 - Resultados
A pesar de que la subunidad CaV2.1 pudo ser detectada fácilm ente en
los lisados originalm ente ut ilizados para el ensayo de inm uno-precipitación,
ninguna de las m uest ras testeadas m ost ró una interacción apreciable con el
canal de t ipo P/ Q (Figura 5 .1 6 C ) .
Adicionalm ente, em pleam os un sistem a alternat ivo de expresión del
canal de Ca2+ de t ipo P/ Q (Figura 5 .1 7 ) . En dichos experim entos se ut ilizó
una línea celular derivada de la HEK293 que expresaba este canal en form a
estable e inducible por tet raciclina ( línea T-Rex293) . Los resultados
encont rados fueron esencialm ente los m ism os que los observados con la
t ransfección t ransiente del canal (Figuras 5 .1 6 A y 5 .1 6 C) .
Em pleando el m ism o t ipo de ensayo, tam bién evaluam os varias
m uest ras en búsqueda de react ividad cont ra proteínas presentes en la pre-
sinapsis de un ext racto de sinaptosom as de cerebelo, tales com o
sinaptotagm ina I , sintaxina 1A, sinaptofisina y sinaptobrevina I I (Figura
5 .1 8 ) . En ninguno de los casos testeados pudim os detectar una interacción
ent re las I gGs-ELA analizadas y dichos com ponentes pre-sinápt icos, a pesar
de que estos últ im os resultaron ser fácilm ente detectables, ya sea en la
fracción proteica ut ilizada para el ensayo ( input ) y/ o en el cont rol posit ivo
del m ism o (Figura 5 .1 8 ; PRE) .
82
5 - Resultados
83
Figura 5 .1 7 : I nteracción de los ant icuerpos de ELA con e l cana l de Ca 2 + de t ipo P/ Q inducido. Las células sobre-expresaron solo las subunidades accesorias (β2a y α2δ2, -) o el canal P/ Q int acto (CaV2.1, β2a y α2δ2, +). Las int eracciones con los ant icuerpos de ELA se evaluaron 48 h post -inducción. A) West ern blot de los l isados de células T-rex293 expuestas (+) o no (-) al agent e inductor t et racicl ina durant e 48 h. Las membranas fueron incubadas con los ant icuerpos de pacient es con ELA (1:500) o con un ant icuerpo ant i-CaV2.1 (1:10.000) como cont rol de la expresión. B) Experiment os de inmuno-precipit ación de células T-rex293 inducidas (+) o no inducidas (-), ut i l izando las IgGs-ELA o un ant icuerpo ant i-CaV2.1 como cont rol posit ivo. Una f racción del l isado original (50 μg) fue procesada en el mismo gel para verif icar la correcta inducción de la subunidad CaV2.1 (input ). También se real izó un cont rol negat ivo por omisión de ant icuerpos (bol it as).
Figura 5 .1 8 : I nteracción de los ant icuerpos de ELA con proteínas presinápt icas. Los experiment os de inmuno-precipit ación con las IgGs-ELA se l levaron a cabo con prot eínas de la f racción cruda de membranas sinapt osomales purif icadas de cerebelo de rat ón (CaV2.1+/ +, P17). El análisis de los precipit ados se real izó por west ern blot , usando ant icuerpos cont ra varias prot eínas presinápt icas: sinaptot agmina I (1:500), sint axina 1A (1:1.000), sinapt of isina (1:400) y sinaptobrevina II (1:500). Una f racción del l isado inicial (40 μg) se corrió en paralelo (input ). Se incluyeron cont roles por omisión de ant icuerpos (bolit as) e inmuno-precipit ación con los ant icuerpos cont ra las propias prot eínas presinápt icas (PRE) a modo de cont rol posit ivo.
5 - Resultados
5 .8 - Análisis com parat ivo de la i nteracción de las I gGs- ELA con las
proteínas sinápt icas de los ra tones Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -
Con el objet ivo de realizar una com paración en la interacción de las I gGs-
ELA con las proteínas sinápt icas de los anim ales salvajes y aquellos
carentes de canales de Ca2+ de t ipo P/ Q, llevam os a cabo ensayos de
inm uno-precipitación. Los ext ractos em pleados en estos experim entos
com prendieron proteínas sinaptosom ales de la fracción cruda de m em brana,
purificadas a part ir de los anim ales CaV2.1+ / + o CaV2.1 - / -. El estudio se
cent ró pr incipalm ente en aquellas m uest ras de I gGs que habían presentado
una interacción select iva hacia los term inales de las m otoneuronas de los
ratones salvajes. Los com plejos que interactuaron con los ant icuerpos se
separaron por elect roforesis unidim ensional desnaturalizante y las bandas
proteicas se revelaron por t inción del gel con nit rato de plata.
Com o se puede observar en la Figura 5 .1 9 A , el pat rón de las
proteínas de ext ractos crudos de sinaptosom as cerebelares que se unieron
a las I gGs-ELA fue m uy sim ilar tanto ent re los genot ipos com o ent re las
m uest ras analizadas. En uno de los casos estudiados detectam os la
aparición de una banda diferencial de 61 kDa (Figura 5 .1 9 A ; aster isco en
ELA1) , pero por su alta inespecificidad se desest im ó su posterior estudio.
Tam bién se realizó el m ism o t ipo de estudio ut ilizando para el ensayo
proteínas provenientes de un ext racto total de cerebelo y aislando por
cent r ifugación aquellos com ponentes con afinidad hacia las I gGs-ELA. Com o
se aprecia en la Figura 5 .1 9 B , tam poco en este caso se pudo detectar el
reconocim iento por parte de los ant icuerpos de ELA de alguna proteína con
una expresión m enor en ratones CaV2.1 - / - respecto de los CaV2.1+ / + .
84
5 - Resultados
85
5 - Resultados
Figura 5 .1 9 : I nm uno- precipitación com parat iva de pr oteínas. de cerebelo as IgGs-ELA, eicas fueron
V V -prot eínas se separaron por cent rifugación y se eluyeron con buf fer Laemmli. Luego de la elect roforesis, el gel se t iñó con nit rat o de plat a, empleando un prot ocolo compat ible con espect romet ría de masa. Las cadenas pesadas (IgGCP) y l ivianas (IgGCL) de los ant icuerpos est án indicadas en el margen izquierdo. A la derecha de la f igura se muest ran los pesos moleculares de los pat rones. Una f racción de cada l isado inicial se corrió en paralelo (input ), así como t ambién el cont rol por omisión de ant icuerpos (bol it as). El ast erisco en (A) denot a una banda no específ ica (61 kDa) que no est uvo present e en t odos los experiment os.
Una aproxim ación experim ental alternat iva consist ió en llevar a cabo
una inm uno-precipitación a part ir de un ext racto total de proteínas
m usculares. El pat rón de react ividad obtenido en este caso fue m uy sim ilar
en todas las m uest ras analizadas, no detectándose ninguna interacción
presente en form a select iva en las I gGs-ELA con act ividad neuronal
potenciadora (Figura 5 .1 9 C ) .
5 .9 - Proteóm ica com parat iva de las proteínas sinápt icas de los
ra tones Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -
Con el propósito de estudiar cam bios globales en la expresión de las
proteínas sinápt icas en los ratones carentes de la subunidad CaV2.1, se
em prendió un abordaje que involucró el uso de técnicas de elect roforesis
m ult idim ensional acopladas a proteóm ica. Para ello, se purificaron los
sinaptosom as de cerebelo de los anim ales CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - m ediante
una cent r ifugación diferencial en gradiente discont inuo de sacarosa. Las
proteínas sinápt icas así aisladas se analizaron por m edio de una
elect roforesis bidim ensional que im plicó una prim era separación de la
m uest ra según su punto isoeléct r ico, seguida de un segundo
Las prot eínas provenient es de la f racción cruda de membranas de sinaptosomas (A) o de un ext ract o t ot al de cerebelo (B) o músculo (C) se precipit aron con lmediant e el uso de bolit as de agarosa unidas a prot eína G. Las f racciones protaisladas a part ir de rat ones Ca 2.1+/ + o Ca 2.1-/ - (P18-20). Los complej os IgGs
86
5 - Resultados
fraccionam iento de acuerdo al peso m olecular. La presencia de proteínas se
reveló por t inción con Coom assie coloidal.
Realizando la com paración ent re genot ipos del perfil proteico de los
sinaptosom as se pudo detectar que la m ayoría de las proteínas presentes
en la sinapsis se encont raron en niveles sim ilares cuando el canal de Ca2+
de t ipo P/ Q se hallaba ausente, com parando con los anim ales salvajes
(Figura 5 .2 0 ) .
No obstante, algunas proteínas m ost raron cam bios im portantes en
sus niveles sinápt icos en ratones CaV2.1 - / -, pudiéndose observar tanto
proteínas que se encont raron increm entadas (Figura 5 .2 0 ; círculos rojos)
com o dism inuidas (Figura 5 .2 0 ; círculos negros) en las m uest ras
t ransgénicas. Esta diferencia puede apreciarse m ás claram ente en la Figura
5 .2 1 , donde se grafica la cuant ificación de la densidad ópt ica de estas
proteínas diferenciales.
Con el objeto de proceder a la ident ificación de dichas proteínas
diferenciales, las m ism as fueron escindidas del gel y digeridas
exhaust ivam ente con t r ipsina. Cada m ezcla de pépt idos resultante de la
digest ión fue analizada por espect rom et ría de m asa ut ilizando un equipo del
t ipo MALDI -TOF-TOF. Para la ident ificación de cada m uest ra se ut ilizó tanto
la inform ación del m apeo pept ídico ( lista de picos de cada espect ro) com o
los datos de los fragm entos producto de la disociación inducida por colisión.
En la Figura 5 .2 2 se pueden observar los espect ros de m asa obtenidos
para aquellas proteínas que m ost raron una dism inución m arcada en los
anim ales CaV2.1 - / -, j unto con los picos em pleados para la fragm entación
87
5 - Resultados
88
5 - Resultados
89
Figura 5 .2 0 : Elect roforesis com parat iva. El anál isis de las muest ras de los sinapt osomas se real izó por elect roforesis en dos dimensiones. Las prot eínas (50 μg) se f raccionaron según su punt o isoeléct rico (en sent ido horizont al) y post eriorment e según su peso molecular (en sent ido vert ical). La det ección de las prot eínas se l levó a cabo por t inción con azul de Coomassie. En los ext remos derecho e inferior se muest ra el rango de peso molecular y pH anal izados, respect ivament e. Las prot eínas sinapt osomales se purif icaron a part ir de los ratones CaV2.1+/ + (A) o CaV2.1-/ - (B). Los círculos denot an aquellas prot eínas que most raron un aumento ( ) o una disminución ( ) en los ratones t ransgénicos respect o de los WT.
5 - Resultados
90
Figura 5 .2 1 : Cuant if icación de la intens idad de las proteínas diferencia les. Las prot eínas numeradas en los geles most rados en la Figura 5.20 fueron suj etas a un anál isis densit omét rico para est imar su int ensidad en cada genot ipo. El est udio de la densidad ópt ica se l levó a cabo con el programa ImageJ, analizando una región de int erés y post eriorment e sust rayendo la señal de fondo.
(Figura 5 .2 2 ; aster iscos) . Por su parte, la Tabla 5 .3 detalla los resultados
de las ident ificaciones de las ocho proteínas diferenciales, m ost rando
inform ación concerniente a cada m olécula encont rada y algunos de los
parám etros de dicha invest igación. Para el caso de la m uest ra núm ero 3, el
espect ro de m asa obtenido contenía pr incipalm ente los fragm entos producto
de la auto-digest ión de la t r ipsina, hecho que im posibilitó una ident ificación
estadíst icam ente significat iva de dicha proteína.
5 -
Re
su
lt
ad
os
91
79
9.0
16
42
.42
48
5.8
33
29
.2
Ma
ss (m
/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
1940.9261
2211.1023
2751.2227
2225.1125
842.4973
1126.5492
806.0816
2083.0110
870.5336
1922.9180
1475.7595
2716.2078
3533.5569
2299.1833
1365.6359
2221.1301
2807.3093
1051.4902
1283.6509
2011.9606
1774.8854
1179.5771
950.4432
1622.8124
1713.7937
2564.1833
2408.0657
2869.3359
ma
sa (m
/z)
intensidad (% )
*
mu
estra 1
79
9.0
16
42
.42
48
5.8
33
29
.2
Ma
ss (m
/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
p[
,]
1475.7581
2211.1111
1365.6394
1427.7858
1940.9335
2729.3911
3011.4128
1320.5793
1179.5945
1708.7515
1383.6700
842.5012
2225.1245
1109.4806
954.4537
1996.9685
2383.9678
1445.6700
1716.8466
832.2959
1193.6062
1838.9186
1037.5171
2075.9067
2285.9900
973.5167
1265.6296
1908.8195
1491.7417
2508.1199
905.4484
1118.5066
2399.0327
1329.6461
1605.7423
1390.6732
827.4060
2564.2107
1699.8264
1989.0021
2717.1121
2807.3325
2221.1477
2144.9714
1550.7148
1791.7639
1852.9011
1189.5988
3312.3430
2921.4033
3097.4478
ma
sa (m
/z)
intensidad (% )
*
*
mu
estra 2
79
9.0
16
42
.42
48
5.8
Ma
ss
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
1940.9438
2211.1250
842.5005
2239.1506
1923.9606
806.0964
1126.5605
2042.9990
1774.9148
881.2586
1051.4941
2300.1912
1282.6843
971.4418
1504.7051
1713.8020
1425.7507
1341.6863
2564.2322
2408.0852
2807.3359
1623.8231
1978.8988
2193.1326
mu
estra 3
intensidad (% )
ma
sa (m
/z)
5 - Resultados
92
Figura 5 .2 2 : Espect ros de m asa. Las prot eínas numeradas en la Figura 5.20 fueron escindidas del gel, digeridas con t r ipsina y los pépt idos result ant es fueron suj et os a una ident if icación por espect romet ría de masa. Para el lo se ut i l izó la t écnica de mapeo pept ídico empleando un espect rómet ro de masa del t ipo MALDI-TOF-TOF. Se muest ran en la f igura los espect ros de masa represent at ivos de las cinco prot eínas que present aron mayor expresión en los ratones salvaj es. Los números corresponden a los picos de masa de mayor int ensidad. Los ast eriscos indican los pépt idos ut i l izados para el anál isis de secuencia por medio de disociación inducida por col isión.
799.0 1642.4 2485.8
Mass (
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1779.820
1
832
.3064
100
3.564
2
1940.957
6
162
8.954
2
2211.139
2
189
7.966
1
806
.4174
1826.913
1
230
7.081
1
2229.147
5
147
5.774
2
104
8.556
9
1560.813
6
110
6.549
4
1720.772
1
1312.697
4
192
2.955
7
208
3.039
3
1229.543
2
2565.236
8
238
3.997
1
881
.266
8
826
.4009
280
7.389
2
949
.4609
masa (m / z)
inte
nsi
da
d (
%)
*
* muest ra 4
799.0 1642.4 2485.8
Mass (
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 133
7.662
6
194
0.987
9
2196.170
9221
1.167
5
842.5313
151
9.730
7
222
5.181
9
128
5.7173
1106
.572
8
192
3.993
7
118
1.6282
208
3.0652
806
.1155
135
9.645
9
871
.0464
2012.038
1
1025.557
3
256
5.263
9
229
9.248
8
280
8.407
2
171
4.871
2
1775.950
2
1427.819
5
masa (m / z)
inte
nsi
da
d (
%)
*
*
*
muest ra 5
5 - Resultados
Tabla 5.3: Resumen de la identificación proteica po r mapeo peptídico. La búsqueda en la base de dat os de NCBInr se real izó con el programa MASCOT.
muest ra prot eína ident if icada Especie PM
t eórico1,2 PM
experiment al cobert ura de
Score3 secuencia
1 Sust rat o de quinasa C rico en alanina, mirist oi lado (MARCKS)
Rat ón 30 kDa 90 kDa 160 (46) 10 %
2 Prot eína ácida soluble de cerebro-1 (BASP-1/ NAP-22/ CAP-23)
Rat ón 22 kDa 52 kDa 159 (49) 47 %
3 Muest ra no ident if icada - - 47 kDa - -
4 Gl iceraldehído-3-fosfat o deshidrogenasa
Rat ón 36 kDa 39 kDa 79 (54) 4 %
5 Cof i l ina-1 Rat ón 19 kDa 20 kDa 216 (54) 25 %
6 Secernina-1 Rat ón 46 kDa 57 kDa 177 (52) 29 %
7 Subunidad α de ATP sint et asa mit ocondrial
Rat ón 60 kDa 59 kDa 245 (53) 7 %
8 Calmodul ina Rat ón 17 kDa 16 kDa 171 (53) 19 %
1 PM: Peso molecular 2 Especie: Mus musculus (rat ón) 3 Los dat os est án expresados en relación al umbral a part ir del cual las ident if icaciones son signif icat ivas (número ent re parént esis).
5 .1 0 - I nteracción de las I gGs- ELA con la proteína BASP- 1
De todos los candidatos sugeridos por el análisis com parat ivo de
espect rom et ría de m asa, decidim os proseguir con el estudio m ás detallado
de la interacción de las I gGs-ELA con la proteína BASP-1. Para ello,
realizam os ensayos de inm uno-precipitación em pleando com o fuente de
proteínas ext ractos de cerebelo enriquecidos en rafts (Maekawa et al.
1999) .
Com o prim era aproxim ación, realizam os con algunas de las m uest ras
de ELA potenciadoras, un estudio com parat ivo ent re ext ractos proteicos de
ratones salvajes y CaV2.1 - / -. El pat rón de proteínas interactuantes con los
ant icuerpos puede apreciarse en la Figura 5 .2 3 A , donde no se observaron
diferencias apreciables ent re genot ipos, salvo la muest ra ELA4 que presentó
interacción con una proteína m ás representada en los ratones CaV2.1 - / -.
(Figura 5 .2 3 A , asterisco) . En part icular, no se advirt ió la presencia de
93
5 - Resultados
94
Figura 5 .2 3 : I nm uno- precipitación com parat iva de pr oteínas de rafts. Los ext ractos enriquecidos en prot eínas cerebelares de raf t s provenient es de rat ones CaV2.1-/ - (A) o CaV2.1+/ + (A y B) fueron incubados con las IgGs-ELA, y los complej os fueron aislados mediant e el uso de bolit as de agarosa conj ugadas a prot eína G. Para el experimento se ut i l izaron ratones de edad P16-20. Luego de la elect roforesis de los precipit ados, el gel (acri lamida 7,5 % v/ v) se t iñó con nit rat o de plat a, empleando un protocolo compat ible con espect romet ría de masa. La cadena pesada de los ant icuerpos (IgGCP) se indica en el margen izquierdo. A la derecha de la f igura se muest ran los pesos moleculares de los pat rones. El ast erisco en A denota una banda precipit ada con ELA4 enriquecida en la muest ra de ratones CaV2.1-/ -.
5 - Resultados
95
proteínas diferenciales en la zona de pesos m oleculares correspondientes a
los reportados para esta proteína, en las condiciones de nuest ro ensayo, es
decir la zona de 55-60 kDa (Maekawa et al. 1993; Maekawa et al. 1999) .
En un acercam iento alternat ivo, tam bién se llevó a cabo la
com paración de los pat rones de proteínas precipitadas con sueros que
presentaron o no afinidad hacia la PNM. En la Figura 5 .2 3 B se m uest ran
los resultados para las cuat ro m uest ras analizadas. Nuevam ente, en la zona
de pesos m oleculares donde se esperaba la presencia de BASP-1, no se
apreció u cción s l ct iva d t n de rafts co los sueros
m oduladores.
na intera e e e pro eí as n
DDiissccuussiióónn
6 - Discusión
6 .1 - Placa neurom uscular
En el presente t rabajo de tesis hem os detectado la existencia de una
subpoblación de pacientes con ELA esporádica, que representa un 63 % del
total de las m uest ras, cuya fracción de I gGs indujo un increm ento en la
liberación espontánea de acet ilcolina (Figura 5 .2 ) . Este efecto ha sido
postulado com o una consecuencia de un aum ento en la concent ración
int racelular de Ca2+ a nivel de los term inales sinápt icos, ocasionado por la
unión de las I gGs-ELA a la m em brana presinápt ica (Uchitel et al. 1988;
Uchitel et al. 1992a; Pagani et al. 2006) .
I nteresantem ente, la m ism a serie de pacientes cuyos ant icuerpos
produjeron dicha potenciación sinápt ica tam bién presentaron I gGs en suero
capaces de interactuar con la PNM de ratón (Figuras 5 .3 y 5 .4 ) . De hecho,
se pudo encont rar una correlación significat iva ent re estos parám etros,
com o se observa en la Figura 5 .1 3 A , sugir iendo de esta m anera una
asociación ent re la unión de los ant icuerpos al term inal m otor y su posterior
efecto funcional. Estos resultados refuerzan aquellos obtenidos por Pagani
et al. (2006) , donde los autores correlacionaron posit ivam ente la unión de
los ant icuerpos de ELA con los efectos elect rofisiológicos estudiados. De
esta m anera, es posible separar a los pacientes analizados en este estudio
en dos grupos, uno de los cuales podría presentar un com ponente auto-
inm une neurom uscular m ediando su neuropatología.
Existe una am plia serie de evidencias que sugieren un rol para el Ca2+
com o un im portante prom otor de disfunción y m uerte celular (Appel et al.
2001; Orrenius et al. 2003) . Adicionalm ente, las m otoneuronas espinales
son conocidas por su part icular vulnerabilidad a cualquier desbalance de
97
6 - Discusión
Ca2+ , dada la baja expresión de proteínas buffer de este ión (Alexianu et al.
1994) . Un increm ento en los niveles int racelulares de Ca2+ por encim a de
un cierto valor um bral podría disparar procesos deletéreos, tales com o la
act ivación de calpaínas, el plegam iento incorrecto de proteínas acoplado al
est rés del ret ículo endoplásm ico, la producción de especies react ivas del
oxígeno y la liberación de glutam ato (Orrenius et al. 2003; Sm aili et al.
2009) . La est im ulación de cada una de estas vías podría eventualm ente
llevar a la inducción de apoptosis. Por lo tanto, el aum ento en la
concent ración int racelular de Ca2+ provee una conexión clave para
relacionar las hipótesis previam ente propuestas para explicar la patología
de ELA. En este sent ido, num erosos reportes docum entando un aum ento en
el contenido de Ca2+ de las m otoneuronas y los term inales sinápt icos de los
ratones inoculados con las I gGs-ELA han provisto una im portante relación
ent re la sobre-carga de Ca2+ y esta patología (Engelhardt et al. 1995; Pullen
y Hum phreys 2000) .
La com paración ent re los niveles de react ividad de los ant icuerpos de
ELA hacia la PNM (Figura 5 .4 ) y su efecto potenciador sobre la tasa de
descarga espontánea (Figura 5 .2 ) indica que am bos fenóm enos m uest ran
un com portam iento sim ilar, a pesar de que sus rangos de increm ento
parecen ser m oderadam ente diferentes. Adem ás de las diferencias
int r ínsecas en la sensibilidad de las técnicas em pleadas, las discrepancias
podrían ser el resultado de la presencia en algunas m uest ras de dist intos
ant icuerpos capaces de interactuar con los term inales sinápt icos.
La presencia de niveles significat ivos de inm uno- react ividad en
algunos cont roles enferm os no fue com pletam ente inesperada (Figuras 5 .3
y 5 .4 ) , debido a que se sabía que estos individuos podían poseer
98
6 - Discusión
ant icuerpos dir igidos cont ra proteínas involucradas en la t ransm isión
sinápt ica (CCDVs en CE1 y el receptor de acet ilcolina en CE2) . En este
sent ido, estas m uest ras resultaron út iles com o cont roles posit ivos para la
técnica de inm uno- fluorescencia ut ilizada para detectar auto-ant icuerpos en
las m uest ras de los pacientes con ELA. Adem ás, cabe recalcar que si bien
algunos cont roles enferm os m ost raron afinidad por la PNM de ratón, en
ningún caso las I gGs de los cont roles increm entaron la act ividad sinápt ica
espontánea (Figura 5 .2 ) .
Ot ro aspecto im portante a tener en cuenta es la falta de unión a las
preparaciones de m úsculo de los ant icuerpos provenientes de pacientes
presentando la form a fam iliar de ELA (Figura 5 .4 ; CE4-6) , así com o
tam bién su incapacidad de increm entar la act ividad sinápt ica espontánea de
los term inales m otores (Figura 5 .2 B ) . Estos resultados enfat izan la
especificidad de nuest ros hallazgos con las inm unoglobulinas de individuos
con ELA esporádica, debido a que se sabe que la form a hereditar ia de esta
enferm edad es clínicam ente indist inguible de la variante esporádica.
6 .2 - Sistem a nervioso cent ra l
Para efectuar una caracterización adicional de la react ividad de las I gGs-ELA
hacia ot ros posibles sust ratos neuronales, llevam os a cabo experim entos de
inm uno-m arcación en rodajas de m édula espinal y corteza cerebral de
ratón. Estas est ructuras son los sit ios donde residen los som as de las
m otoneuronas infer iores y superiores, respect ivam ente. Am bos t ipos
celulares son im portantes efectores del m ovim iento. Tam bién se analizaron
cortes de cerebelo m urino, debido a que esta parte del cerebro está
involucrada en la coordinación de los m ovim ientos y se ha visto que los
99
6 - Discusión
ant icuerpos de ELA pueden m odular las corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q en
neuronas de Purkinje (Llinas et al. 1993) , sugir iendo de esta m anera una
posible interacción con com ponentes cerebelares.
6.2.1 - Médula espinal
Llevando a cabo el análisis m encionado, hem os encont rado un am plio
pat rón de react ividad de las I gGs-ELA en el asta vent ral de la m édula
espinal (Figura 5 .7 ) , donde la gran m ayoría de las m uest ras analizadas
m ost ró afinidad hacia m otoneuronas infer iores y ot ros t ipos celulares de
m enor tam año. Realizando una co- t inción con un m arcador neuronal
específico (NeuN) encont ram os que no todas las m otoneuronas unieron
ant icuerpos de pacientes con ELA (Figura 5 .1 0 A ) . Esta heterogeneidad fue
una característ ica presente en la totalidad de las m uest ras analizadas. La
m arca predom inantem ente citoplasm át ica observada con el ant icuerpo ant i-
NeuN ha sido reportada con anter ior idad para esta est ructura neural (Mullen
et al. 1992; Kim et al. 2009) .
Adicionalm ente, estas células NeuN+ I gGs-ELA- no m ost raron ninguna
ubicación preferencial en los cortes, ya sea a lo largo del eje m edio- lateral
(Figura 5 .1 0 B ) , com o al analizar dist intas secciones espinales (m édula
toráxica y lum bar) . Estos últ im os resultados sugieren que los ant icuerpos de
ELA no estarían interactuando preferencialm ente con m otoneuronas que
inervan grupos part iculares de m úsculos, sean éstos distales/ proxim ales
(dist r ibuidos en dirección latero-m edial en la m édula) , o toráxicos/ de
ext rem idades infer iores. Tam poco se encont ró correlación ent re la unión de
las I gGs-ELA y los niveles de expresión de proteínas com o parvalbúm ina o
calbindina, sugir iendo que el ant ígeno presente en el som a neuronal no
100
6 - Discusión
estaría relacionado con la capacidad buffer de Ca2+ ( resultados no
m ost rados) .
Existen variados antecedentes que docum entan la react ividad de las
I gGs-ELA hacia los ant ígenos de las m otoneuronas infer iores. Dichos
reportes se valieron de técnicas elect rofisiológicas (Carter y Mynlieff 2003) ,
inm uno-histoquím icas (Kiernan y Hudson 1993; Greiner et al. 1996;
Schluep et al. 1998) y elect roforét icas (Brown et al. 1987; Niebroj -Dobosz
et al. 2006) . En el presente t rabajo, llevando a cabo un estudio de
correlación ent re varios de los parám etros m encionados previam ente, se
encont ró una asociación significat iva ent re la unión de las I gGs a la PNM y
su correspondiente interacción con las m otoneuronas espinales (Figura
5 .1 3 B) . Esta relación sugerir ía la posibilidad de que el ant ígeno presente en
la PNM que reacciona con las I gGs-ELA tam bién esté presente en el som a
de las m otoneuronas. Com o puede apreciarse en la Figura 5 .1 4 , la falta de
variación en la inm uno-m arcación de la m édula espinal ent re los ratones
CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - (a diferencia de lo que ocurre en la PNM) indicaría que,
o bien se t rata de ant ígenos diferentes, o bien es la m ism a m olécula pero su
presencia en el som a m otoneuronal es en principio independiente de la
expresión del canal P/ Q.
Resultaría de gran ut ilidad indagar en m ás detalle en futuras
aproxim aciones experim entales sobre la ident idad de este ant ígeno de
expresión heterogénea en el som a de m otoneuronas. De esta m anera se
podría dilucidar si guarda correlación con alguna característ ica fisiológica
dist int iva de este sub-grupo de neuronas m otoras, así com o tam bién su
relevancia en la patofisiología de ELA.
101
6 - Discusión
6.2.2 - Cerebelo
Existen extensos reportes indirectos de la interacción de los ant icuerpos de
ELA con com ponentes cerebelares. En un estudio hecho en células de
Purkinje disociadas en form a aguda, se detectó un aum ento en las
corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q inducido por las I gGs-ELA (Llinas et al.
1993) . Asim ism o se ha visto que la fracción de inm uno-proteínas del suero
de pacientes con ELA dism inuye las corr ientes de Ca2+ de alto voltaje de
act ivación en células granulares en cult ivo (Zhainazarov et al. 1994) ,
sugir iendo un posible efecto dependiente del t ipo celular. A nivel de la
react ividad de las I gGs-ELA hacia est ructuras cerebelares, se ha detectado
la presencia de estos ant icuerpos en la capa m olecular y sustancia blanca
de cerebelo de ratones som et idos a un protocolo de t ransferencia pasiva
(Schluep et al. 1998) .
Estos reportes concuerdan con los resultados obtenidos en este
t rabajo, donde encont ram os una am plia react ividad de las I gGs-ELA hacia
células residentes en el cerebelo (Figura 5 .8 ) , donde hem os detectado una
im portante inm uno- t inción en el som a de las neuronas de Purkinje.
El análisis m ás detallado de la m arca en la capa granular reveló no
solo unión de I gGs-ELA a neuronas granulares NeuN+ (Figura 5 .1 1 ) sino
tam bién una im portante asociación a interneuronas GABAérgicas con
expresión de GAD65/ 67 (Figura 5 .1 2 ) . Éstas podrían t ratarse tanto de
células Lúgaro com o de neuronas de Golgi (Sillitoe y Joyner 2007) , aunque
por su ubicación alejada de la capa de Purkinje, es probable que se t rate de
estas últ im as.
En cuanto al estudio análogo de la capa m olecular, encont ram os una
im portante m arca asociada al citoplasm a de neuronas NeuN+ (Figura
102
6 - Discusión
5 .1 1 ) . Estas células m uy probablem ente se t raten de neuronas granulares
ya que se ha reportado que la m ayoría de las neuronas que expresan el
m arcador NeuN en la capa m olecular son células granulares localizadas
ectópicam ente (Mullen et al. 1992) . Por su parte, el m arcador GAD65/ 67 nos
perm it ió apreciar la intensa t inción de las dendritas pr incipales de las
neuronas de Purkinje (Figura 5 .1 2 ) .
Todos estos resultados sugieren que los ant icuerpos de ELA estarían
reaccionando con proteínas exclusivam ente presentes en el linaje neuronal,
aunque tendrían una dist r ibución bastante am plia dent ro de este grupo. Sin
em bargo, la ausencia de correlación ent re la inm uno- t inción de las neuronas
de Purkinje y los efectos y m arca en la PNM (Figuras 5 .1 3 C y 5 .1 3 E)
sum ada a la invariabilidad en la interacción de la m ayoría de las m uest ras
con las rodajas de cerebelo de los anim ales CaV2.1 - / - (Figura 5 .1 5 )
sugieren un rol m enos específico para estos ant icuerpos.
Los datos arr iba m encionados en relación al cerebelo (Figura 5 .1 5 ) y
la m édula espinal (Figura 5 .1 4 ) cont rastan significat ivam ente con los
cam bios observados en los ensayos de inm uno- fluorescencia desarrollados
en la PNM (Figura 5 .5 ) , y de esta m anera tam bién enfat izan la
especificidad de los resultados obtenidos en los term inales m otores. En este
sent ido, se podría especular que el ant ígeno que interactuaría con los
ant icuerpos de ELA en la PNM se expresaría select ivam ente en esta
est ructura, respecto de ot ras com o el cerebelo o el asta vent ral espinal. Sin
em bargo, no se puede excluir la posibilidad de que en el som a de las
m otoneuronas y las células de Purkinje haya una im portante expresión de
proteínas react ivas que enm ascaren la presencia del ant ígeno detectado en
la PNM. Adem ás, la presencia en el suero de ant icuerpos react ivos hacia el
103
6 - Discusión
sistem a nervioso cent ral podría ser consecuencia de la exposición del
contenido int racelular debido a la injur ia neuronal. Esta exposición
patológica est im ularía la producción de ant icuerpos cont ra com ponentes
propios del organism o (algunos de los cuales podrían ser ant ígenos
com unes a ot ros t ipos neuronales) y just ificarían la am plia dist r ibución de
react ividad encont rada hacia el sistem a nervioso cent ral. De esta m anera se
podría explicar la presencia de los ant icuerpos cont ra las est ructuras
nerviosas cent rales incluso en las m uest ras que no evidenciaron afinidad
hacia la PNM (ELA6-8) , teniendo en cuenta la degeneración m otoneuronal
característ ica de la enferm edad y presente en todos los pacientes, en m ayor
o m enor m edida.
6.2.3 - Corteza cerebral
Las m otoneuronas superiores residen en la capa V de la corteza m otora
pr im aria y están involucradas en el cont rol del m ovim iento por su influencia
sobre los circuitos locales en el tallo cerebral y la m édula espinal. Se sabe
que esta área representa un blanco tem prano durante el desarrollo de la
patología de ELA. Adicionalm ente, experim entos de inm uno-histoquím ica
han revelado la presencia de las I gGs en las células piram idales de los
pacientes con esta enferm edad (Engelhardt y Appel 1990) y en corteza de
ratones sujetos a un esquem a de t ransferencia pasiva (Schluep et al.
1998) , sugir iendo una posible interacción in vivo ent re los ant icuerpos y los
com ponentes m otoneuronales. Esta interacción se podría producir m ediante
m ecanism os act ivos que prom uevan la endocitosis de las I gGs-ELA en la
PNM y el posterior t ransporte axonal ret rógrado hacia est ructuras neurales
superiores (Fabian y Pet roff 1987; Fratantoni et al. 1996) .
104
6 - Discusión
En nuest ros ensayos no pudim os detectar la unión de las I gGs-ELA a
las rodajas de la corteza cerebral conteniendo la región m otora pr im aria, en
ninguna de las m uest ras analizadas (datos no m ost rados) . A pesar de que
estos resultados parecen ser cont rar ios a los ensayos m encionados
previam ente, no podem os excluir la posibilidad de que la interacción de los
ant icuerpos con las m otoneuronas sea dependiente de procesos act ivos
(com o los m encionados en el párrafo precedente) , los cuales se
encont rarían ausentes en el tej ido fij ado ut ilizado en este estudio. Por ot ro
lado, estos resultados avalan la especificidad de la interacción de los
ant icuerpos con la PNM y se encuent ran esencialm ente en concordancia con
los ensayos realizados en sinaptosomas cort icales (Thom as y Dunn 1997) .
En este estudio los autores no pudieron detectar cam bios en el influjo de
Ca2+ luego de la incubación con las I gGs-ELA.
6.2.4 - Ast rocitos
Los estudios de inm uno- t inción ut ilizando el m arcador GFAP revelaron que
algunas de la m uest ras de ELA contenían ant icuerpos cont ra com ponentes
ast rocít icos. En principio, la señal encont rada co- localizaría solo
parcialm ente con la correspondiente al m arcador citoesqueletar io, por lo
que no se t rataría del m arcador en sí. Estas I gGs fueron capaces de unirse a
la ast roglía tanto de m édula espinal (Figura 5 .9 A ) com o de cerebelo
(Figura 5 .9 B ) , por lo que sería una proteína expresada en el linaje
ast rocít ico en diversas regiones del sistem a nervioso. Sin em bargo, cabe
recalcar que este fenóm eno no estuvo presente en la totalidad de las
m uest ras analizadas, sugir iendo que no estaríam os frente a una
característ ica universal de la enferm edad.
105
6 - Discusión
Existen extensas evidencias que docum entan una posible disfunción
ast rocít ica en la patología de ELA. Ent re ellas se puede m encionar la
dism inución de la liberación de factores t róficos (Ekestern 2004) , el
com prom iso en la regulación de la concent ración ext racelular de K+ (Neusch
et al. 2007) , la deficiencia en la elim inación de glutam ato de la hendidura
sinápt ica (Shaw et al. 1994; Rothstein et al. 1995) y la acum ulación de
agregados de la proteína superóxido dism utasa en núcleos gliales de
pacientes con ELA (Forsberg et al. 2011) . A esto se sum a la presencia de
ast rocitos react ivos adyacentes a las m otoneuronas en proceso de
degeneración (Hirano 1996) . Adem ás, estudios recientes con m odelos
t ransgénicos de ELAf han revelado que la toxicidad hacia las m otoneuronas
podría derivarse de un daño ejercido sobre células gliales, m ás
precisam ente sobre los ast rocitos (Nagai et al. 2007; Di Giorgio et al.
2007) .
En relación con los resultados presentados en este t rabajo, Stenovec
y col. han encont rado recientem ente que las I gGs-ELA aum entaron la
m ovilidad de vesículas lisosom ales/ endosom ales m arcadas con el
com puesto Lysot racker , en cult ivos prim arios de ast rocitos de rata
(Stenovec et al. 2011) . Los autores asociaron estos datos a un posible
increm ento en la concent ración citosólica de Ca2+ por liberación desde
depósitos int racelulares. Ot ro grupo ha detectado la presencia select iva de
ant icuerpos de ELA en varias regiones del sistem a nervioso cent ral de
ratones, luego de un esquem a de t ransferencia pasiva de las I gGs hum anas
(Schluep et al. 1998) . La react ividad en este caso se vio asociada tanto a
neuronas com o a ast rocitos y se encont ró ausente en experim entos usando
m uest ras cont roles. Sin em bargo, los ast rocitos de cult ivos pr im arios m ixtos
106
6 - Discusión
de m édula espinal han m ost rado ser m enos suscept ibles que las
m otoneuronas a la m uerte celular apoptót ica inducida por exposición a las
I gGs-ELA (Dem est re et al. 2005) . Por tal m ot ivo se cree que el rol que
jugaría la ast roglía en la patogénesis de ELA estaría relacionado con la
generación de un am biente tóxico para las m otoneuronas.
Si bien la ident idad del ant ígeno ast rocít ico perm anece desconocida y
sería necesario profundizar el estudio para establecer la dist r ibución,
funcionalidad y relevancia de estos ant icuerpos, nuest ras evidencias
favorecen la hipótesis de que los ast rocitos jugarían un papel en la
degeneración de las neuronas m otoras en la patología de ELA.
6 .3 - Canales de Ca 2 + de t ipo P/ Q y N
Los CCDVs de t ipo P/ Q son los pr incipales m ediadores de la t ransm isión
sinápt ica en la PNM de los m am íferos (Uchitel et al. 1992b; Katz et al.
1997) . Por ot ro lado, existen num erosas evidencias que sugieren una
interacción ent re las I gGs-ELA y los canales de Ca2+ (Llinas et al. 1993;
Sm ith et al. 1994; Carter y Mynlieff 2003) . Teniendo en cuenta estos
antecedentes, nuest ro próxim o paso consist ió en analizar el efecto de la
ausencia de la subunidad CaV2.1 sobre la potenciación sinápt ica y la
react ividad de los ant icuerpos de ELA en la PNM, ut ilizando m úsculos
diafragm a de los anim ales carentes de esta subunidad.
Nuest ros resultados m ost raron que la ausencia de la subunidad
form adora del poro del canal de t ipo P/ Q produjo una dism inución
significat iva en la unión de las I gGs-ELA a la PNM de ratón (Figura 5 .5 ) ,
j unto con una com pleta supresión del efecto sobre la liberación espontánea
de acet ilcolina (Tabla 5 .1 ) . Esta inhibición de la acción de los ant icuerpos
107
6 - Discusión
no fue consecuencia del deter ioro de la preparación, ya que la m ism a fue
capaz de responder sat isfactor iam ente a un est ím ulo despolar izante (KCl 15
m M, 10 m in) , luego de varios lavados, increm entando su frecuencia de
act ividad espontánea (Tabla 5 .2 ) a niveles sim ilares a los de preparados
WT t ratados con las I gGs-ELA potenciadoras (Tabla 5 .1 ) .
Por lo tanto, los datos sugieren que los ant icuerpos de ELA
interactúan con la subunidad CaV2.1 m ism a o con una proteína cuya
expresión -o al m enos su localización en la PNM- se ve francam ente
dism inuida com o consecuencia de la deleción genét ica de esta subunidad
form adora del poro. Adicionalm ente, se deduce de los resultados que la
presencia de esta subunidad sería esencial para la m odulación sinápt ica
inducida por las I gGs-ELA. De hecho, se sabe que estos ratones carentes de
la subunidad CaV2.1 presentan alteraciones en el pat rón de expresión de
ot ros genes, adem ás de la subunidad m ism a (Piedras-Renteria et al. 2004) .
Por ot ro lado, existen reportes que sugieren que el influjo de Ca2+ a
t ravés del canal de t ipo P/ Q -y por lo tanto, su presencia y funcionalidad-
podría actuar com o un potente inductor de la t ranscripción. Este es el caso
de varias proteínas sinápt icas, ent re las que se puede m encionar la proteína
que form a parte del com plejo SNARE (soluble N-ethylm aleim ide sensit ive
factor at tachm ent protein receptor) , sintaxina 1A (Sut ton et al. 1999;
Barbado et al. 2009) .
Ot ro dato interesante a tener en cuenta es la relación que se ha
encont rado ent re la expresión del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q y la
suscept ibilidad de diferentes m úsculos durante el desarrollo de ELA.
Mediante un análisis de m icroarreglos diseñado para el estudio del gen
Cacna1a de rata (que codifica para la subunidad α1A del canal P/ Q) , se ha
108
6 - Discusión
detectado un nivel de ARN m ensajero para CaV2.1 siete veces m ayor en un
m úsculo t ípicam ente esquelét ico (Tibialis anter ior) com parado con el
m úsculo ext raocular (Fischer et al. 2002) . Es sabido que durante la
progresión de la enferm edad este últ im o tej ido resulta ser relat ivam ente
poco vulnerable, reteniendo sus funciones hasta estadíos m uy avanzados de
la neurodegeneración (Leveille et al. 1982) . Adem ás, el m úsculo ext raocular
ha m ost rado resistencia a la acción de las I gGs-ELA en ensayos de
t ransferencia pasiva (Mosier et al. 2000) .
A pesar de los antecedentes arr iba m encionados, nuest ros
experim entos de inm uno-precipitación y western blot ut ilizando células
HEK293 t ransfectadas con las subunidades del canal de t ipo P/ Q no
sugieren una interacción directa de los ant icuerpos de ELA con el canal
m ism o (Figuras 5 .1 6 y 5 .1 7 ) , al m enos en las condiciones analizadas en
este estudio. Por ot ro lado, es im probable que ocurra una alteración en la
corr ientes de Ca2+ de t ipo P/ Q por efecto de las I gGs-ELA, ya que se ha
encont rado que los ant icuerpos de ELA no se unen a los canales m arcados
con 125I -ω-conotoxina MVI I C (Drachm an et al. 1995) , m ient ras que la
inhibición específica de estos canales por ω-agatoxina I VA no previene la
potenciación sinápt ica inducida por los ant icuerpos (Pagani et al. 2006) .
Todos estos resultados sugieren que la proteína que interactúa con
las I gGs-ELA necesitaría la expresión y/ o act ividad del canal de Ca2+ de t ipo
P/ Q para estar presente en la PNM de ratón. Tam bién se desprende de
estos datos que en ot ras est ructuras neuronales -com o el cerebelo y la
m édula espinal- su presencia sería en principio m enos dependiente de la
expresión del gen Cacna1a.
109
6 - Discusión
Un aspecto significat ivo que m erece ser m encionado es la ausencia
de cam bio en la unión de los ant icuerpos de los cont roles enferm os a la PNM
de los ratones CaV2.1 - / -, com parado con aquellos WT (Figura 5 .5 ) . Esta
invariabilidad en la inm uno- t inción adiciona relevancia a los resultados
encont rados para las I gGs-ELA, resaltando su especificidad hacia un subset
de pacientes y el hecho de que no se t rata de un fenóm eno generalizado.
Adem ás, se puede descartar que las diferencias encont radas en los
anim ales carentes del canal de t ipo P/ Q sean consecuencia del proceso de
deleción genét ica en sí, ya que en ot ro m odelo t ransgénico sim ilar ( los
ratones CaV2.2 - / -) no se detectaron dichas diferencias.
El hecho de que la m uest ra DC1 (un paciente con el síndrom e
m iasténico de Lam bert -Eaton) haya exhibido niveles de interacción
sim ilares con la PNM de los ratones CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - (Figura 5 .5 ) ,
podría parecer cont radictor io a pr im era vista dada la et iología propuesta
para esta patología. Sin em bargo, debería considerarse que la m uest ra
podría contener -adem ás de ant icuerpos cont ra el canal de t ipo P/ Q- I gGs
con afinidad hacia el canal de t ipo N (Takam ori et al. 1995; Motom ura et al.
1997) . Se sabe que este últ im o canal puede com pensar la falta del canal de
t ipo P/ Q, tanto a nivel funcional (Urbano et al. 2003) com o a nivel proteico
(Pagani et al. 2004) , y por lo tanto podría explicar la invar iabilidad
observada en los experim entos de inm uno- fluorescencia del m úsculo
diafragm a.
Por ot ro lado, se ha encont rado que la act ivación de los canales de
Ca2+ de t ipo N es relevante para la inducción de la act ividad sinápt ica
espontánea por los ant icuerpos de ELA (Pagani et al. 2006) . Sin em bargo,
este efecto no sería consecuencia de una interacción directa ent re los
110
6 - Discusión
ant icuerpos y el canal de Ca2+ , dado que la ausencia de la subunidad CaV2.2
no m odificó significat ivam ente la interacción de la m ayoría de las I gGs-ELA
con la PNM de ratón (Figura 5 .6 ) . Lo que es m ás, en anim ales CaV2.1 - / -,
donde se sabe que hay una com pensación funcional en la t ransm isión
neurom uscular por los canales de Ca2+ de t ipo N (Urbano et al. 2003) , al
igual que un increm ento en los niveles de la proteína (Pagani et al. 2004) ,
se pudieron detectar cam bios substanciales en la inm uno- react ividad de
algunas de las m uest ras de los pacientes con ELA (Figura 5 .5 ) . En su
conjunto, estos resultados no apoyarían la hipótesis de una interacción
directa ent re las ant icuerpos de ELA y el canal de Ca2+ de t ipo N, sino que
sugerir ían un efecto indirecto de las I gGs sobre la act ividad del canal, por
ejem plo a t ravés de una vía de señalización de segundos m ensajeros, com o
ha sido extensivam ente reportado (Lipscom be et al. 1989; Werz et al.
1993; Mart in et al. 2006) . De hecho, Pagani et al. (2006) detectaron un
requerim iento de la act ivación de fosfolipasa C, el receptor de r ianodina y el
receptor de inositol t r ifosfato, para que se produzca la potenciación
sinápt ica m ediada por las I gGs-ELA. En un t rabajo reciente tam bién se ha
reportado que los ant icuerpos de ELA inducen la m ovilización de los
depósitos int racelulares de Ca2+ desde el ret ículo endoplásm ico en ovocitos
de Xenopus laevis que sobre-expresan las subunidades del receptor de
NMDA (Texido et al. 2011) .
6 .4 - Ot ras proteínas presinápt icas
Num erosos reportes han docum entado la presencia de ant icuerpos hum anos
en el som a y los term inales m otoneuronales de los ratones inyectados con
las I gGs-ELA (Fratantoni et al. 1996; Engelhardt et al. 2005) . Estos
111
6 - Discusión
antecedentes nos llevaron a hipotet izar una posible interacción de los
ant icuerpos con com ponentes pre-sinápt icos. Para testear esta posibilidad
ut ilizam os ensayos de inm uno-precipitación con las I gGs-ELA para estudiar
su unión a var ias proteínas presinápt icas purificadas de ext ractos crudos de
m em brana de sinaptosom as de cerebelo. En estos experim entos
encont ram os que ninguna de las m uest ras ELA analizadas m ost ró afinidad
hacia las proteínas presentes en los term inales sinápt icos, tales com o
sinaptotagm ina I , sintaxina 1A, sinaptofisina y sinaptobrevina I I , a pesar de
que todas se pudieron detectar fácilm ente en el lisado original (Figura
5 .1 8 ) . Ot ros candidatos a testear en futuros experim entos incluyen
m oléculas de m at r iz ext racelular, receptores de neurot rofinas y proteínas
involucradas en la sinaptogénesis y guiado de axones, dado su rol
propuesto durante la neurodegeneración (Glas et al. 2007; Dawbarn y Allen
2003; Schm idt et al. 2009) .
Ot ro enfoque experim ental consist ió en estudiar de una m anera m ás
general las proteínas que interactuaban con las I gGs-ELA. Para ello
ut ilizam os la técnica de inm uno-precipitación para aislar aquellos com plejos
proteicos reconocidos por los ant icuerpos de ELA en diversas preparaciones.
En part icular, realizam os una com paración ent re los anim ales de genot ipo
CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / - part iendo de ext ractos crudos de m em brana cerebelar,
proteínas totales de cerebelo, purificados de rafts o preparaciones de
m úsculo, ya sea focalizando el estudio en los sueros que m ost raron afinidad
hacia la PNM o com parando éstos con los no m oduladores.
En ninguna de las condiciones experim entales testeadas con
proteínas cerebelares pudim os encont rar alguna banda diferencial que
sugir iera la presencia de una proteína interactuante con niveles infer iores
112
6 - Discusión
en los ext ractos de los anim ales t ransgénicos (Figuras 5 .1 9 A , 5 .1 9 B y
5 .2 3 ) . En general, las diferencias detectadas correspondieron a proteínas
con una m ayor expresión en los anim ales CaV2.1 - / -, respecto de los salvajes.
Esto podría deberse a que el ant ígeno de la PNM -de estar presente en los
sinaptosom as de cerebelo- m uest re una afinidad poco estable o m enor
hacia las I gGs-ELA y de este m odo se im posibilite su pur ificación por
ensayos de precipitación.
En lo que respecta a la PNM (Figura 5 .1 9 C ) , se podría especular que
los resultados negat ivos obtenidos ut ilizando esta preparación derivan de la
probable pobre representación de proteínas pre-sinápt icas en el ext racto
final. Uno de los factores que cont r ibuye a esta situación puede ser la gran
desproporción de proteínas m usculares respecto de las presentes en el
term inal m otor. Lam entablem ente no se dispone actualm ente de ninguna
técnica análoga a la purificación de sinaptosom as del sistem a nervioso
cent ral que nos perm ita realizar un enriquecim iento select ivo en proteínas
pre-sinápt icas de la placa m otora.
6 .5 - Proteóm ica com parat iva de la sinapsis Ca V2 .1 + / + y Ca V2 .1 - / -
Existen escasos reportes donde se estudien cam bios en la expresión génica
com o consecuencia de la deleción de la subunidad CaV2.1. Se ha publicado
un solo t rabajo que analiza de m anera sistem át ica la expresión de los ARN
m ensajeros en el hipocam po por m edio de un ensayo de m icroarreglos
(Piedras-Renteria et al. 2004) .
Desafortunadam ente, en esta publicación los autores se cent raron
principalm ente en aquellas proteínas que aum entaban sus niveles de
m ensajeros en ausencia del canal. Adem ás, debido a todos los procesos
113
6 - Discusión
regulator ios que ocurren posteriorm ente a la t ranscripción de un gen, se
sabe que un cam bio en la cant idad de ARN m ensajero no necesariam ente se
t raduce en una m odificación en los niveles de la proteína que codifica. Ante
la falta de reportes a nivel proteico, decidim os em prender un estudio global
para detectar e ident ificar cam bios de expresión por m edio de técnicas de
proteóm ica, y cent rar dicho estudio en la sinapsis.
El análisis com parat ivo de am bos proteom as reveló que la m ayoría de
las proteínas presentes en los sinaptosom as de cerebelo m antuvo sus
niveles invariantes en respuesta a la deleción del gen Cacna1a, com o se
observa en la Figura 5 .2 0 . Sin em bargo, algunos com ponentes de la
m uest ra sí evidenciaron cam bios sustanciales en ausencia del canal de Ca2+
de t ipo P/ Q, los cuales se vieron reflejados en la cuant ificación de su
intensidad (Figura 5 .2 1 ) . Todas las proteínas diferenciales -con excepción
de la m uest ra núm ero 3- pudieron ser ident ificadas sat isfactor iam ente por
espect rom et ría de m asa y correspondieron a siete productos génicos
diferentes (Figura 5 .2 2 y Tabla 5 .3 ) .
Las proteínas que m ost raron niveles alterados en sinaptosom as de
ratones carentes del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q incluyeron m oléculas
involucradas en el m etabolism o energét ico (gliceraldehído-3- fosfato
deshidrogenasa y ATP sintetasa m itocondrial) , la dinám ica citoesqueletar ia
(sust rato de quinasa C r ico en alanina m ir istoilado, cofilina-1 y proteína
ácida soluble de cerebro-1) , la señalización regulada por Ca2+ ( calm odulina)
y la exocitosis (secernina-1) .
La m odificación en los niveles de ciertas proteínas detectado en la
sinapsis de los ratones CaV2.1 - / - podría representar una act ivación de
m ecanism os com pensatorios ante la falta de esta im portante vía de ent rada
114
6 - Discusión
de Ca2+ en respuesta a la act ividad neuronal. Por ejem plo, las
dism inuciones observadas se podrían deber a que algunas proteínas
necesiten de la expresión y/ o act ividad del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q para
expresarse y/ o estar presentes en los term inales sinápt icos. De hecho,
Piedras Rentería (2004) ha reportado m odificaciones en la cant idad de ARN
m ensajeros de num erosos genes en el hipocam po de estos anim ales
t ransgénicos.
Ot ro aspecto a tener en cuenta es el rol que se ha propuesto para el
Ca2+ que ingresa a las células por los CCDVs en la regulación de la
t ranscripción (Barbado et al. 2009) . Esta m odulación puede ser tanto
posit iva com o negat iva y provee una asociación interesante ent re la
act ividad neuronal y la expresión génica. Adem ás de la inducción
t ranscripcional inducida por el canal de t ipo P/ Q mencionada anter iorm ente,
se ha visto que el Ca2+ que ingresa a las células a t ravés del canal de t ipo L
cont rola la expresión del receptor de inositol t r ifosfato por m edio de la
act ivación de calcineurina (Genazzani et al. 1999) . Tam bién se ha reportado
que el canal de t ipo N puede est im ular la t ranscripción de la t irosina
hidroxilasa en neuronas sensoriales (Brosenitsch y Katz 2001) . Ot ros
procesos suscept ibles de ser regulados por cam bios en los niveles
int racelulares de Ca2+ son los m ecanism os post - t ranscr ipcionales que
cont rolan el splicing y la estabilidad de los ARN m ensajeros (Barbado et al.
2009) .
6.5.1 - Metabolism o energét ico
La gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa es una enzim a tet ram érica que
cataliza una reacción crucial de la vía glucolít ica, llevando a la producción de
115
6 - Discusión
ATP. Adem ás de su rol en la glucólisis, se ha reportado que esta enzim a
está involucrada en m uchos ot ros procesos celulares com o la reparación del
ADN, la exportación de ARN de t ransferencia, el t ransporte y la fusión de
m em branas, la dinám ica citoesqueletar ia y la m uerte celular (Tristan et al.
2011) .
Con respecto a la relación ent re el Ca2+ y la energét ica m itocondrial,
se ha visto que en las neuronas, las m itocondrias se encuent ran
frecuentem ente agrupadas en los sit ios de alta act ividad de los canales del
ret ículo endoplásm ico que liberan Ca2+ ( receptor de r ianodina y receptor de
inositol t r ifosfato) . Se cree que la alta concent ración de Ca2+ en estos sit ios
de liberación induce la producción m itocondrial de ATP por m edio de la
act ivación de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs (piruvato, α-
cetoglutarato e isocit rato deshidrogenasas) , las cuales son sensibles a Ca2+
(Clapham 2007) .
El aum ento observado en los niveles de la subunidad α de la ATPasa
podría ser consecuencia de una m enor act ivación de algunas enzim as del
ciclo de Krebs acoplada a la dism inución en los niveles de gliceraldehído-3-
fosfato deshidrogenasa, detectada en este t rabajo. De hecho, se sabe que
en los anim ales CaV2.1 - / - la corr iente de calcio total en neuronas cerebelares
está dism inuida ent re un 65 y 70 % (Jun et al. 1999) . Se podría especular
que para m antener la producción de ATP en estas condiciones sería
necesario increm entar la cant idad de la enzim a responsable de la síntesis de
ATP. No obstante, para saber si el cam bio detectado representa un
increm ento real en el núm ero de m oléculas de ATPasa sería im perioso
estudiar si este aum ento tam bién im plica a las ot ras subunidades que
com ponen la enzim a.
116
6 - Discusión
6.5.2 - Citoesqueleto
Tres de las proteínas que m ost raron cam bios significat ivos en sus niveles
sinápt icos están involucradas en la dinám ica citoesqueletar ia. MARCKS
actúa com o una proteína ent recruzadora de act ina F m odulada por proteína
quinasa C y el com plejo Ca2+ -calm odulina (Hartwig et al. 1992) m ient ras
que BASP-1 regula el citoesqueleto de act ina y el crecim iento de neuritas
(Frey et al. 2000) . Por su parte se ha propuesto que cofilina-1 cum ple
funciones en el desensam blado, la nucleación y la estabilización de los
filam entos de act ina dependiendo de la concent ración local que presente
(Andrianantoandro y Pollard 2006) .
El hecho de que varias proteínas que regulan el m ism o proceso hayan
m ost rado una dism inución en los anim ales que carecen del canal de Ca2+ de
t ipo P/ Q sugiere la ocurrencia de un desbalance en la dinám ica
citoesqueletar ia en este m odelo experim ental. Sin em bargo, no se ha
reportado que estos ratones tengan alguna alteración evidente en su
citoarquitectura en regiones com o el cerebelo o la PNM donde hay una alta
expresión del canal de Ca2+ ( Jun et al. 1999; Urbano et al. 2003; Miyazaki
et al. 2006) . Adem ás, com o las m oléculas que se encont raron alteradas
cum plen funciones diversas, resulta difícil predecir cuál sería el resultado
neto de la ausencia de este canal de Ca2+ sobre la est ructura
citoesqueletar ia. Por lo tanto, se podría especular que los cam bios en estas
proteínas se com pensarían m utuam ente, m inim izando el im pacto de las
m odificaciones sobre los filam entos de act ina.
117
6 - Discusión
6.5.3 - Señalización de Ca2+
Existen num erosas asociaciones ent re el canal de t ipo P/ Q y proteínas
sensoras de Ca2+ , ent re las que se destaca la calm odulina, una de las
m acrom oléculas que ha m ost rado un aum ento en sus niveles
sinaptosom ales en este t rabajo.
Se ha reportado que la calm odulina se une a un dom inio C- term inal
en la subunidad CaV2.1 e induce la inact ivación y la facilitación dependiente
de Ca2+ del canal (Lee et al. 1999; Lee et al. 2000) . Se cree que esta
regulación es im portante para los fenóm enos de plast icidad sinápt ica
dependientes de act ividad. I nteresantem ente, ot ra molécula im plicada en
estos m ecanism os regulator ios - la calm odulina quinasa I Iα- tam bién ha
m ost rado un increm ento significat ivo en sus niveles de ARN m ensajero en el
hipocam po de ratones CaV2.1 - / - (Piedras-Renteria et al. 2004) . Todos estos
antecedentes sugieren una posible inducción de varios com ponentes de la
vía involucrada en la regulación de la plast icidad sinápt ica en este m odelo
experim ental.
6.5.4 - Exocitosis
La secernina-1 es una proteína citosólica que est imula la exocitosis en los
m astocitos (Way et al. 2002) por m ecanism os que todavía no se conocen
con exact itud. Curiosam ente, la fusión de vesículas en este t ipo celular se
encuent ra m ediada por la m ism a m aquinaria exocitót ica que opera en las
neuronas y las células neuroendócrinas (Guo et al. 1998) . Adem ás,
experim entos de hibr idización in situ han revelado la presencia del ARN
m ensajero para esta proteína en varias regiones del sistem a nervioso, com o
el cerebelo, el hipocam po y la m édula espinal (Allen Brain At las; www.brain-
118
6 - Discusión
m ap.org) , datos que sugerir ían un rol en ot ros t ipos celulares.
Adicionalm ente, se sabe que la m aquinaria de liberación en las sinapsis
hipocam pales de los anim ales CaV2.1 - / - presenta una m ayor sensibilidad al
Ca2+ (Piedras-Renter ia et al. 2004) .
Suponiendo que secernina-1 tam bién desem peñe funciones
exocitót icas en células neuronales, se podría especular que esta m ayor
liberación en respuesta a la ent rada de Ca2+ se podría explicar en parte por
el aum ento en los niveles de esta proteína detectado en el presente estudio.
6.5.5 - BASP-1
La proteína ácida soluble de cerebro-1 (BASP-1/ NAP-22/ CAP-23) es una
m acrom olécula de m em brana que se encuent ra altam ente expresada en
neuronas en el adulto y se localiza en regiones sinápt icas tales com o la
m em brana presinápt ica y la m em brana vesicular (Maekawa et al. 1993; I ino
et al. 1999) . Está especialm ente enriquecida en los m icrodom inios
abundantes en colesterol conocidos com o rafts a los cuales se une por un
grupo m ir istoilo (Maekawa et al. 1999) y donde se cree que cum ple
funciones relacionadas con la organización de la m em brana, en part icular
con la m aduración de los filam entos de act ina. Además, se vio que la
expresión de BASP-1 aum enta cuando los axones se encuent ran en proceso
de elongación y su sobre-expresión en neuronas adultas prom ueve la
ram ificación axonal (Caroni 1997) . Un t rabajo publicado recientem ente
tam bién propone un rol para BASP-1 en la regulación de la endocitosis
debido a su interacción e inhibición de sinaptojanina-1, una fosfatasa clave
para el desprendim iento de las vesículas recubiertas de clat r ina (Takaichi et
al. 2012) . Ot ras funciones reportadas para esta proteína incluyen la
119
6 - Discusión
part icipación en procesos com o la regulación de la t ranscripción (Green et
al. 2009) , la apoptosis (Sanchez-Nino et al. 2010) y la form ación de canales
(Ost roum ova et al. 2011) .
La expresión de BASP-1 en el sistem a nervioso es bastante am plia,
destacándose en regiones del cerebro anter ior com o la corteza cerebral, la
form ación hipocam pal, el bulbo olfator io, los ganglios basales y el tálam o.
En el cerebelo la inm uno- react ividad de BASP-1 ha sido observada
principalm ente en las células granulares y en est ructuras que se cree son
los term inales de las fibras m usgosas ( I ino et al. 1999) . A nivel de la
m édula espinal se ha detectado claram ente la expresión del ARN m ensajero
en el som a de las grandes neuronas del asta vent ral (m otoneuronas
infer iores) , así com o tam bién la presencia de la proteína tanto en term inales
sinápt icos que rodean los som as de las m otoneuronas com o en la PNM ( I ino
y Maekawa 1999; Frey et al. 2000; I ino et al. 2004) .
Los ratones que t ienen genét icam ente delecionada la expresión de
BASP-1 presentan una alta tasa de m ortalidad post -natal, anom alías
severas en el sistem a nervioso y m alform aciones a nivel de la PNM (Frey et
al. 2000) . Todas estas evidencias indican que esta proteína está involucrada
en form a crít ica en procesos fisiológicos norm ales.
Una de las característ icas bioquím icas dist int ivas de BASP-1 (que
tam bién es com part ida por MARCKS) es su com portam iento anóm alo en
separaciones elect roforét icas, lo cual lleva a que el peso m olecular
observado difiera significat ivam ente del esperado y a que dependa del
porcentaje de acrilam ida ut ilizado (Maekawa et al. 1993) . Esto explicaría las
discrepancias encont radas en el peso m olecular al m om ento de realizar las
ident ificaciones por espect rom etría de m asa de estas dos proteínas.
120
6 - Discusión
De todos los productos génicos analizados com parat ivam ente ent re
anim ales CaV2.1+ / + y CaV2.1 - / -, BASP-1 se destaca com o uno de los
candidatos m ás interesantes a ser el ant ígeno reconocido por las I gGs-ELA,
por varias razones: 1) presenta una dism inución significat iva en sus niveles
en paralelo a la ausencia del canal de Ca2+ de t ipo P/ Q ( resultados del
presente t rabajo) , 2) se expresa en altos niveles tanto en term inales
sinápt icos de cerebelo com o en la PNM ( I ino et al. 1999; I ino y Maekawa
1999; Frey et al. 2000; I ino et al. 2004) , 3) su localización subcelular
incluye la m em brana presinápt ica y la m em brana vesicular (Maekawa et al.
1993; I ino et al. 1999) , y 4) está involucrada en la regulación de la
endocitosis vesicular (Takaichi et al. 2012) . Por lo tanto, BASP-1 es una de
las proteínas cuya interacción con los ant icuerpos de ELA será evaluada con
m ás detalle en futuros abordajes experim entales.
6 .6 - Perspect ivas futuras
La correlación encont rada ent re la ausencia del canal P/ Q y la falta de unión
y efecto de las I gGs-ELA sobre la PNM aporta una herram ienta im portante
para el direccionam iento de futuros estudios tendientes a dilucidar la
ident idad del ant ígeno de ELA. Sin em bargo, todavía restan realizar estudios
funcionales m ás detallados para clar ificar la relevancia funcional de la
deleción del canal de Ca2+ en el contexto de la patología. Por ejem plo, se
debería estudiar si los ratones CaV2.1 - / - son m enos suscept ibles que los
salvajes a la disfunción neurom uscular inducida por la t ransferencia pasiva
de las I gGs-ELA. Adem ás, se podría testear en experim entos in vit ro si los
preparados de m úsculo de estos ratones presentan un m enor influjo de Ca2+
121
6 - Discusión
o liberación desde depósitos int racelulares, en respuesta a la incubación con
los ant icuerpos de ELA.
Los estudios de proteóm ica de la sinapsis realizados en este t rabajo
sugieren com o un candidato interesante a ser el ant ígeno de ELA a la
proteína BASP-1. No obstante, resultaría im perioso llevar a cabo un análisis
m ás detallado a fin de establecer su posible interacción con las I gGs-ELA.
Por ejem plo, se podrían ut ilizar sistem as de expresión t ransiente para
enriquecer los lisados celulares en la proteína de interés y así favorecer su
detección en los ensayos de inm uno-precipitación.
Asim ism o, se debería evaluar la unión de las I gGs-ELA a cada una de
las ot ras m acrom oléculas que m ost raron una expresión dism inuida en
term inales de ratones CaV2.1 - / - (MARCKS, gliceraldehído-3- fosfato
deshidrogenasa, cofilina-1) . En este sent ido, tam bién representaría un
aporte valioso la validación de los resultados de proteóm ica em pleando
m etodologías alternat ivas y m ás sensibles, com o la de I TRAQ ( isobaric
pept ide tags for relat ive and absolute quant ificat ion) o 2D-DI GE ( two-
dim ensional difference gel elect rophoresis) . Estas técnicas perm it ir ían
adem ás am pliar la lista de proteínas candidato a ser evaluadas y facilitarían
el cam ino hacia una eventual ident ificación.
6 .7 - Conclusiones genera les
Los resultados m ost rados en este t rabajo aportan evidencias relevantes a
favor de la hipótesis de auto- inm unidad com o uno de los posibles
m ecanism os que cont r ibuyen a la patología de ELA. Tam bién sugieren por
pr im era vez que los auto-ant icuerpos en el suero de algunos pacientes se
unirían a una(s) proteína(s) cuya presencia en la PNM se encont raría
122
6 - Discusión
123
asociada a la expresión de la subunidad form adora del poro del canal de
Ca2+ de t ipo P/ Q (CaV2.1) , pero no a la del t ipo N (CaV2.2) . Adicionalm ente,
nuest ros datos indican que este ant ígeno se localizaría preferentem ente en
la PNM de ratón, a diferencia de lo que ocurre en el som a de las células de
Purkinje, m otoneuronas superiores e infer iores, donde su expresión sería
m enor y/ o m enos dependiente de la presencia de la subunidad CaV2.1.
Las evidencias aquí presentadas cont r ibuirán a establecer el valor de
las I gGs com o m arcadores biológicos en ELA, así com o tam bién su rol en el
desarrollo de la patología. Tam bién ayudarán en la ident ificación de los
ant ígenos potencialm ente relevantes para la et iología de la enferm edad y en
la or ientación de futuras invest igaciones hacia el descubrim iento e
im plem entación de t ratam ientos terapéut icos m ás efect ivos que los
em pleados en la actualidad.
Lic. Laura E. González
Dr. Osvaldo D. Uchitel Dra. Mónica L. Kot ler
RReeffeerreenncciiaass BBiibblliiooggrrááffiiccaass
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Parte de los resultados de esta tesis fueron incluidos en las siguientes
publicaciones:
o Gonzalez L. E. , Kot ler M. L., Vat t ino L. G., Cont i E., Reisin R. C., Mulatz
K. J., Snutch T. P. y Uchitel O. D. (2011) Am yot rophic lateral sclerosis-
im m unoglobulins select ively interact with neurom uscular junct ions
expressing P/ Q- type calcium channels. J. Neurochem . 1 1 9 (4) , 826-838.
o Pagani M. R., Gonzalez L. E. y Uchitel O. D. (2012, en prensa)
Autoim m unity in Am yot rophic Lateral Sclerosis: past and present .
Neurol. Res. I nt .
La m ayoría de estos resultados tam bién fueron presentados en los
siguientes congresos:
41st Annual Meet ing of the Society for Neuroscience (Washington, DC,
USA, Noviem bre 12-16, 2011) “Analysis of am yot rophic lateral sclerosis
im m unoglobulins interact ion with pre-synapt ic proteins” L. E. González ,
M. L. Kot ler, K. J. Mulatz, R. C. Reisin, T. P. Snutch, O. D. Uchitel.
XXVI Congreso Anual de la Sociedad Argent ina de I nvest igación en
Neurociencia (Huerta Grande, Córdoba, Argent ina, Octubre 18-22, 2011)
“Analysis of am yot rophic lateral sclerosis im m unoglobulins interact ion
with pre-synapt ic proteins” L. E. González , M. L. Kot ler, K. J. Mulatz, R.
C. Reisin, T. P. Snutch, O. D. Uchitel.
40th Annual Meet ing of the Society for Neuroscience (San Diego,
California, USA, Noviem bre 13-17, 2010) “Am yot rophic Lateral Sclerosis
I m m unoglobulins-G interact with calcium channels?” L. E. González , L.
G. Vat t ino, M. L. Kot ler, R. C. Reisin, O. D. Uchitel.
I I Reunión Conjunta de Neurociencias ( I RCN) (Huerta Grande, Córdoba,
Argent ina, Octubre 8-10, 2010) “P/ Q- type calcium channel α1 subunit is
necessary for ALS- I gGs spontaneous synapt ic act ivit y m odulat ion on
m ouse neurom uscular junct ion” Vat t ino L. G., González L. E. , Kot ler M.
L., Reisin R. C., Uchitel O. D.
I Reunión Conjunta de Neurociencias ( I RCN) (Huerta Grande, Córdoba,
Argent ina, Sept iem bre 4-6, 2009) “Am yot rophic Lateral Sclerosis auto-
149
150
ant ibodies and absence of P/ Q- type calcium channels” González L. ,
Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.
Gordon Research Conference - Phosphorylat ion and G-protein m ediated
signaling networks (Biddeford, Maine, USA, Junio 7-12, 2009)
“Am yot rophic Lateral Sclerosis auto-ant ibodies and absence of P/ Q- type
calcium channels” González L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel
O.
3rd Annual Canadian Neuroscience Meet ing (Vancouver, Brit ish
Colum bia, Canadá, Mayo 24-27, 2009) “Am yot rophic Lateral Sclerosis
auto-ant ibodies and absence of P/ Q- type calcium channels” González
L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.
I er Congreso I BRO/ LARC de Neurociencias de Am érica Lat ina, Caribe y
Península I bérica, XXI I I Congreso de la Sociedad Argent ina de
I nvest igación en Neurociencias (SAN) (Buzios, Río de Janeiro, Brasil,
Sept iem bre 1º -4, 2008) “Searching for auto-ant ibodies in Am yot rophic
Lateral Sclerosis” Gonzalez L. E. , Kot ler M. L., Sanchez V. N., Reisin R.
C., Uchitel O. D.
X Taller Argent ino de Neurociencias (Huerta Grande, Córdoba, Argent ina,
Abril 9-13, 2008) "Buscando auto-ant icuerpos en la Esclerosis Lateral
Am iot rófica" González L. , Kot ler M., Sanchez V., Reisin R., Uchitel O.