Instructivo Técnico para el diagnóstico de virus y
viroides en tejido vegetal para el Programa de
Certificación de Plantas Frutales
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INSTRUCTIVO TÉCNICO PARA EL DIAGNÓSTICO VIRUIS Y
VIROIDES EN TEJIDO VEGETAL PARA EL PROGRAMA DE CERTIFICACIÓN
DE PLANTAS FRUTALES
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CONTENIDOS
OBJETIVOS Y ALCANCE .......................................................................................... 3
REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS ....................................................... 4
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS ............................................................................ 5
REQUISITOS PARA LA AUTORIZACIÓN DE LABORATORIOS ......................................... 7
4.1 REQUISITOS DE INFRAESTRUCTURA, EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS. .............................. 7 4.1.1 Requisitos de infraestructura ......................................................................... 7 4.1.2 Requisitos de equipamiento. .......................................................................... 8 4.1.3 Requisitos de materiales y reactivos ............................................................... 8
4.2 REQUISITOS DEL PERSONAL .................................................................................. 10 4.2.1 Responsable técnico ................................................................................... 10 4.2.2 Analista .................................................................................................... 11
4.3 REQUISITOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 11 4.4 MEDIOS DE VERIFICACIÓN DE REQUISITOS ................................................................. 11
ANÁLIS/ENSAYOS................................................................................................ 12
5.1 CONDICIONES PREVIAS ....................................................................................... 12 5.2 CAPTACIÓN Y ENVÍO .......................................................................................... 12 5.3 RECEPCIÓN Y MANEJO DE LA MUESTRA/CONTRAMUESTRA ................................................ 13
5.3.1 Recepción de la muestra ............................................................................. 13 5.3.2 Preparación de la muestra ........................................................................... 14 5.3.3 Manejo de la contramuestra ........................................................................ 15
5.4 METODOLOGÍA ................................................................................................. 16 5.4.1 Control de calidad interno ........................................................................... 26 5.4.2 Interpretación de resultados ........................................................................ 28 5.4.3 Expresión de resultados .............................................................................. 29
REGISTRO Y ENVÍO DE LOS RESULTADOS .............................................................. 29
SUPERVISIÓN DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS ............................................ 30
MEDIDAS POR INCUMPLIMIENTO .......................................................................... 30
OBLIGACIONES ................................................................................................... 31
FORMULARIOS ................................................................................................. 31
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OBJETIVOS Y ALCANCE
El presente documento establece las directrices a cumplir por los/as interesados/as que
voluntariamente postulen ante el SAG, para ser laboratorio de análisis/ensayo para el diagnóstico
de virus y viroides fitopatógenos en tejido vegetal para el Programa de Certificación de Plantas
Frutales. Asimismo, este documento entrega las condiciones que deben cumplir estos laboratorios,
una vez autorizados.
El alcance de la autorización será de carácter nacional y se otorgará por hospedero (género). Cabe
señalar, que el laboratorio debe realizar la totalidad de los diagnósticos de virus y viroides
correspondiente al hospedero al cual postula. Y deberá diagnosticarlos según la técnica indicada
por el Servicio en el acta de toma de muestras enviada al laboratorio autorizado.
Sin perjuicio de lo anterior, en caso de que el Servicio lo requiera, podrá ampliar el número de
virus y/o técnicas diagnósticas que forman parte del alcance de esta autorización SAG, frente a lo
cual, los laboratorios que deseen mantener su autorización en esta categoría, deberán postular a
la ampliación de su autorización de acuerdo al procedimiento descrito en el numeral 13 del
Reglamento Específico de Autorización de Laboratorios de Análisis/Ensayos.
Tabla 1. Virus y viroides, en certificación de plantas frutales
ESPECIE / GÉNERO VIRUS / VIROIDES TÉCNICA
DIAGNÓSTICA
Especies del Género
Ribes spp.
Arabis mosaic virus (ArMV)
Tomato ringspot virus (ToRSV) Strawberry latent ringspot virus
(SLRSV)
DAS-ELISA y
RT-PCR
Especies del Género
Rubus spp.
Arabis mosaic virus (ArMV) Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) Strawberry latent ringspot virus
(SLRSV)
Tomato ringspot virus (ToRSV)
DAS-ELISA y
RT-PCR
Especies del género
Vaccinium spp.
Tomato ringspot virus (ToRSV) Tobacco ringspot virus (TRSV)
DAS_ELISA y
RT-PCR
Blueberry mosaic associated virus (BlMaV)
RT-PCR
Blueberry shoestring virus (BSSV)
Tobacco streak virus (TSV) DAS-ELISA
Manzano Malus domestica Borkh
Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) Apple mosaic virus (ApMV) Tomato ringspot virus (ToRSV)
ELISA y/o
RT-PCR
Membrillo
Cydonia oblonga Mill Peral Pyrus L.
Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) ELISA y/o
RT-PCR
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REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS
Ley 18.755, que fija la organización y atribuciones del Servicio Agrícola y Ganadero y sus
modificaciones.
Ley 19.880, que establece bases de los procedimientos administrativos que rigen los actos de
los órganos de la administración del estado.
ESPECIE / GÉNERO VIRUS / VIROIDES TÉCNICA
DIAGNÓSTICA
Almendro
Prunus dulcis (Mill.) D. A. Webb
Prune dwarf virus (PDV) Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) Tomato ringspot virus (ToRSV)
ELISA y/o
RT-PCR
Cerezo
Prunus avium (L.) L. Guindo
Prunus Cereasus
Prune Dwarf virus (PDV) Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV)
Tomato ringspot virus (ToRSV)
ELISA y/o
RT-PCR
Ciruelo
Prunus domestica L. -Prunus salicina Lindl. Damasco
Prunus armeniaca L. Duraznero
Prunus persica (L.) Batsch
Nectarino
Prunus persica cv. nectarina(L.) Batsch
Plum Pox Virus (PPV) Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) Prune Dwarf virus (PDV) Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) Tomato ringspot virus (ToRSV)
ELISA y/o
RT-PCR
Peach latent mosaic viroid (PLMVd) RT-PCR
Vides
Vitis spp.
Grapevine leafroll virus 1 (GLRaV-1) Grapevine leafroll virus 2 (GLRaV-2)
Grapevine leafroll virus 3 (GLRaV-3) Grapevine fan leaf virus (GFLV) Grapevine virus A (GVA)
Grapevine virus B (GVB)
ELISA y
RT-PCR
Olivo
Olea europaea L.
Cherry leaf roll virus (CLRV) Strawberry latent ringspot virus
(SLRSV)
RT-PCR
Cítricos
Citrus spp.
Citrus tristeza virus (CTV) Citrus psorosis virus (CPsV)
ELISA y/o
RT-PCR
Citrus exocortis viroid (CEVd) Citrus cachexia viroid (CCVd)
RT-PCR
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Resolución Exenta Nº 529, de fecha 26 de enero de 2012 del SAG, la cual norma el Sistema
Nacional de Autorización de Terceros y deroga Resoluciones Nº 3.678 de 2004 y N° 6.061 de
2008 de la Dirección Nacional del SAG.
Resolución Exenta N° 90, de fecha 06 de enero de 2014, del Director Nacional del SAG, que
aprueba Reglamento Específico para la Autorización de Laboratorios de Análisis/Ensayos
Servicio Agrícola y Ganadero. Versión vigente.
Resolución Exenta del Director Nacional Nº 10140, de fecha 30 de diciembre de 2015, que
establece Norma Específica de Certificación de material de Propagación de las Especies de los
Géneros Ribes Spp., Rubus Spp. y Vaccinium Spp.
Resolución Exenta del Director Nacional Nº 6551 de 2012, que establece Norma específica de
certificación de materiales de propagación de carozos y pomáceas
Resolución Exenta del Director Nacional Nº 7605 del 03 de diciembre de 2013. Establece Norma
Específica de Certificación de Material Vegetal de Propagación de vides (Vitis spp.) y Deroga
Resolución N° 2411 de 2007.
Resolución Exenta Nº 10143 del 30 de diciembre de 2015, que establece Norma Específica de
Certificación de Material de Propagación de olivo (Olea europea l) y deroga Resolución 4725 de
2007.
Faggioli, F. et Al. Distribution of olive tree viruses in Italy as reveleated by One Step RT-PCR
(2005), 87(1), 49-55.
Servicio Agrícola y Ganadero. 1998. Resolución Exenta del Director Nacional Nº 7520/2013.
Establece Norma Específica de Certificación de Material Vegetal de Propagación de Cítricos y
Deroga Resolución N° 134 de 1998.
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Laboratorio Autorizado Laboratorio autorizado por el Servicio para ejecutar uno o más
análisis/ensayos determinados, en apoyo a los programas oficiales
del SAG, bajo condiciones definidas por el Reglamento Específico
de Autorización de Laboratorios de Análisis/Ensayos y los
correspondientes Instructivos Técnicos.
Analista Persona designada por el laboratorio autorizado, para
desempeñarse en temas técnicos asociados a su actividad y que
cumple con el perfil definido por el Servicio para este cargo.
Responsable Técnico Persona designada por un laboratorio autorizado para actuar como
contraparte del SAG, en temas técnicos asociados a su actividad y
que cumple con el perfil definido por el SAG para este cargo.
Material de Referencia Material, sustancia u organismo que provee trazabilidad esencial y
se usa para demostrar la exactitud de los resultados, calibraciones
de equipos y métodos, para monitorear el funcionamiento del
laboratorio, para validar métodos y que permite la comparación de
métodos, usándolos como estándares transferibles.
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BPL Las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) representan el conjunto
de reglas, procedimientos operativos y prácticas adecuadas para
garantizar que los datos generados por los laboratorios sean
confiables y que aseguren un nivel de bioseguridad adecuado para
el riesgo asociado al desarrollo de los análisis.
Identifican, definen y describen los principios que deben regir sobre
los procesos de la organización y las condiciones bajo las cuales se
lleva a cabo la planificación y ejecución de los análisis de
laboratorio para asegurar la calidad de los ensayos. Los principios
de las BPL son: instalaciones adecuadas, personal calificado,
equipo adecuado y calibrado, y procedimientos técnicos
estandarizados.
ELISA Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, técnica serológica
en la cual, un antígeno inmovilizado se detecta mediante un
anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto
detectable, como cambio de color o algún otro tipo de señal.
DAS-ELISA Double Antibody Sándwich ELISA: Modalidad de ELISA que conlleva, la
captura del antígeno por un anticuerpo unido a soporte sólido. El antígeno
inmovilizado es reconocido y unido por un segundo anticuerpo conjugado
con una enzima que permite la detección del antígeno mediante una
reacción colorimétrica.
PCR Polimerase Chain Reaction. Reacción en cadena de la polimerasa,
técnica con la cual se obtiene un gran número de copias de un
fragmento de ADN específico, mediante ciclos térmicos que son
separados electroforéticamente y visualizados en un gel de agarosa
teñido con bromuro de etidio.
PCR Nested PCR Nested o Anidada: Variante de la PCR convencional que
consiste de dos amplificaciones, con distintos pares de partidores
en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de la
detección.
RT-PCR Variante de la PCR en que hebras de ARN por acción de la
trancriptasa reversa generan ADN complementario que es usado
como templado en una PCR convencional.
Fitopatógeno Agente virulento, capaz de infectar una planta.
Servicio/SAG Servicio Agrícola y Ganadero.
Signo Presencia del agente causal en una planta enferma.
Síntoma Expresión externa o interna de alteraciones morfológicas por la
acción de un agente causal en una planta enferma.
CSM Sistema de Semillas y Plantas Frutales, sistema en línea ingresando
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a la dirección web: htpp.csm.sag.gob.cl.
Monitoreo
Actividad desarrollada por personal capacitado y que tiene la
finalidad de identificar sintomatología o la presencia de plagas de
interés para el SAG a nivel de huerto productivo.
Muestreador Persona capacitada y calificada para realizar labores de muestreo
a nivel de huerto productivo.
Muestreo Revisión de un cultivo, en busca de una determinada plaga o
enfermedad, incluyendo la recolección de muestras vegetales o
plagas a nivel de huerto productivo, cumpliendo los protocolos
técnicos definidos para la actividad.
Prospector/a Persona capacitada y calificada para realizar monitoreo/s a nivel de
huerto productivo.
Protocolo/Plan de
Trabajo
Documento o lineamiento establecido por el SAG en base a los
requisitos de la ONPF del mercado de destino, que describe el
procedimiento para las actividades de muestreo, monitoreo y
análisis.
Trazabilidad de la
muestra
Sistema de documentación que permite la identificación de la
muestra desde su recolección y su posterior ingreso al laboratorio
hasta la emisión del resultado.
REQUISITOS PARA LA AUTORIZACIÓN DE LABORATORIOS
4.1 Requisitos de infraestructura, equipos, materiales y reactivos.
4.1.1 Requisitos de infraestructura
El laboratorio debe contar con una infraestructura, que garantice el correcto desarrollo de la
metodología de análisis a realizar, disponiendo de áreas con suficiente espacio para ejecutar en
forma óptima las actividades.
En todos los casos, debe existir una separación efectiva entre las áreas vecinas, ya sea mediante
paneles o piezas separadas, en donde se efectúan actividades incompatibles, para evitar
contaminación cruzada.
Las superficies de muros, cielos, pisos y mesones deben ser lisas, de fácil limpieza e impermeables.
Para desarrollar la técnica de ELISA; el laboratorio debe contar al menos con tres (3) salas
separadas para: preparación de muestras, laboratorio de serología y lavado.
Para desarrollar la técnica de RT-PCR; el laboratorio debe contar al menos con cuatro (4)
salas separadas: preparación de soluciones, Extracción de ARN, amplificación y
electroforesis.
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4.1.2 Requisitos de equipamiento.
El laboratorio, debe contar con los equipos necesarios acordes al volumen de muestras y que
garanticen el correcto desarrollo de la metodología de análisis. Deben contar con certificado de
mantención y/o calibración vigente, efectuada a lo menos una vez cada 2 años por una empresa
pertinente y reconocida en el área.
a. Equipamiento para la realización de los análisis a través de la técnica ELISA, se debe
considerar como mínimo el siguiente:
Sensor de temperatura que permita verificar la temperatura de las muestras al momento del
ingreso, el rango de trabajo debe ser de 0° a 30°C, con una división de 1°C y un error máximo
de 0.5 °C.
Balanza 1 a 500 g con una resolución de 0.1 g.
Estufa de incubación que alcance una temperatura de 37 °C, con un error máximo de ± 1°C.
Micropipetas de 10, 100 y 1000 µl, o equivalente.
Peachímetro.
Agitador magnético.
Freezer que alcance temperaturas de -20 °C o menores.
Refrigerador que alcance una temperatura de 6°C ± 2°C.
Conservadora de muestras que alcance una temperatura de 6°C ± 2°C.
Lector ELISA con sistema de impresión de registros de los resultados trazables (fecha y hora).
b. Equipamiento para la realización de los análisis a través de la técnica RT-PCR convencional,
se debe considerar como mínimo el siguiente:
Sensor de temperatura que permita verificar la temperatura de las muestras al momento del
ingreso, el rango de trabajo debe ser de 0° a 30°C, con una división de 1°C y un error máximo
de 0.5 °C.
Cámara para PCR.
Balanza rango de uso 0.01 a 500 g. con una resolución de 0.1 g.
Micro-Centrifuga (hasta 14000 r.p.m.)
Micropipetas de 10, 100 y 1000ul, de uso exclusivo para la técnica
Refrigerador que alcance una temperatura de 6°C+-2°C
Conservadora de muestras a que alcance una temperatura de 6°C+-2°C
Freezer que alcance temperaturas de -18 °C o menores
Mezclador Vortex
Termociclador
Cámara de electroforesis
Sistema de fotodocumentación
4.1.3 Requisitos de materiales y reactivos
El laboratorio, debe contar con los materiales, reactivos necesarios y material de referencia
acordes al volumen de muestras (stock suficiente para los análisis de la temporada) y que
garanticen el correcto desarrollo de la técnica de análisis a realizar.
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Deberá contar con todos los kit de diagnósticos necesarios para analizar todos los virus indicados
en el alcance de la presente autorización.
A continuación se detallan algunos de los materiales y reactivos que se deben considerar como
mínimo:
a. Para técnica ELISA: debe contar con Kit de diagnóstico de acuerdo a los virus indicados en
el alcance indicado en la Tabla 2 descrita a continuación:
Tabla 2. Identificación de los kit ELISA y materiales para el diagnóstico por tipo de virus.
Rubus spp., Ribes spp.
y Vaccinium spp.
Carozos y
Pomáceas
Virus en Vides (Vitis
spp.) Virus en Cítricos
Blueberry shoestring
virus (BSSV)
Raspberry bushy dwarf
virus (RBDV).
Strawberry latent
ringspot virus (SLRSV).
Arabis mosaic virus
(ArMV)
Tomato ringspot virus
(ToRSV).
Tobacco ringspot virus
(TRSV).
Tobacco streak virus
(TSV)
Controles positivos y
negativos de los virus
del alcance.
Placas ELISA Nunc
Maxisorp.
Puntas de micropipetas.
Bolsas de extracción.
Tampón de extracción o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampón de lavado o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampones conjugados o
reactivos para
preparación.
Tampón sustrato o
reactivos para
preparación.
Sustrato p-
nitrofenilfosfato.
Plum Pox Virus (PPV).
Apple chlorotic leafspot
virus (ACLSV).
Prune Dwarf virus
(PDV).
Prunus necrotic
ringspot virus (PNRSV).
Tomato ringspot virus
(ToRSV).
Apple mosaic virus
(ApMV).
Controles positivos y
negativos de los virus
del alcance.
Placas ELISA Nunc
Maxisorp.
Puntas de micropipetas.
Bolsas de extracción.
Tampón de extracción o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampón de lavado o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampones conjugados o
reactivos para
preparación.
Tampón sustrato o
reactivos para
preparación.
Sustrato p-
nitrofenilfosfato.
Grapevine leafroll virus
1 (GLRaV-1).
Grapevine leafroll virus
2 (GLRaV-2).
Grapevine leafroll virus
3 (GLRaV-3).
Grapevine fan leaf virus
(GFLV).
Grapevine virus A
(GVA).
Grapevine virus B
(GVB).
Controles positivos y
negativos de los virus
del alcance.
Placas ELISA Nunc
Maxisorp.
Puntas de micropipetas.
Bolsas de extracción.
Tampón de extracción o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampón de lavado o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampones conjugados o
reactivos para
preparación.
Tampón sustrato o
reactivos para
preparación.
Sustrato p-
nitrofenilfosfato.
Citrus Tristeza Virus
(CTV), Bioreba.
Citrus Psorosis Virus
(CPsV), Agritets.
Controles positivos y
negativos de los virus
del alcance.
Placas ELISA Nunc
Maxisorp.
Puntas de micropipetas.
Bolsas de extracción.
Tampón de extracción o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampón de lavado o
reactivos necesarios
para preparación.
Tampón conjugado o
reactivo para
preparación.
Tampón sustrato o
reactivos para
preparación.
Sustrato p-
nitrofenilfosfato.
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b. Para técnica RT-PCR: debe contar con reactivo e insumo de acuerdo a los virus indicados en el
alcance indicado Tabla 3 descrita a continuación:
Tabla 3. Identificación de reactivos e insumos para técnica de diagnóstico RT-PCR por tipo de
virus.
Rubus spp., Ribes spp. y Vaccinium
spp.
Carozos y Pomáceas
Virus en Vides (Vitis spp.)
Virus en Olivos Virus y viroides
en Cítricos
Bolsa de extracción
Buffer de
extracción
Microtubo de 1,5 ml
Agua libre de
nucleasas.
Buffer extracción
de litio
β mercaptoetanol
Acetato de potasio
6M.
Isopropanol
Etanol 70%
Random Primer
Buffer 5x
dNTPs 10 mM
DTT 0.1 mM
MMLuV 200 U/ul.
Buffer Taq
Polymerasa10X
Taq Polymerase 5
U u/l.
MgCl2 50 mM.
Partidores Anexo 2.
i. Inciso 2.4.
Bolsa de
extracción
Buffer extracción
de silica
Microtubo de 1,5
ml
Sarcosina al 10%
β-mercaptoetanol
Hielo
Solución de NaI
Etanol absoluto
Silica.
Buffer de lavado
Agua libre de
nucleasas
Random Primer
Buffer 5x
dNTPs 10 mM
DTT 0.1 mM
MMLuV 200 U/ul
Buffer Taq
Polymerasa10X
Taq Polymerase
5 U u/l
Partidores Anexo
2. Inciso 2.1.
MgCl2 50 mM.
Bolsa de
extracción
Buffer extracción
de silica
Microtubo de 1,5
ml
Sarcosina al 10%
β-mercaptoetanol
Hielo
Solución de NaI
Etanol absoluto
Silica.
Buffer de lavado
Agua libre de
nucleasas
Random Primer
Buffer 5x
dNTPs 10 mM
DTT 0.1 mM
MMLuV 200 U/ul
Buffer Taq
Polymerasa10X
Taq Polymerase 5
U u/l.
Partidores Anexo
2. Inciso 2.5.
MgCl2 50 mM.
Bolsa de
extracción
Buffer extracción
de silica
Microtubo de 1,5
ml
Sarcosina al 10%
β-mercaptoetanol
Hielo
Solución de
yoduro de sodio
(NaI)
Etanol absoluto
Suspensión de
silica.
Buffer de lavado
Agua libre de
nucleasas
Random Primer
Buffer 5x
dNTPs 10 mM
DTT 0.1 mM
MMLuV 200 U/ul
Buffer Taq
Polymerasa10X
Taq Polymerase 5
U u/l.
MgCl2 50 mM.
Partidores Anexo
2. Inciso 2.2.
Bolsa de
extracción
Buffer de
extracción
Microtubo de 1,5
ml
Sarcosina.
Β-mercaptoetanol
Hielo
Yoduro de sodio
(NaI).
Etanol absoluto
Silica.
Buffer de lavado
Agua libre de
nucleasas
Random Primer
Buffer 5x
dNTPs 10 mM
DTT 0.1 mM
MMLuV 200 U/ul
Buffer Taq
Polymerasa10X
MgCl2 50 mM
Taq Polymerase 5
U u/l
Partidores Anexo
2. Inciso 2.3.
MgCl2 50 mM.
4.2 Requisitos del personal
El laboratorio debe contar con el siguiente personal:
4.2.1 Responsable técnico
El laboratorio deberá designar un(a) responsable técnico, quien será la contraparte ante el SAG
en temas técnicos asociados a su actividad como laboratorio autorizado y tendrá responsabilidad
directa en el correcto desempeño de las actividades que el laboratorio autorizado realice en el
ámbito de su autorización. Asimismo, deberá cumplir con los siguientes requerimientos:
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Poseer título profesional otorgado por una entidad reconocida por el Estado, correspondiente
a una carrera de las ciencias silvoagrícolas, bioquímicas, biotecnológicas o biológicas. En caso
de título obtenido en el extranjero, éste deberá estar revalidado según procedimiento
establecido por el Ministerio de Educación.
Experiencia laboral en el área de laboratorios de al menos dos (2) años.
Tener competencia técnica o experiencia laboral (de al menos 6 meses) comprobable en
diagnósticos de virología y técnicas serológicas.
4.2.2 Analista
El laboratorio deberá contar con analistas en número adecuado de acuerdo a la cantidad de análisis
a realizar, quienes deben cumplir el siguiente perfil:
Contar con título profesional o técnico o ser egresado, de una carrera correspondiente al área
biológica o afín, impartida por una entidad de enseñanza superior reconocida por el Estado.
En caso de título obtenido en el extranjero, éste deberá estar revalidado según procedimiento
establecido por el Ministerio de Educación.
Tener competencia técnica o experiencia laboral comprobable (de al menos 6 meses) en
diagnósticos de virología y técnicas serológicas, asimismo, para el análisis de virus en olivos,
se considerará además, que el analista presente experiencia en técnicas moleculares.
El laboratorio, previendo una eventual ausencia del responsable técnico o del o los analistas, podrá
postular a otras personas para que actúen en ausencia del o los titulares, en calidad de subrogante.
En tal caso, el laboratorio deberá solicitarlo por escrito, presentando al Servicio el formulario
asociado junto con la documentación que demuestre que ese personal cumple con el perfil para
desempeñar el cargo.
4.3 Requisitos específicos
El laboratorio postulante, debe contar con un sistema de gestión de calidad o aseguramiento de
calidad implementado basado en buenas prácticas de laboratorio (BPL). En este sentido, debe
contar con un manual de procedimientos que describa en forma detallada el proceso de análisis,
el manejo de los controles, el manejo de las contramuestras, la preparación de las soluciones y la
eliminación de residuos. Sin perjuicio de lo anterior, el laboratorio también deberá contar con los
procedimientos que consideren la metodología indicada en el numeral 5.4 de este instructivo.
El laboratorio autorizado, deberá contar con timbres para ser utilizados en el marco de la
autorización, que consigne el nombre del laboratorio.
4.4 Medios de verificación de requisitos
De acuerdo a lo dispuesto en el Reglamento Específico para la Autorización de Laboratorios de
Análisis/Ensayos, los interesados en autorizarse para realizar el Diagnóstico de virus y viroides
para la certificación de plantas frutales, deben presentar junto a la solicitud de autorización
los documentos que a continuación se detallan y que dan cuenta del cumplimiento de los requisitos
establecidos por el SAG:
1. Formulario anexo para el diagnóstico de virus y viroides, indicando el alcance y técnica a la
que postule, (adjunto al presente documento).
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2. Los antecedentes generales del laboratorio que se establecen en el numeral 6.1 del
Reglamento Específico para la Autorización de Laboratorios de Análisis/Ensayos.
3. Croquis del laboratorio, identificando uso de áreas y ubicación de equipos.
4. Lista de equipos, indicando nombre, marca, modelo, fecha de puesta en servicio y capacidad
cuando corresponda.
5. Registros de la calibración de los equipos, según corresponda.
6. Lista de materiales, reactivos y material de referencia.
7. Formulario de identificación del responsable técnico, según formato establecido en el
Reglamento Específico para la Autorización de Laboratorios de Análisis/Ensayos (F-GF-CGP-
PT-069)
8. Certificado de título del responsable técnico identificado en el formulario respectivo, en
original o fotocopia legalizada.
9. Formulario de identificación del personal que se desempeña como analista, según formato
adjunto (F-GF-CGP-PT-113).
10. Certificado de título o de egreso de los/las analistas identificados en el formulario respectivo,
en original o fotocopia legalizada.
11. Documentos que acrediten la competencia técnica y/o experiencia laboral del/la responsable
técnico en las áreas de virología y serológicas, técnicas moleculares, según corresponda.
12. Documentos que acrediten la competencia técnica y/o experiencia laboral de los/las analistas
en las áreas de virología y serológicas y técnicas moleculares y/o, según corresponda.
13. Manual de procedimientos de acuerdo a lo señalado en el numeral 4.3 de este instructivo.
14. Manual de Procedimientos de la Metodología.
Sin perjuicio de lo anterior, el cumplimiento de los requisitos descritos tanto en el Reglamento
Específico de Autorización de Laboratorios de Análisis/ensayos, como en este instructivo, serán
confirmados por el Servicio en la visita de verificación o por los medios que considere idóneos para
tal efecto. Asimismo, el SAG podrá solicitar al postulante, la ejecución de la técnica por parte del
responsable técnico o de uno o más analistas del laboratorio.
ANÁLIS/ENSAYOS
5.1 Condiciones previas
El vivero deberá informar al Servicio a qué laboratorio autorizado se deberán enviar las muestras
para ser analizadas, con el fin de coordinar la calendarización tentativa de muestreo. Dicha
información, debe ser enviada a través de un correo electrónico ([email protected]) el cual va dirigido
al Encargado(a) del Programa de Certificación de Plantas Frutales y al Encargado(a) Regional de
Semillas.
5.2 Captación y Envío
El muestreo será realizado por personal del SAG o por una Empresa Externa autorizada por el
Servicio, de acuerdo a los procedimientos establecidos por el Servicio, por lo tanto no es una
actividad de responsabilidad de los laboratorios autorizados en esta especialidad.
El despacho de la(s) muestra(s), será de responsabilidad del funcionario de la oficina SAG sectorial
a cargo del muestreo o del funcionario de la empresa externa autorizado por el Servicio,
garantizando el envío en el tiempo y las condiciones de temperatura adecuados (mantención de
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cadena de frío de ser necesario), según los requerimientos específicos establecidos en el presente
instructivo.
Los costos asociados al despacho de la encomienda, serán de cargo al laboratorio de destino de
la(s) muestra(s) a analizar, por lo que el envío se efectuará, según sea el caso, de la siguiente
manera:
i. Cargado a un número de cuenta, previamente informado al Servicio o al tercero
muestreador autorizado (de acuerdo a documento según formato establecido en formulario
F-GF-CGP-PT-085), en caso de existir un convenio entre el laboratorio autorizado y una
empresa de transporte de encomiendas, o,
ii. Por cobrar al laboratorio autorizado, si al momento de efectuar el envío, el laboratorio de
destino no posea, o el Servicio no esté en conocimiento de la existencia del convenio antes
descrito. En este caso, el SAG se reserva el derecho de envío a través de una empresa de
transporte de encomiendas que asegure adecuadas condiciones de traslado, siendo
obligatoriedad por parte del laboratorio, recepcionar la(s) muestra(s) y pagar la tarifa
correspondiente.
El laboratorio autorizado, deberá gestionar la devolución de las cajas de transporte de muestras,
enviando correo a [email protected], quienes informarán el proceder.
5.3 Recepción y manejo de la muestra/contramuestra
5.3.1 Recepción de la muestra
El laboratorio autorizado, deberá informar por escrito vía correo electrónico, al Encargado de
Supervisión SAG de ese laboratorio, el inicio de actividades asociadas al alcance de la autorización
correspondiente a la primera recepción de muestras de la temporada. Este aviso, deberá ser
realizado el mismo día de recepción de las muestras, señalando lo siguiente:
INFORMO A USTED QUE EL DÍA DE HOY ________________(dd/mm/aaaa) EL LABORATORIO
AUTORIZADO______________________(indicar nombre) HA DADO INICIO A LAS ACTIVIDADES
ASOCIADAS AL ALCANCE DE LA AUTORIZACIÓN, RECEPCIONÁNDOSE __________(indicar
cantidad) MUESTRAS VEGETALES PARA EL DIAGNÓSTICO DE VIRUS y VIROIDES EN MATERIAL
VEGETAL DE PROPAGACIÓN DE PLANTAS DE _______________________ (indicar el material
vegetal).
Toda muestra debe ingresar al laboratorio autorizado con su correspondiente identificación (código
de barras, número de solicitud o correlativo numérico) y acompañada por el “Acta de Toma de
Muestras”, donde se indica la técnica diagnóstica que el laboratorio autorizado debe ejecutar, de
acuerdo a las técnicas indicadas en la Tabla 1, generada por el Sistema en línea de Semillas y
Plantas Frutales u otro que estime pertinente el Servicio, acompañada (de ser necesario) por el
“Formulario oficial para el envío de muestras vegetales y de suelo”.
El laboratorio autorizado, deberá verificar al momento del ingreso de la muestra, que ésta se
encuentre en condiciones adecuadas de embalaje y que el tiempo entre el muestreo y la recepción
en el laboratorio sea menor o igual a 72 horas. Además, debe comprobar que la información
contenida en el formulario oficial esté completa y que el número de folio y correlativo señalado,
coincidan con la rotulación de la etiqueta de identificación de cada una de las muestras, así como
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también con la cantidad de muestras recibidas. Una vez verificado lo anterior, el recepcionista del
laboratorio, dejará constancia de esto, mediante timbre y firma del formulario oficial, indicando
además la fecha y hora de recepción, quedándose el laboratorio autorizado con una copia de este
formulario y del documento o guía de despacho de la empresa de encomiendas.
Posteriormente, el responsable técnico deberá evaluar la aptitud de las muestras para el análisis,
considerándose como muestra apta, aquella que no presenta signos evidentes de deshidratación
y/o descomposición.
Las muestras, se deberán conservar, hasta el momento del análisis, a una temperatura de 6°C ±
2°C, teniendo la precaución de no compactarlas para no producir deterioro del tejido vegetal.
Si la muestra presenta condiciones de embalaje inadecuadas o no es apta para el análisis, ésta
debe ser rechazada.
En caso que las muestras no vengan acompañadas por todos sus documentos, que la información
esté incompleta, no coincida y/o en caso de rechazo de muestras, se debe avisar en forma escrita
de tal situación vía correo electrónico y de manera simultánea, al correo [email protected] y al
Encargado Regional de Semillas correspondiente al origen de la muestra. En éste documento, se
deberá indicar el problema, identificando el número de folio del Protocolo, el o los números
correlativos de las muestras (esto dentro de un plazo máximo de 1 día corridos, contados desde
la recepción de la muestra por parte del laboratorio autorizado) y solicitar las medidas a seguir
(corrección del problema o envío de nueva muestra, según corresponda).
Una vez que el laboratorio autorizado ha verificado los términos documentales y la condición
analítica de la muestra, deberá ingresar al sistema en línea (htpp.csm.sag.gob.cl) el número de
folio del Acta de Toma de Muestras, para validar los patógenos a analizar.
5.3.2 Preparación de la muestra
En la siguiente Tabla 4, se indica la preparación de la muestra por categoría del alcance indicado
en el presente documento
Tabla 4: Preparación de la muestra por tipo de virus y de análisis a realizar
Rubus spp., Ribes spp. y Vaccinium spp.
Para las muestras que requieran la detección de los virus por ELISA, se tomaran 0,5
g de tejido foliar y se extraerán de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit de
anticuerpos utilizado.
En caso que se requiera la detección de virus por RT-PCR, se tomaran 0,1 g de tejido de hojas que se extraerán por el método de Litio para Vaccinium spp., Rubus spp. y Ribes spp.
Carozos y Pomáceas
Para las muestras que requieran la detección de los virus por ELISA, se tomaran 0,5
g de tejido foliar y se extraerán de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit de
anticuerpos utilizado.
En caso que se requiera la detección de virus o viroide por RT-PCR, se tomaran 0,1 g de tejido de hojas que se extraerán por el método de la silica.
Virus en Vides (Vitis spp.)
Para las muestras que requieran la detección de los virus por ELISA, se tomaran 0,5
g. de tejido foliar y se extraerán de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit
de anticuerpos utilizado.
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En caso que se requiera la detección de virus por RT-PCR, se tomaran 0,1 g. de tejido
de hojas que se extraerán por el método de la silica.
Virus en Olivos Para las muestras que requieran la detección de los virus CLRV y SLRSV por RT-PCR,
se tomaran 0,1 g de tejido floemático de ramillas que se extraerán por el método de
la silica.
Virus en Cítricos
Para las muestras que requieran la detección de CTV por ELISA, se tomaran 0,5 g de
tejido foliar y se extraerán de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit de
anticuerpos utilizado.
En caso que se requiera la detección de virus o viroides por RT-PCR, se tomaran 0,1
g de tejido floemático de ramillas que se extraerán por el método de la silica.
5.3.3 Manejo de la contramuestra
En la tabla 5, se indica la preparación de la muestra por categoría del alcance indicado en el
presente documento.
Tabla 5. Manejo de la contramuestra por tipo de virus.
Rubus spp., Ribes spp. y Vaccinium spp.
Se deberá mantener al menos 2 tubos de 1,5 o 2 ml con tejido de la muestra macerado en tampón de extracción para ELISA y los extractos de ARN, por al menos 6 meses, después del análisis. El mantenimiento se deberá realizar a una temperatura de -20
+ 2°C. Además, para las muestras positivas, se deberá conservar tejido a -20 °C por al menos tres meses, posteriores a la recepción de la muestra.
Carozos y
Pomáceas Se deberá mantener al menos 2 tubos de 1,5 o 2 ml con tejido de la muestra macerado
en tampón de extracción para ELISA y los extractos de ARN, por al menos 6 meses,
después del análisis. El mantenimiento se deberá realizar a una temperatura de -20 + 2 °C. Además, para las muestras positivas, se deberá conservar tejido a -20°C por al menos tres meses, posteriores a la recepción de la muestra.
Virus en Vides (Vitis spp.)
Se deberá mantener al menos 2 tubos de 1,5 o 2 ml con tejido de la muestra macerado en tampón de extracción para ELISA y los extractos de ARN, por al menos
6 meses después del análisis. El mantenimiento se deberá realizar a una temperatura de -20 + 2°C. Además, para las muestras positivas, se deberá conservar tejido a -20 °C por al menos tres meses, posteriores a la recepción de la muestra.
Virus en Olivos Se deberá mantener contramuestra de tejido vegetal de las muestras originales y de
las extracciones de ARN, a -20 ± 2°C, por al menos 6 meses, después de realizado el análisis.
Virus en
Cítricos
Se deberá mantener al menos 2 tubos de 1,5 o 2 ml con tejido de la muestra macerado
en tampón de extracción para ELISA y los extractos de ARN, por al menos 6 meses, luego del análisis. El mantenimiento se deberá realizar a una temperatura de -20 + 2 °C.
Además para las muestras positivas, se deberá conservar tejido -20 °C por al menos tres meses, después de la recepción de la muestra.
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5.4 Metodología
a. Por ELISA
i. Extracción de RNA por el Método de la Captura con silica para detección de virus y
viroides en cítricos, Vitis spp., Olea europea L, carozos y pomáceas.
1. Rotule cada una de las bolsas plásticas con número de extracción, de tal manera que permita
identificar la muestra.
2. Rotule los tubos nuevos de 1,5 ml, de tal manera que permita la trazabilidad de la muestra.
3. Pesar 0.1 gramo de tejido (hoja/ floema), introducir en bolsa de extracción, agregar 1 ml. de
buffer de extracción y macerar.
4. Transferir 0.5 ml. del macerado a un microtubo de 1,5 ml y adicionar 0.1 ml. de sarcosina al
10% y 1,5 μl β – mercaptoetanol.
5. Incubar 10 minutos a 70° C con agitaciones cada 2 minutos.
6. Traspasar a hielo por 2 minutos y luego centrifugar a 12.000 rpm. por 5 minutos.
7. Transferir 0.3 ml. del sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf y agregar 300 μl de solución
de NaI, 150 μl de etanol absoluto y 25 μl de suspensión de partículas de silica. Incubar a
temperatura ambiente por 5 minutos con agitaciones cada 2 minutos.
8. Centrifugar a 6000 rpm. durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante.
9. Agregar 0.5 ml. de buffer de lavado y agitar en vortex hasta resuspender el pellet.
10. Repetir el paso N° 6.
11. Eliminar el sobrenadante con cuidado y secar el pellet a temperatura ambiente invirtiendo el
tubo.
12. Resuspender el pellet en 0.1 ml. de agua libre de nucleasas e incubarlo durante 2 minutos a
70°C.
13. Centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo
eppendorf nuevo, teniendo cuidado de no arrastrar silica.
14. El RNA extraído se almacena a -80° C, hasta su uso.
ii. Extracción de RNA por el Método de extracción con Litio para detección de virus
en Vaccinium spp., Rubus spp. y Ribes spp. (Hughes D.W., Galau G. 1988.)
1. Rotule cada una de las bolsas plásticas con número de extracción, de tal manera que permita
identificar la muestra.
2. Rotule los tubos nuevos de 1,5 ml, de tal manera que permita la trazabilidad de la muestra.
3. Pese 0,1 gr. de tejido e introduzca la muestra en la bolsa.
4. Agregue 1 ml de buffer de extracción de litio con β–mercaptoetanol a una concentración final
del 0,1 %.
5. Macere la muestra con ayuda del equipo moledor “Homex”.
6. Transfiera 600 µl del macerado al tubo previamente rotulado y adicione 600 µl de acetato de
potasio 6M.
7. Agite el tubo por inversión al menos 10 veces.
8. Centrifugue a 13.000 rpm durante 10 minutos.
9. Rotule tubos nuevos de 1,5 ml, de tal manera que permita la trazabilidad de la muestra.
10. Transfiera 750 µl del sobrenadante al nuevo tubo y agregue 750 µl de Isopropanol.
11. Agite el tubo por inversión al menos 10 veces.
12. Centrifugue a 14.000 rpm durante 20 minutos.
13. Elimine el sobrenadante con cuidado y lavar el pellet con 1 ml de etanol 70% frio.
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14. Centrifugue a 14.000 rpm durante 10 minutos.
15. Eliminar el sobrenadante con cuidado y deje secar el pellet durante al menos 1hora a
temperatura ambiente.
16. Resuspenda el pellet en 40 µl de agua libre de nucleasas.
17. Los ácidos nucleicos extraídos son almacenados a -20° C, hasta su uso.
La metodología de análisis a utilizar, deberá seguir las especificaciones técnicas (diluciones,
tiempos de incubación, etc) del fabricante de cada tipo de Kit, indicado en la Tabla 6.
Tabla 6. Kit marca Elisa por tipo de virus
Género Virus Marca ELISA
Rubus spp., Ribes spp. y
Vaccinium spp.
Arabis mosaic virus (ArMV) Agdia, Bioreba
Tomato ringspot virus (ToRSV) Agdia, Prime Diagnostic
Strawberry latent ringspot virus (SLRSV) Bioreba
Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) Bioreba
Blueberry shoestring virus (BSSV) AC Diagnostic
Tobacco streak virus (TSV) Agdia, Bioreba
Tobacco ringspot virus (TRSV) Agdia, Bioreba
Carozos y Pomáceas
Plum pox virus (PPV) Agdia
Tomato ringspot virus (ToRSV) Agdia / Prime
Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV) Bioreba / Prime
Prune Dwarf virus (PDV) Bioreba
Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) Bioreba
Apple mosaic virus (ApMV) Bioreba
Virus en Vides
(Vitis spp.)
GLRaV-1 Bioreba
GLRaV-2 Bioreba
GLRaV-3 Bioreba
GFLV Bioreba
GVA Bioreba, Agritest
GVB Agritest
Virus en Cítricos
Citrus Tristeza Virus CTV Bioreba
Cada muestra, se dispondrá en la placa ELISA en duplicado, siguiendo un diseño estándar para el
laboratorio, sin embargo se debe tener en cuenta que no pueden situarse en forma consecutiva,
ya sea en la fila como en la columna de la placa.
Se deberán incluir en cada placa, controles positivos (al menos 2 pocillos) y controles negativos
(al menos 3 pocillos). Los controles positivos, podrán corresponder a controles proporcionados por
la empresa proveedora del kit de diagnóstico o muestras propias que estén infectadas por el o los
virus a analizar, y que estén debidamente almacenadas y validadas en su condición. Esta
validación, debe ser realizada en forma previa al proceso de muestras oficiales, y puede realizarse
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realizando un test en los cuales se incluyan controles comerciales y las muestras postulantes a
control.
Los detalles de la preparación de las muestras, así como el uso de tampones de extracción,
diluciones de anticuerpos, tampones conjugados, tiempos de incubación, entre otros, deberán
realizarse según las instrucciones del proveedor.
Cuando corresponda, realizar más de un análisis por muestra, se deberá respetar el proceso de
preparación de muestras de cada kit utilizado.
Debido a que todos los kit autorizados, utilizan el sustrato P-Nitrofenilfosfato, las placas deberán
ser leídas en un Lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm y los datos obtenidos deberán
adjuntarse al Mapa de las muestras.
Eventualmente, el Servicio podrá establecer modificaciones a las pautas de análisis, para lo cual
el laboratorio, será informado a través de capacitaciones específicas y los acuerdos técnicos serán
agregados como documentos adicionales a este instructivo.
b. Por RT-PCR
El diagnóstico de los virus y viroides del alcance de éste instructivo, por la técnica molecular de
RT-PCR en dos pasos, consiste en términos generales en la extracción de ARN total a partir de lo
indicado en el punto 5.3.2 de éste documento, el cual es utilizado en una retrotranscripción, para
sintetizar cDNA que será usado como molde para la amplificación con partidores específicos para
los virus y/o viroides a analizar.
i. Metodología para Prunus spp y pomáceas.
Amplificación por RT-PCR en dos etapas. Se deben incluir en cada tanda de RT-PCR controles positivo, negativo y un control de agua
(control de mezcla).
Primer Paso: Síntesis de cDNA.
Mezcla Denaturación por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
RNA 10
Random Primer 0.3 ug/ul 2
Agua libre de nucleasas 18
Volumen Total 20
Incubar a 95°C por 5 min., pasar a hielo por 3 min, realizar spin y agregar 30 ul de mezcla de
síntesis.
Mezcla de Síntesis
Reactivo Vol. (µl)
Buffer 5x 10.0
dNTPs 10 mM 2.5
DTT 0.1 mM 2.4
MMLuV 200 U/ul 0.5
Agua libre de nucleasas 4.6
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Luego incubar a 42°C por 1 hora, el cDNA obtenido, se usa de inmediato o se guarda a -20°C
hasta su uso.
Segundo paso: Amplificación por PCR.
Para la amplificación de los distintos virus y viroide, se utilizan los partidores y las temperaturas
de annealing indicadas en la siguiente tabla:
Virus T° de Annealing (T° A) secuencia
ACLSV (f) 50 CCA TCT TCG CGA ACA TAG C
ACLSV (r) 50 GTC TAC AGG CTA TTT ATT ATA AG
PDV (f) 50 CAA CGT AGG AAG TTC ACA G
PDV (r) 50 GCA TCC CTT AAA GGG GCA TC
PNRSV (f) 50 GAA CCT CCT TCC GAT TTA G
PNRSV (r) 50 GCT TCC CTA ACG GGG CAT CCA AC
ApMV (f) 50 CGT GAG GAA GTT TAG GTT G
ApMV (r) 50 GCC TCC TAA TCG GGG CAT CAA
PPV (f) 60 ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC
PPV (r) 60 CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA
ToRSV (f) 55 GAC GAA GTT ATC AAT GGC AGC
ToRSV (r) 55 TCC GTC CAA TCA CGC GAA TA
PLMVd (f) 55 CCC GAT AGA AAG GCT AAG CAC CTC G
PLMVd (r) 55 AAC TGC AGT GCT CCG T
Mezcla de Reacción por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
Buffer Taq Polymerasa10X 2.5
MgCl2 25 mM 2.0 (1.5 para PLMVd)
dNTP’s 10 mM 0.5
Primer (f) 10 µM 0.5 Primer (r) 10 µM 0.5 Taq Polymerase 5 U u/l 0.2
Agua libre de nucleasas 16.25 Volumen Total 25
Agregar 2.5l de cDNA obtenido previamente, agitar, dar spin y colocar los tubos en el
termociclador.
Poner en marcha el programa PCR que consiste en:
94°C por 5 minutos.
39 ciclos de: 94 °C por 45 seg., T° A por 45 seg. y 72°C por 45 seg.
72°C por 5 minutos.
4 °C por tiempo indefinido.
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Los productos de amplificación obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al
1,6% y TAE 1X. Una muestra será positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado de
acuerdo a lo indicado en la tabla anterior y negativa, si no se visualiza la banda del tamaño
esperado.
ii. Metodología para Olivo.
Amplificación por RT-PCR en dos etapas
Se deben incluir en cada tanda de RT-PCR controles positivo, negativo y un control de agua (control
de coctel).
Primer Paso: Síntesis de cDNA.
Mezcla Denaturación por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
RNA 5
Random Primer 0.3 ug/ul 1
Agua libre de nucleasas 9
Volumen Total 15
Incubar a 95°C por 5 min., pasar a hielo por 3 min, realizar spin y agregar 10 ul de mezcla de
síntesis.
Mezcla de Síntesis
Reactivo Vol. (µl)
Buffer 5x 5
dNTPs 10 mM 1.25
DTT 0.1 mM 1.2
MMLuV 200 U/ul 1
Agua libre de nucleasas 1.55
Luego incubar a 42°C por 1 hora, el cDNA obtenido, se usa de inmediato o se guarda a -20°C
hasta su uso.
Segundo paso: Amplificación por PCR.
La amplificación de CLRV se realiza con partidores descritos por Werner y colab., 1997 (CLRV-5
5’ TGGCGACCGTGTAACGGCA3’ / CLRV-3 r 5’-GTCGGAAAGATTACGTAAAAGG-3’) que amplifica un
producto de 416 bp a una temperatura annealing 55°C. Para la amplificación de SLRSV, se utilizan
los partidores descritos por Faggioli y colab., 2002 (SLRSV-5D 5’-CCC TTG GTT ACT TTT ACC TCC
TCA TTG TCC-3’ / SLRSV 3D 5’-AGG CTC AAG AAA ACA CAC-3’) que amplifican un producto de
PCR de 293 bp a una temperatura annealing 55°C.
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Mezcla de Reacción por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
Buffer Taq Polymerasa10X 2.5
MgCl225 mM 1.5
dNTP’s 10 mM 1
Primer (f) 10 µM 1
Primer (r) 10 µM 1
Taq Polymerase 5 U u/l 0.25
Volumen Total 25
Agregar 1.5l de cDNA obtenido previamente, agitar, dar spin y colocar los tubos en el
termociclador.
Poner en marcha el programa PCR que consiste en:
94°C por 5 minutos.
39 ciclos de: 94 °C por 45 seg., 55 °C por 45 seg. y 72°C por 45 seg.
72°C por 5 minutos.
4 °C por tiempo indefinido.
Los productos de amplificación obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1,6%
y TAE 1X. Una muestra será positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado de acuerdo a
lo indicado previamente y negativa, si no se visualiza la banda del tamaño esperado.
iii. Metodología para cítricos:
Amplificación por RT-PCR en dos etapas.
Se deben incluir en cada tanda de RT-PCR controles positivo, negativo y un control de agua (control
de mezcla).
Primer Paso: Síntesis de cDNA.
Mezcla Denaturación por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
RNA 5
Random Primer 0.3 ug/ul 1
Agua libre de nucleasas 9
Volumen Total 15
Incubar a 95°C por 5 min., pasar a hielo por 3 min, realizar spin y agregar 10 ul de mezcla
de síntesis.
Mezcla de Síntesis
Reactivo Vol. (µl)
Buffer 5x 5
dNTPs 10 mM 1.25
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DTT 0.1 mM 1.2
MMLuV 200 U/ul 1
Agua libre de nucleasas 1.55
Luego incubar a 42°C por 1 hora, el cDNA obtenido, se usa de inmediato o se guarda a -
20°C hasta su uso.
Segundo paso: Amplificación por PCR.
Para la amplificación de los virus y viroides, se utilizan los partidores y las temperaturas de
annealing indicadas en la siguiente tabla:
Virus T° de
Annealing
(T° A)
Secuencia de los partidores (5’ -3’) Referencia / tamaño
esperado (bP)
CTV(f) 55 ATG GAC GAC GAA ACA AAG AAA T Hilf et al. (2005)
CTV(r) 55 TCA ACG TGT GTT GAA TTT CCC A 672 bp
CPsV (f) 50 GCT TCC TGG AAA AGC TGA TG Barthe et al. (1998)
CPsV(r) 50 TCT GTT TTT GTC AAC ACA CTC C 600 bp
CEVd (f) 55 GGA AAC CTG GAG GAA GTC GAG Gross et al. (1982)
CEVd (r) 55 CCG GGG ATC CCT GAA GGA CTT 371 bp
HSVd (f) 55 GGCAACTCTTCTCAGAATCCAGC Sano et al., (1988)
HSVd (r) 55 CCGGGGCTCCTTTCTCAGGTAAGT 269 bp
Mezcla de Reacción por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
Buffer Taq Polymerasa10X 2.5
MgCl225 mM 1.5
dNTP’s 10 mM 1
Primer (f) 10 µM 1
Primer (r) 10 µM 1
Taq Polymerase 5 U u/l 0.25
Volumen Total 25
Agregar 1.5l de cDNA obtenido previamente, agitar, dar spin y colocar los tubos en el
termociclador.
Poner en marcha el programa PCR que consiste en:
94°C por 5 minutos.
39 ciclos de: 94 °C por 45 seg., T° A por 45 seg. y 72°C por 45 seg.
72°C por 5 minutos.
4 °C por tiempo indefinido.
Los productos de amplificación obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1,6%
y TAE 1X. Una muestra será positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado de acuerdo a
lo indicado en la tabla anterior y negativa, si no se visualiza la banda del tamaño esperado.
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iv. Metodología para Rubus spp., Ribes spp., y Vaccinium spp.
Amplificación por RT-PCR en dos etapas.
Se deben incluir en cada tanda de RT-PCR controles positivo, negativo y un control de agua (control
de mezcla).
Primer Paso: Síntesis de cDNA.
Mezcla Denaturación por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
RNA 10 (1/10)
Random Primer 0.3 ug/ul 2
Agua libre de nucleasas 18
Volumen Total 20
Incubar a 95°C por 5 min., pasar a hielo por 3 min, realizar spin y agregar 30 ul de mezcla de
síntesis.
Mezcla de Sintesis
Reactivo Vol. (µl)
Buffer 5x 10.0
dNTPs 10 mM 2.5
DTT 0.1 mM 2.4
MMLuV 200 U/ul 1.0
Agua libre de nucleasas 14.1
Luego incubar a 42°C por 1 hora, el cDNA obtenido, se usa de inmediato o se guarda a -20°C
hasta su uso.
Segundo paso: Amplificación por PCR.
Para la amplificación de los virus, se utilizan los partidores y las temperaturas de annealing
indicadas en la siguiente tabla:
Virus T° de
Annealing
(T° A)
Secuencia de los partidores (5’ -3’) Referencia / tamaño
esperado (bP)
ARMV-5A 50 TAC TAT AAG AAA CCG CTC CC Faggioli y colab., 2005
ARMV-3A 50 CAT CAA AAC TCA TAA CCC AC 302 bp
SLRSV-F 50 CCT CTC CAA CCT GCT AGA CT Postman y colab., 2004
SLRSV-R 50 AAG CGC ATG AAG GTG TAA CT 497 bp
ToRSV-U1 55 GAC GAA GTT ATC AAT GGC AGC Griesbach y colab., 1995
ToRSV-D1 55 TCC GTC CAA TCA CGC GAA TA 449 bp
TRSV-f 50 CAG GGG CGT GAG TGG GGG CTC Fuchs y colab., 2010
TRSV-r 50 CAA TAC GGT AAG TGC ACA CCC CG 320 bp
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Mezcla de Reacción por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
Buffer Taq Polymerasa10X 2.5
MgCl225 mM 1.5
dNTP’s 10 mM 1.0
Primer (f) 10 µM 1.0 Primer (r) 10 µM 1.0 Taq Polymerase 5 U u/l 0.25
Agua libre de nucleasas 16.25 Volumen Total 25
Agregar 1.5l de cDNA obtenido previamente, agitar, dar spin y colocar los tubos en el
termociclador.
Poner en marcha el programa PCR que consiste en :
94°C por 5 minutos.
39 ciclos de: 94 °C por 45 seg., 55 °C por 45 seg. y 72°C por 45 seg.
72°C por 5 minutos.
4 °C por tiempo indefinido.
Los productos de amplificación obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1,6%
y TAE 1X. Una muestra será positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado de acuerdo a
lo indicado en la tabla anterior y negativa, si no se visualiza la banda del tamaño esperado.
v. Metodología para Vitis spp.
Amplificación por RT-PCR en dos etapas
Se deben incluir en cada tanda de RT-PCR controles positivo, negativo y un control de agua (control
de mezcla).
Primer Paso: Síntesis de cDNA.
Mezcla Denaturación por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
RNA 10
Random Primer 0.3 ug/ul 1
Agua libre de nucleasas 19
Volumen Total 30
Incubar a 95°C por 5 min., pasar a hielo por 3 min, realizar spin y agregar 30 ul de mezcla de
síntesis.
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Mezcla de Sintesis
Reactivo Vol. (µl)
Buffer 5x 10.0
dNTPs 10 mM 2.5
DTT 0.1 mM 2.4
MMLuV 200 U/ul 1.0
Agua libre de nucleasas 4.1
Luego incubar a 42°C por 1 hora, el cDNA obtenido, se usa de inmediato o se guarda a -20°C
hasta su uso.
Segundo paso: Amplificación por PCR.
Para la amplificación de los distintos virus se utilizan los partidores y las temperaturas de annealing
indicadas en la siguiente tabla:
Virus
T° de
Annealin
g (T° A)
Secuencia de los partidores (5’ -3’) Referencia / tamaño
esperado (bP)
GLRa1V (f) 55 CGT TCG CGT TAC CCA CGC TGC CTA Good and Monis
GLRa1V (r) 55 GCT GGC AAA CCT GGT GGA CCT TAC
ATC
2001.
150 bp
GLRa2V (f) 55 ACG GTG TGC TAT AGT GCG TG Bertazzon and Angelini 2004
GLRa2V (r) 55 GCA GCT AAG TAC GAA TCT TC 589 bp
GLRa3V (f) 52 CGC TCA TGG TGA AAG CAG ACG Turturo et Al 2005
GLRa3V (r) 52 CTT AGA ACA AAA ATA TGG AGC AG 546 bp
GVA (f) 52 GAC AAA TGG CAC ACT ACG Minafra et Al 1997
GVA (r) 52 AAG CCT GAC CTA GTC ATC TTG G 430 bp
GVA(f) 52 AGG TCC ACG TTT GCT AAG MacKenzie 1997
GVA (r) 52 CAT CGT CTG AGG TTT CTA CTA 235 bp
GVB(f) 52 GTG CTA AGA ACG TCT TCA CAG C Minafra and Hadidi 1994
GVB(r) 52 ATC AGC AAA CAC GCT TGA ACC G 469 bp
GFkV(f) 55 TGG TCC TCG GCC CAG TGA AAA AGT A Shi et Al 2003
GFkV(r) 55 GGC CAG GTT GTA GTC GGT GTT GTC 315 bp
ToRSV (f) 55 GAC GAA GTT ATC AAT GGC AGC Griesbach 1995
ToRSV (r) 55 TCC GTC CAA TCA CGC GAA TA 449 bp
Mezcla de Reacción por tubo:
Reactivo Vol. (µl)
Buffer Taq Polymerasa10X 2.5
MgCl225 mM 1.5
dNTP’s 10 mM 1.0
Primer (f) 10 µM 1.0 Primer (r) 10 µM 1.0 Taq Polymerase 5 U u/l 0.25
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Agua libre de nucleasas 16.25 Volumen Total 25
Agregar 2.5l de cDNA obtenido previamente, agitar, dar spin y colocar los tubos en el
termociclador.
Poner en marcha el programa PCR que consiste en:
94°C por 5 minutos.
39 ciclos de: 94 °C por 30 seg., T° A por 30 seg. y 72°C por 45 seg.
72°C por 5 minutos.
4 °C por tiempo indefinido.
Los productos de amplificación obtenidos son sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1,6%
y TAE 1X. Una muestra será positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado de acuerdo
a lo indicado en la tabla anterior y negativa, si no se visualiza la banda del tamaño esperado
Se deberán incluir a lo menos un control positivo, un control negativo y un control de coctel. Los
controles positivos, corresponderán a muestras de tejido vegetal que estén infectadas por el virus
a analizar, que estén debidamente almacenadas y validadas en su condición, los controles
negativos, corresponderán a muestras de tejido vegetal que no presentan el virus a analizar, que
han sido debidamente almacenadas y validadas en su condición y los controles de coctel, consisten
en la amplificación de una mezcla de reacción en que se reemplaza la muestra de templado por
agua. Esta validación debe ser realizada en forma previa al proceso de muestras oficiales.
No obstante lo anterior, los laboratorios podrán presentar para la evaluación por parte del Servicio,
otras metodologías o variantes de las indicadas en este instructivo, las que una vez aprobadas
podrán ser implementadas por los laboratorios autorizados.
5.4.1 Control de calidad interno
a. Para el diagnóstico por ELISA,
Para todos los virus y viroides, el laboratorio deberá definir “Cartas Control” para sus materiales
de referencia (controles positivos y negativos) los cuales deberán definirse previo a cada
temporada o a cada nuevo kit utilizado o material de referencia. Con estas cartas control se
definirán los criterios de aceptación o rechazo de cada placa analizada.
La metodología será la siguiente:
Se definirán valores promedios esperados para los materiales de referencia. Estos valores se
pueden obtener a través del análisis de estos materiales, empleando el kit seleccionado para
la temporada, y agregando las posibles variables a actuar en los valores obtenidos, como por
ejemplo realizar el análisis con distintos operarios. Con estos valores se definirá un valor
promedio y las correspondientes desviaciones estándar.
Con estos valores se procederá a realizar un gráfico o Carta Control en la cual a través de
líneas perpendiculares se definirán distintas áreas.
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Las líneas se definirán como:
o Línea central: valor promedio.
o 2 líneas superiores: la primera como el valor promedio más una vez la deviación
estándar, y la segunda corresponde al valor promedio más dos veces la desviación
estándar.
o 2 líneas inferiores: la primera como el valor promedio menos una vez la deviación
estándar, y la segunda corresponde al valor promedio menos dos veces la desviación
estándar.
En este cuadro control se graficarán todos los valores obtenidos para cada Kit y sus respectivos
materiales de referencia, los cuales se obtienen de los análisis realizados para las muestras
enviadas por los inspectores SAG o muestreadores terceros autorizados.
Cuando 2 puntos del gráfico en forma consecutiva caigan fuera de la zona de Prom+2DS para
los controles negativos y/o Prom-2DS para los controles positivos, se deberá dar aviso al
Encargado de Supervisión SAG de ese laboratorio a través de correo electrónico, y se deberá
enviar un informe de revisión del sistema en el cual se indique las posibles causales de esta
desviación de valores de los materiales de referencia. Esta comunicación deberá realizarse al
día siguiente de obtenido el valor fuera de rango.
b. Para el diagnóstico por RT-PCR
Los resultados obtenidos serán validados, sólo si, se cumplen las siguientes condiciones, el control
positivo deberá presentar una banda del tamaño esperado (indicado en la Tabla 7) y tanto la
muestra control negativa, como el control de mezcla PCR, no deben presentar banda a la altura
esperada para el amplificado viral.
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Tabla 7. Control de calidad interno para el tamaño esperado
Género / Especie Virus
Tamaño esperado
del Producto de
PCR (bp)
Especies de los géneros Ribes spp.
Rubus spp. y Vaccinium spp.
ArMV 302
ToRSV 449
TRSV 320
SLRSV 497
Carozos y Pomáceas
Prunus persica (L.) Batsch /
Prunus persica cv. Nectarina (L.) Batsch / Prunus armeniaca L. /
Prunus dulcis (Mill.) D. A. Webb / Prunus domestica L. / Prunus salicina Lindl. /
Prunus Avium
ApMV 417
ToRSV 449
ACLSV 632
PPV 243
PNRSV 346
PDV 517
PLMVd 336
Vides
Vitis spp.
GLRaV-1 150
GLRaV-2 589
GLRaV-3 546
GFLV 290
GVA 430/ 235
GVB 469
Olivos
Olea europaea L. CLRV 416
SLRSV 293
Cítricos
Citrus spp.
CTV 672
CPsV 600
CEVd 371
CCVd 269
5.4.2 Interpretación de resultados
a. En el caso del análisis por ELISA
- Una muestra será considerada positiva cuando: el promedio de los valores obtenidos en los 2
pocillos, sea mayor al doble del promedio de los valores obtenidos en los controles negativos
(línea de corte), y,
- Una muestra será considerada negativa cuando: sea menor que este parámetro.
Sin embargo, cuando en forma individual 1 pocillo tenga el valor considerado positivo y el otro
pocillo arroje un valor negativo, la muestra deberá ser repetida a partir de uno de los tubos
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almacenados como contramuestra. Si la situación se vuelve a repetir se deberá dar aviso vía correo
electrónico al Encargado de Supervisión del laboratorio, para evaluar las medidas a tomar.
b. En el caso del análisis por RT-PCR
- Una muestra es considerada positiva, si se aprecia una banda del tamaño esperado indicado
en la Tabla 6.
- Una muestra es considerada negativa, si no está presente la banda del tamaño esperado.
La estimación del tamaño de la banda, se realiza comparando, su distancia de migración en el gel,
respecto al marcador de peso molecular.
5.4.3 Expresión de resultados
Los resultados para ambas técnicas diagnósticas DAS-ELISA y RT-PCR, son cualitativos, esto
implica, que una muestra es positiva, si la muestra analizada presenta el patógeno analizado y
será negativa, si en la muestra analizada el patógeno no está presente.
REGISTRO Y ENVÍO DE LOS RESULTADOS
El laboratorio deberá contar con un libro de registro y/o planilla digital formato tipo Excel de
resultados de muestras que incluya el número de folio del acta de toma de muestras con sus
correlativos respectivos, fecha de recepción, aceptación/rechazo, resultado, fecha de resultado,
firma del analista y observaciones.
Además, el laboratorio deberá mantener un archivador con la orden de análisis, diagrama de carga
de la placa de ELISA con lectura adjunta y en el caso de análisis por RT-PCR se debe tener el
registro de extracción de ARN asociado a cada muestra y orden de carga de corrida electroforética
con foto del gel respectivo. Todos los registros y documentos se deben conservar al menos durante
los 5 años siguientes de realizado el análisis.
Los resultados correspondientes, se ingresaran e informaran a través sistema en línea
(htpp.csm.sag.gob.cl), en un plazo de 15 días hábiles a partir desde la recepción de la(s)
muestra(s).
Una vez ingresados los resultados, el laboratorio deberá notificar lo anterior en forma escrita, a la
Oficina SAG correspondiente al origen de la muestra, al Encargado de Supervisión SAG de ese
laboratorio, con copia al correo electrónico [email protected], indicando el o los números de folio del
acta de toma de muestras (con su correspondiente correlativo) que fueron ingresados al sistema.
En caso que el laboratorio autorizado prevea cualquier atraso en el tiempo de respuesta de alguna
muestra, deberá informarlo con 24 horas de anticipación a la fecha límite de respuesta, vía correo
electrónico, al Encargado de Supervisión SAG de ese laboratorio con copia al correo electrónico
[email protected], indicando el número de la muestra en esa situación (folio del acta de toma de
muestras con su respectivo número correlativo), para que el Servicio determine los pasos a seguir.
Cualquier información obtenida producto del proceso de análisis (resultados parciales o totales u
otro), será de carácter confidencial entre el laboratorio autorizado y el SAG, en caso de no
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viroides en tejido vegetal para el Programa de
Certificación de Plantas Frutales
Código: D-GF-CGP-PT-037 Versión: 01
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respetarse lo anterior, sin previa autorización del Servicio, será considerado como una no
conformidad crítica y causal de suspensión inmediata de la condición de autorizado.
SUPERVISIÓN DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS
Todo laboratorio autorizado será supervisado mediante visitas al menos una vez al año. Sin embargo, deberá estar dispuesto a recibir supervisiones adicionales, en cualquier momento.
El Encargado de Supervisión SAG del Laboratorio Autorizado, podrá solicitar a este último en
cualquier momento, el envío de contramuestras, ya sea tejido vegetal y/o extracción (acorde a lo
indicado en el punto 5.3.2 de este instructivo), para ser analizados por el SAG. En el caso de no
haber concordancia con los resultados, se programará una visita de supervisión adicional para
verificar la conducción del ensayo y determinar las medidas que correspondan.
Si producto de las acciones de supervisión, se detectan faltas en el desempeño del Laboratorio
Autorizado, que afecten negativamente el resultado del Programa de Certificación de plantas
frutales asociado a su autorización, el SAG, de conformidad con lo dispuesto en la cláusula sexta
del correspondiente convenio de autorización, podrá instruir al Laboratorio Autorizado mediante
una carta suscrita por el/la Jefe(a) del Departamento Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias,
Director(a) Regional y/o Jefe(a) de Oficina Sectorial, el cese inmediato de prestaciones de servicios ejecutados en el alcance de su autorización hasta que el SAG resuelva en definitiva su caso.
MEDIDAS POR INCUMPLIMIENTO
En caso de detectarse algún incumplimiento o hallazgo durante las supervisiones, se procederá a
evaluar la criticidad del mismo, por lo cual el autorizado quedará afecto a la aplicación de medidas
por incumplimiento dependiendo del tipo de incumplimiento en el marco de las obligaciones de su
actividad.
Las medidas que se pueden aplicar ante la detección de incumplimientos son:
Suspensión de la autorización.
Revocación de la autorización.
Las medidas señaladas se aplicarán a nivel nacional, sin perjuicio de las sanciones que contemplan
las leyes vigentes.
Cabe señalar, que en caso de detectar incumplimientos moderados, el supervisor podrá consignar
en el acta de supervisión correspondiente, una amonestación por escrito y establecerá un plazo
para solucionar el hallazgo. En caso que el incumplimiento no sea subsanado, en el plazo
establecido, se aplicará la medida por incumplimiento que corresponda.
Las suspensiones de la autorización, durarán el tiempo que determine el Servicio
considerando la gravedad del hallazgo. En el caso de tener que subsanar algún incumplimiento, la
suspensión durará, al menos, el tiempo que requiera el autorizado para implementar las medidas
correctivas y su posterior verificación por parte del Servicio, caso en que la medida de suspensión
quedará levantada a contar de la fecha en que el supervisor SAG a cargo de la supervisión
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Certificación de Plantas Frutales
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comunique por escrito al laboratorio autorizado la verificación conforme de las medidas correctivas
por éste implementadas.
En caso de revocación, el laboratorio autorizado afecto a tal medida, quedará inhabilitado para
postular nuevamente a esta autorización, por el plazo de 2 (dos) años, contados desde que
quede ejecutoriada la resolución que la establece.
OBLIGACIONES
El laboratorio autorizado ante el SAG para la ejecución de labores pertinentes al diagnóstico
asociado al presente documento, tendrá las obligaciones señaladas en el numeral 7 de la última
versión del Reglamento Específico para la autorización de laboratorios de análisis/ensayos.
En el caso que, por motivos del transporte propiamente tal, las muestras lleguen al laboratorio en
mal estado o que no cumplan con las condiciones específicas para realizar los análisis (es decir
estado de descomposición u otro), el laboratorio autorizado deberá cambiar de empresa de
transporte de encomiendas o courier, cuando tal situación ocurra en 3 oportunidades consecutivas,
dando cuenta de tal situación al Encargado de Supervisión SAG de ese laboratorio, mediante
documento escrito enviado vía correo electrónico u otro.
En caso de cambio o término abrupto de convenio con empresa de transporte de encomienda por
parte del laboratorio autorizado, este deberá dar aviso formal por escrito vía correo electrónico en
forma inmediata al Encargado de Supervisión SAG de ese laboratorio con copia al correo
electrónico [email protected].
No podrá ejercer como laboratorio autorizado para el diagnóstico de virus y viroides para la
certificación de plantas frutales, cuando el representante legal, socios, directores, accionistas,
gerentes, responsable técnico o personal de la empresa tengan un interés directo e incompatible
con la actividad para la cual fue autorizada, como ser propietario del producto que se desea
certificar, u otras que determine el Servicio.
Cualquier información obtenida producto del proceso de análisis (resultados parciales o totales u
otro), será de carácter confidencial entre el laboratorio autorizado y el SAG, en caso de no
respetarse lo anterior, sin previa autorización del Servicio, será considerado como una no
conformidad crítica y causal de suspensión inmediata de la condición de autorizado.
FORMULARIOS
Código Nombre
F-GF-CGP-PT-160 Formulario anexo para el diagnóstico de virus y viroides, para la certificación
de plantas frutales
F-GF-CGP-PT-113 Formulario de identificación del personal vinculado al/los análisis
F-GF-CGP-PT-085 Empresa(s) de transporte de encomiendas o courier en convenio
F-GF-CGP-PT-161 Declaración jurada para la designación del laboratorio autorizado
F-GF-CGP-PT-162 Formulario recepción de muestras
FORMULARIO ANEXO
DIAGNÓSTICO DE VIRUS Y VIROIDES, PARA LA
CERTIFICACIÓN DE PLANTAS FRUTALES
Código: F-GF-CGP-PT-160
Versión:01
Página 32 de 36
Identificación del laboratorio:
Nombre/razón social: .............................................................................................
Cédula de identidad N°/RUT: …………………………………………..
Marque con una “X” el género / especie a la que postula:
Fecha: _____________
GÉNERO / ESPECIE
Especies - Ribes spp.
Especies - Rubus spp.
Especies - Vaccinium spp.
Manzano - Malus domestica Borkh
Membrillo - Cydonia oblonga Mill
Peral - Pyrus L.
Almendro - Prunus dulcis (Mill.) D. A. Webb
Cerezo - Prunus avium (L.) L.
Guindo - Prunus Cereasus
Ciruelo - Prunus domestica L. -Prunus salicina Lindl.
Damasco - Prunus armeniaca L.
Duraznero - Prunus persica (L.) Batsch
Nectarino - Prunus persica cv. nectarina(L.) Batsch
Vides - Vitis spp.
Olivo - Olea europaea L.
Cítricos - Citrus spp.
Nombre o representante legal
Laboratorio autorizado
DECLARACIÓN JURADA PARA LA DESIGNACIÓN
DEL LABORATORIO AUTORIZADO PARA EL
ANÁLSIS DE MUESTRAS
Código: F-GF-CGP-PT-161
Versión:01
Página 33 de 36
Por el presente instrumento, yo ………………………..…………………………………………………….
………….……............................., cédula de identidad N° …………..………........................, de
nacionalidad …................................., con domicilio en
……….……………..........................….................................................................………,
comuna de ……………….……………………………………………..………., persona encargada del material
vegetal: ……………………………………………………………………………………………………………………….……………. de
la empresa ……………….……..………………….………………………, declaro bajo juramento:
1- Que todas las muestras vegetales obtenidas para los análisis virológicos obtenidas desde
los predios que están ubicados en la comuna de .……………………………….………… deberán ser
enviadas al siguiente laboratorio autorizado para que realice el diagnóstico de virus :
Nombre o Razón social:…………………………………………………….……………….…..……….….…
Número y año de su resolución de autorización vigente: …………………………........…
Dirección: ………………………………………………………………………………….…………………………….
Correo electrónico: …………………….……………………………………………………………………………
Teléfono: …………………………………………………………………………………………………..…………….
2- Que ante una modificación en la designación del laboratorio autorizado, informaré a la
Oficina SAG correspondiente al origen de la muestra, con copia al correo electrónico
[email protected] en un plazo no superior a 48 horas, el nombre del nuevo laboratorio autorizado
al cual el Servicio deberá enviar las muestras.
Personal encargado
Empresa multiplicadora
Nombre o representante legal
Laboratorio autorizado
Fecha recepción SAG:…………………………………………….
FORMULARIO RECEPCIÓN DE MUESTRAS
Código: F-GF-CGP-PT-162
Versión:01
Página 34 de 36
Logo Laboratório Autorizado
Fecha aviso
ANTECEDENTES TERCERO AUTORIZADO (Emisor)
Nombre Laboratorio Autorizado
Nombre Responsable Técnico
Dirección Oficina/ Comuna
Teléfono (s) (fijo/ móvil)
Correo electrónico
ANTECENTES SERVICIO AGRICOLA Y GANADERO (Uso exclusivo SAG)
Departamento Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias – UNIDAD VIROLOGÍA
Nombre Funcionario Receptor
Firma Funcionario Receptor Fecha
Recepción
ANTECEDENTES RECEPCION MUESTRAS
Informo a usted que a partir de ______________(indicar fecha) se han empezado a recepcionar muestras
vegetales para diagnóstico
de:_______________________________________________________________________________,
correspondientes a temporada____________/________, de acuerdo al siguiente detalle:
N° de Folio del acta
de toma de muestras REGION COMUNA
Oficina SAG que
envía Muestra
NOMBRE
FIRMA
RESPONSABLE TECNICO LABORATORIO
FORMULARIO DE IDENTIFICACIÓN DE
EMPRESA/S DE TRANSPORTE DE
ENCOMIENDAS O COURIER EN CONVENIO
Código: F-GF-CGP-PT-085
Versión:01
Página 35 de 36
Identificación del laboratorio:
Nombre/razón social: ..................................................................................
Cédula de identidad N°/RUT: …………………………………………..
Nombre Empresa Número de
Cuenta
Fecha de
convenio
Fono contacto
Firma del postulante o representante legal
Fecha,…………………………………………….
FORMULARIO DE IDENTIFICACIÓN DE
ANALISTAS VINCULADOS AL ANÁLISIS DE
LABORATORIOS DE ANÁLISIS/ENSAYO
Código: F-GF-CGP-PT-113
Versión:01
Página 36 de 36
Identificación del laboratorio:
Nombre/razón social: .......................................................................................................
Cédula de identidad N°/RUT: …………………………………………..
Nombre Completo Nº cédula de
identidad Firma
Técnica/s que
realiza
Firma del postulante o del representante legal
Fecha: …………………………………………….