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24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Escuela de Técnicos en Hemoterapia
e Inmunohematología UBA
Hospital de Clínicas
Procedimientos serológicos seleccionados.
Uso de agentes reductores. Sustancias solubles de grupos sanguíneos. Adsorción. Elución: diferentes técnicas. Titulación. Disociación de IgG por cloroquina. Micrométodos. Automatización. Uso de
anticuerpos monoclonales.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Empleo de reactivos sulfhidrilo
Ditiotreitol (DTT)
2-Mercaptoetanol (2-ME)
2-Aminoetilisotiouronio (AET)
Mecanismo de acción • Clivan los puentes disulfuro que unen las
subunidades monoméricas de los pentámeros de IgM (19S en 7S)
• Los puentes intercatenarios de las IgG monoméricas son bastante resistentes al clivaje
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Reactivos sulfhidrilo
Usos
Determinación de la clase de inmunoglobulina de los Acs
Identificación de las especificidades en mezclas de Acs, IgM e IgG (desenmascarar)
Determinación del monto relativo de IgG e IgM en una especificidad dada
Disociación de aglutinatos eritrocitarios por IgM (crioglobulinas)
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Reactivos sulfhidrilo
Usos
Destrucción de antígenos eritrocitarios seleccionados para investigación de Acs
(Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)
Combinación con enzimas proteolíticas, para disociar los Acs IgG de GR (ZZAP)
DTT + Papaína activada con cisteína
La cisteína forma puentes disulfuro que contribuyen al plegamiento de las proteínas
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Empleo de reactivos sulfhidrilo para
distinguir los anticuerpos IgM e IgG
Principios
El tratamiento de los Acs IgM, anula las actividades aglutinante y fijadora de complemento
La visualización de la actividad de los Acs antes y después del tratamiento con sulfhidrilos es útil para determinar la clase de inmunoglobulina
El tratamiento con sulfhidrilos también se emplea para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y permitir la detección de IgG coexistentes
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Ditiotreitol (DTT) 0,01 M
Preparación • Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3
Conservación • 2 a 6 ºC
Los reactivos sulfhidrilos en baja concentración debilitarían los Ag del sistema Kell
Pudiera observarse gelificación de la muestra Causas • Preparación incorrecta del DTT o concentración
superior a 0,01 M. • Incubación de suero y DTT prolongada
Las muestras gelificadas no pueden estudiarse
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Pruebas de inhibición de la
hemaglutinación
Algunos antígenos de grupo sanguíneo están presentes en formas solubles en saliva, orina y plasma
Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la reactividad de los anticuerpos correspondientes
La inhibición también permite neutralizar anticuerpos que enmascaran la presencia de otros no neutralizables
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Adsorción
Para los procedimientos de adsorción no existe un procedimiento único ideal
Para incrementar la captación de
anticuerpos puede aumentarse la proporción de antígenos utilizando un
volumen celular mayor
La temperatura de incubación debe ser la de reactividad óptima de los
anticuerpos
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Adsorción
Las pruebas de adsorción requieren un volumen importante de GR
Los eritrocitos testigos de los paneles comerciales resultan insuficientes
• las fuentes mas convenientes pueden ser unidades donadas o muestras de sangre del personal de los fenotipos deseados
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Elución
Las técnicas de elución liberan las moléculas
de Acs de los GR sensibilizados
Los Acs fijados pueden liberarse:
• por modificación de la termodinámica de las reacciones Ag-Ac
• neutralización o reversión de las fuerzas de atracción que mantienen unidos a los complejos
• alteración de la concordancia estructural entre los Ag y los puntos de fijación en las moléculas de Acs
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Elución
Usos
Las técnicas de elución pueden servir para:
• Investigar una PAD positiva
• Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresión débil e identificar especificidades múltiples (junto a adsorción)
• Preparar GR sin Acs para fenotipificación o estudios de adsorción autólogos.
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Elución
Si el eluato reacciona con todas las células
• Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos
Si el paciente no fue transfundido en fecha reciente y no existen Acs séricos inesperados no se requieren estudios serológicos adicionales
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Técnicas para elución de anticuerpos
Calor (56ºC) Calor suave (45ºC) Congelación-descongelación Frío-ácido Digitonina-ácido Diclorometano (DCM) Glicina-HCl / EDTA CLOROFORMO XILENO ETER
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Calor (56ºC)
Ventajas
Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO
Rápido y fácil
Desventajas
Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Congelación-descongelación
Ventajas
Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO
Rápido y fácil
Requiere un volumen celular reducido
Desventajas
Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Frío-ácido
Ventajas
Rápido y fácil
Sensibilidad comparable a digitonina-ácido
Desventajas
Menos sensible para auto y aloanticuerpos reactivos en caliente
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Digitonina-ácido
Ventajas
No peligroso
Recuperación adecuada de la mayoría de los Acs significativos
Kit comercial
Desventajas
El lavado del estroma es lento
Baja sensibilidad sistema Kidd
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Diclorometano (DCM)
Ventajas
Adecuado para anti-K
No inflamable
Desventajas
Tóxico
Recuperación escasa de anti-Fyb
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
Glicina-HCl / EDTA
Ventajas
Apropiado para preparar eluatos y obtener células PAD negativas
No destruye las células tratadas
Sensibilidad comparable a digitonina-ácido
Desventajas
Desnaturaliza los Ag del sistema Kell
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
CLOROFORMO
Ventajas
Método de acción rápida
Líquido no inflamable
Recuperación de la mayoría de los anticuerpos significativos
Desventajas
Sustancia reconocida como carcinogénica
Altamente tóxico
Efecto narcótico inhalatorio
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Técnicas para elución de anticuerpos
XILENO
Ventajas
Buena recuperación de la mayoría de los Acs significativos
Desventajas
Carcinogénico
Tóxico
Narcótico
Provoca hemólisis
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Técnicas para elución de anticuerpos
ETER
Ventajas
Excelente recuperación de la mayoría de los Acs de grupo sanguíneos
Desventajas
Narcótico
Tóxico
Explosivo
Muy inflamable
Poca recuperación de anti-S-s
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Titulación
Principios
Es un método semicuantitativo que se emplea para determinar la concentración de Acs en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresión antigénica en distintas muestras de GR
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Titulación
Aplicaciones Estimar actividad de Acs en embarazadas
alosensibilizadas Definir la especificidad relativa de los
autoanticuerpos Caracterizar Acs de título alto baja avidez
(TABA) • Ejemplo
Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH
Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)
Monitoreo de IgG en embarazadas
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Titulación
Interpretación
Observar la mayor dilución que produce aglutinación 1+
El título es la inversa de la dilución
Si se advierte aglutinación en el tubo que contiene el suero mas diluido no se alcanzó el punto final
En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de 3 diluciones
Los títulos solos sin la evaluación adicional de la intensidad de la aglutinación pueden ser engañosos
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Titulación
Score • Asignar un valor numérico a la
intensidad de la aglutinación
• La suma correspondiente a todos los tubos representa el score
• El umbral significativo arbitrario para comparar los puntajes es de 10 ó más
Por ser un método semicuantitavo la variabilidad técnica puede desviar los resultados
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Titulación Claves Técnicas
• Calidad de las pipetas y su utilización
• Respetar tiempo y temperatura de incubación
• Duración y potencia de centrifugación
• La antigüedad, el fenotipo y la concentración de las células influyen en los resultados
Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad • Las comparaciones son válidas con análisis
simultáneos
Se disminuye la variabilidad con la utilización de mayores volúmenes
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Disociación de la IgG de los GR con
PAD positiva
Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse con reactivos que requieran una técnica de AGH
En condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de la membrana de los GR sin afectar su integridad.
Esto permite la fenotipificación completa de los GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos en caliente
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Cloroquina
Reactivos Necesarios
Solución de difosfato de cloroquina preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF
Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N
Conservación 2 a 6º C
Se necesitan GR de control portadores de una dosis simple de los antígenos a fenotipificar
Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecífico
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Cloroquina Limitaciones técnicas
No disocia el complemento de la membrana celular
Incubación no > de 2 hs. causa hemólisis y/o pérdida de reactividad antigénica
Los Ag del sistema Rh podrían experimentar cierta desnaturalización.
Pudieran no eliminarse por completo los Acs de los GR sensibilizados
sólo atenuar la intensidad de la PAD
La cloroquina atenúa la expresión de Ag HLA de Clase I eritrocitarios
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Micrométodos, Microplacas
Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados.
Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados
En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva
Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales
Una célula B estimulada da origen a una progenie clonal que produce Acs específicos para un epítopo
El sobrenadante del cultivo de un clon de células B contiene Acs de especificidad única.
• Los eventos posteriores a la activación pueden inducir diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas
• la especificidad idiotípica codificada en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas no se modifica.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales
Hibridomas
La fusión de células plasmáticas normales, productoras de anticuerpos, con células plasmáticas neoplásicas permite obtener líneas celulares con capacidad reproductiva infinita.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales
Aplicaciones
Los Acs que reaccionan en forma específica e intensa con un solo epítopo, que forma parte de Ag multivalentes, pudieran no reconocer al Ag ante la falta de esa configuración particular
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales
Aplicaciones
Los reactivos usados en los bancos de sangre son mezclas de distintos productos monoclonales que permiten incrementar las variantes fenotípicas que el antisuero puede reconocer
Solos o mezclados suelen reaccionar con mayor intensidad con los Ag de expresión débil que los sueros inmunes
Para individualizar y caracterizar sistemas antigénicos complejos se utilizan baterías de diferentes especificidades monoclonales
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Anticuerpos monoclonales
Las especificidades antiglobulínicas monoclonales se emplean para reconocer distintas clases de inmunoglobulinas o fracciones del complemento sobre la membrana eritrocitaria
Las mezclas de varios reactivos monoclonales se utilizan para elaborar los reactivos poliespecíficos
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Hacemos un breve intervalo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Procedimientos Inmunohematológicos
en paciente con autocontrol o PAD
positiva
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Verificar Hemólisis
Macroscópica
BI
Haptoglobina
LDH
Hemoglobina libre en plasma y orina
Si no hay clínica ni laboratorio de hemólisis no se justifican estudios adicionales
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Paciente con autocontrol o PAD
positiva
Siempre comenzar por verificar la
existencia de antecedentes transfusionales recientes
Puede tratarse de:
• Autoanticuerpos reactivos en frío
• Autoanticuerpos reactivos en caliente
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Autoanticuerpos reactivos en caliente
La reactividad de la mayoría de los
autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta con el uso de PEG y enzimas
Es conveniente realizar la DAI sin los medios potenciadores habituales
Si los resultados son negativos puede emplearse el mismo procedimiento para la prueba de compatibilidad sin necesidad de adsorciones
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Transfusiones recientes
Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podría haber células recubiertas con Acs que determinan una PAD positiva con campo mixto
La elución podría ser útil en especial cuando las pruebas séricas no son concluyentes
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Transfusiones recientes
En el paciente con PAD positiva transfundido en fecha reciente o no, podría ser difícil obtener el fenotipo exacto de los GR
Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar resultados válidos a pesar de la PAD positiva
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Transfusiones recientes
La elución concentra las pocas moléculas de inmunoglobulina presentes en los GR de la preparación inicial en un volumen reducido
Es excepcional que las células
transfundidas generen un control positivo en otras fases de la prueba, pero puede ocurrir si existen neo o crioaloanticuerpos
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Pensemos
Implementación de algoritmos operativos para la utilización racional de los recursos
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Gracias por su atención
Vale disfrutar si el esfuerzo no fue en vano