SeenfatizalarecomendaciónquetodaslasmuestrasdeinfluenzatipoAnosubtificablesseanenviadasdeinmediatoparaeldiagnósticoylacaracterizaciónadicionalaunodeloscincoCentrosColaboradoresdelaOMSparalagripe.

21demayodel2009EstedocumentopresentainformaciónsobrelosmediosdediagnósticodisponiblesalafechaindicadaparaelvirusdelainfluenzatipoAhumana(H1N1)A/California/4/2009yvirussimilares.Lainformaciónsobreeldiagnósticoseactualizarácuándoéstaseencuentredisponible.Muestras Lasmuestrasmásapropiadassegúnlorecomendadoporlasinvestigacionesdelainfluenzaestacionalsonaquellasdeltractorespiratoriosuperior.Lasmuestrasdebentomarsedelosorificiosnasalesprofundos(hisoponasal),nasofaringe(hisoponasofaríngeo),aspiradonasofaríngeo,gargantaoaspiradobronquial.Todavíanosesabequémuestraclínicaproporcionaelmejorrendimientoeneldiagnóstico.La(s)persona(s)quetome(n)lamuestradebe(n)cumplirconlasprecaucionesapropiadasdetomademuestrasyaquepuede(n)exponerseasecrecionesrespiratoriasdelospacientes.Hastaahora,noexisteningunainformaciónsobreelvalordediagnósticodelasmuestrasnorespiratorias,porejemplo,muestrasdeheces.Muestrasdesueroagudoyconvalecientedebenusarseparaladeteccióndelostítulosascendentesdeanticuerpo.Pruebas de laboratorio  Diagnostico molecular  LosmediosdediagnosticomolecularsonactualmenteelmétodopreferidoparalainfluenzaA(H1N1)linajeporcino(swl)virus(A/California/4/2009yvirussimilares).Elusodeensayoscondiferentesgenesblancosesmásapropiadoparalaidentificacióndeestevirus.Lossiguientesgenesblancossonimportantes:genmatrizdelaInfluenzadetipoA;elgendelahemaglutininaespecíficodelvirusdelaInfluenzaA(H1N1)swlyelgendelahemaglutininaespecíficodelaInfluenzaestacionalAH1/H3yotrossubtipos.

 

Información  de  la  OMS  para  diagnóstico  de  laboratorio  del  nuevo virus de la Influenza A (H1N1) en seres humanos   

Lossiguientesprotocolosestánactualmentedisponibles:PCRconvencionalespecíficoparainfluenzatipoAyRT‐PCRentiemporeal(véaseanexos1y2);RT‐PCRentiemporealdelosCDC(rRT‐PCR)paraladetecciónycaracterizacióndelainfluenzatipoA(H1N1)(versión2009)1ElanálisissecuencialdelproductodelPCRdelgenmatrizdelainfluenzatipoAusandoloscebadoresdelosprotocolosdelaOMS(véaseanexo1)diferenciaráentregenesMdelinajeporcinoyvirusH1N1estacionales.Sinembargo,unanálisisadicionaldebeserrealizadoparaconfirmarelorigendelvirus.Enestemomento,laspruebasdeRT‐PCRconvencionalestánsiendoevaluadas.Unaactualizaciónsepublicarácuandoestedisponible.Aislamiento y tipificación del virus mediante la inhibición de hemaglutinina o la inmunofluorescencia: SepuedenutilizarlosprotocolosvigentesparaelaislamientodevirusdelainfluenzaestacionalusandocélulasdeMDCKeinoculación devirusenhuevosembrionados,aunquesusensibilidadestáaúnpendientededeterminarse(véaseseccióndebioseguridadabajo).Loseritrocitosdepavos,pollos,conejillosdeindiasyhumanosseaglutinaránconelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swl.LosanticuerpospoliclonalesespecíficosparaelsubtipoH1delosvirusdelainfluenzaestacionaldelkitdelaOMSnoreaccionaránconlapruebadeinhibicióndehemaglutinación(HAI)delvirusactualdelainfluenzaA(H1N1).LosresultadosobtenidosutilizandolosanticuerposmonoclonalesH1delkitdelaOMSnodebetomarsecomocomprobaciónconcluyenteyserecomiendarealizarunaverificaciónadicional.Pruebas de inmunofluorescencia rápida:  Lasensibilidadyespecificidaddelaspruebasdeinmunofluorescenciarápidaenellugardeatención,diseñadasparaladeteccióndirectadelosvirusdelainfluenzatipoAsonactualmentedesconocidas.Unaactualizaciónsepublicarácuándoexistaevidenciadisponible.DeberecalcarsequeestaspruebasnodiferenciaránlainfluenzaestacionaldeladelvirusdeinfluenzadetipoA(H1N1)swl.

1 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html

Serología SeesperaquelaspruebasdeHAIylasreaccionesdemicro‐neutralizaciónempleandoelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swlpuedandetectarrespuestasdeanticuerposdespuésdelainfección.Interpretación de los resultados de laboratorio 

• PCR:UnamuestraseconsiderapositivasilosresultadosdelaspruebasusandodosdiferentesblancosdePCR(porejemplo,iniciadoresespecíficosparagenMygenporcinodehemaglutininaH1)sonpositivosperoelPCRparavirushumanoH1+H3esnegativo.SielPCRentiemporeal(RT‐PCR)parahemaglutininamúltiple(HA)(esdecir,H1,H3yH1delinajeporcino)daresultadospositivosenlamismamuestra,laposibilidaddecontaminacióndePCRdebeserprimeramenteexcluidaalrepetirelprocedimientodePCRusandoARNnuevoextraídodelamuestraoriginaloARNextraídodeotramuestra.SiserepitenlosresultadospositivosparalosblancosmúltiplesdeHA,existeentonceslaposibilidaddecoinfección,quedebeconfirmarsemediantesecuenciaciónocultivoviral.ElAnexo3muestraundiagramadeflujoparafacilitarlainterpretacióndelosresultadosdePCR.

• RT‐PCR en tiempo real de los CDC:Losresultadosdebeninterpretarsesegúnlo

descritoenelmanualdepruebasdeH1N1entiemporealdelosCDC.1

• Un resultado de PCR negativo no permite descartar que la persona pueda estar infectada por el virus de la influenza A (H1N1):Losresultadosdebeninterpretarseconjuntamenteconlainformaciónclínicayepidemiológicadisponible.LasmuestrasdelospacientescuyosresultadosdePCRsonnegativosperoparaquieneshayunaaltasospechadeinfecciónconH1N1debeninvestigarsemásafondoyseranalizadasporotrosmétodoscomoelcultivooserologíaviral,paradescartarinfecciónporinfluenzaA(H1N1)swl(véasediagramadeflujoenAnexo3).

• Serología:Unincrementocuádrupleenlosanticuerposneutralizantes

específicosdelvirusdelainfluenzaA(H1N1)indicainfecciónrecienteconelvirus.

• Secuenciación:enestaetapa,lasecuenciacióndealmenosunodelosblancos

esesencialparalaconfirmaciónporPCRconvencional.

• Aislamiento del virus:LaidentificaciónytipificacióndelcultivodevirusdeinfluenzapuedelevarseacaboporPCR,porlatécnicadelanticuerpofluorescenteindirecto(IFA),lapruebausandoanticuerposmonoclonales

específicosdeNP,oelanálisisdeHAyelanálisisantigénico(subtipificación)porHAIusandoantisuerosdereferenciaseleccionados.

Referencia para la confirmación y caracterización adicionales: AloslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddediagnósticodelvirusdelainfluenzaAselesrecomiendaenviarlasmuestrasrepresentativasdeloscasossospechososdeinfluenzaA(H1N1),deacuerdoaladefinicióndecasodelaOMS2,aunodelosCentrosColaboradoresdelaOMSparainfluenza(WHOCCs).LasmuestrasconresultadosdelaboratoriopositivasparainfluenzaAperonosubtipificables(esdecir,negativasparainfluenzaA(H1)yA(H3));seconsiderancomonoconfirmadasdeacuerdoaloscriteriosdelaOMS)debenremitirseaunodelosWHOCCsparalaconfirmación.Loslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddeaislamientodelvirus(oquenotenganelnivelnecesariodemedidasdebioseguridad)debenremitirlasmuestrasacualquieradelosWHOCCs.EnadiciónalosreglamentospertinentesdeIATA,sedebenseguirlasnormasordinariasdealmacenamiento,envasadoyenvíodemuestrasdeinfluenza.Bioseguridad EltrabajodelaboratorioconmuestrasclínicasdepacientesconsideradoscomocasossospechososdeinfecciónporvirusdeinfluenzaA(H1N1)swlsedebenrealizaraplicandolasnormasyprocedimientosdeniveldebioseguridad2utilizandoelequipodeprotecciónpersonalapropiado(PPE).Todamanipulacióndemuestrasdebehacersedentrodeunacabinadebioseguridadcertificada(BSC).VerManualdebioseguridadenellaboratoriodelaOMS,3.ªed.3Actualmente,elaislamientoviralrequieremayoresmedidasdebioseguridad.Paralasrecomendacionesespecíficasver:GestióndelosriesgosbiológicosenloslaboratoriosdondesemanipulanmuestrashumanasquecontienenopuedencontenerelvirusdelagripeA(H1N1)queestácausandolasactualesepidemiasinternacionales.4

2 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/interim_guidance/en/index.html 3 http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/ 4 http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/swineflu/Laboratorybioriskmanagement_es.pdf

Prueba de los algoritmos ElmétodogeneraldeladeteccióndevirusdelainfluenzaporPCR‐RTdebeconsiderarseenelcontextodelasituaciónnacional,porejemplo,cuántasmuestraspuedenprocesarse(producto),elblancoutilizadoparalasecuenciadelgenporPCR‐RT,ysiseutilizalacomprobaciónconcurrenteosecuencialdeM,NPygenesdeHAporPCR‐RT.Buenas prácticas de laboratorio Losprotocolosestándarparatodoslosprocedimientosdebenexistiryserrevisadosregularmente.Esfundamentalasegurarsequelosreactivosrecomendadosseusenymanejenadecuadamenteyaquelasreaccionessoncomplejasyproblemasinclusosóloconunreactivopuedentenerefectossignificativossobrelosresultadosobtenidos.Validación Todoslosprotocolosdebenservalidadosencadaunodeloslaboratoriosparaevaluarquesuespecificidadysensibilidadalusarlosmismoscontrolesencadarondaseanadecuadas.Aseguramiento de la calidad Losprotocolosdeaseguramientodelacalidadybuenasprácticasdelaboratoriodebenexistir.LaparticipaciónenlosejerciciosdeevaluacióndelosCentrosNacionalesdeInfluenza(Proyectodeevaluaciónexternadelacalidad)esaltamenterecomendadaparaconfirmarqueloslaboratoriosestánalcanzandounniveladecuadodesensibilidadyespecificidadensuspruebas.Capacitación del personal Lafamiliaridaddelpersonalconlosprotocolosyexperienciaenlainterpretacióncorrectadelosresultadossonpiedrasangularesparalaejecuciónexitosadelaspruebasdiagnósticas.Instalaciones y áreas de manejo Debenexistirinstalacionesadecuadasparaelmanejodemuestrasyreactivos(incluyendocadenasdefrío)conunaseparaciónapropiadaparalasdiferentesetapasdeRT‐PCRafindeprevenirlacontaminacióncruzada.Lasinstalacionesyelequipodebencumplirconelniveldebioseguridadapropiado.ElRT‐PCRdeberealizarseenunespacioseparadodelusadoparalastécnicasdeaislamientodevirus.

Equipo Elequipodeequipodebeusarseymantenersedeacuerdoalasrecomendacionesdelfabricante.Anexo 1:   Análisis de RT‐PCR convencional del gen matriz de los virus de Influenza de tipo A Protocolo Convencional de RT‐PCR 5 Acontinuaciónsepresentanlosprotocolosycebadores(oprimers)dePCRconvencionalyelectroforesisengeldeproductosparadetectarvirusdeinfluenzatipoAenmuestrasdesereshumanos.EstosprotocoloshandemostradoserampliamenteefectivosparalaidentificacióndelvirusdeinfluenzadetipoAcuandoselesutilizaconlosreactivosycebadoresindicados.SerecomiendaqueloslaboratoriosquetengandudassobrelaidentificacióndelosvirusactualmentecirculantescontactaraunodelosLaboratoriosdeReferenciaH5delaOMS6oaunodeWHOCCsparalainfluenza7afinderecibirayudaparalaidentificacióndeloscebadoresóptimosparasuusoMateriales requeridos • QIAamp®ViralRNAMiniKit(QIAGEN,Cat#52904.Otroskitsdeextracciónpueden

serusadosdespuésdehabersidosujetosaunaevaluaciónapropiada).• OneStepRT‐PCRKit(QIAGEN,,Cat#210212)• InhibidordeRNase20U/μl（AppliedBiosystems,Cat#N8080119）• Aguadestilada(libredeRNase)• Ethanol(96–100%)• Microcentrífuga(ajustablehasta13000rpm)• Pipetasajustables(10,20,200,and100μl）• Puntasparapipetaestériles(libresdeRNase)conbarreradeaerosol• Vortex• Tubosparamicrocentrífuga（0.2,1.5ml）• Termociclador(equipodePCR)• Conjuntodecebadores• Controlpositivo(estepuedesolicitarsealWHOCCenlosCDCdeAtlanta,EEUU)

5 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China (WHO H5 Reference Laboratory). 6 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/ 7 http://www.who.int/csr/disease/influenza/collabcentres/en/

Cebadores Gen:MVirusInfluenzaASecuenciasdecebadoresM30F2/08: 5`‐ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG‐3`M264R3/08: 5`‐TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG‐3`Tamañoesperadodelproducto244bp(referencia:NIID8) Procedimiento 

1. ExtraerARNviraldelamuestraclínicaconelMiniKitQIAampViralRNAokitdeextracciónequivalente,deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante.

2. RealiceelRT‐PCRdeunaetapa.• Sacarlosreactivosdesualmacén,déjelosdescongelaratemperatura

ambiente.Unavezdescongelados,manténgalosenhielo.• Prepararlamezclamaestra(operadaenhielo)• Agregarlosiguienteauntuboparacentrífugaymezclarlobien

agitándoloparaarribayparabajo10veces,(Nota:Afindeevitardiferenciaslocalizadasenlaconcentracióndesales,esmuyimportantemezclarlassolucionesantesdesuuso).

Reacción sin solución Q Aguadestilada(sinRNasa)9.5μlAmortiguador5xQIAGENRT‐PCR5.0μlMezcladedNTP1.0μlCebadorsentido(+)(10μM)1.5μlCebadorantisentido(‐)(10μM)1.5μlMezclaenzimática1.0μlInhibidordelaRNasa(20U/μl)0.5μlVolumentotal20.0μl/pruebaDistribuir20μldelamezclamaestraencadatubodereaccióndePCR.Añadir5μldeRNAdelamuestraalamezclamaestra.Paralasreaccionesdecontrol,usar5 μldeaguadestiladalibredeRNaseparacontrolnegativoy5μldelosRNAviralesadecuadosparacontrolpositivo.Programareltermocicladordeacuerdoalascondicionesdetermociclado.IniciarelprogramadeRT‐PCRmientraslostubosdePCRseencuentrenaúnenelhielo.Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzadolos50˚C.LuegocolocarlostubosdePCReneltermociclador.

8 Primers designed by Laboratory at National Institute of Infectious Diseases (NIID), Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)

Condiciones de ciclado de la temperatura para PCR Transcripcióninversa30min,50°CActivacióndelaPCRinicial15min,95°CCicladoentresetapasDesnaturalización30seg,94°CTemplado30seg,50°CExtensión1min,72°CNúmerodeciclos45Extensiónfinal10min,72°CMantener4°C3.   Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT‐PCR Prepararelgeldeagarosa,cargarlosproductosdePCRyelmarcadordepesomolecular,ejecutardeacuerdoconlosprotocolosestándar.Visualizarlapresenciadelmarcadorconluzultravioleta.Materiales requeridos • Bandejaparageldeagarosaycámaradeelectroforesis• Suministroeléctricoyelectrodos• CajadeluzUV(302nm)• CámaraypelículaPolaroidocomputadoraconectadaalacámara• Pipetasajustables• Geldeagarosaal2%en1×TAE• Amortiguador1×TAE• Bromurodeetidio(10mg/ml)• 6xSoluciónamortiguadoraconcargadegel(GLB)Procedimiento A)Fundirungeldeagarosa:I. Colocarunabandejaparafundicióndelgeldentrodeunabaseparafundiciónde

gel.Inserteunpeineynivelelabase.II. Prepararagarosaal2%pesando4gdepolvodeagarosaydisuélvalaen200ml1×

amortiguadorTAE.Disuelvaelagarcalentándoloenhornodemicroondas.III. Enfriarelagarderretidohastaaproximadamente60°C,yluegoagregue10μlde

bromurodeetidio.IV. Verterlaagarosaderretidaenunabandejaparafundicióndegel.V. Dejarqueelgelsesolidifiqueatemperaturaambiente.VI. Retirarelpeinedelmarco.

VII. Colocarlabandejadentrodelacámaradeelectroforesisconlasfosasdelladodeloscátodos.

VIII. Llenarlacámaraamortiguadoracon1×TAEaunnivelquepuedacubrirlapartesuperiordelgel.

B)Cargadelasmuestras:I. Agregar5μldeGLBdePCR.II. Cargarelmarcadordepesomolecularenlafosadelgeldeagarosa.III. Pipetear15μldelproductodePCR/GLBenelgel.IV. Cerrarlatapadelacámarayconecteloselectrodos.Correrelgela100Vdurante

30–35min.V. VisualizarlapresenciadebandasdemarcadoresyproductosdePCRconluzUV.VI. Documentarlaimagendelgelconunafotografía.Interpretación de los resultados EltamañodelosproductosdePCRobtenidosdebecompararseconeltamañoesperadodelosproductos.Silapruebaseejecutasinuncontrolpositivo,losproductosdebenserconfirmadosmediantesecuenciaciónycomparaciónconlassecuenciasdisponibles.Anexo 2: Análisis de RT‐PCR en tiempo real de la matriz de los virus de Influenza de tipo A LaRTPCRentiemporealpresentadiferentesdesafíosencomparaciónconlaRT‐PCRconvencional.AdemásdelasconsideracionessobreRT‐PCRdescritasenelAnexo1,lasconsideracionesespecíficasparaRT‐PCRentiemporealincluyen:• Garantizarqueseusenymanipulencorrectamentelosequipos,elsoftwareylos

reactivosparafluorescenciaadecuados.• Garantizarlacapacitaciónadecuadadelpersonalparalainterpretacióndelos

resultados(esesenciallaexperienciaparareconocerlosverdaderospositivos,interpretacióndeloscontroles/valorCtyfluorescenciaaberrante,etc.).

• Parahacerdeterminacionescuantitativas,esesenciallavalidaciónenellaboratorioylaoptimizacióndelasreacciones.

• Haypocaprobabilidaddecontaminacióncuandosedescartanlasreaccionesdespuésderealizarlaspruebas.Sinembargo,muchoslaboratorioshacenanálisispostreacciónadicionales(porej.,polimorfismodelongituddefragmentosderestricciónusandogeles,secuenciación)quepuedenreintroducirlacontaminación.

Protocolo de RT‐PCR en tiempo real9 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicosegúnsedescribeenelAnexo1:AnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos TranscripciónInversaAmortiguadorI10XPCRcon15mMMgCl(AppliedBiosystems)Hexámeroaleatorio50μM(AppliedBiosystems)TranscriptasaInversadeMuLV50U/μl(AppliedBiosystems)InhibidordelaRNasa20U/μl(AppliedBiosystems)PCRentiemporealKitLightCycler®–FastStart™DNAMasterHybProbes(Roche)Cebadoresymezcladesondas:AgregarigualvolumendelossiguientescomponentesparaprepararloscebadoresylamezcladesondasparaH5ygenMCebadoresysondasVirusdeinfluenzatipoASecuenciadecebadoresFLUAM‐1F:5'‐AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2F:5'‐CATTGGGATCTTGCACTTGATATT‐3'(10μmol/l)FLUAM‐1R:5'‐CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2R:5'‐AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA‐3'(10μmol/l)FLUA‐1P:5'‐(FAM)‐TTTGTGTTCACGCTCACCGT‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)FLUA‐2P:5'‐(FAM)‐TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)Elcebadoractivoylamezcladesondassepreparamezclandolos6reactivosenvolúmenesiguales.

9 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China, WHO H5 Reference Laboratory

Procedimiento 1.RealizarRTutilizandolosreactivosquesemuestranenlasiguientetablaylasinstrucciones1‐3alcalcedelatabla.

Reactivo Volumen(μl)porreacciónAmortiguador10xPCRIcon15mmol/lMgCl2 2Extra25mmol/lMgCl2 2.82.5mmol/ldNTPs 8Hemámeroaleatorio50μM 1InhibidordelaARNasa20U/μl 1TranscriptasaInversa50U/μl 1ARNextraído 4.2

I. AgitarenVortexycentrifugareltuboconlamezclabrevemente(aprox.3seg.)II. Mantenereltuboatemperaturaambientedurante10minutosyluegoincubara

42°Cporlomenosdurante15minutosIII. Incubareltuboa95°Cdurante5minutosyluegoenfriarenhielo.

2.RealizarPCRentiemporeal

I. Prepararlamezcladereacción“HotStart”pipeteandosuavemente60μldeSondasdeHibridaciónparaMezcladeReacciónLC‐FastStart™(frascoampolla1b)enelLC‐EnzimaFastStart™(frascoampolla1a).

II. Paracadamuestradepruebaycontrolespositivosynegativos,prepararlamezcladelreactivoconcebadoresymezcladesondasdeacuerdoconlosiguiente

Mezclamaestra:

Reactivo Volumen(μl)H2OgradoPCR 7.6MgCl2(25mmol/l) 2.4Cebadoresymezclaparasondas 3Mezclaparareacción“HotStart” 2Volumentotal 15Cadareacción:Mezclamaestra 15ADNc: 5

CondicionesdecicladodelatemperaturadePCR

Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)

No.deciclos

95 10:00 195 0:1056 0:1572 0:10

}50

40 0:30 1Protocolo de RT‐PCR en tiempo real10 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicocomosedescribeenAnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos • QIAGEN®QuantiTect,EquipodeSondaparaRT‐PCR(#204443):

o 2xQuantiTect®,MezclaMaestradeSondadeRT‐PCRo QuantiTect®,MezclaRTo AguasinRNasa

• InhibidordelaARNasa• Cebadores• SondaTaqMan®MGB• Equipo:SistemadeDeteccióndePCRentiemporealChromo‐4™(BioRad);

LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)PCRentiemporealLaPCRentiemporealserealizamedianteRT‐PCRdeunsolopasousandounasondaTaqMan®Cebadoresysondas:Gen:TipoA(M)SecuenciasdecebadoresMP‐39‐67For 5'‐CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC‐3'(10μmol/l)MP‐183‐153Rev 5'‐TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA‐3'(10μmol/l)

10 Protocol provided by National Institute of Infectious Diseases (NIID), Center for Influenza Virus Research, Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza).

SecuenciadesondasMP‐96‐75ProbeAs 5'(FAM)‐ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG‐(MGB)‐3'(5pmol/μl)MezcladeReacción

Reactivo Volumen(μl)MezclaMaestraparaSondadeRT‐PCR2xQuantiTect® 12.5CebadorDirecto(10μM) 1.5CebadorInverso(10μM) 1.5SondaTaqMan®MGB(5pmol/μl) 0.5MezclaQuantiTect® 0.25AguasinRNasa 3.75Total 20Procedimiento 

1) Distribuir20μldelamezcladereacciónencadaplacadereacciónparaRT‐PCR.

2) Agregar5μlARNdemuestraalamezcladereacción.Parareaccionesdecontrol,usar5μldeaguadestiladaparacontrolnegativo,y5μldeARNviralespositivosadecuadosparacontrolpositivo.

3) Programareltermocicladordeacuerdoconelprogramaquesedescribeacontinuación.

4) IniciarelprogramadeRT‐PCRentiemporealmientrasquelasplacasdereacciónparaRT‐PCRtodavíaestánenhielo.

5) Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzado50C.Luego,colocarlasplacasdereacciónparaRT‐PCReneltermociclador.

CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:SistemadedeteccióndePCRChromo‐4‐Real‐time(BioRad)

Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)

No.deciclos

50 30:00 195 15:00 194 0:1556 1:00

}45

CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)

Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)

No.deciclos

50 30:00 195 15:00 194 0:15

(ramprate1.2oC/seg)56 1:00

(ramprate1.2oC/seg)Recopilacióndedatos

}45

Anexo 3: Algoritmo de prueba por PCR e interpretación de resultados