IMPREGNACIONES ARGENTICAS
TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ
Qué son?
Solución salina de sal metálica y la precipitación
del metal (plata, oro o cromo) reducida
fibras reticulares y otros elementos
determinados de los tejidos.
la reducción de la solución es debida en
parte a la acción propia del tejido y a la
de sustancias reductoras utilizadas en
cada técnica o a agentes físicos como la
luz.
• El metal forma un compuesto metal-orgánico
para sensibilizar el tejido y luego la plata
reemplaza ese metal. La plata amoniacal es la
que impregna las fibras reticulares. Ese metal
sensibilizante puede:
• nitrato de uranilo (Técnica de Wilder)
• nitrato de plata diluida (Técnica de Gridley)
• aluminio férrico (Técnica de Gomori)
Recomendaciones
• Portaobjetos: éstos deben ser silanizados,
pues las soluciones de plata suelen ser
alcalinas lo que favorece el desprendimiento
de los cortes.
• No utilizar pinzas metálicas (tipo pato para
manipular las láminas), pues al contacto con
metal la plata se reduce.
• Usar reactivos pro análisis
• Usar agua destilada de buena calidad. La
calidad del agua se chequea agregando un
grano de plata al agua, si se vuelve lechosa
desecharla.
• Lavado de material de vidrio acucioso.
• Para la utilización de reactivos como el
amoníaco, hacerlo siempre bajo campana, no
pipetear ácidos ni bases fuertes.
• Para las soluciones amoniacales eliminar
INMEDIATAMENTE aquellas donde se ha
formado un cristal negro brillante.
• Mantener las soluciones de plata simples en
frascos ambar, bien tapados y rotulados a 4°c
• Evitar luz directa en soluciones y polvos de
plata.
• Eliminar soluciones de plata precipitadas
• La impregnación argéntica se basa en la
interacción de determinadas estructuras
del tejido con los iones Ag+ y la
capacidad de éstas estructuras de
formar puntos de nucleación de Ag°
metálica.
MECANISMOS
1.- Predominantemente físicos y físico –
químicos
mecanismo puro de impregnación
mecanismo electroestático iones de plata
cargados + = argirofilia
2.- Impregnación por mecanismos
histoquímicos.
PROTOCOLOS
• Impregnación argéntica en dos pasos
• Impregnación argéntica en un paso
Un Paso
• Nitrato de plata
• Reducción con hidroquinona brusca
• Las técnicas de Bodian para neurifibrillas y la
de Grimelius para argirofilia son
impregnaciones argénticas de un tiempo.
Dos pasos
• 1ra reducción Nitrato de plata a oxido de
plata.
• Impregnación del tejido con solución de
impregnación
• Reducción con formalina
Dos Pasos
1. Impregnación primaria:
Solución de nitrato de plata (plata amoniacal,
diamina de plata, proteinato de plata), la Ag
es captada por ciertos tejidos, donde se
forman puntos de nucleación de la plata.
Dos pasos
• 2.- Impregnación secundaria:
• Se coloca un agente reductor, puntos de
nucleación se genera Ag°
• Hidroquinona
• formalina
Pasos
• 1.- Mordentación: Bouin. Oxidación
• 2.- Blanqueamiento: ác. Oxálico, Metabisulfito
• 3.- Impregnación: de 1 / 2 tiempos
• 4.- Reducción: 1 tiempo hidroquinona
2 tiempos formalina
• 5.- Contraste: cloruro de oro
• Fijación: tiosulfato
Estructuras Argentafines
• La capacidad de algunas estructuras de
precipitar la plata metálica en un paso único
sin necesidad de agentes reductores externos
se denomina argentafinidad.
• Son argentafines la melanina y algunas células
endocrinas (granulaciones entero dromafines)
.
Argentafines
• El mecanismo preciso que desencadena esta
reacción no está del todo claro, pero parece
depender de la presencia de 5-
hidroxitriptamina la que es convertida a
terahidro-4-carbonila por el formol. Todas las
estructuras argentafines son argirófilas, pero
no al revés Se demuestran con tinciones como
Masson- Fontana.
Estructuras Argirofilas
• La capacidad de atraer iones plata e
impregnarse con plata metálica en los
protocolos se denomina argirofilia. Estos iones
plata atraídos al tejido son posteriomente
precipitados a plata metálica por reductores
externos (hidroquinona por ejemplo).
• Se demuestran en tinciónes de Bielchowsky,
Sevier-Munger y Grimelius
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
Es una técnica de dos tiempos.
Oxidante: permanganato de potasio
Blanqueamiento: metabisulfito de potasio
Mordentador: alumbre férrico
Reductor: formol
Plata: plata amoniacal
Fijador: hiposulfito de sodio
• El permanganato oxida grupos HO de la fibra
reticular a CHO, y éstos son argirofilos a la
plata se fija la plata por ADORCION
.-
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
• Permanganato de potasio 1% acuoso
• Metabisulfito de potasio 2% acuoso
• Alumbre férrico acuoso 2% (preparar antes de
usar)
• Formalina 10%
• Hiposulfito de sodio acuoso al 2%
.-
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
• Plata amoniacal. Se toman 10 ml de nitrato de
plata al 10%, se añaden 2 ml de hidróxido de
potasio al 10%, se debe formar un precipitado
el que se disuelve agregando gota a gota
amoniaco puro, agitar permanentemente y
bajo campana; después de añade unas gotas
de nitrato de plata hasta que empiece a
formarse un nuevo precipitado, diluir al doble
con agua destilada.
Platas Amoniacales
• Las platas amoniacales se descompone
generando vapores altamente
explosivos. Tener extremo cuidado con el
manejo y eliminación de cristales de
plata generados.
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
• PROTOCOLO
• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
• Oxidar durante 1 a 2 min con permanganato
• Lavar con agua corriente
• Blanquear con metabisulfito
• Lavar con abundante agua corriente
• Tratar con alumbre por 1 minuto
• Lavar con agua corriente 5 min
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
• Lavar con agua destilada 2 veces
• Tratar por 1 minuto con plata amoniacal
• Lavar con agua destilada 10 segundos
• Reducir con formol
• Lavar con agua corriente
• Hiposulfito algunos segundos
• Lavar con agua corriente
• Deshidratar, aclarar y montar
METODO DE GOMORI PARA
FIBRAS RETICULARES
• RESULTADOS
• Fibras reticulares negras
• Fibras colágenas y fondo amarillo
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• Impregnación argéntica en dos tiempos.
• Reductor: formol
• Blanqueamiento: acido oxálico
• Contraste: cloruro de oro.
• Plata: plata amoniacal
• Oxidante: permanganato
• Fijador: tiosulfato
• Mordentador: alumbre de hierro
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• SOLUCIONES
• 1.- Baño argéntico de Wilder.
• -nitrato de plata 1% acuoso
• -hidróxido de sodio 3% acuoso
• Se toman 5 ml de nitrato de plata; añadir gota a gota
amoniaco puro hasta que desaparezca el precipitado
formado; agragar 5 ml de hidróxido (se forma un
nuevo precipitado) y volver a agregar amoniaco puro
gota a gota hasta disolver el precipitado, completar
hasta 50 ml con agua destilada.
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• Cloruro de oro 0,02gra en 10 ml de agua
destilada.
• Acido oxálico 5% acuoso
• Alumbre de hierro 2% acuoso
• Tiosulfato de sodio 5% acuoso
• Mezclar 47,5 ml de permanganato de potasio
al 5% acuoso con 2,5 ml de ácido sulfúrico 3%
acuoso.
• Formalina 10%
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• PROTOCOLO
• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
• Oxidar por 5 min
• Lavar con agua destilada
• Blanquear por 1 min
• Lavar en tres cambios de agua destilada
• Tratar con mordiente por 30 min
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• Lavar en dos cambios de agua destilada
• Solución de plata durante algunos segundos
• Lavar en agua destilada
• Reducir con Formalina 10 min
• Lavar en agua
• Cloruro de oro 5 min
• Lavar en agua destilada
• Fijar con hiposulfito
• Agua destilada, Deshidratar, aclarar y montar
• Si quedan débilmente teñidas, repetir desde 7
METODO DE GORDON SWEET
PARA FIBRAS RETICULARES
• RESULTADOS
• Fibras reticulares negras azuladas
• Resto sin teñir
Gordon Sweet
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
Impregnación argéntica en dos tiempo.
El amoniaco realiza la primera reducción el nitrato de
plata a óxido diamino argéntico y el tejido la
segunda, precipitando la plata metálica sobre las
granulaciones con capacidad reductora.
•
• La principal dificultad de la técnica se
encuentra en la preparación de las soluciones,
dado que es importante encontrar el punto en
que la plata esta apunto de precipitar sin que
llegue en realidad a hacerlo.
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
• SOLUCIONES
• Solución de Fontana
• A 95 ml de nitrato de plata al 5%, añadir
hidróxido de amoniaco hasta obtener una
solución clara sin precipitados. Luego añadir
gota a gota los restantes 5 ml de nitrato de
plata al 5% hasta que la solución se torne
ligeramente turbia. Dejar reposar por 1 a 2
horas antes de usar.
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
• Cloruro de oro 1%, tomar 10 ml y completar
hasta 50 ml con agua destilada.
• Tiosulfato de sodio 5% acuoso
• Rojo nuclear rápido
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
• Incubar en solución de plata a 56°c por 1 hora
o bien 24 a 48 horas a temperatura ambiente
a la oscuridad. Los cortes toman un color
marrón claro.
• Lavar en agua destilada
• Cloruro de oro 5 min
• Lavar tres veces en agua destilada
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
• Tiosulfato 5 min
• Lavar
• Contraste 5 min
• Lavar
• Deshidratar, aclarar y montar.
TECNICA DE MASSON FONTANA
PARA ARGENTAFINIDAD
• RESULTADOS
• Sustancias reductoras de plata negras
• Núcleos y fondo rosa
MF sobre teñida, inespecifica
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
Impregnación argéntica de un tiempo
La reducción del nitrato de plata es con
hidroquinona.
Se recomienda post fijar las muestras en Bouin.
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
• SOLUCIONES
• Tampon acetato 0,1M pH 5,8 (ver guía de TH)
• Solución de impregnación.
• Nitrato de plata 0,5% en tampón acetato
• Solución reductora de Bodian.
• Sulfito de sodio anhidro 5g + hidroquinona 1+
en 100 ml de agua destilada
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
• Solución fijadora
Tiosulfato de sodio 2%
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
• Desparafinar e hidratar hasta en agua
destilada
• Lavar 4 veces en agua destilada
• Solución de impregnación por 3 horas a 60°c
• Solución reductora de Bodian por 5 min a
60°c. Debe aparecer color negro.
• Lava r en agua destilada
• Fijar por 30 segundos
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
• Solución de impregnacion 30 min a T.
ambiente
• Transferir a Solución Bodian por 5 minutos
(recién preparada)
• Lavar
• Fijar 20 segundos
• Lavar
• Deshidratar, aclarar y montar.
•
TECNICA DE GRIMELIUS PARA
ARGIROFILIA
• RESULTADOS
Células argirófilas negro
Células alfa 2 de islotes de pancreáticos
negro
Grimelius
Organización
• sistema nervioso central (SNC): cerebro y
médula espinal
• sistema nervioso periférico (SNP): nervios
craneales que surgen del encéfalo, nervios
raquídeos que surgen de la médula espinal y
ganglios relacionados.
• neuronas, que son las encargadas de las
funciones receptoras, integradoras y motoras
del sistema nervioso, y
• células de la neuroglía, que son las
encargadas de brindar sostén y nutrición a las
neuronas.
• Neuronas: Son las encargadas de la recepción
en la transmisión de los impulsos nerviosos
hacia el SNC y desde éste son las neuronas. La
mayor parte de las neuronas están
compuestas por tres partes definidas: un
cuerpo celular, múltiples dendritas y un solo
axón.
Células Neuroglia
• Su función es el sostén metabólico y mecánico
y la protección de las neuronas. Las células de
la neuroglia que residen exclusivamente en el
SNC son:
• Astrocitos
• Oligodendrocitos:
• Células de microglia
• Células ependimarias:
• Células de Shwann
Enfermedad de Parkinson
• Enfermedad neurodegenerativa que se
produce por la pérdida de neuronas en la
sustancia negra cerebral, lo que ocasiona
problemas de coordinación motora.
• En un laboratorio de neuropatología su
diagnóstico entraña cierta dificultad: se
emplean más bien en la diagnosis criterios
motrices y tomografía por emisión de
positrones como análisis de imagen.
Enfermedad Creutzfeldt- Jakob
• La nueva variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) es un mal
neurológico con formas genéticas hereditarias
y también contagiosas, producidas por una
proteína llamada prión (PrP) que se pliega de
forma anómala; dicha alteración en la
conformación de la estructura de la PrP
provoca la muerte neuronal y, por tanto la
destrucción de masa encefálica,
especialmente en el tálamo
Enfermedad Creutzfeldt- Jakob
• Más adelante, la enfermedad cursa con
proliferación glial. Ambos hechos
proporcionan un aspecto espongiforme a los
encéfalos afectados.
• Para su diagnóstico se emplean técnicas de
inmunohistoquímica con anticuerpos
monoclonales específicos, o, en casos graves,
simplemente tinciones de rutina. Se muestrea
mediante biopsia de la corteza, núcleos
basales o tálamo
• Los priones “sobreviven” en formalina.
• Resistentes a solventes orgánicos, calor,
enzimas, frio, autolisis.
• Sensibles a autoclave 121°c por 1 hora
• Enfermedad siempre se curso fatal
• Período de latencia de hasta 20 años
• Las muestras se fijan por 48 horas a 10 días, ,
luego formalina con fenol por 72 horas. Hasta
este punto el prion aun no esta inactivo.
• Solución de ácido fórmico por 48 horas y
luego 1 hora en hidróxido de sodio 2N y
después el histoprocesamiento normal.
Enfermedad de AlzaheimerEnfermedad neurodegenerativa que se
manifiesta como deterioro cognitivo y
trastornos conductuales. Se caracteriza en su
forma típica por una pérdida progresiva de la
memoria y de otras capacidades mentales, a
medida que las neuronas mueren y diferentes
zonas del cerebro se atrofian.
• Se diagnostica mediante pruebas
conductuales, electroencefalografía y
mediante procesamiento histológico de tejido
extraído en autopsia
Placas seniles en paciente con
Alzahimer. Plata
Alzheimer
• Técnica de PAS
modificada.
• Se evidencias
numerosas placas
seniles (PAS+)entre las
neurofibrillas
Alzheimer
• Detalle de una placa
senil “clásica”, teñida
con PAS modificado.
Alzheimer
• Técnina realizada en
MW. Muchas placas
seniles se observan.
• Tec. Bielschowsky
IDENTIFICACION DE TEJIDO
NERVIOSO
1. Coloraciones No argénticas:
Coloración para neuronas y gránulos de Nissl
Métodos de coloración para glia
Coloración para vainas de mielina
2. Coloraciones Argénticas:
Identificación de neurofibrillas
Para tejido nervioso en general
Coloración para neuronas y
gránulos de Nissl
• Los gránulos de Nissl son acúmuos de retículo
endoplasmico rugoso (ARN ribosómico y
mensajero) en el citoplasma de neuronas.
• Para identificarlos se utilizan colorantes
básicos de anilina (azul de metileno, azul de
toluidina, tionina, violeta de cresilo, etc).
• Estos colorantes se unen por un mecanismo
fisicoquímico a los ácidos nucleicos por
atracción electroestática.
TECNICA DE NISSL
SOLUCIONES
Tampón acetato pH 3,8 -4(ver guía de TH)
Solución de Violeta de cresilo 0,5 g en 100 ml de
tampón acetato pH 3,8 -4
T. De Nissl
PROCEDIMIENTO
• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
• Violeta de cresilo por 10 min
• Lavar en tampón
• Deshidratar, aclarar y montar
T. De Nissl
RESULTADOS:
• Granos de Nissl y núcleos violeta
• Células nerviosas azul tenue
• Resto del tejido no se tiñe
Violeta de cresilo
TECNICA DE AZUL DE TOLUIDINA
PARA GRANULOS DE NISSL
• SOLUCIONES
Tampon ácido acético – acetato pH 4,2 (ver guía
TH)
Azul de toluidina 0,5% en tampón anterior
Solución acuosa de molibdato de amónico 4%
• PROCEDIMIENTO
• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
• Azul de toluidina por 5 a 10 min
• Lavar en tampón
• Tratar por 10 min en molibdato
• Lavar en agua corriente por 10 min
• Deshidratar y montar en MEDIO ACUOSO
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
• El Luxol es derivado de las ftalocianinas, es
insoluble en agua pero muy soluble en ciertos
disolventes orgánicos. Se postula la coloración
es debida a una atracción físico química d de
la colina y la función ácida sulfonada del
colorante luxol. Para otros autores, el luxol
tendría gran apetencia por los fosfolípidos y la
coloración sería por disolución.
Luxol y solvente
• Solvente Apetencia
• Etanol Fosfatidilserina y fosfadilcolina
• Isopropanol Todos los fosfolipidos
• Metanol No colorea
• Isobutanol Todos los fosfolípidos excepto
esfingomielina
• Cloroformo esfingomielina
•
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
• SOLUCIONES
Luxol Fast blue 0,1% en alcohol 96%, añadir
ácido acético glacial 10% 0,5 ml
Violeta de cresilo 0,1% en agua destilada, antes
de usar agregar 10 gotas de ácido acético
glacial al 10%
Carbonato de litio 0,5%
Alcohol etílico 70%
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
PROCEDIMIENTO
1.- Desparafinar e hidratar hasta alcohol 96%
2.- Solución de luxol 60°c toda la noche
3.- Eliminar exceso de colorante con alcohol
96%
4.- Pasar por agua destilada rápido
5.- Diferenciación rápida con Carbonato de litio
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
6.- Continuar diferenciación con alcohol 70%
7.- lavar agua destilada
8.- Terminar diferenciación con carbonato de
litio, continuar con varios cambios de alcohol
70% hasta que el azul verdoso de la
susutancia blanca contraste con el de la
sustancia gris.
9.- Aclarar rápidamente en agua destilada
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
10.- mantener la preparación en 10 in de Violeta
de cresilo. Filtrar y precalentar la solución de
violeta de cresilo.
11.- Deshidratar en varios cambios de alcohol de
96%
12.- Alcohol absoluto
13.- Xilol y montar
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
• RESULTADOS
Vainas de mielina azul o verde
azuladas
Neuronas y gránulos de Nissl violeta a
rosadas
TECNICA DE LUXOL FAST BLUE
METODO DE KLUVER BARRERA
Luxol fast blue
Corte de médula.
Luxol Fast Blue
Detalle imagen anterior, se ve claramente el detalle de la mielina
Técnica de Bodian
• Fibra nerviosa de negro
y cuerpo neuronal es un
“artefacto”, se ve
espacio.
Técnica de Bodian
• Cerebelo con técnica de
Bodian y contraste de
azul de anilina.
Técnica de Sevier Munger
• Cerebelo, se observan
celulas de Purkinje y
otras fibras en la
sección.
• Argirofilia.
Oligodendroglioma
Oligodendroglioma Rio
Hortega
Nitrato de plata de Holmes
• Fibra nerviosa negra y
cuerpo neuronal como
espacio artefactual.
Holmes + Luxol fast blue
Técnica de Holzer
Se identifican células gliales con cristal violeta resistentes a decoloración, utiliza HPA
Técnica de Cajal
Astrocitos, cercanos a membrana basal de un capilar.