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Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en
la Respuesta Celular al Estrés
Rosa M. Marion
Erin K. O’Shea LabHoward Hughes Medical Institute
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oxygen availability,temperature,salt concentration,DNA damaging agents,nutrient starvation,pH………..
signaling pathway
stress inducedgene expression
program
STRESS!!!!!!!!STRESS!!!!!!!!
transcriptionfactor
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~200
~6000
Transcriptional Regulatory NetworksTranscriptional Regulatory Networks
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The transcriptional response to stress
ESRrepressed
ESRinduced
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Transcriptional Regulatory NetworksTranscriptional Regulatory Networks
Transcription factor-GFP fusion
Change in localization?
STRESSSTRESS
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Construction of a yeast TF-GFP library
251 known or predicted transcription factors
172 had detectable fluorescent signal (70%)
137 nuclear (80%)35 cytoplasmic (20%)
-live cells, no fixation needed-endogenous promoter
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1
24
2
23
3
22
4
21
5
20
6
19
7
18
8
17
9
16 15
10
14
11
13
12
Msn2-GFP
0.5 M NaCl
Large-Scale Analysis of Transcription Factor Subcellular
Localization Upon Stress
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0.4 mM H202
Sfp1-GFP relocalizes in response to different stresses
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Before stress
Afterstress
0.1%MMS2mM DTT0.5 M NaCl
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Sfp1 controls ribosomal biogenesis
Jorgensen P. and Tyers M. Science (2002)
sfp1 has a very small cell size (~40% smaller than WT)and overexpression increases cell size
propose that Sfp1 is a regulator of genes involved inribosome biogenesis
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Regulation of ribosome biosynthesis
200000 ribosomes /cell 2000ribosomes/minute70% splicing activity
-Involves the activity of Pol I, Pol II and Pol III
-Regulated mainly at the level of transcription: transcription of genes involved in ribosome biosynthesis is tightly coordinated
-It consumes an enormous amount of the cell’s resources:
RNA:80%rRNA (60% of total transcription) 15%tRNA 5% mRNA (50% pol II activity dedicated to RP)
Ribosome formation is coupled with the protein-synthetic needs of the cell and the availability of nutrients
Not known how signaling pathways regulate RP gene expression
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nuclear Sfp1
cytosolic Sfp1 ribosomal gene transcription
ribosomal genetranscription
ON
OFF
Does Sfp1 localization correlate with RP gene expression?
HYPOTHESIS: Sfp1 is a regulator of ribosomal gene expression
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Regulation of ribosomal protein gene expression
2. when cells reach stationary phase
RP gene expression is down regulated :
1. under environmental stress
4. when cells are starved for glucose
5. when there is a defect in the secretory pathway
3. when cells are treated with rapamycin
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0.5 M NaCl
1. Sfp1 relocalizes to the cytoplasm under environmental stress
Ctrl
ON OFFRibosomal genetranscription
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Stationary phaseLog phase
ON OFFRibosomal genetranscription
2. Sfp1 relocalizes to the cytoplasm when cells reach stationary phase
![Page 16: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/16.jpg)
Ctrl Rapamycin
ON OFF
Powers T. and Walter P.Mol. Biol. Cell (1999)
ribosomal genetranscription
3. Sfp1 relocalizes to the cytoplasm when cells are treated with rapamycin
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SD complete S ethanol +glucoseS ethanol
ON OFF ON
4. Sfp1 relocalizes to the cytoplasm when cells are starved for glucose
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Tunicamycin (3h 30’)Ctrl
ON OFFribosomal genetranscription
5. Sfp1 relocalizes to the cytoplasm when the secretory pathway is interrupted
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Sfp1 binds RP promoters
0
1
2
3
4
50' rapamycin30' rapamycin60' rapamycin
Sfp1
Occ
upan
cy
Sfp1-HA Chromatin IP and Quantitative PCR
Quantitavive PCR for target genes(promoter area)
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Defect in regulation of RP gene expression in sfp1 mutants
WT vs. WT + rap1
sfp1 vs. sfp1 + rap2
WT vs. sfp13
WT + rap vs. sfp1 + rap4
1 2 3 4
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![Page 22: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/22.jpg)
Pathways that control ribosomal protein gene transcription
TOR PKA PKC
ribosomal protein genetranscription
Nutrients Glucose
ON
![Page 23: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/23.jpg)
Adapted from Jacinto E. and Hall M. N. Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 117-126 (2003)
SFP1Ribosomal Biogenesis Genes
TOR and RP gene expression
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TOR CONTROLS LOCALIZATION OF SFP1
WTSfp1-GFP
tor1-1Sfp1-GFP
Ctrl Rapamycin
![Page 25: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/25.jpg)
msn2, 4 Sfp1-GFP gat1 Sfp1-GFP
gln3 Sfp1-GFP
tip41 Sfp1-GFP
pph21 Sfp1-GFP
rtg2 Sfp1-GFP
rtg3 Sfp1-GFP
rtg1 Sfp1-GFP
mks1 Sfp1-GFP
sit4 Sfp1-GFP
Ctrl Rapamycin
![Page 26: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/26.jpg)
PKA and RP gene expression
Low PKA High PKA
RP gene expression OFF
RP gene expression ON
starvation Glucose (cAMP)
Bcy1(regulatory)
Tpk1,2,3(catalitic)
![Page 27: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/27.jpg)
wtSfp1 GFP
bcy1Sfp1GFP
Ctrl Rapamycin
PKA CONTROLS LOCALIZATION OF SFP1
Schmelzle T. and Hall M. N. Mol. Cell. Biol. (2004)
![Page 28: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/28.jpg)
Schmelzle T. and Hall M. N. Mol. Cell. Biol. (2004)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
RPL1B RPL27B RPS0B RPL11A RPL2B
WT
bcy1
Sfp1-HA Chromatin IP and Quantitative PCR
Sfp1
Occ
upan
cy
![Page 29: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/29.jpg)
TOR can control Sfp1 localization independently of PKA
![Page 30: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/30.jpg)
Stress stimuli can be transmitted to Sfp1 independently of PKA
![Page 31: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/31.jpg)
TORrapamycin
nutrients
TAP42/SIT4RAS/cAMP
PKA
SFP1RP Promoter ON
glucose
Stress?
![Page 32: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/32.jpg)
-Sfp1 is an activator of RP gene transcription
-Sfp1 relocalizes from the nucleus to the cytoplasm in response to diverse environmental stimuli and stresses, coincident with lower expresssion of RP genes
-Sfp1 binds to the RP promoters and this binding is regulated by stress
-Cells lacking Sfp1 show a defect in regulation of RP gene transcription in response to stress, indicating that Sfp1 is required for the proper downregulation of RP genes in response to stress
-The TOR pathway controls localization of Sfp1. TOR activity induces Sfp1 nuclear localization
-PKA controls localization of Sfp1. PKA activity induces Sfp1 nuclearlocalization
-Stresses such as oxidative or osmotic stress can control Sfp1 localization Independently of PKA
Summary
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![Page 34: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/34.jpg)
TORrapamycin
nutrients
TAP42/SIT4RAS/cAMP
PKA
SFP1RP Promoter ON
glucose
Stress?
![Page 35: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/35.jpg)
SFP1
RP PromoterFHL1
IFH1
RAP1
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![Page 37: Identificación y Análisis Funcional de Nuevos Reguladores Transcripcionales Implicados en la Respuesta Celular al Estrés](https://reader035.vdocuments.co/reader035/viewer/2022070500/56816860550346895ddeafc1/html5/thumbnails/37.jpg)
-localization of Sfp1 binding site in RP promoters