Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Generación de precursores neurales a partir de fuentes alternas:
determinación de marcadores del linaje neural.
Claudia Isabel Ramírez Vélez (Becario)
Unidad Académica de Ciencias Naturales UaGro
Verano UaGro
Correo: [email protected]
Área III: Medicina y Ciencias de la Salud
Dr. Jesús Santa Olalla Tapia (Asesor-Investigador)
Profesor- Investigador Titular A, TC del
Laboratorio de Biología de Células Troncales de la Facultad de Medicina UAEM
Resumen
La medicina regenerativa es un campo interdisciplinario de investigación y aplicaciones clínicas,
el cual se centra en la reparación, sustitución o regeneración de las células, tejidos u órganos, para
restaurar funciones biológicas alteradas por diversas causas, incluyendo malformaciones
congénitas, enfermedades o traumatismos (Manson et al., 2008). Lo atractivo de la terapia celular
se deriva del hecho de que las células introducidas puedan ser manipuladas ex vivo, tanto a nivel
celular como molecular, para hacerlas más eficientes durante la recuperación de la función perdida
(Ball et al.,2000), donde las células precursoras pueden ser empleadas para generar fenotipos útiles.
La importancia de utilizar células troncales o células precursoras adultas, recae en el hecho de que
se obtienen con facilidad, pueden ser autólogas, tienen la capacidad de proliferar por tiempos
prolongados y diferenciar hacia los diferentes fenotipos celulares de los tejidos dañados, así es
posible, que, con su proliferación extensa, se genere la cantidad de células necesaria para la
recuperación funcional. En este contexto, el presente proyecto propone el empleo de queratinocitos
humanos para la generación de precursores neurales por eventos de plasticidad para el posible
empleo de enfermedades neurodegenerativas. Siendo estas alteraciones una de las principales
causas de morbi y mortalidad a nivel mundial, no existiendo tratamiento que repare el daño.
Palabras Clave: Medicina Regenerativa, Terapia Celular, Células troncales, Plasticidad,
Queratinocitos, Precursores Neuronales.
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
Introducción
Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por provocar un deterioro
neurológico progresivo, que se acompaña de una disminución de la funcionalidad e independencia
personal, y que en fases avanzadas comportará una reestructuración familiar porque aparece la
necesidad de un cuidador principal (Abril et al,.2004). Además de que los tratamientos de hoy en
día son muy costosos, no todas las personas tienen acceso a ese tipo de tratamientos y ponen la
integridad y salud del paciente.
Las enfermedades neurodegenerativas más comunes son la enfermedad de Alzheimer (EA)
y la enfermedad de Parkinson (EP), la EA es la enfermedad neurodegenerativa más frecuente,
afectando aproximadamente a 15 millones de personas en todo el mundo, la EP es la segunda
enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer, con una
prevalencia de 1 a 2% en personas mayores de 65 años (Ramirez,2008). México registra un rápido
avance de las enfermedades neurodegenerativas (Crónica, 2016), el especialista de la Universidad
de Guadalajara, doctor Carlos Beas Zárate mencionó que; “La incidencia de enfermedades
neurodegenerativas ha sido mayor; lo que hace 20 años se pensaba que era exclusivo de la raza
anglosajona ahora está en nuestro país” (Universidad de Guadalajara, 2014).
La terapia celular es un procedimiento terapéutico que involucra la transferencia de
poblaciones celulares a un individuo hospedero, con la finalidad de corregir algún defecto o
introducir nuevas funciones en este.
Actualmente las células introducidas pueden ser manipuladas ex vivo a nivel celular y
molecular, y hacerlas más eficientes en la restitución de una función deficiente por la pérdida de
células (Peredo, 2015). Una opción serían las células troncales que se ha demostrado su utilidad y
capacidad de proliferar exitosamente y son participes de diferentes tratamientos de múltiples
enfermedades, entre las que destacan las enfermedades neurodegenerativas.
Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por provocar un deterioro
neurológico progresivo, que se acompaña de una disminución de la funcionalidad e independencia
personal, y que en fases avanzadas comportará una reestructuración familiar porque aparece la
necesidad de un cuidador principal (Abril et al,.2004). Además de que los tratamientos de hoy en
día son muy costosos, no todas las personas tienen acceso a ese tipo de tratamientos y ponen la
integridad y salud del paciente.
Las células troncales se definen como una población indiferenciada, capaz de autor
renovarse, es decir dar origen a células idénticas a sí mismas, con el mismo potencial a diferenciar,
tienen la capacidad de proliferar extensamente y generar todos los tipos celulares presentes en un
tejido (Acevedo et al.,2011).
Además de que presentan la característica de ser pluripotentes, es decir, dan origen a los
diferentes tipos celulares originados de las tres capas germinativas (endodermo, mesodermo y
ectodermo), en cada una de estas capas germinativas es posible identificar células troncales
comprometidas para cada uno de los tejidos que se generan, las cuales tienen a su cargo la
capacidad de dar origen a los fenotipos terminales. (McDonald et al. 1999; D. C. Wu et al. 2007).
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
En este contexto se creía que su capacidad de diferenciación era un proceso irreversible, es
decir las células se iban diferenciando a un tipo de linaje especifico. Este hecho implicaba que, si
se buscaba una fuente celular para terapia celular, esta solo podía provenir de células que originaran
el tejido de interés, por ejemplo, las células troncales neuronales solo generarían exclusivamente
neuronas.
Recientes estudios han demostrado que las células troncales poseen una propiedad
denominada plasticidad, que se define como la capacidad que posee una célula dentro de un linaje
especifico, para generar células de otro linaje de origen embrionario distinto. Esta capacidad,
permite nuevas estrategias terapéuticas, debido a que ya no es forzoso que la fuente celular
provenga de un tejido al cual es difícil de acceder (Peredo, 2015)
Las células troncales epidermales, en este caso los queratinocitos, son capaces de generar
distintos tipos celulares in vitro por medio de eventos de plasticidad (Bickenbach & Stern 2005),
por lo tanto estas células podrían ayudar a generar tejidos de difícil acceso, como lo es el tejido
neural, lo que facilitaría su utilización en terapia celular para tratar enfermedades
neurodegenerativas. La piel presenta las mejores características para la obtención y propagación
de células, entre las que destaca la ausencia de problemas éticos, mal diferenciación, o de respuesta
inmune al paciente, por tratarse de un trasplanté autologo. Es por eso que el objetivo de este
presente trabajo fue evaluar y demostrar que es posible generar precursores neuronales de vías
celulares alternas en este caso, queratinocitos.
Materiales y Métodos
Descongelamiento de crioviales con queratinocitos humanos
Se descongelo la línea celular de Queratinocitos obtenidos anteriormente de una biopsia de
prepucio humano, este procedimiento se llevó a cabo en condiciones estrictas de esterilización.
Primero el criovial con células fue suspendido en baño maría a 37° C por 3 minutos para
descongelar, posteriormente se llevó a la campana de flujo laminar previamente esterilizada y
lavada con agua destilada y Etanol al 70%.
Se realizó un lavado del criovial en donde se congelaron las células con 1 ml de medio de
cultivo ideal para queratinocitos, se lavó el criovial con aproximadamente 700 ul y la tapa con una
aproximado de 300 ul pasando el medio con células al tubo Falcón de 15 ml después del enjuague,
para garantizar que se han pasado todas las células. El tubo se centrifugo a 400 G por 5 minutos
(en centrifuga SIGMA 3-18K), se retiró el sobrenadante por aspiración con una pipeta Pasteur
estéril cuidando de no jalar el pellet (pastilla celular), se agregó 1ml de medio ideal para
queratinocitos, se enjuagó la pastilla con el medio.
Para estimar la viabilidad, en un tubo de micro centrifuga de 0.6 ml se agregó 10 ul de azul
de Tripano 0.4% y 10 ul de células resuspendidas. Se colocó 10 ul de la mezcla anterior en el borde
de la cámara de Neubauer cuidadosamente para que se llene por capilaridad. Se colocó la cámara
en la platina del microscopio invertido, se retiró el filtro verde, y se observó la preparación con el
objetivo 10X.
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Se procedió a contar las células con un contador manual, se obtiene el total de células de
los 5 cuadrantes (cuadro central delimitado por líneas triples, constituido por 4 x 4 cuadros, y los
cuatro cuadrantes ubicados en los vértices del cuadro central), se identificaron las células vivas que
se ven refrigerantes ya que su membrana se encontraba integra y las muertas azules, por disrrupción
de membrana.
Cultivo celular
De acuerdo a los cálculos obtenidos se tomaron 428 ml de células que se suspendieron en
4 cajas para cultivó de células de 10 centímetros de diámetro (55 cm²), en 7 ml de medio. Se mueve
la caja de manera que el medio toque todas las direcciones para lograr una distribución homogénea
de células. La viabilidad de estas células fue de 95 %, y se sembró 500,000 células en cada caja.
Las cajas fueron llevadas al microscopio invertido y se observó la homogeneidad de la distribución.
Las células se incubaron a 37° C en una atmosfera de CO2 al 5 %
Subcultivo de queratinocitos
Una vez alcanzada la confluencia de 80 % se procedió a hacer un subcultivo, el primer paso
consiste en retirar el medio de la caja(s), teniendo cuidado de no desprender o dañar la monocapa,
posteriormente se colocó en la caja Petri tripsina al 0.25% distribuyendo a toda la caja de manera
que llegue a todas las células y se incuba durante 3 min. Una vez pasado el tiempo se observaron
en el microscopio para asegurar el desprendimiento de las células de la caja, se inactiva la tripsina
agregando medio de inactivación (DMEM, + 10% SFB), disgregando 30 veces para asegurar que
la monocapa de células se separe, una vez hecho el lavado se pasó el contenido de las cajas a tubos
Falcón de 15 ml para centrifugar, se enjuagaron las cajas con 1ml de medio para asegurar el
máximo desprendimiento de células, se transfiere el resto del medio al tubo de centrifuga y se
centrifuga a 400g en la centrífuga Sigma 3-18k durante 5 minutos, terminado esto, quedaron dos
fases, una fase acuosa y otra con el pellet, retirar el sobrenadante, cuidando de no tomar el pellet
(pastilla celular). Se resuspendió en 3 ml de medio epidermal, homogenizando con la pipeta unas
10 veces, para asegurar la máxima homogeneidad de células, y se procede nuevamente a hacer
conteo celular con azul de Tripano en la cámara de Neubaeur.
Se sembró en cajas de cultivo con 7 ml de medio epidermal, se mezcló el medio con las
células para lograr una distribución homogénea de las mismas. Se inclina la caja 5 veces en las 4
direcciones (frente, atrás, derecha e izquierda). Se observan en microscopio para asegurarse de que
la distribución de células sea homogénea. Se incubó a 37º C en una atmósfera de CO2 al 5% durante
el tiempo requerido para alcanzar una confluencia entre el 80% y 90% (cuatro días,
aproximadamente).
Generación de precursores neurales a partir de queratinocitos humanos
El protocolo de inducción neural consiste en dos etapas. La primera etapa (7 días de
cultivo), pretende generar agregados celulares, y en la segunda etapa (20 días de cultivo), obtención
de precursores neurales.
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Etapa 1: Generación de agregados celulares
Una vez que las células alcanzaron el 90% de confluencia, se procedió a cultivar los
queratinocitos en medio de diferenciación neural 1 (DMEM/F-12 con 17.5 mM de glucosa, 20
ng/ml EGF, 40ng/ml de bFGF y 1% B27) durante 7 días, para generar agregados celulares.
Se sembraron tres cajas con queratinocitos. Dos con medio diferenciación 1 y una caja con
medio de propagación UDMM-Queras (control negativo), en cada caja se sembraron un total de 1
millón de células, y se incubó a 37º C en una atmósfera de CO2 al 5%. Se realizó cambio de medio
cada tercer día. Al finalizar el tiempo de cultivo, una caja fue lisada para la extracción de ARN y
la otra se empleó para continuar el proceso de inducción (etapa 2).
Etapa 2: Generación de precursores neurales
Previamente las cajas donde se cultivaron las células, fueron tratadas con Laminina (durante
2 horas), para permitir la adherencia.
Una vez culmina la etapa de inducción uno, las células fueron disgregadas con tripsina y
sembradas en Medio de Inducción Neural 2 (DMEM F12 suplementado con B27 y 1% SFB (Suero
Fetal Bovino) durante 20 días.
Caracterización Molecular de precursores neurales mediante PCR-RT.
El laboratorio de Biología de las células Troncales, cuenta con un banco de oligonucleótidos
(diseñados en el programa, OLIGO6), de los cuales se eligió trabajar con oligonucleótidos para
Nestina y NeuroD como biomarcadores del linaje neural.
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados y su correspondiente secuencia, sentido y anti sentido.
OLIGO SENTIDO ANTISENTIDO
Neuro D CCC TTC TTT GAA AGC CCT CTG ACT AAA TGG TGA AAC TGG CGT GCC TCT
Nestina CAT CTG ACC AGG GAA GAG GTG AT CTC CTC CTG CTC GCT CTC TAC TTT
Fuente: Laboratorio de Biología de Células Troncales, UAEM.
Una vez elegidos los oligonucleótidos, se buscó en la página virtual “Human Protein Atlas” las
líneas celulares que expresan los genes de interés para emplearlos como controles positivos y
estandarizar las condiciones eficientes de PCR-RT. Seleccionando la línea celular como lo indica
en la siguiente tabla.
Tabla 2. Línea celular que expresan los genes de interés. Se seleccionó la línea celular SH-
SY5Y, la cual expresan preferentemente los genes a evaluar. Las barras moradas muestran la
expresión de ARN para cada línea, calculado como valores FPKM (fragmentos por kilobase
mapeada).
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Factor de
Transcripción
Línea
celular
Resumen de la línea celular
Nestina SH-SY5Y Línea celular de neuroblastoma
metastásico
NeuroD SH-SY5Y Línea celular de neuroblastoma
metastásico
Fuente: The Human Protein Atlas
Estandarización del PCR-RT para biomarcador.
Con el fin de estandarizar el PCR-RT del factor de transcripción NeuroD y Nestina se
cultivó la línea celular SH-SY5Y (ATCC CRL-2266), la cual fue propagada durante 15 días y se
les llevó a cabo la extracción de ARN, posteriormente se evalúo la calidad del ARN, mediante
pruebas de pureza e integridad. La primera corresponde en evaluar la posible contaminación con
ADN mediante un PCR y observando la amplificación del gen constitutivo GAPDH y la medición
del índice de las absorbancias 260nm/280nm, tomando como punto de corte 1.8. La segunda prueba
corresponde a la integridad del ARN mediante un gel de urea-ácido cítrico al 2%.
Previamente las células (SH-SY5Y) fueron lisadas al día de cultivo 4 (85% de confluencia)
por un tratamiento de trizol, adicionando 1ml de trizol por cada 5x10⁶ de células.
Purificación de ARNm
A partir del lisado con Trizol, se procede a la obtención y purificación de ARNm, siguiendo
el protocolo de purificación de RNA. Las muestras se dejaron descongelar 5 minutos a temperatura
ambiente, una vez descongeladas se procedió a añadir Cloroformo (J.T. Baker No. Cat. 9175-03)
de acuerdo al volumen de trizol usado se añadió 200 ul por cada mililitro de Trizol, se agito
vigorosamente para asegurar la homogenización del cloroformo y el trizol, y se dejó reposar 3
minutos a temperatura ambiente, no en hielo, el cloroformo tiene la propiedad de separar el ARN
de la fase orgánica que contiene proteínas y otros contaminantes.
Las muestras se centrifugaron a 12 000 G durante 15 minutos a una temperatura de 4°C en
la centrifuga LW Científica Prism R refrigerada, una vez transcurrido el tiempo la muestra se
separó en tres fases, una fase acuosa, fase orgánica y una interfase blanca que contiene el ADN, se
toma solamente la fase acuosa que contiene el ARN cuidando de no aspirar la interfase blanca y se
pasa a un tubo de microcentrífuga (aproximadamente 500 ul), una vez obtenida la fase acuosa se
añadieron 500 ul de Alcohol Isopropílico ( J.T Baker No.Cat. 9084-03) al 100% a los tubos con la
fase acuosa y se vortexeo 10 segundos para una óptima homogenización, se incuban por 10 minutos
a temperatura ambiente y se vuelve a centrifugar a 12 000 durante 10 minutos a la misma
temperatura (4° C), se obtiene un pellet que contiene el ARN, se decanta el sobrenadante cuidando
de no retirar el pellet y se coloca en papel absorbente los tubos de manera invertida, se seca el
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exceso de solución con un hisopo de algodón estéril cuidando de no llegar al pellet, y los tubos se
pasan a hielo. Se añade 1 ml de etanol al 70 % frío ( -20° C) para lavar la pastilla, se vortexea 10
segundos, y se centrifuga a 7 500 G durante 5 minutos a la misma temperatura. Igualmente se
decanta el sobrenadante y se repite los pasos de secado anteriores. Los tubos se dejaron secar al
aire, cubriendo con papel parafilm el tubo realizando tres perforaciones en el con aguja estéril, y
se colocaron en una incubadora de crecimiento bacteriano durante 10 minutos.
Transcurrido el tiempo se resuspendieron en 150 ul de agua inyectable, y se vortexearon
durante dos pulsos de 30 segundos. Una vez suspendidas se pasaron al refrigerador de -20 ° C.
Se hizo un tratamiento con DNasa para eliminar los posibles residuos de ADN en nuestras
muestras de RNA, a cada una de las muestras se le añadió 15 ul de Buffer de Reacción 10x para
DNasa 1 (Thermo Science) y 3 ul de DNasa 1 (Thermo Science No. Cat. EN0521), estos parámetros
de volumen se siguieron de acuerdo al volumen empleado de agua inyectable, las muestras se
vortexearon durante 10 segundos y se incubaron a 37°C durante 1 hora en una incubadora de
crecimiento bacteriano.
El proceso de extracción se repitió para una óptima eliminación de materia orgánica y restos
de ADN, añadiendo 1ml de Trizol al RNA. Al terminar el proceso se resuspendió la pastilla de
RNA en 50 ul de agua inyectable. Al termino de este proceso se realizó una PCR para comprobar
que no existiera residuos de ADN genómico.
Una vez comprobado que el ARN es puro, se cuantifica la absorbancia a 260 nm y 280 nm
para estimar la cantidad y pureza de RNA, de acuerdo al protocolo de uso del espectrofotómetro
Biodrop. Los resultados se encuentran en la siguiente tabla
Tabla 3. Resultados de la cuantificación de las muestras de RNA
Muestras A 260/230 A260/280 Concentración
ug/ul
1 1.112 1.842 0.175 ug/ul
2 0.243 1.852 0.196 ug/ul
3 2.244 1.774 0.244 ug/ul
Fuente: Elaboración propia
Síntesis de ADNc
Para la síntesis de ADN complementario a partir de RNA, se programó el baño seco a 65°
C, y se hicieron los cálculos para saber cuánto ARN debemos tomar para tener 3 ug (en este caso
son 3 ul debido que se hicieron 3 reacciones por muestra), esto de acuerdo a los resultados de la
cuantificación de las muestras y se llevó a 30 ul de agua de agua inyectable, los volúmenes se
muestran a continuación en la tabla 2.
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Tabla 4. Volumen de RNA y agua inyectable para la desnaturalización del RNA
Muestras
Queratinocitos
Volumen de RNA Volumen de Agua
Inyectable
1 17.2 ul 12.8 ul
2 15.3 ul 14.7 ul
3 12.0 ul 18 ul
Fuente: Elaboración propia
Se colocó en un tubo de 0.6 ml la cantidad de agua calculada, y se agregó la cantidad de
RNA correspondiente al cálculo, y se calentó a 65 °C por 5 minutos para desnaturalizar el RNA.
Mientras se calienta el ARN se colocaron los reactivos para la mezcla general excepto la
Transcriptasa Reversa M-MLV en el tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. La mezcla se vortexeo por
10 segundos y se centrifugó en la minifuga durante 10 segundos. Se colocó el volumen requerido
de la Transcriptasa Reversa, se vortexeo y centrifugo por 10 segundos.
Los tubos con RNA se sacaron del baño seco, se vortexearon y se centrifugaron para bajar
la condensación de la tapa y se colocaron en hielo, se agregó 60 ul de la mezcla general a los tubos,
se vortexeo y se centrifugo por 10 segundos. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante una hora.
Al término de la incubación se tomaron 3 ul de la reacción y se procedió a realizar una PCR para
comprobar calidad e integridad.
Estandarización de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
Posteriormente, se prosiguió con la optimización de la amplificación de los genes NeuroD
y Nestina mediante la estandarización de la concentración de MgCl2 y de la temperatura de
apareamiento, con la finalidad de encontrar la condición que tenga una mayor amplificación del
gen, y sin la presencia o la menor cantidad de artefactos (especificidad y dímeros de primer).
Para llevar a cabo esta optimización se realizó de manera simultánea una curva de
temperatura que partía de 54 a 68°C (54, 54.3, 55, 56.1, 57.7, 59.7, 62, 64.1, 65.6, 66.9, 67.6, 68)
y de 4 concentración de MgCl2 (0.5, 1, 1.5 2, 2.5, 3, 3.5 y 4 Mm).
Resultados
Cultivo de Queratinocitos
El rendimiento celular fue de 2,840,000 células del descongelamiento del criovial con una
viabilidad del 85 %. Se realizó un registro fotográfico en donde se monitoreo desde CP (Cultivo
Primario) a P-3 para evaluar si existen cambios morfológicos y capacidad proliferativa durante la
propagación de queratinocitos (Fig. 1). Los resultados indican que en el CP hay por lo menos 2
poblaciones celulares ya que existe heterogeneidad morfológica. I de células con soma alargado,
con prolongaciones apicales y núcleo oval y morfología II células con soma redondo, con gran
citoplasma y núcleo circular (Fig. 2). En el P-1 aún se observan los 2 tipos de morfologías, siendo
el primer tipo el que predomina (Células con soma alargado). Posterior a este pase es decir el P-2
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y P-3, ya no se observan células con soma redondo. Por lo tanto, el medio epidermal favorece el
crecimiento de una población.
Figura 1. Figura 2.
Se observó un aumento en el número de células conforme avanzan los pases, es decir, en el
pase 1 se obtuvieron alrededor de 4,396,000 células por caja, en el P-2 5,984,000 células por caja
y para el P-3 6,404,500 células por caja. (Fig.3) se mantuvo una vialidad mayor al 90% de los
casos, por lo tanto, los datos son confiables y no tienen relación con muerte celular o efecto en la
manipulación.
Figura 3. Grafica de Rendimiento celular y Viabilidad durante la propagación de
queratinocitos humanos.
Diferenciación de Queratinocitos
Las células fueron monitoreadas a lo largo del procedimiento de diferenciación, obteniendo
evidencia fotográfica de cada una de las etapas, en donde se observó cambio morfológico durante
el proceso.
0
2,000,000
4,000,000
6,000,000
8,000,000
CP P1 P2 P3
No
. de
célu
las
Pase
Rendimiento celular
0.00%
50.00%
100.00%
AIS CP P1 P2 P3
%
Pase
Viabilidad
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Etapa 1:
En la etapa uno podemos observar los cambios morfológicos de acuerdo a la comparación
de morfologías con Queratinocitos en medio de propagación epidermal (control negativo) (Fig.5),
podemos observar a partir del primer día de siembra la generación de las agregadas celulares
flotantes, mostrando morfología oval y delimitada. (Fig.4).
A)
B)
Figura 4. Generación de precursores neurales. A) Diferenciación de Queratinocitos a las 24
de horas de siembra, se pueden observar las agregadas celulares de forma ovalada y delimitada. B)
Queratinocitos en medio de propagación UDMM-Queras.
Etapa 2:
Una vez culminado el periodo de incubación (7 días) con medio de diferenciación neural 1,
los agregados fueron obtenidos y disgregados con tripsina para la obtención de células individuales.
y resembradas en cajas previamente tratadas con Laminina a una densidad de 120,000 células en
cajas de 55 cm² con medio de Diferenciación Neural 2.
A partir de las 24 horas, se observó adherencia de las células. En el día 5 de cultivo, se
observó cambios morfológicos de las células, en donde se aprecian células con soma alargado y
prolongaciones muy extensas similares a neuronas como se muestra en la figura 6.
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
Figura 6. Se observan las células observadas a 10x,20x y 40x en el microscopio invertido,
se observan las células con prologaciones y ya adheridas a la caja similares a neuronas.
Estandarización del PCR-RT para biomarcador.
El cultivo celular de la línea SH-SY5Y las cuales se observaron el crecimiento y se dejaron
propagar durante un mes (Fig.7).
Figura 7. Línea celular SH-SY5Y.
Se lisaron estas células con trizol y se purifico el ARN, en la figura 8 se observan los geles
de agarosa y se comprueba que no se encuentra rastros de ADN al no mostrarse producto de
amplificación, además de que se realizó un gel de urea ácido cítrico para comprobar la integridad
y el tamaño del ARN.
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Figura 8. Gel de agarosa que muestra la pureza del ARN al no mostrar productos de
amplificación, se utilizó como control positivo GAPDH, se muestra también el gel de urea que
muestra la integridad y el tamaño.
Síntesis de DNA
La integridad y calidad se observó en el gel de agarosa (Fig. 9) donde se observa
amplificación a partir del ciclo 20 y con más producto de amplificación en el ciclo 40, lo que
comprueba que es un cDNA de buena calidad además que no ha dímeros de primer lo cual nos dice
que hay un buen pegado de iniciadores.
Figura 9. ADN complementario de la línea celular SH-SY5Y, con sus respectivos controles
positivo y negativo.
Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
Estandarización de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
De acuerdo a los resultados de las PCR, en el caso de Nestina, la mejor condición fue en
0.5 a 68 °C y 1.0 a 68°C, de acuerdo con la figura 10, donde se muestra la curva de Mg y el producto
de amplificación que fue de 459 pb
Por el tiempo reducido de la estancia de investigación no se pudo realizar la evaluación
molecular de los marcadores NeuroD y Nestina de las células inducidas a la diferenciación.
Discusión y conclusiones
El presente trabajo me permitió evaluar y propagar una línea celular de Queratinocitos,
además de diferenciarlos hacia un linaje diferente y expresar precursores del linaje neural, lo cual
es muy importante ya que su aplicación en terapia celular. También aplique la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa, electroforesis en gel de agarosa, urea y síntesis de ARN y purificación
de ADN complementario para su aplicación en PCR. De acuerdo con los objetivos planteados en
el presente trabajo, la generación de precursores neuronales fue posible gracias a la propagación
de Queratinocitos y la línea celular SH-SY5Y , además de que comprueba que el uso de
Queratinocitos, además de su fácil manejo y propagación, reúnen grandes características para
inducirlos no solo al linaje neural, sino también en la terapia de otras enfermedades como la
Diabetes, esto también abre las probabilidades de usar otro tipos de células como lo son los
Figura 10. Curva de
concentración de Mg, se observa
como el producto de amplificacion
conforme la concetracion de Mg
sube.
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fibroblastos que también forman parte de la piel. Es muy importante recalcar que el desarrollo de
este trabajo, abre próximas investigaciones y avances en la aplicación de la terapia celular
Agradecimientos
Antes que nada, quiero agradecer a la Universidad Autónoma de Guerrero por haberme
proporcionado los recursos necesarios para que esta estancia fuese posible, también por alentar a
los jóvenes estudiantes de buscar nuevas maneras de aumentar su conocimiento y abrir puertas en
varios lugares del estado y del país. También quiero agradecer al Dr. Jesús Santa Olalla Tapia por
haberme aceptado en su laboratorio y proporcionarme el material necesario para la realización de
este proyecto, también agradecerle su confianza, y por compartir su conocimiento conmigo, me
llevo una gran experiencia científica, gracias. Agradezco también el asesoramiento del estudiante
de maestría, Biol. Joel Esquivel Estudillo por su ayuda, asesoramiento y por compartir su
conocimiento conmigo, además de su ayuda proporcionada para la realización de este trabajo,
también agradezco la ayuda de mis compañeros de estancia, Karina Pellat, Naolly Barradas, Salma
Muñoz y Jesús Quevedo, nos ayudamos mutuamente en nuestros diferentes trabajos, gracias por
esta experiencia científica.
Referencias
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