UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE
MORELOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE DIFERENTES CEPAS DE Trichoderma spp.
SOBRE LA PUDRICIÓN DE RAÍZ CAUSADA POR Fusarium oxysporum EN
NOCHEBUENA DE INTERIOR
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TÍITULO DE:
B I O L O G O
P R E S E N T A:
MIRNA VERONICA BAUTISTA VALLE
DIRECTOR
DR. FELIPE DE JESÚS OSUNA CANIZALEZ
CUERNAVACA, MORELOS Octubre, 2013
II
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), que mediante el
Proyecto FOMIX: “Estudios Epidemiológicos de Enfermedades y Bioecología de Plagas en
Cultivos de Importancia Económica en el Estado de Morelos” (Registro: MOR-2010-CO1-
148902), me apoyó con una beca para elaborar el presente trabajo.
Al Dr. Felipe de Jesús Osuna Canizalez, por incontables razones, especialmente por
permitirme formar parte de su equipo de trabajo aun sin conocerme, así también por su
excelente disposición, orientación y apoyo en todo momento.
A mi consejo de sínodos el Dr. Sergio Ramírez Rojas, la Maestra Adriana Trejo
Loyo por tomarse tiempo de revisar mi escrito, en especial al Dr. Jesus Telesforo
Hernandez Abarca y el Dr. Edgar Martínez Fernández , por mostrarme su apoyo y
disposición durante este tiempo, además de su infinita paciencia.
A mi compañera de trabajo la Ing. María Félix Moreno Lopez, que desde que nos
conocimos me ha brindado su apoyo incondicional, además de compartir sus conocimientos
conmigo, convirtiéndose en una gran amiga.
Al personal de Laboratorio de Microbiología de sustratos y Inoculación in vitro; y
del Laboratorio de Fitopatologia por brindarme toda su ayuda y apoyo.
A mis amigas que me han ayudado a terminar esta etapa en mi vida, muy
especialmente a Lucero que ha sido la primer persona en aceptar y más importante
compartir mis gustos, por mostrar su lado más valiente en el momento preciso y hacerme
reír con su muy especial sentido del humor.
III
DEDICATORIA
A Dios por concederme la sabiduría y fuerza de voluntad necesaria, para afrontar
cada una de las dificultades que la vida me ha presentado, por brindarme la familia que
tengo y rodearme de personas que me aman.
A mis padres Rogelio y Verónica por estar conmigo en todo momento, brindándome
su comprensión y amor infinito, y darme siempre palabras de aliento y superación.
A mi hermano Alexis por sacarme de la rutina diaria y hacerme reír siempre.
A Jaejoong, Yoochun y Junsu, quienes desde que los conocí, han sido una fuente de
inspiración, al enfrentar cualquier adversidad, enseñándome a mantener la fe en todo
momento.
IV
INDICE
INDICE DE CUADROS ...................................................................................................... VI
INDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... VIII
RESUMEN………………………………………………………………...………………IX
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1
2. REVISION BILIOGRAFICA ............................................................................................ 3
2.1. Nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch)......................................... 3
2.2. Sustratos para el cultivo de nochebuena ...................................................................... 4
2.2.1. Características de sustratos inorgánicos ................................................................ 5
2.2.2. Características de sustratos orgánicos ................................................................... 6
2.3. Plagas de la nochebuena .............................................................................................. 6
2.3.1. Enfermedades de la nochebuena ........................................................................... 7
2.3.2. Fusarium spp. ........................................................................................................ 8
2.4. Control biológico ....................................................................................................... 10
2.4.1. Trichoderma spp. ................................................................................................ 11
2.5. Interacción y competencia por la rizosfera Trichoderma spp.-planta-Fusarium sp. . 14
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 17
4. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 18
4.1. Objetivo general ........................................................................................................ 18
4.2. Objetivos particulares ................................................................................................ 18
5. HIPÓTESIS ...................................................................................................................... 18
6. METODOLOGIA ............................................................................................................. 19
6.1. Cepas de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum ................................................. 19
6.2. Material vegetal ......................................................................................................... 19
6.3. Obtención de inóculo de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum ........................ 19
6.4. Elaboración y desinfección de sustrato ..................................................................... 20
6.5. Obtención de la suspensión de esporas e inoculación de Trichoderma spp. al sustrato
.................................................................................................................................. 21
V
6.6. Elaboración de suspensión de esporas e inoculación de Fusarium oxysporum a la
raíz de nochebuena.................................................................................................... 22
6.7. Tratamientos y diseño experimental. ......................................................................... 23
6.8. Trasplante de esquejes e inoculación de Fusarium oxysporum al sustrato ............... 25
6.9. Desarrollo de las plantas inoculadas .......................................................................... 28
6.10. Monitoreo de condiciones ambientales ................................................................... 28
6.11. Variables medidas.................................................................................................... 29
6.12. Reaislamiento .......................................................................................................... 30
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 32
7.1. Ensayo 1 .................................................................................................................... 32
7.1.1 Incidencia de Fusarium oxysporum ..................................................................... 32
7.1.2. Severidad de Fusarium oxysporum ..................................................................... 32
7.1.3. Efecto de la inoculación de las cepas de Trichoderma spp. y Fusarium
oxysporum sobre las variables de crecimiento ..................................................... 37
7.2. Ensayo 2 .................................................................................................................... 42
7.2.1 Incidencia de Fusarium oxysporum ..................................................................... 42
7.2.2. Severidad de Fusarium oxysporum ..................................................................... 44
7.2.3. Efecto de la inoculación de las cepas de Trichoderma spp. y Fusarium
oxysporum. sobre las variables de crecimiento .................................................... 46
8. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 50
9. PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 51
10. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................ 52
VI
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Cierre de la producción agrícola en cultivo de planta de nochebuena para el
estado de Morelos del año 2011. ............................................................................ 1
Cuadro 2. Variedades comerciales de nochebuena en Morelos. ............................................ 4
Cuadro 3. Cepas de Trichoderma spp. y de Fusarium oxysporum....................................... 24
Cuadro 4. Cepas inoculadas en los tratamientos del ensayo 1 ............................................. 26
Cuadro 5. Cepas inoculadas en los tratamientos del ensayo 2 ............................................. 27
Cuadro 6. Escala propuesta por Cotxarrera et al. (2002) ..................................................... 29
Cuadro 7. Incidencia (%) de Fusarium oxysporum para los tratamientos en el primer
monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt).
.............................................................................................................................. 33
Cuadro 8. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo1, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre el
primer monitoreo (7 ddt), el monitoreo intermedio (15 ddt) y el ultimo monitoreo
(37 ddt). ................................................................................................................ 34
Cuadro 9. Severidad de síntomas de pudrición de raíz en los tratamientos del ensayo 1 para
el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo
(37 ddt). ................................................................................................................ 35
Cuadro 10. Medias de las cepas de Trichoderma spp. del ensayo 1 para el primer monitoreo
(7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt). .............. 36
Cuadro 11. Severidad de síntomas de pudrición de raiz con las cepas de Fusarium
oxysporum del ensayo 1 para el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio
(22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt). .............................................................. 37
Cuadro 12. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 1, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre las
variables de crecimiento. ...................................................................................... 38
Cuadro 13. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en los
tratamientos del ensayo 1 en las variables de altura y número de hojas. ............. 39
VII
Cuadro 14. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en los
tratamientos del ensayo 1 en las variables de número de tallos, diámetro del
tallo primario y número de brácteas. ................................................................. 40
Cuadro 15. Medias del factor cepas de Trichoderma spp. del ensayo 1 para las variables de
crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo
primario.............................................................................................................. 41
Cuadro 16. Efecto de la inoculación de cepas de Fusarium oxysporum en ensayo 1 en las
variables de crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro
del tallo. ............................................................................................................. 42
Cuadro 17. Incidencia (%) de Fusarium oxysporum en los tratamientos del ensayo 2 en el
primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo
(37 ddt)............................................................................................................... 43
Cuadro 18. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 2, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre el
primer monitoreo (07 ddt), el monitoreo intermedio (15 ddt) y el ultimo
monitoreo (30 ddt). ............................................................................................ 44
Cuadro 19. Efecto de los tratamientos del ensayo 2 en la severidad de síntomas de secadera
para el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (51 ddt) y el último
monitoreo (95 ddt). ............................................................................................ 45
Cuadro 20. Medias de las cepas de Fusarium oxysporum del ensayo 2 para el primer
monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (51 ddt) y el último monitoreo (95
ddt). .................................................................................................................... 46
Cuadro 21. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 2, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre
las variables de crecimiento. .............................................................................. 47
Cuadro 22. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en los
tratamientos sobre las variables de altura, número de hojas, número de tallos,
diámetro del tallo primario y número de brácteas. ............................................ 48
Cuadro 23. Medias del factor cepas de Trichoderma spp. del ensayo 2 para las variables de
crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo
primario.............................................................................................................. 49
VIII
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Suspensión de esporas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en arroz. ... 20
Figura 2. Desinfección del sustrato con vapor de agua. ....................................................... 21
Figura 3. Inoculación de la suspensión de esporas de Trichoderma spp. en sustrato
desinfectado ......................................................................................................... 22
Figura 4. Raíces de los esquejes de nochebuena sumergidas en suspensión de esporas de
Fusarium oxysporum............................................................................................ 23
Figura 5. Aspecto de las plantas al segundo día del trasplante............................................. 24
Figura 6. Inoculación de suspensión de esporas de Fusarium oxysporum al sustrato. ......... 25
Figura 7. Desarrollo de plantas en túnel ............................................................................... 28
Figura 8. Severidad de síntomas de acuerdo a la escala propuesta por Cotxarrera et al.
(2002) ................................................................................................................... 30
Figura 9. Plantas nivel de escala 3 de severidad de síntomas de pudrición de las cuales se
realizaron aislamientos de raíz y tallo. ................................................................. 30
Figura 10. Muestras de Fusarium oxysporum obtenidas de los aislamientos de raíz, tallo y
sustratos de las plantas con nivel de incidencia 3 en los ensayos 1 y 2. .............. 31
IX
RESUMEN
La nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. Ex Klotzsch) pertenece a la familia
Euphorbiaceae y al género Euphorbia. La especie es originaria de las zonas tropicales de
México. La nochebuena de interior es una planta ornamental de temporada, y su producción
en México es una actividad económica de gran importancia.
En Morelos uno de los problemas fitosanitarios más importante en este cultivo es la
marchitez de la planta causada por pudrición de raíz, la cual se presenta durante cualquier
etapa del ciclo de desarrollo de la planta. Diferentes estudios han permitido identificar al
hongo Fusarium sp. como el principal agente causal de esta enfermedad de la raíz.
El uso de agentes de control biológico para prevenir o controlar enfermedades en
plantas cultivadas, es una alternativa sustentable que ha mostrado efectividad en un amplio
número de casos. Las especies pertenecientes al género Trichoderma se caracterizan por
ser hongos saprófitos que habitan en suelos con diferentes cantidades de materia orgánica.
En la acción biocontroladora de Trichoderma se han descrito diferentes mecanismos de
acción que regulan el desarrollo de los hongos fitopatógenos.
En este proyecto se evaluó in vivo en plantas de nochebuena el efecto de la
inoculación de diferentes cepas de Trichoderma spp. , previamente seleccionadas con base
en el potencial antagónico mostrado ante cepas de Fusarium oxysporum en cultivos duales
in vitro. Todas las cepas de Trichoderma spp. mostraron variación en el efecto antagonista
contra Fusarium oxysporum y todas las cepas de Fusarium oxysporum mostraron
patogenicidad hacia las plantas de nochebuena cv. Freedom Red. Se seleccionó una cepa de
Fusarium oxysporum (C2B) que fue la que mostro mayor capacidad patogénica y dos cepas
nativas de Trichoderma spp. (Trich16, Trich20), que mostraron mayor capacidad
antagonista.
Palabras clave: Euphorbia pulcherrima, Euphorbiaceae, Euphorbia, Fusarium sp., control
biológico, Trichoderma spp., Fusarium oxysporum, nochebuena de interior.
1
1. INTRODUCCIÓN
La planta de nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch), es una de las
especies de plantas ornamentales de mayor importancia económica de México, se cultiva en
su mayoría en invernaderos, generando 3 200 empleos directos y 9 600 empleos indirectos
aproximadamente, esto principalmente para cinco entidades del centro del país. Para el año
2011, se comercializaron alrededor de 20 millones de plantas, con un valor en el mercado
de 700 millones de pesos (SAGARPA, 2011).
El estado de Morelos es una de las principales entidades productoras de plantas de
nochebuena al generar el 41.4% de la producción a nivel nacional. Las zonas de producción
de esta planta en Morelos se ubican en los municipios de: Tepoztlán, Emiliano Zapata,
Cuernavaca, Cuautla, Yautepec, Puente de Ixtla y Jiutepec (SAGARPA, 2011) (Cuadro 1).
Cuadro 1. Cierre de la producción agrícola en cultivo de planta de nochebuena para el
estado de Morelos del año 2011.
Municipio Superficie Sembrada Producción Valor Producción
(Ha) (Ton) (Miles de Pesos)
Cuautla 11.5 690,000.00 17,250.00
Cuernavaca 30.0 1,806,000.00 50,568.00
Emiliano Zapata 6.0 372,000.00 9,300.00
Jiutepec 5.5 330,500.00 8,593.00
Puente de Ixtla 6.0 376,200.00 10,533.60
Tepoztlán 16.0 979,200.00 29,376.00
Yautepec 20.0 1,240,000.00 34,720.00
Total 95.0 5,793,900.00 160,340.60
La calidad de las plantas que se producen es un factor que influye en la competitividad
de las plantas ornamentales. Algunos de los principales problemas que disminuyen la
calidad, son las plagas, enfermedades y el deficiente manejo nutrimental durante el
desarrollo de las plantas, además del manejo deficiente en la cosecha y poscosecha.
2
En Morelos uno de los principales problemas fitosanitarios de este cultivo es la
marchitez de la planta causada por patógenos (Fusarium sp. y Rhizoctonia solani) que
provocan la pudrición de raíz (García et al., 2009).
El hongo Fusarium sp. ha sido identificado como el principal agente causal de
pudrición de la raíz, observándose un necrosamiento en las raíces, al tornarse de un color
oscuro, comenzando la planta a marchitarse hasta morir (García et al., 2009).
Normalmente, los métodos para controlar la pudrición de raíz en nochebuena están
basados en aplicaciones frecuentes de productos agroquímicos (García, 2008), aunque esto
implique aumentar el costo de producción así como los riesgos a la salud humana, ya sea
por la exposición directa o por la contaminación del agua y aire. En Morelos debido a que
la mayoría de los invernaderos comerciales de producción de nochebuena están localizados
en zonas urbanas o periurbanas, con alta densidad poblacional, el riesgo es mayor.
Es por esta razón que una alternativa sustentable que ha mostrado su efectividad en un
amplio número de casos es el uso de agentes de control biológico (Harman, 2000).La
utilización de especies de Trichoderma spp. es una estrategia promisoria para el control de
enfermedades, al presentar diferentes mecanismos de acción que regulan el desarrollo de
los hongos fitopatógenos y mecanismos cuya acción biorreguladora es de forma indirecta,
entre estos el micoparasitismo y antibiosis (Castaño 2008).
3
2. REVISION BILIOGRAFICA
2.1. Nochebuena (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch).
La planta ornamental Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, conocida como
“nochebuena”, es nativa de México, con gran importancia económica entre las especies del
género Euphorbia, debido a su uso a nivel mundial como planta de ornato durante la época
decembrina. Esta planta de manera nativa es un arbusto no suculento de 3m de altura, hojas
lanceoladas u ovadas-elípticas, entera a dentada a lobulada, estípite largo; brácteas
atractivas, parecidas a hoja escarlata; glándulas amarillas glándulas involucradas. Muchas
variedades con un rango grande de características; varios hábitos, de lento crecimiento,
compacta y enana, vigorosa, grande y delgada; tallos frecuentemente gruesos, con soporte
propio; brácteas en tintes de blanco, rosa y rojo, pequeñas, estrechas a grandes y anchas,
planas, arrugadas (Cabrera et al., 2006).
En el mercado predominan las plantas con las brácteas de color rojo con alrededor
del 70%, nuevos colores están cobrando mucha importancia y en el mercado pueden verse
cada año nuevas variantes.
Las nochebuenas nativas no se cultivan en macetas, sino en el suelo, ya que no
poseen las características propias para ser cultivadas en ellas. Las nochebuenas nativas
perduran todo el año y aún se les localiza en algunos hogares adornando los jardines como
arbustos. La nochebuena de interior se cultiva en macetas de diversas capacidades. En el
estado de Morelos el sustrato “tierra de hoja” y el “ocochal” son los componentes orgánicos
más empleados, mezclados con componentes inorgánicos como el tezontle, el tepojal y la
agrolita (Osuna, 2011).
En México existen varios cultivares de nochebuena de intemperie o de sol, Superior,
Orejona y Corona: Rosa, Amarilla, en los que sus brácteas empiezan a tomar colorido a
inicios de octubre, su follaje tiene varias tonalidades de verde, con los bordes dentados. A
pesar de que va en aumento las variedades de la planta de nochebuena que se comercializan
(Cuadro 2), los cultivares Freedom y Subjibi de brácteas rojas, son las más cultivadas por
los floricultores. La flor empieza a pigmentar desde octubre y sus brácteas permanecen
4
coloreadas hasta mayo del siguiente año. Su propagación se realiza por esquejes o estacas.
Crece en zonas de clima templado y cálido, y en forma silvestre se le encuentra en algunos
lugares de los estados de Guerrero, Morelos, Sinaloa, Nayarit, Jalisco, Michoacán, Oaxaca
y Chiapas (Trejo, 2012).
Cuadro 2. Variedades comerciales de
nochebuena en Morelos.
Variedad Color
Subjibi Red Rojo
Nutcracker Red Rojo
Freedom Red Rojo
Festival Red Rojo
Red Ángel Rojo
Sonora Red Rojo
Orion Red Rojo
Freedom Brigth Red Rojo
Red Elf Rojo
Nutcracker White Blanco
Freedom White Blanco
Festival White Blanco
Sonora White Blanco
Marble Star Mármol
Puebla Mármol
Freedom Marble Mármol
Sonora White Glitter Jaspeado
Monet Jaspeado
Davinci Jaspeado
Festival Rosado Rosa
Sonora Pink Rosa
Maren Salmon-Rosa
2.2. Sustratos para el cultivo de nochebuena
Un buen sustrato es esencial para la producción de plantas de alta calidad. Dado que
el volumen de una maceta es limitado, el sustrato y sus componentes deben de poseer
características físicas y químicas que combinadas con un programa integral de manejo,
5
permitan un crecimiento óptimo (Cabrera et al., 1995; Caron y Riviere, 2003). Las
propiedades físicas como son: aireación y drenaje, retención de agua y bajo peso húmedo
por volumen son consideradas como las más importantes para un sustrato (Bowman y Paul,
1983; Bunt, 1988; Ansorena-Miner, 1994; Cabrera et al., 1995). Esto es debido a que si la
estructura física de un sustrato es inadecuada, difícilmente podremos mejorarla una vez que
se ha establecido el cultivo. En cambio, las propiedades químicas sí pueden ser alteradas
posteriormente al establecimiento del cultivo, ejemplo de estas es su pH.
Las plantas que crecen en macetas se exponen generalmente a un ambiente menos
estresante y de pocos cambios en comparación con una planta que crece en el campo
(Bowman y Paul, 1983). Factores tales como la retención de humedad, la aireación,
nutrición, pH, salinidad y temperatura que pudieran derivar en condiciones estresantes,
pueden considerarse una consecuencia directa del volumen restringido del sustrato en la
maceta, el cual tiene que suplir las necesidades de una planta que es relativamente grande
para ese volumen. El problema no es que el sustrato no pueda suplir las necesidades de la
planta, sino que el período en que deben de abastecerse esas necesidades siempre es corto.
En Morelos se utilizan una gran diversidad de materiales de origen orgánico e
inorgánico, los cuales se combinan en diversas proporciones dando como resultado un gran
número de sustratos.
2.2.1. Características de sustratos inorgánicos
Dentro de los componentes inorgánicos de sustratos encontramos: tezontle, tepojal,
agrolita, etc.
Tezontle: material formado en eventos de erupciones volcánicas, constituido por
aluminosilicatos. Se le puede encontrar en colores rojo y negro; su densidad aparente es
alta, su aporte nutrimental es muy bajo y se le considera inerte (Raviv et al., 2002).
Tepojal: también tiene origen volcánico, es más ligero y físicamente más inestable
que el tezontle.
6
Agrolita: la materia prima (perlita) es un material silicio vítreo natural, de origen
ígneo, después de ser sometido a un proceso industrial, se obtiene un material granulado, de
muy baja densidad aparente y biológicamente estéril. Es útil para incrementar la porosidad
de las mezclas y posee alta capacidad de retención de agua (Moreno, 2004).
2.2.2. Características de sustratos orgánicos
Dentro de los componentes orgánicos de sustratos encontramos: tierra de hoja y
ocochal, peat moss (turba), fibra de coco o polvo de coco (Osuna, 2011).
Tierra de hoja y ocochal: se le define como el material que se origina en la parte
superficial de los terrenos forestales, al acumularse material orgánico forestal, constituido
por materia en descomposición que se acumula sobre el suelo (Bures, 1997).
Turba (Peat moss): tiene un pH muy bajo, sin embargo, sus propiedades físicas y
químicas, son muy adecuadas para el cultivo en contenedor.
Fibra de coco o polvo de coco: es un subproducto de la explotación del fruto de
coco.
2.3. Plagas de la nochebuena
Las plagas que afectan el cultivo de nochebuena son, la mosca blanca, mosca negra
o Fungus gnat, araña roja, mosca esciarida, babosas y trips (Gil, et al., 2008).
La mosca blanca se alimenta de la savia de la planta, marchitando y provocando un
amarillamiento en las hojas, dando como resultado tallos delgados y rojizos.
Las larvas de la mosca negra provocan daños en los esquejes, alimentándose de las
raíces nuevas y del tejido calloso.
La araña roja y las babosas se alimentan de la savia, causando manchas amarillas
en las hojas.
7
La mosca esciarida en su etapa larval se alimenta de las raíces de la planta,
haciéndola más susceptible al ataque de enfermedades que provocan pudrición
radicular.
Los trips dañan la planta al alimentarse de los brotes tiernos y hojas (Molina, 2006).
Existe un gran número de productos químicos para combatir las plagas insectiles,
entre ellos: clorpirifios etil permetrina, oxamil, cadusafos, imidacloprid, bifentrina,
phyriproxyfen, fenpropatin, endosulfan, bifentrina puriproxyfen, abamectina, docofol,
acefate, fipronil, etc. (Gil et al., 2008).
2.3.1. Enfermedades de la nochebuena
Los problemas de enfermedades en la producción de nochebuena pueden ocurrir en
cualquier estado de crecimiento de la planta, y afectan el follaje, tallo y raíz (García et al.,
2009). Muchas de estas enfermedades son causadas por hongos y oomicetos, que incluyen:
Fusarium spp., Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia y Thielaviopsis (Alabama Cooperative
Extension System, 2006).
Fusarium spp. propicia la pudrición en la raíz en la planta, observándose síntomas
de necrosamiento en las raíces, las cuales se tornan oscuras y posteriormente la planta
comienza a marchitarse hasta morir.
Botrytis cinerea causa la enfermedad conocida como mancha gris, inicia la
infección a partir de los bordes de las hojas y se extiende hasta cubrir la mayor parte del
follaje y tallos. Los tejidos dañados se necrosan y se tornan de color oscuro.
Oidium sp. causa la enfermedad conocida como cenicilla, aunque no provoca la
muerte de la planta, le causa un deterioro de forma tal que comienzan a aparecer pequeñas
manchas blancas en el haz de las hojas y brácteas lo cual favorece la caída prematura del
follaje
Alternaria euphorbiicola causa la enfermedad conocida como mancha de la hoja al
provocar lesiones en el tallo y a las hojas de la planta volviéndolas cloróticas y provocando
su caída prematura.
8
Cladosporium fulvum causa la enfermedad conocida como moho de la hoja, y sus
síntomas comienzan con manchas de coloración verde pálido y finalizan de un color
grisáceo en la superficie del haz de la hoja, causándole necrosis.
Rhizoctonia solani causa pudrición de las plántulas, podredumbre de la raíz, de la
corona, y marchitamiento foliar y del tallo.
2.3.2. Fusarium spp.
La clasificación taxonómica del hongo Fusarium sp. según Barnett y Hunter, (1978)
es la siguiente:
Reino: Fungi
División. Eumycota
Subdivisión: Deuteromycotina
Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Moniliacea
Género: Fusarium
Especie: Fusarium oxysporum
El género Fusarium incluye 70 especies según Leslie y Summerell (2006), las
cuales son causantes de varias enfermedades en plantas, tales como marchitamiento
vascular y pudrición de la raíz y tallo, afectando una gran variedad de cultivos de
importancia económica alrededor de todo el mundo (Ortoneda et al., 2004; Groenewald,
2006).
Pocas especies de Fusarium presentan conidios pluriseptados sin una célula basal en
forma de pie y se las llama mesoconidios (Carrillo, 2003). Algunas especies presentan
clamidosporas terminales, laterales o intercalares, a veces formando cadenas. Las células
9
conidiales ocasionalmente se transforman en clamidosporas. Algunas especies forman
esclerocios irregulares, de color beige, ocre, pardo o gris oscuro. Las colonias de las
distintas especies de Fusarium que crecen moderadamente a profusamente, tienen diversos
colores (blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, púrpura, celeste o pardo), especialmente
en el reverso de la colonia, excepto pardo oscuro o negro. El micelio es ralo o denso, ya sea
algodonoso, como un fieltro o con una zona central de funículos, pero en algunos casos es
limoso. Hay especies de Fusarium con pionotos de color anaranjado. Los pigmentos que
difunden en el agar suelen variar de color o tono con el pH. Algunas especies presentan
zonas concéntricas de distinta morfología macroscópica debido a la secuencia luz -
oscuridad (Carrillo, 2003).
La tolerancia de algunas especies de Fusarium, tales como F. oxysporum y F.
solani, a una alta presión parcial de CO2 permite el aislamiento selectivo de las mismas a
partir de algunos sustratos muy poblados (Griffin 1973).
Muchas especies de Fusarium son saprofitas encontradas de manera común en
suelos, colonizando raíces y tallos enfermos. Estas especies son de rápido crecimiento en
medios de aislamiento, además de poder aislarse fácilmente de raíz y tallo enfermos.
Este hongo se caracteriza por dañar las raíces secundarias, destruyéndolas
completamente, y evitando que haya absorción de nutrientes. Además, sube por la base del
tallo, donde se puede observar una secreción color negro brillante de diferente tamaño, que
al cortarse, muestran secciones con pudrición negra. Debido a lo anterior, se presenta un
amarillamiento en la planta. La infección de la planta se inicia con la entrada del hongo a
las raíces por contacto directo, ya sea a través de lesiones causadas por nematodos,
insectos, daño mecánico, y aparece tanto en época seca como lluviosa. Después de penetrar,
sube hasta el tallo provocando lesiones negras en el interior del tallo, facilitado al estar en
contacto con el suelo o el sustrato, aumentando las poblaciones del hongo para futuras
infecciones (Garces de Granada, 2001).
10
2.4. Control biológico
La agricultura moderna basada en el crecimiento de cultivos sembrados en grandes
extensiones de tierra, es un sistema ecológicamente desbalanceado que favorece el
desarrollo de enfermedades. Tradicionalmente el control de enfermedades causadas por
hongos ha sido a través del uso de fungicidas químicos. Sin embargo, los consumidores
comienzan a mostrar preocupación acerca de la contaminación química del ambiente y de
los residuos de plaguicidas en la comida y los agricultores se enfrentan con más frecuencia
con la resistencia de los patógenos al usar un fungicida químico.
Los fungicidas con bases biológicas han permitido la reducción o remplazo de las
aplicaciones químicas. Cook y Baker (1983) proponen la siguiente definición de Control
Biológico: “Es la reducción de la cantidad del inóculo o de la actividad productora de la
enfermedad de un patógeno por o a través de uno o más organismos distintos del hombre”.
Esta definición incluye también el uso de variantes menos virulentas del patógeno y
antagonistas microbiológicos “que interfieran con la supervivencia o con las actividades
productoras de la enfermedad del patógeno”.
Los agentes de control biológico al ser organismos vivos, reaccionan a los cambios
en su hábitat en una forma que los fungicidas químicos no podrían. Trichoderma es un
saprofito de rápido crecimiento, sus aislamientos pueden competir ecológicamente, así
como en el tiempo de aplicación, siendo capaces de colonizar espacios potencialmente
infectados, raíces en crecimiento, heridas, tejido senescente, conforme se vuelven
disponibles; al ser micoparásitos agresivos, también atacan a aquellos patógenos ya
establecidos. Un agente de control biológico será afectado por factores abióticos y bióticos
tales como el agua, la presión ejercida por la enfermedad, y competencia con la microflora
nativa. Un control incompleto y variables de una misma enfermedad será el resultado a
menos que los antagonistas usados en las fórmulas y sus aplicaciones les brinden una
ventaja competitiva sobre los patógenos que se intenta controlar.
Las medidas de control biológico no erradican el daño causado por el patógeno o al
mismo; sin embargo sí pueden reducir su habilidad patogénica de producir y mantener altos
niveles de inóculos. Al no haber fuentes de inóculos, los niveles futuros de enfermedad
11
eventualmente irán reduciéndose. Se sabe que las cepas de control biológico son efectivas
en diferentes hábitats y contra una gran cantidad de patógenos.
Los aislamientos de Trichoderma en gran variedad de cultivos han sido usados
contra enfermedades provocadas por los géneros Rhyzoctonia, Mucor, Pythium,
Phytophthora, Fusarium, Rhizopus, Botrytis, Colletotrichum, y muchos géneros más;
además, ayudan a reducir la incidencia de nematodos.
La confiabilidad en los sistemas de control biológico puede aumentar por el uso de
fórmulas que provean un entorno propicio para la bioprotección y sistemas de fermentación
que produzcan propágulos de alta calidad (Harman et al., 1991).
2.4.1. Trichoderma spp.
La clasificación taxonómica de Trichoderma spp. según Barnett y Hunter,(1978).es
la siguiente:
Reino: Fungi
Phyllum: Ascomycota
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Género: Trichoderma
La gran capacidad de adaptación mostrada por cepas de Trichoderma spp. se debe a
que estos hongos se encuentran de forma natural en los suelos de todo el mundo, bajo
diferentes condiciones ambientales y viviendo en varios sustratos. Todo esto además de su
fácil crecimiento en sustratos económicos, hace a los aislamientos de Trichoderma spp.
candidatos atractivos para una gran variedad de aplicaciones en control biológico.
12
Las cepas de Trichoderma spp. han sido aisladas de hábitats con diferente humedad,
temperatura y diferentes estados de nutrientes.
La distribución natural de Trichoderma spp. está influenciada en gran medida por la
temperatura del hábitat, y las especies varían de acuerdo a su temperatura óptima y
tolerancia. Aislamientos entre grupos de especies también pueden variar en su actividad
antagónica a diferentes temperaturas (Kölh y Schlösser, 1989).
Además de la temperatura, la humedad relativa es la variable ambiental que más
influye en la distribución natural de Trichoderma spp. en suelo (Danielson y Davey, 1973).
La temperatura ambiental afecta fisiológicamente el crecimiento del hongo por el aumento
en los costos de energía para la osmoregulación bajo condiciones secas o disminución de
disponibilidad de oxígeno en hábitats húmedos. Además, la humedad afecta la
disponibilidad de nutrientes, a través del transporte de solutos y la presencia de láminas de
agua.
Los conidios de Trichoderma spp. requieren nutrientes exógenos para germinar, el
tipo de propágulos y su edad influyen en los requerimientos de nutrientes. Danielson y
Davey (1973), encontraron que las esporas de Trichoderma spp. se vuelven más sensibles
por falta de nutrientes conforme el tiempo pasa.
Las cepas de Trichoderma spp. sólo se consideran efectivas contra patógenos
específicos, esto podría estar relacionado con sus características de especificidad
patogénica como antagonista.
Un aspecto importante del uso de Trichoderma spp. como tratamiento biológico es
cómo los agentes de control afectan las plantas, además de los efectos de la disminución de
la enfermedad. Algunos aislamientos de Trichoderma spp. se han relacionado con agentes
causales de enfermedades, mientras que a otros se les considera estimuladores de
crecimiento de las plantas, entre éstos también hay algunos aislamientos que inducen
reacciones de resistencia en las plantas.
Las interacciones antagónicas entre Trichoderma spp. y otros hongos han sido
clasificados como de antibiosis, micoparasitismo y competencia por nutrientes; sin
13
embargo, estos mecanismos no son exclusivamente mutualistas y pueden ser resultado de
ciertas interacciones (Kubicek, 1998).
Las cepas de Trichoderma spp. producen una variedad de metabolitos secundarios
volátiles y no volátiles, algunos de los cuales inhiben a otros microrganismos con los que
no están físicamente en contacto.
Existen cuatro estados bien distinguidos en las interacciones directas entre
Trichoderma spp. y otros hongos (Harman et al.,1998):
a) Crecimiento quimiotrófico en el que un estímulo químico del hongo destino atrae al
antagonista.
b) Reconocimiento especifico mediado probablemente por la lactina en la superficie de la
célula de ambos (patógeno y antagonista).
c) Adhesión y enrollamiento de hifas de Trichoderma alrededor de su hospedero.
d) Secreción de enzimas líticas que degradan la pared del hospedero.
Como saprófito de suelo, Trichoderma está biológicamente adaptado a la
colonización agresiva de bases de nutrientes disponibles y a sobrevivir de forma inactiva
como clamidospora y conidios cuando los nutrientes son escasos.
Su veloz rango de crecimiento, producción abundante de conidios, y su variación en
utilización de sustratos hacen a los aislamientos de Trichoderma saprófitos muy eficientes.
El interés por Trichoderma se debe a la necesidad de tener una alternativa de control
biológico contra el uso de compuestos químicos en las plantas cultivadas. Los fungicidas
químicos tienen efectos indeseables en el ambiente y, cuando su uso es regular provoca la
resistencia de los patógenos a los mismos.
El reemplazamiento de algunos tratamientos de fungicidas químicos con agentes de
control biológico no sólo reduce la entrada de químicos dentro de los sistemas agrícolas sí
no que también puede resultar en el aumento de control de enfermedades.
14
2.5. Interacción y competencia por la rizosfera Trichoderma spp.-planta-Fusarium sp.
Los organismos asociados estrechamente con las raíces de las plantas pueden
influenciar directamente el crecimiento y desarrollo de la planta. Las especies de
Trichoderma, son estudiadas por su habilidad de controlar enfermedades en plantas a través
del micoparasitismo y la producción de componentes antimicrobianos.
La determinación de los efectos benéficos o perjudiciales de especies de
Trichoderma en el crecimiento de la planta es complicado por las muchas interacciones que
toman lugar en el suelo o sustrato entre Trichoderma spp. y otros microorganismos, además
de cambios en el medio ambiente del suelo y la raíz de la planta.
Varios componentes microbianos son producidos por Trichoderma, los cuales se
sabe que tienen actividad antimicrobiana. Entre estos compuestos están la gliotoxina y el
viridin, cuya actividad tiende a ser mayor a un pH más bajo (pH =4.0) que a un pH más
neutral (pH=6.0), quizás debido al incremento de la estabilidad de los componentes. Wright
(1956), observó que algunas cepas producen predominantemente gliotoxina o viridin,
mientras que otras cepas producen cantidades no detectables de cualquiera de los
compuestos. Los efectos fitotóxicos de la gliotoxina y viridin son limitados comparados
con sus actividades antifúngicas (Lumsden et al., 1992).
Haraguchi y colaboradores (1996), observaron que la gliotoxina inhibe la enzima
acetolactata sintasa (ALS) en plantas. ALS está envuelta en la biosíntesis de cadenas
ramificadas de aminoácidos. La adición de estas cepas al medio de crecimiento de la planta
la alivia parcialmente de la toxicidad de la gliotoxina e inhibe la actividad de otras enzimas
(De Clercq et al., 1978).
Las especies de Trichoderma también producen viridiol, un dihidro-derivado de
viridin. El viridin enzimáticamente es convertido a viridiol al producir cadenas de hongos.
El viridiol tiene muy poca actividad antibiótica pero tiene una actividad herbicida
considerable. Los efectos fitotóxicos de viridiol, son activos contra una amplia gama de
especies de plantas, han sido estudiados más extensamente que otros metabolitos
secundarios producidos por especies de Trichoderma. El viridiol es más tóxico para
15
especies anuales compuestas y menos tóxicos para especies monocotiledóneas. Síntomas
típicos que ocasiona son: reducción de emergencia de plántulas, y reducción de brotes y del
peso de la raíz. Cultivos de Trichoderma spp. producen otros metabolitos con actividades
fitotóxicas (Kubicek, 1998).
La cantidad total y el tipo de inóculo usado en la protección de las plantas contra
enfermedades deben ser limitados a niveles que no produzcan efectos fitotóxicos. La
producción de metabolitos secundarios es dependiente de la cepa. Por lo tanto, sus efectos
perjudiciales pueden estar limitados en muchos casos por la selección de la misma cepa
(Howell, 1991).
La estimulación del crecimiento vegetal por cepas de Trichoderma spp. ha sido
reportada desde hace años (Lindsey y Baker, 1967). Chang y colaboradores (1986),
observaron que la estimulación del crecimiento vegetal al inocular al suelo turba/salvado
con suspensión de conidios de T. harzanium ocasionaba un aumento en la germinación, la
floración se incrementaba y era rápida, se aumentaba la altura y peso fresco del chile,
crisantemo, y otras plantas.
Por otro lado, Trichoderma tiene la habilidad para desarrollarse sobre amplios
rangos de condiciones externas de pH, se puede adaptar a suelos ácidos, y logra interactuar
con otros microorganismos (Benítez et al., 2004).
Algunas cepas de Trichoderma están siempre asociadas con raíces de plantas y
ecosistemas de raíces. La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer
raíces, penetrar y resistir metabolitos tóxicos producidos en respuesta a la invasión de
organismos extraños, sean o no patógenos (Benítez et al., 2004)
La adición de aislamientos específicos de Trichoderma a la rizosfera puede resultar
en la estimulación del crecimiento vegetal, sin embargo, varios aislamientos de especies de
Trichoderma difieren en sus habilidades para mantener poblaciones en la rizosfera en
ausencia de fuentes de alimento externas. Para el mantenimiento de altas poblaciones de
especies de Trichoderma en la rizósfera, su influencia en el crecimiento vegetal (i.e.
aumento por inhibición) debe ser maximizado. Lo que no es claro en este punto es como las
16
especies de Trichoderma estimulan el crecimiento vegetal, y como el efecto puede ser
producido y explotado.
Se ha propuesto que la estimulación en el crecimiento vegetal con un tratamiento
con Trichoderma spp. es el resultado del control de patógenos menores. Esta hipótesis
sugiere que todas las plantas que crecieron en un medio ambiente abierto están hasta cierto
punto enfermas e incapaces de alcanzar su potencial máximo de crecimiento y que la
adición de especies de Trichoderma para estas plantas, con potenciales indefinidos de
enfermedad, resulta en supresión de enfermedades y crecimiento mejorado de la planta. Los
patógenos menores primarios se piensa que son especies de Pythium, contra los cuales se
conoce que Trichoderma spp. tiene actividad (Harman et al., 1989). En muchos estudios de
crecimiento vegetal, T. harzianum inhibe el crecimiento y desarrollo de especies de
Pythium en la raíz (Harman et al., 1989).
17
3. JUSTIFICACIÓN
En Morelos actualmente las dos variedades de nochebuena de interior más demandadas
son Freedom Red y Prestige Red, ambas reportadas como susceptibles a marchitez por
pudrición de raíz. Mediante este estudio se busca encontrar una cepa nativa de Trichoderma
que manifieste un poder antifúngico mayor al demostrado por las cepas comerciales de
Trichoderma. De esta forma se contaría con una opción más para poder controlar esta
enfermedad de pudrición de raíz provocada por Fusarium oxysporum permitiendo apoyar
los programas de manejo integrado de enfermedades empleando tecnologías limpias y
amigables con el medio ambiente.
18
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Encontrar cepas de Trichoderma spp. que muestren mayor capacidad para
suprimir a Fusarium oxysporum que las disponibles en el mercado.
4.2. Objetivos particulares
1) Evaluar la patogenicidad de cuatro aislamientos de Fusarium oxysporum en
plantas de nochebuena cv. Freedom red.
2) Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de siete
aislamientos de Trichoderma spp. sobre el hongo patógeno Fusarium oxysporum
3) Comparar la capacidad antagonista de las siete cepas de Trichoderma spp. contra
una cepa comercial sobresaliente.
4) Evaluar la incidencia y severidad de las cepas de Fusarium oxysporum en plantas
de nochebuena cv. Freedom red.
5. HIPÓTESIS
Al menos una de las cepas de Trichoderma spp. evaluadas superará el efecto
antagonista contra Fusarium oxysporum de la cepa comercial sobresaliente, y al menos una
de las cepas de Fusarium oxysporum inoculadas mostrará virulencia a las plantas de
nochebuena cv. Freedom red.
19
6. METODOLOGIA
6.1. Cepas de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum
Se utilizaron siete cepas de Trichoderma spp., las cuales se aislaron de diferentes
sustratos, producto de cultivos monospóricos, además de una cepa comercial; estas fueron
seleccionadas por mostrar mayor poder antagónico en pruebas de cultivos duales in vitro.
Así mismo, se evaluaron cuatro cepas de Fusarium oxysporum, que fueron aisladas de
raíces de plantas de nochebuena del Campo Experimental “Zacatepec”, INIFAP, las cuales
se obtuvieron de cultivos monospóricos y fueron seleccionadas por mostrar mayor poder
patogénico de entre otras cepas, siendo producto de un trabajo previo en el laboratorio de
sustratos del Campo Experimental “Zacatepec”, Morelos.
6.2. Material vegetal
Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo “in vivo” se utilizaron esquejes
enraizados de nochebuena cv. Freedom red producidos en un vivero comercial en Tetela del
Monte, Cuernavaca.
6.3. Obtención de inóculo de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum
Se pesaron 200 g de arroz pulido para cada cepa de los dos microorganismos; el
arroz se vació en contenedores con 1 litro de agua destilada y antibiótico (cloranfenicol,
500 ppm) y se dejó reposar durante 10 minutos, pasado ese tiempo se ajustó el pH a 4.0
(con la ayuda de un potenciómetro marca HANNA instruments). Posteriormente, se retiró
el agua y se eliminó el exceso con un tamiz de 2 mm, se vació el arroz en matraces kitazato
de 500 ml, los cuales se sellaron con papel aluminio y cinta cleanpack, y se ajustó su
humedad a 70-80% en una autoclave a 121°C durante 15 min. Después se secó en una
estufa de aire forzado (Sanyo modelo MOV-2125), a 70°C durante 48 horas y se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Se preparó una suspensión de cada cepa de ambos
microorganismos, y se agregaron 5 ml de esta suspensión a un matraz kitazato.
20
Posteriormente, se incubaron en la oscuridad a 25°C durante el tiempo necesario para el
desarrollo de las colonias, suministrando aire a presión a los matraces cada 5 días (Figura
1).
Figura 1. Suspensión de esporas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en arroz.
6.4. Elaboración y desinfección de sustrato
Se prepararon 180 litros de sustrato con los siguientes componentes y proporciones
(V/V): 24% de tepojal, 56% de tierra de hoja-ocochal y 20% de lombricomposta de
cachaza. La desinfección se hizo en un contenedor de 200 litros de capacidad, utilizando
vapor de agua, sometiendo el sustrato a temperaturas superiores a 80°C durante 3 horas
(Figura 2).
21
Figura 2. Desinfección del sustrato con vapor de agua.
6.5. Obtención de la suspensión de esporas e inoculación de Trichoderma spp. al
sustrato
Se realizó el conteo de conidios en cada cepa de Trichoderma spp., multiplicada en
arroz. El conteo de conidios consistió en adicionar 300 ml de agua estéril dentro del matraz
y con una espátula desinfectada se removió el arroz, se vació la suspensión de esporas a un
vaso de precipitado, filtrándola con una pieza de manta de cielo, y se tomaron 200 µL con
una micropipeta, el contenido se vertió en una cámara de Neubauer, y se realizó el conteo
de esporas con la ayuda de un microscopio compuesto. Se prepararon suspensiones de 1 x
106 conidios de Trichoderma spp. por mililitro de sustrato. Al tener la suspensión se realizó
la inoculación al sustrato desinfectado, de manera que fueran 20 litros de sustrato para cada
cepa, este sustrato se mantuvo en total aislamiento y se dejó incubar durante tres días
(Figura 3).
22
Figura 3. Inoculación de la suspensión de esporas de
Trichoderma spp. en sustrato desinfectado.
6.6. Elaboración de suspensión de esporas e inoculación de Fusarium oxysporum a la
raíz de nochebuena
Se realizó el conteo de esporas por cada cepa de Fusarium oxysporum en el arroz y
se elaboró una suspensión de 1 x 105 conidios de Fusarium oxysporum por mililitro de
sustrato. Se realizó la remoción del sustrato de la raíz de los esquejes de forma manual, y
posteriormente, se lavaron las raíces con agua estéril; una vez removido todo el sustrato, se
sumergieron las raíces de los esquejes en las suspensiones de Fusarium oxysporum (5
repeticiones para cada cepa) durante 20 minutos (Figura 4).
23
Figura 4. Raíces de los esquejes de nochebuena
sumergidas en suspensión de esporas de Fusarium
oxysporum.
6.7. Tratamientos y diseño experimental.
Se empleó un diseño factorial completo de tratamientos, mediante la combinación
de las cepas de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum seleccionadas en la evaluación in
vitro (Cuadro 3). A los productos del diseño factorial se adicionaron testigos de sustrato sin
desinfectar y sin inoculación de microorganismos, así como sustrato desinfectado sin
inoculación de microorganismos. La unidad experimental constó de una maceta de 5
pulgadas con una planta y se utilizó un diseño experimental completamente al azar con
cinco repeticiones (Figura 5).
24
Cuadro 3. Cepas de Trichoderma spp. y de Fusarium
oxysporum
Cepas
Fusarium oxysporum Trichoderma spp.
A3A Trich11
B1A Trich12
C2B Trich16
X3B Trich18 (Cepa comercial)
Trich20
Trich21
Trich24
Trich25
Figura 5. Aspecto de las plantas al segundo día
del trasplante.
25
6.8. Trasplante de esquejes e inoculación de Fusarium oxysporum al sustrato
Se realizó el trasplante de los esquejes a macetas de plástico de 5 pulgadas color
terracota, con 5 repeticiones para cada tratamiento, posteriormente, se realizó la inoculación
al sustrato de la suspensión de esporas de Fusarium oxysporum (Figura 6). Debido a
limitaciones de espacio en el área donde se realizó el estudio, se decidió realizar el proyecto
en dos ensayos.
Figura 6. Inoculación de suspensión de esporas de
Fusarium oxysporum al sustrato.
Para el ensayo 1 se obtuvieron 12 tratamientos, más 4 testigos de las cepas de
Trichoderma spp. y 3 testigos de las cepas de Fusarium oxysporum, así como un testigo al
que no fue inoculado cepa alguna, de sustrato sin desinfectar y uno de sustrato
desinfectado, obteniendo un total de 21 tratamientos, de 5 repeticiones cada uno (Cuadro
4), los cuales fueron monitoreados después de siete días, durante 11 días de forma continua
y después en 6 días de forma al azar, terminando el monitoreo a las cuatro semanas del
trasplante.
En el ensayo 2 se obtuvieron 12 tratamientos, más 6 testigos de las cepas de
Trichoderma spp. y 2 testigos de las cepas de Fusarium oxysporum, así como un de sustrato
sin desinfectar y uno de sustrato desinfectado testigo a los que no fueron inoculados con
cepa alguna, se obtuvieron un total de 22 tratamientos, de 5 repeticiones cada uno (Cuadro
26
5), los cuales fueron monitoreados después de siete días, durante 10 días de forma continua
y después en 10 días de forma al azar, terminado el monitoreo a los tres meses del
trasplante.
Cuadro 4. Cepas inoculadas en los tratamientos del ensayo 1
Tratamiento Cepas inoculadas
Fusarium oxysporum Trichoderma spp.
1 C2B Trich11
2 C2B Trich16
3 C2B Trich20
4 C2B Trich18
5 X3B Trich11
6 X3B Trich16
7 X3B Trich20
8 X3B Trich18
9 B1A Trich11
10 B1A Trich16
11 B1A Trich20
12 B1A Trich18
13 C2B Sin inoculación
14 X3B Sin inoculación
15 B1A Sin inoculación
16 Sin inoculación Trich11
17 Sin inoculación Trich16
18 Sin inoculación Trich20
19 Sin inoculación Trich18
20 Sin inoculación Sin inoculación
21 Sin inoculación Sin inoculación
Tratamiento 20= desinfectado; Tratamiento 21= sin desinfectar
27
Cuadro 5. Cepas inoculadas en los tratamientos del ensayo 2
Tratamiento Cepas inoculadas
Fusarium oxysporum Trichoderma spp.
23 C2B Trich12
24 C2B Trich25
25 C2B Trich24
26 C2B Trich21
27 C2B Trich16
28 C2B Trich18
29 A3A Trich12
30 A3A Trich25
31 A3A Trich24
32 A3A Trich21
33 A3A Trich16
34 A3A Trich18
35 Sin inoculación Trich12
36 Sin inoculación Trich25
37 Sin inoculación Trich24
38 Sin inoculación Trich21
39 Sin inoculación Trich16
40 Sin inoculación Trich18
41 C2B Sin inoculación
42 A3A Sin inoculación
43 Sin inoculación Sin inoculación
44 Sin inoculación Sin inoculación
Tratamiento 43=Sustrato desinfectado; Tratamiento 44=Sustrato sin desinfectar
28
6.9. Desarrollo de las plantas inoculadas
Después de la inoculación de Fusarium oxysporum, las plantas se colocaron en un
túnel de forma semicircular de 2.15 m de altura, con cubierta de polietileno blanco lechoso
con 30 % de transmisividad de luz y una malla sombra aluminizada con 50 % de sombra;
ubicado en las instalaciones del Campo Experimental de Zacatepec, del INIFAP. El túnel se
selló con plástico en las dos cabeceras para incrementar el efecto invernadero y generar un
estrés ambiental adicional por alta temperatura y baja humedad relativa. (Figura 7). El
tratamiento de estrés se aplicó durante tres días, para favorecer la infección de Fusarium
oxysporum a las plantas.
Figura 7. Desarrollo de plantas en túnel
6.10. Monitoreo de condiciones ambientales
Se colocó un equipo Hobo onset, con dispositivo de almacenamiento de datos, para
monitorear temperatura (ºC) y humedad relativa (%) cada hora durante el desarrollo de las
evaluaciones.
29
En el tiempo total de duración del ensayo 1, la temperatura vario de 18.2 ºC a
40.4ºC y la HR osciló entre 38.56% a 93.7%. Para el ensayo 2, la temperatura oscilo de
16.99ºC a 38.9 ºC y la humedad relativa oscilo entre 40.28 % a 99.49 %.
6.11. Variables medidas
Después de siete 7 de haber realizado el trasplante, se hicieron observaciones diarias
para detectar visualmente la presencia de plantas con síntomas de pudrición de raíz (Figura
8). La severidad de síntomas se cuantificó con la escala propuesta por Cotxarrera et al.
(2002) mostrada en el Cuadro 6.
Cuadro 6. Escala propuesta por Cotxarrera et al. (2002)
Escala Síntomas
0 Asintomático
1 Planta débilmente infectadas (≤50% de las hojas cloróticas o marchitas).
2 Plantas con alto nivel de infección (>50% de las hojas marchitas pero no
plantas muertas).
3 Plantas muertas
Con los datos recolectados de las variables evaluadas se realizó un análisis de
varianza, utilizando el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS 2000, versión 8.1.
En función de los resultados del análisis de varianza, se realizaron comparaciones de
medias de tratamientos, de acuerdo con la prueba de Tukey, con el mismo paquete
estadístico.
Una vez detectadas plantas con síntomas de pudrición de raíz, se tomaron muestras
de raíz, tallo y sustrato para determinar la presencia de Fusarium oxysporum y de
Trichoderma spp. Los resultados se contrastaron con la morfología del microorganismo en
los cultivos monospóricos de la cepa correspondiente de Trichoderma spp. o Fusarium
oxysporum según correspondiera.
30
Figura 8. Severidad de síntomas de acuerdo a la escala propuesta por
Cotxarrera et al. (2002)
6.12. Reaislamiento
Se realizaron aislamientos de tallo, raíz y sustrato para corroborar la presencia tanto
de Fusarium oxysporum como de Trichoderma spp. (Figura 9), y de esta forma se
determinaron las cepas de Fusarium oxysporum que presentaron mayor poder patogénico
(Figura10) y aquellas de Trichoderma spp. con mayor potencial antagónico.
Figura 9. Plantas nivel de escala 3 de severidad de síntomas de
pudrición de las cuales se realizaron aislamientos de raíz y tallo.
0 1 2 3
31
Por último, se realizó la medición de las siguientes variables de crecimiento en
planta terminada: altura, número de hojas, número de tallos y número de brácteas.
Figura 10. Muestras de Fusarium oxysporum obtenidas de los aislamientos de raíz,
tallo y sustratos de las plantas con nivel de incidencia 3 en los ensayos 1 y 2.
32
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Ensayo 1
7.1.1 Incidencia de Fusarium oxysporum
La incidencia observada en el primer monitoreo osciló entre el 0-80% de los
tratamientos. Los porcentajes más bajos de incidencia de Fusarium oxysporum en el primer
monitoreo se observaron en los tratamientos 6 y 14 (Cuadro 7), siendo el último el testigo
de la cepa X3B de Fusarium oxysporum. En el segundo monitoreo la mayoría de los
tratamientos mantuvieron el mismo porcentaje de incidencia de Fusarium oxysporum En el
caso de los testigos de Fusarium oxysporum en el tratamiento 14 el porcentaje de incidencia
aumentó, a diferencia del tratamiento 15, en el cual la incidencia disminuyó en gran
medida, al igual que para el tratamiento 7, que fue inoculado con las cepas Trich20 y X3B.
En el tercer monitoreo, la mayoría de los tratamientos mantuvieron sus porcentajes
de incidencia sin cambios, respecto al segundo. Solo en el tratamiento 13 testigo de la cepa
C2B de Fusarium oxysporum fue en donde el porcentaje de incidencia aumento al 100%,
siendo este el único tratamiento en mostrar una incidencia de Fusarium oxysporum en todas
sus repeticiones (Cuadro 7). Esto podría deberse a la amplia variación genética en las cepas
de Fusarium sp., que presentan variación en su efecto patogénico (Figueroa-Rivera, et. al.,
2010). Estos resultados difieren a los obtenidos por Navarret-Maya y colaboradores
(2009), quienes trabajaron con plantas de frijol, y en el cual, la incidencia fue del 100%, en
todos sus tratamientos; al mostrar todas las plantas algún nivel de daño.
7.1.2. Severidad de Fusarium oxysporum
Con los datos obtenidos de los monitoreos en base a la escala propuesta por
Cotxarrera et al. (2002), se realizaron análisis de varianza y separación de medias con la
prueba de Tukey (α=0.05). Para homogeneizar las varianzas, los datos de la severidad de
Fusarium oxysporum para cada repetición (R) fueron transformados con:
RTransformada= (R1.5
-1)/1.5, según Krause et al. (2001).
33
Cuadro 7. Incidencia (%) de Fusarium oxysporum para los tratamientos en
el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último
monitoreo (37 ddt).
Tratamiento Cepas Incidencia (%)
7 ddta)
22 ddt 37 ddt
1 Trich11 vs C2B 80 20 20
2 Trich16 vs C2B 20 0 0
3 Trich20 vs C2B 20 20 20
4 Trich18 vs C2B 60 80 80
5 Trich11 vs X3B 20 20 20
6 Trich16 vs X3B 0 0 0
7 Trich20 vs X3B 60 0 0
8 Trich18 vs X3B 20 0 0
9 Trich11 vs B1A 20 60 60
10 Trich16 vs B1A 20 20 20
11 Trich20 vs B1A 40 80 80
12 Trich18 vs B1A 40 60 60
13 C2B 80 80 100
14 X3B 0 20 0
15 B1A 60 20 0
16 Trich11 0 0 0
17 Trich16 0 0 0
18 Trich20 0 0 0
19 Trich18 0 0 0
20 Sin inoculación 0 0 0 a)ddt= días después del trasplante
No se encontraron diferencias significativas (Cuadro8) para los tratamientos del
ensayo 1 sobre el primer monitoreo (Pr>F=0.1893), pero el análisis de varianza indicó una
diferencia significativa para el monitoreo intermedio (Pr>F=<.0001); en este la prueba de
separación de medias permitió diferenciar tres niveles de significancia, con el máximo
valor de 2.29 para el tratamiento 13, al que solo se inoculó la cepa C2B de Fusarium
oxysporum, y al tratamiento 15, al que solo inoculo la cepa B1A de Fusarium oxysporum; y
el valor mínimo de 0.0, para el tratamientos: tratamiento 1 el cual se inoculó con las cepas
Trich11 y C2B, último el tratamiento 2 al que se inocularon las cepas Trich16 y C2B, el
34
tratamiento 6 se inoculó con las cepas Trich16 y B1A, el tratamiento 7 se inoculo con las
cepas Trich20 y X3B, el tratamiento 8 que fue inoculado con las cepas Trich18 y X3B, el
tratamiento 14 testigo de la cepa X3B de Fusarium oxysporum, el tratamiento 17 testigo de
la cepa Trich16 de Trichoderma spp., el tratamiento 18 testigo de la cepa Trich20 de
Trichoderma sp., el tratamiento 19 testigo de la cepa Trich18 de Trichoderma spp. y por
último el tratamiento 20 que no se inoculó con cepa alguna (Cuadro 9).
Cuadro 8. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo1, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre el primer
monitoreo (7 ddt), el monitoreo intermedio (15 ddt) y el ultimo monitoreo (37 ddt).
Fuente de
variación
Significancia (Pr>F)
Tratamientos Trichoderma spp. Fusarium
oxysporum.
Trichoderma spp.*
Fusarium oxysporum
7 ddta)
0.1893 0.4243 0.1544 0.2143
15 ddt <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
37 ddt <.0001 <.0001 <.0001 <.0001 a)ddt= días después del trasplante
De igual forma el análisis de varianza indicó una diferencia significativa (Cuadro 8)
para el ultimo monitoreo (Pr>F=<.0001) y la prueba de separación de medias permitió
diferenciar 8 niveles de significancia, con el máximo valor de 3.97 para el tratamiento 13,
testigo de la cepa C2B de Fusarium oxysporum y el tratamiento 15 testigo de la cepa B1A
de Fusarium oxysporum; y el valor mínimo de 0.0 para el tratamiento 2, el cual fue
inoculado con las cepas Trich16 y C2B, el tratamiento 6 que se inoculo con las cepas
Trich16 y X3B, el tratamiento 7 que fue inoculado con las cepas Trich20 y X3B, el
tratamiento 8 al que se inocularon las cepas Trich18 y X3B, el tratamiento 14 testigo de la
cepa X3B de Fusarium oxysporum, el tratamiento 18 testigo de la cepa Trich20 de
Trichoderma spp. y por último el tratamiento 19 testigo de la cepa Trich18 de Trichoderma
spp.(Cuadro 9).
Al realizar el análisis de varianza de los datos de severidad de síntomas no se
encontraron diferencias significativas (Cuadro 8) para el factor Trichoderma spp. sobre el
primer monitoreo (Pr>F=0.4243).
35
Cuadro 9. Severidad de síntomas de pudrición de raíz en los tratamientos del ensayo 1 para
el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt).
Tratamiento Cepas Severidad
7 ddta)
22 ddt 37 ddt
1 Trich11 vs. C2B 0.24 a 0.000 c 0.244 g
2 Trich16 vs. C2B 0.24 a 0.000 c 0.000 h
3 Trich20 vs. C2B 0.24 a 0.559 c 0.933 f
4 Trich18 vs. C2B 1.11 a 2.237 a 3.734 b
5 Trich11 vs. X3B 0.55 a 0.559 c 0.933 f
6 Trich16 vs. X3B 0.00 a 0.000 c 0.000 h
7 Trich20 vs. X3B 0.24 a 0.000 c 0.000 h
8 Trich18 vs. X3B 0.24 a 0.000 c 0.000 h
9 Trich11 vs. B1A 0.00 a 1.362 b 2.426 d
10 Trich16 vs. B1A 0.00 a 0.559 c 1.867 e
11 Trich20 vs. B1A 0.80 a 1.922 a b 3.734 b
12 Trich18 vs. B1A 1.11 a 2.052 a b 2.8 c
13 C2B 1.11 a 2.296 a 3.977 a
14 X3B 0.00 a 0.000 c 0.000 h
15 B1A 1.11 a 2.296 a 3.977 a
16 Trich11 0.55 a 0.559 c 1.867 e
17 Trich16 0.55 a 0.000 c 1.000 h
18 Trich20 0.00 a 0.00 c 0.000 h
19 Trich18 0.00 a 0.000 c 0.000 h
20 Sin inoculación 0.00 a 0.000 c 1.000 h Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
a)ddt= días después del trasplante
Para el monitoreo intermedio (Pr>F=<.0001) el análisis de varianza si mostró una
diferencia significativa (Cuadro 8) y la prueba de separación de medias permitió diferenciar
tres niveles de significancia, con valores que oscilan de 0.139 a 1.148. Entre los valores
más altos se encuentra la cepa Trich18 con una media de 1.072, y la cepa Trich16 con una
media de 0.13 para el valor más bajo (Cuadro 10).
Para el último monitoreo (Pr>F=<.0001), el análisis de varianza mostró nuevamente
diferencias significativas (Cuadro 8) y la prueba de separación de medias permitió
diferenciar cinco niveles de significancia. El segundo valor más alto fue nuevamente para la
36
cepa Trich18 con un valor de 1.633 y de igual forma la cepa Trich16 con el valor más bajo
0.46 (Cuadro 10).
Estas diferencias entre los monitoreos sugiere que aunque las cepas de Trichoderma
spp. utilizadas como agentes de control biológico, no protegieron en su totalidad a las
plantas inoculadas, éstas sí mostraron resistencia a la enfermedad gracias al poder
antagonista que poseen (Salazar, et. a.2011).
Cuadro 10. Medias de las cepas de Trichoderma spp. del ensayo 1 para el primer
monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt).
Tratamiento Trichoderma spp. Severidad
7 ddta)
22 ddt 37 ddt
20 Sin inoculación 0.55 a 1.148 a 1.989 a
16 Trich11 0.34 a 0.620 b 1.368 c
17 Trich16 0.20 a 0.139 c 0.467 e
18 Trich20 0.32 a 0.620 b 1.167 d
19 Trich18 0.68 a 1.072 a 1.633 b Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05),a) ddt= Días después del trasplante
Al realizar el análisis de varianza no se encontraron diferencias significativas
(Cuadro 8) para el factor Fusarium oxysporum sobre el primer monitoreo (Pr>F=0.1544).
Para el monitoreo intermedio (Pr>F=<.0001) el análisis de varianza sí mostró una
diferencia significativa (Cuadro 8) y la prueba de separación de medias permitió diferenciar
tres niveles de significancia. El nivel más alto lo mostró la cepa B1A con un valor de 1.638,
y la cepa X3B con el valor de 0.111 para el valor más bajo (Cuadro 11). Para el último
monitoreo (Pr>F=<.0001), el análisis de varianza mostró nuevamente diferencias
significativas (Cuadro 8) y la prueba de separación de medias permitió diferenciar cuatro
niveles de significancia. El valor más alto fue nuevamente para la cepa B1A con un valor
de 2.96 y de igual forma la cepa X3B con el valor de 0.18 para el valor más bajo (Cuadro
11).
No se encontraron diferencias significativas (Cuadro8) al realizar el análisis de
varianza para la interacción Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. sobre el primer
37
monitoreo (Pr>F= 0.2143), pero si para el monitoreo intermedio (Pr>F= <.0001) y el último
monitoreo (Pr>F= <.0001).
Cuadro 11. Severidad de síntomas de pudrición de raiz con las cepas de
Fusarium oxysporum del ensayo 1 para el primer monitoreo (7 ddt),
monitoreo intermedio (22 ddt) y el último monitoreo (37 ddt).
Tratamiento Fusarium
oxysporum
Severidad
7 ddta)
22 ddt 37 ddt
20 Sin inoculación 0.22 a 0.111 c 0.373 c
13 C2B 0.64 a 1.018 b 1.778 b
14 X3B 0.20 a 0.111 c 0.187 d
15 B1A 0.60 a 1.638 a 2.961 a Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05) ddt= Días después del trasplante
Al igual que en el estudio realizado por Figueroa-Rivera y colaboradores (2010) en
maíz, las cepas de Fusarium oxysporum utilizadas presentaron variación en su efecto
patogénico en las plantas de nochebuena al estar en competencia con cepas de Trichoderma
spp. y sin ellas.
7.1.3. Efecto de la inoculación de las cepas de Trichoderma spp. y Fusarium oxysporum
sobre las variables de crecimiento
Después de realizar el análisis de varianza a los datos de las plantas del ensayo 1 se
encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, para las variables de
crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo primario
(Cuadro 12). En general los tratamientos testigos de Trichoderma spp. mostraron estar entre
los valores mas altos, para todas las variables de crecimiento, en relación a esto, Cano
(2011) menciona que la interacción entre microorganismo-suelo-planta repercuten de forma
directa, en el crecimiento y desarrollo de la planta; y Trichoderma spp. tiene un efecto
estimulatorio vegetal, debido a la producción de diferentes metabolitos secundarios que
influyen directamente en la disponibilidad de nutrientes (Cano, 2011).
38
Para la variable de crecimiento: altura (Pr>F=<.0001), la prueba de comparación de
medias permitió diferenciar 9 niveles de significancia con valores que oscilan de 2.20 cm a
21.30 cm. El mayor valor para altura lo presentó el tratamiento 19, que fue el testigo de la
cepa de Trichoderma spp. Trich18. El menor valor para altura lo presentaron los
tratamientos 13 y 15, que fueron los testigos para las cepas C2B y B1A de Fusarium
oxysporum (Cuadro 13).
Cuadro 12. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 1, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre las variables
de crecimiento.
Fuente de variación
Significancia (Pr>F)
Tratamientos Trichoderma spp. Fusarium
oxysporum
Trichoderma
spp.* Fusarium
oxysporum
Altura (cm) <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
Numero de hojas <.0001 0.039 <.0001 0.0141
Numero de tallos <.0001 0.4493 <.0001 0.0082
Diámetro de tallo
primario(mm) <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
Para la variable de crecimiento: número de hojas (Pr>F=<.0001), la prueba de
separación de medias permitió diferenciar 4 niveles de significancia con valores que oscilan
de 5.40 a 37.40. El mayor valor para número de hojas lo presentó el tratamiento 20, que fue
al que no se inoculó cepa alguna. El menor valor para el numero de hojas lo presentaron los
tratamientos 13 y 15, que fueron los testigos para las cepas C2B y B1A de Fusarium
oxysporum (Cuadro 13).
Para la variable de crecimiento: número de tallos (Pr>F=<.0001), la prueba de
separación de medias permitió diferenciar tres niveles de significancia con valores que
oscilan de 1.00 a 11.80. El mayor valor para número de tallos lo presentó el tratamiento 20,
que fue el tratamiento al que no se inoculó cepa alguna. El tratamiento 4 al cual se
inocularon las cepas Trich18 y C2B mostro el valor más bajo, seguido del tratamiento 11 al
39
cual se inocularon las cepas Trich20 y B1A, el tratamiento 13 testigo de la cepa C2B y el
tratamiento 15 testigo de la cepa B1A de Fusarium oxysporum (Cuadro 14).
Cuadro 13. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en los
tratamientos del ensayo 1 en las variables de altura y número de hojas.
* Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
Se encontró una diferencia significativa entre los tratamientos, para la variable de
crecimiento: diámetro del tallo primario (Pr>F=<.0001), la prueba de separación de medias
permitió diferenciar 5 niveles de significancia con valores que oscilaron de 1.41 a 8.77. El
mayor valor para diámetro del tallo primario lo presentó el tratamiento 20, que fue el
tratamiento al que no se inoculó cepa alguna. El menor valor para número de hojas lo
presentaron el tratamiento 4 al cual se inocularon las cepas Trich18 y C2B, seguido del
tratamiento 11 al cual se inocularon las cepas Trich20 y B1A, el tratamiento 13 testigo de la
cepa C2B y el tratamiento 15 testigo de la cepa B1A de Fusarium oxysporum(Cuadro 14).
Tratamiento Cepas Altura(cm) No. Hojas
1 Trich11 vs. C2B 9.40 g 19.20 a b c d
2 Trich16 vs. C2B 15.00 c d e 31.00 a b c d
3 Trich20 vs. C2B 12.80 d e 23.00 a b c d
4 Trich18 vs. C2B 3.41 j 5.80 c d
5 Trich11 vs. X3B 11.00 f g 21.60 a b c d
6 Trich16 vs. X3B 17.30 b c 34.40 a b
7 Trich20 vs. X3B 15.30 c d 36.00 a
8 Trich18 vs. X3B 13.40 d e f 33.20 a b
9 Trich11 vs. B1A 6.60 h i 18.60 a b c d
10 Trich16 vs. B1A 8.40 g h 19.80 a b c d
11 Trich20 vs. B1A 4.00 i j 8.40 c
12 Trich18 vs. B1A 6.70 h 15.80 a b c d
13 C2B 2.20 j 5.40 d
14 X3B 12.60 e f 32.40 a b c
15 B1A 2.20 j 5.40 d
16 Trich11 8.40 g h 17.80 a b c d
17 Trich16 18.10 b 34.00 a b
18 Trich20 15.40 c d 26.20 a b c d
19 Trich18 21.30 a 31.20 a b c d
20 Sin inoculación 18.50 b 37.40 a
40
Cuadro 14. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp.
en los tratamientos del ensayo 1 en las variables de número de tallos,
diámetro del tallo primario y número de brácteas.
Tratamiento Cepas Número de
tallos
Diámetro del tallo
primario (mm)
1 Trich11 vs. C2B 4.20 b c 5.744 a b c d
2 Trich16 vs. C2B 5.60 a b c 7.882 a b
3 Trich20 vs. C2B 4.20 b c 5.986 a b c d
4 Trich18 vs. C2B 1.00 c 1.414 e
5 Trich11 vs. X3B 3.40 b c 4.418 b c d e
6 Trich16 vs. X3B 5.00 a b c 7.288 a b
7 Trich20 vs. X3B 4.80 a b c 7.010 a b c
8 Trich18 vs. X3B 5.00 a b c 6.118 a b c d
9 Trich11 vs.B1A 2.40 b c 3.356 c d e
10 Trich16 vs.B1A 2.80 b c 4.750 b c d e
11 Trich20 vs.B1A 1.20 c 1.744 e
12 Trich18 vs.B1A 2.40 b c 3.076 d e
13 C2B 1.40 c 1.620 e
14 X3B 5.40 a b c 7.178 a b c
15 B1A 1.40 c 1.620 e
16 Trich11 3.20 b c 4.346 b c d e
17 Trich16 5.20 a b c 7.498 a b
18 Trich20 5.00 a b c 7.556 a b
19 Trich18 10.00 b c 7.856 a b
20 Sin inoculación 11.80 a 8.772 a Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
Se encontraron diferencias significativas (Pr>F=<.0001), para el factor Trichoderma
spp. de las plantas del ensayo 1, sólo para las variables de crecimiento: altura y diámetro
del tallo primario (Cuadro 12).
Para la variable de crecimiento: altura, la prueba de separación de medias permitió
diferenciar tres niveles de significancia con valores que oscilan de 8.85cm a 14.70 cm. El
mayor valor para altura lo presentó la cepa Trich16, y la cepa Trich11 presento el valor más
bajo de 8.85. (Cuadro 15).
41
La prueba de comparación de medias permitió encontrar dos niveles de significancia
para la variable de crecimiento: número de hojas, con valores que oscilan de 19.30 a 29.80.
El mayor valor lo presentó de nueva cuenta la cepa Trich16, y la cepa Trich11 presentó el
valor más bajo (Cuadro 15).
Para la variable de crecimiento: diámetro del tallo primario, la prueba de separación
de medias permitió diferenciar dos niveles de significancia con valores que oscilan de 4.46
a 6.85mm. El mayor valor para diámetro del tallo primario lo presento nuevamente la cepa
Trich16, y la cepa Trich11 obtuvo el valor más bajo de 4.46mm; presentando ambas el
mismo comportamiento (Cuadro 15).
Cuadro 15. Medias del factor cepas de Trichoderma spp. del ensayo 1 para las variables de
crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo primario.
Tratamiento Trichoderma spp. Altura(cm) No. Hojas No.
Tallos
Diámetro de
tallo
primario(mm)
20 Sin inoculación 8.875 c 20.15 a b 5.00 a 4.797 b
16 Trich11 8.850 c 19.30 b 3.30 a 4.466 b
17 Trich16 14.700 a 29.80 a 3.75 a 6.854 a
18 Trich20 11.875 b 23.40 a b 4.60 a 5.574 a b
19 Trich18 11.202 b 21.50 a b 4.65 a 4.616 b Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
Se encontraron diferencias significativas (Pr>F=<.0001) para el factor cepas de
Fusarium oxysporum. en todas las variables de crecimiento (Cuadro 12).
Para la variable de crecimiento: altura, la prueba de separación de medias permitió
diferenciar cuatro niveles de significancia con valores que oscilan de 5.58 a 16.34. Entre las
cepas de Fusarium oxysporum el valor más alto lo presentó la cepa X3B, y la cepa B1A
obtuvo el valor más bajo (Cuadro 16).
Para la variable de crecimiento: número de hojas, la prueba de separación de medias
permitió diferenciar dos niveles de significancia con valores que oscilan de 13.60 a 31.52.
El mayor valor para número de hojas lo presentó la cepa X3B, y la cepa B1A obtuvo el
valor más bajo (Cuadro 16).
42
Para la variable de crecimiento: número de tallos, la prueba de separación de medias
permitió diferenciar tres niveles de significancia con valores que oscilan de 2.04 a 7.04.
Entre las cepas de Fusarium oxysporum el valor más alto lo presentó la cepa X3B, y la cepa
B1A presentó el valor más bajo. (Cuadro 16).
Para la variable de crecimiento: diámetro de tallo primario la prueba de separación
de medias permitió diferenciar tres niveles de significancia con valores que oscilan de 2.90
a 7.20. Entre las cepas de Fusarium oxysporum el valor más alto lo presentó la cepa X3B, y
la cepa B1A presentó el valor más bajo (Cuadro 16).
Cuadro 16. Efecto de la inoculación de cepas de Fusarium oxysporum en ensayo 1 en las
variables de crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo.
Tratamiento Fusarium
oxysporum Altura(cm)
No.
Hojas
No.
Tallos
Diámetro tallo
primario(mm)
20 Sin inoculación 16.34 a 29.32 a 7.04 a 7.205 a
13 C2B 8.56 c 16.88 b 3.24 b c 4.520 b
14 X3B 13.92 b 31.52 a 4.72 a b 6.402 a
15 B1A 5.58 d 13.60 b 2.04 c 2.909 c Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
No se encontraron diferencias significativas (Pr>F=0.4243) al realizar el análisis de
varianza para la interacción entre Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. sobre las
variables de crecimiento: número de hojas (Pr>F=0.0141) y número de tallos
(Pr>F=0.0082), aun después de haberse aplicado la prueba de separación de medias; pero sí
se encontraron diferencias significativas para las variables de crecimiento: altura
(Pr>F=<.0001) y diámetro del tallo primario (Pr>F=<.0001).(Cuadro 12).
7.2. Ensayo 2
7.2.1 Incidencia de Fusarium oxysporum
En este ensayo se utilizó la cepa A3A y la cepa C2B de Fusarium oxysporum,
seleccionada la última en el ensayo uno, por haber provocado la mayor incidencia y la
mayor cantidad de plantas muertas de entre todas las cepas de Fusarium oxysporum.
43
Cuadro 17. Incidencia (%) de Fusarium oxysporum en los tratamientos
del ensayo 2 en el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (22
ddt) y el último monitoreo (37 ddt).
Tratamiento Cepas Incidencia (%)
7 ddta)
22 ddt 37 ddt
23 Trich12 VS C2B 40 20 20
24 Trich25 VS C2B 100 60 60
25 Trich24 VS C2B 100 40 0
26 Trich21 VS C2B 100 60 20
27 Trich16 VS C2B 80 20 0
28 Trich18 VS C2B 60 20 0
29 Trich12 VS A3A 100 20 0
30 Trich25 VS A3A 60 0 0
31 Trich24 VS A3A 80 20 0
32 Trich21 VS A3A 60 60 0
33 Trich16 VS A3A 60 40 40
34 Trich18 VS A3A 80 60 0
35 Trich12 0 0 0
36 Trich25 0 0 0
37 Trich24 0 0 0
38 Trich21 0 0 0
39 Trich16 0 0 0
40 Trich18 0 0 0
41 C2B 100 20 20
42 A3A 80 20 20
43 Sin inoculación 0 0 0
a)ddt= días después del trasplante
La incidencia observada en el primer monitoreo osciló entre el 0-100% en los
tratamientos. Los porcentajes más bajos fueron para los testigos de las cepas de
Trichoderma spp. y el testigo sin ninguna inoculación. A diferencia del ensayo anterior, en
este ensayo se observaron varios tratamientos con el 100% de incidencia de secadera
(Cuadro 17). Estudios realizados por Gonzales y colaboradores (2012), mencionan que
después haber inoculado a la planta con Fusarium oxysporum, la infección a la raíz ocurre
en las siguientes 24 horas, sin embargo su colonización está restringida a las reacciones de
44
defensa que la planta presente, lo que podría explicar el porqué de la disminución de la
incidencia para el monitoreo intermedio y el ultimo.
En el segundo monitoreo el porcentaje de incidencia de Fusarium oxysporum
disminuyó en la mayoría de los tratamientos, con la excepción del tratamiento 32, que
mantuvo el mismo porcentaje de incidencia. En el último monitoreo la mayoría de los
tratamientos disminuyeron sus porcentajes de incidencia, solo los tratamientos 23, 24, 30,
33, 41 y 42 mantuvieron sus porcentajes de incidencia (Cuadro 17).
7.2.2. Severidad de Fusarium oxysporum
El análisis de varianza no mostró ningúna diferencia significativa (Cuadro 18) para
los tratamientos del ensayo 2 sobre los datos del primer monitoreo (Pr>F=0.0249), el
intermedio (Pr>F=0.3117) y el último (Pr>F=0.2025), pero al aplicar la prueba de
separación de medias se logró diferenciar dos grupos para el primer monitoreo con un valor
máximo de 1.60 para el tratamiento 27, el cual fue inoculado con las cepas Trich16 y C2B;
y un valor mínimo de 0.00 para el tratamiento 32, el cual fue inoculado con las cepas
Trich21 y A3A, para el tratamiento 33, el cual fue inoculado con las cepas Trich16. y A3A;
y para el tratamiento 34, que fue inoculado con las cepas Trich18 y A3A (Cuadro 19).
Cuadro 18. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 2, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre el primer
monitoreo (07 ddt), el monitoreo intermedio (15 ddt) y el ultimo monitoreo (30 ddt).
Fuente de
variación
Significancia (Pr>F)
Tratamientos Trichoderma spp. Fusarium
oxysporum
Trichoderma spp.*
Fusarium oxysporum
7 ddta)
0.0249 0.5064 0.0029 0.0876
45 ddt 0.3117 0.7087 0.2729 0.1847
90 ddt. 0.2025 0.0858 0.8564 0.3092 a)ddt= Días después del trasplante
45
Al realizar el análisis de varianza no se encontraron diferencias significativas
(Cuadro 18) para el factor Trichoderma spp. sobre el primer monitoreo (Pr>F=0.5064), el
monitoreo intermedio (Pr>F=0.7087 ) y el ultimo monitoreo (Pr>F= 0.0858).
Cuadro 19. Efecto de los tratamientos del ensayo 2 en la severidad de
síntomas de secadera para el primer monitoreo (7 ddt), monitoreo
intermedio (51 ddt) y el último monitoreo (95 ddt).
Tratamiento Cepas Severidad
7 ddta)
51 ddt 95 ddt
23 Trich12 vs. C2B 0.487 a b 0.559 a 0.559 a
24 Trich25 vs. C2B 0.487 a b 1.420 a 1.421 a
25 Trich24 vs. C2B 0.731 a b 0.487 a 0.000 a
26 Trich21 vs. C2B 1.047 a b 1.177 a 0.933 a
27 Trich16 vs. C2B 1.606 a 0.243 a 0.000 a
28 Trich18 vs. C2B 1.047 a 0.243 a 0.000 a
29 Trich12 vs. A3A 0.487 a b 0.243 a 0.000 a
30 Trich25 vs. A3A 0.975 a b 0.000 a 0.000 a
31 Trich24 vs. A3A 0.487 a b 0.487 a 0.000 a
32 Trich21 vs. A3A 0.000 b 0.487 a 0.000 a
33 Trich16 vs. A3A 0.000 b 0.000 a 1.866 a
34 Trich18 vs. A3A 0.000 b 0.731 a 0.000 a
35 Trich12 0.243 a b 0.000 a 0.000 a
36 Trich25 0.803 a b 0.487 a 1.362 a
37 Trich24 0.731 a b 0.000 a 0.000 a
38 Trich21 0.975 a b 0.243 a 0.243 a
39 Trich16 1.290 a b 0.243 a 0.243 a
40 Trich18 0.975 a 0.000 a 0.000 a
41 C2B 0.731 a b 0.000 a 0.933 a
42 A3A 0.487 a b 0.000 a 0.933 a
43 Sin inoculación 0.731 a b 1.177 a 1.177 a Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05), a)ddt= días después del trasplante
De igual forma no se encontraron diferencias significativas (Cuadro 18) para el
factor Fusarium oxysporum sobre el primer monitoreo (Pr>F=0.0029), el intermedio
(Pr>F=0.2729) y el ultimo (Pr>F=0.8564). Para el primer monitoreo la prueba de
46
separación de medias permitió diferenciar dos niveles de significancia. El valor más alto
fue para la cepa C2B con el valor de 0.876 (Cuadro 20).
El análisis de varianza no mostró diferencias significativas (Cuadro 18) para la interacción
Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. sobre el primer monitoreo (Pr>F=0.0876), el
intermedio (Pr>F=0.1847 ) y el ultimo (Pr>F=3092).
Cuadro 20. Medias de las cepas de Fusarium oxysporum del ensayo 2 para el primer
monitoreo (7 ddt), monitoreo intermedio (51 ddt) y el último monitoreo (95 ddt).
Tratamiento Fusarium
oxysporum
Severidad
7 ddt a)
51 ddt 95 ddt.
43 Sin inoculación 0.821 a 0.307 a 0.432 a
41 C2B 0.876 a 0.590 a 0.549 a
42 A3A 0.348 b 0.278 a 0.400 a
Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05), a)ddt= días después del trasplante
7.2.3. Efecto de la inoculación de las cepas de Trichoderma spp. y Fusarium
oxysporum. sobre las variables de crecimiento
Al igual que Sosa y colaboradores (2006) en un estudio realizado con Brachiaria
decumbens, en donde los valores obtenidos para los parámetros de crecimiento de la planta
evaluados, sugieren que el efecto de la interacción entre los microorganismos sobre la
planta hospedera fue de tipo neutral; en este ensayo los valores mostrados por los
tratamientos inoculados con las cepas de Trichoderma spp. no mostraron diferencias
significativas en las variables de crecimiento: altura (Pr>F=0.7901), número de hojas
(Pr>F=0.0041), número de tallos (Pr>F=0.4379), diámetro de tallo primario (Pr>F=0.3095)
y número de brácteas (Pr>F=0.0002) en las plantas del ensayo 2 (Cuadro 21), al
compararse con los tratamientos inoculados con las cepas de Fusarium oxysporum y el
tratamiento sin inoculación de cepas
La prueba de separación de medias permitió diferenciar dos niveles de significancia
para las variables de crecimiento: número de hojas con valores que oscilan de 2.8 a 11.6, el
47
tratamiento 26 inoculado con las cepas Trich21 y la cepa C2B mostró el valor más bajo y el
tratamiento 40 testigo de la cepa Trich18 de Trichoderma spp. mostró el valor más alto y
para la variable número de brácteas con valores que oscilan de 2.8 a 15.4, nuevamente el
tratamiento 40 mostró el valor más alto y con el valor más bajo el tratamiento 33 con
inoculación de la cepas Trich16 y la cepa A3A (Cuadro 22).
Cuadro 21. Valores de ANOVA para los tratamientos del ensayo 2, el factor Trichoderma
spp., el factor Fusarium oxysporum y la interacción de ambos factores, sobre las variables
de crecimiento.
Fuente de
variación
Significancia (Pr>F)
Tratamientos Trichoderma spp. Fusarium
oxysporum
Trichoderma
spp.* Fusarium
oxysporum
Altura (cm) 0.7901 0.8675 0.7018 0.5178
Numero de hojas 0.0041 0.0082 0.0221 0.0782
Numero de tallos 0.4379 0.5441 0.8208 0.2575
Diámetro de tallo
primario(mm) 0.3095 0.0314 0.844 0.77
Número de brácteas 0.0002 0.0004 0.1333 0.0077
No se encontraron diferencias significativas, para el factor Trichoderma spp.
(Cuadro 21) en las variables de crecimiento: altura (Pr>F=0.8675), número de hojas
(Pr>F=0.0082), número de tallos (Pr>F=0.5441), diámetro del tallo primario
(Pr>F=0.0314) y número de brácteas (Pr>F=0.0004).
La prueba de separación de medias permitió diferenciar dos niveles de significancia
para la variable de crecimiento número de brácteas con valores que oscilan de 5.26 a 12.40,
con el valor más alto para la cepas Trich18 y el valor más bajo para la cepa Trich21
(Cuadro 23).
No se encontraron diferencias significativas (Cuadro 21), para el factor Fusarium
oxysporum en las variables de crecimiento: altura (Pr>F=0.7018), número de hojas
48
(Pr>F=0.0221), número de tallos (Pr>F=8208), diámetro del tallo primario (Pr>F=0.8440)
y número de brácteas (Pr>F=0.1333).
Cuadro 22. Efecto de las cepas de Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. en los
tratamientos sobre las variables de altura, número de hojas, número de tallos, diámetro del
tallo primario y número de brácteas.
Tratamiento Cepas Altura
(cm) No. hojas
No.
Tallos
D. Tallo
primario
(mm)
No.
Brácteas
23 Trich12 vs C2B 9.5 a 7.0 a b 3.6 a 0.700 a 5.8 a b
24 Trich25 vs C2B 8.0 a 5.2 a b 2.8 a 0.660 a 5.6 a b
25 Trich24 vs C2B 11.7 a 4.2 a b 2.6 a 0.720 a 5.4 a b
26 Trich21 vs C2B 8.6 a 2.8 b 2.2 a 0.540 a 4.8 a b
27 Trich16 vs C2B 12.1 a 7.4 a b 3.8 a 0.660 a 6.2 a b
28 Trich18 vs C2B 10.5 a 9.6 a b 3.0 a 0.680 a 12.5 a b
29 Trich12 vs A3A 9.5 a 4.0 a b 2.8 a 0.620 a 4.8 a b
30 Trich25 vs A3A 11.6 a 9.0 a b 3.4 a 0.700 a 13.0 a b
31 Trich24 vs A3A 8.9 a 4.2 a b 3.0 a 0.700 a 4.6 a b
32 Trich21 vs A3A 10.8 a 3.2 b 3.4 a 0.640 a 7.2 a b
33 Trich16 vs A3A 6.1 a 3.8 a b 1.6 a 0.380 a 2.8 b
34 Trich18 vs A3A 10.7 a 6.0 a b 3.2 a 0.680 a 9.2 a b
35 Trich12 12.5 a 6.8 a b 2.8 a 0.680 a 10.6 a b
36 Trich25 8.8 a 4.2 a b 3.0 a 0.660 a 3.0 b
37 Trich24 11.4 a 8.4 a b 3.4 a 0.680 a 6.0 a b
38 Trich21 9.4 a 7.2 a b 3.0 a 0.640 a 3.8 a b
39 Trich16 9.0 a 5.8 a b 3.0 a 0.560 a 8.8 a b
40 Trich18 11.3 a 11.6 a 3.2 a 0.600 a 15.4 a
41 C2B 9.9 a 7.8 a b 2.4 a 0.460 a 9.4 a b
42 A3A 9.5 a 6.8 a b 2.2 a 0.520 a 6.2 a b
43 Sin inoculación 10.4 a 9.2 a b 2.4 a 0.500 a 15.2 a Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
No se encontraron diferencias significativas (Cuadro 21) al realizar el análisis de
varianza para la interacción entre Fusarium oxysporum y Trichoderma spp. (Pr>F=0.4243)
sobre las variables de crecimiento: altura (Pr>F=0.5178) número de hojas (Pr>F=0.0782),
número de tallos (Pr>F=0.2575), diámetro de tallo primario (Pr>F=0.7700) y número de
brácteas (Pr>F=0.0077).
49
Cuadro 23. Medias del factor cepas de Trichoderma spp. del ensayo 2 para las variables de
crecimiento: altura, número de hojas, número de tallos y diámetro del tallo primario.
Tratamiento Trichoderma spp. Altura
(cm)
Número
de hojas
Número
de tallos
D. Tallo
primario
(mm)
Número
de
brácteas
43 Sin inoculación 9.933 a 7.933 a 2.333 a 0.493 a 10.267 a b
35 Trich12 10.500 a 5.933 a 3.066 a 0.666 a 7.067 b
36 Trich25 9.467 a 6.133 a 3.066 a 0.673 a 7.200 a b
37 Trich24 10.667 a 5.600 a 3.000 a 0.693 a 5.333 b
38 Trich21 9.600 a 4.400 a 2.866 a 0.606 a 5.267 b
39 Trich16 9.067 a 5.667 a 2.800 a 0.533 a 5.933 b
40 Trich18 10.833 a 9.067 a 3.133 a 0.653 a 12.400 a Medias con la misma letra no poseen diferencias significativas (α=0,05)
50
8. CONCLUSIONES
Todas las cepas de Trichoderma spp. evaluadas superaron el efecto antagonista
contra Fusarium oxysporum de la cepa comercial sobresaliente (Trich18).
Todas las cepas de Fusarium oxysporum evaluadas mostraron patógenicidad a las
plantas nochebuena cv. Freedom Red.
Las tres cepas nativas (Trich11, Trich16, Trich20) de Trichoderma spp. utilizadas
en el ensayo 1, mostraron variación en su capacidad antagonista contra Fusarium
oxysporum al presentar diferentes niveles de incidencia y severidad de pudrición de raíz.
La cepa comercial (Trich18) de Trichoderma spp. mostró muy poca capacidad
antagonica, al estar en competencia con Fusarium oxysporum, ya que sus tratamientos
tuvieron el mayor número de plantas infectadas (hasta 80%) y mostraron valores altos en
los promedios de severidad en los tres monitoreos (0.68, 1.07 y 1.63)
La cepa comercial (Trich18) de Trichoderma spp. mostró un efecto estimulatorio al
crecimiento de las plantas de nochebuena, ya que aquellas que sobrevivieron a la
inoculación de Fusarium oxysporum, mostraron valores por encima del promedio para las
variables de crecimiento: altura, número de hojas y diámetro del tallo primario.
Las cepas de Fusarium oxysporum utilizadas en el ensayo 1, mostraron variación en
su patógenicidad hacia las plantas de nochebuena, la cepa C2B fue la que provoco el mayor
número de plantas infectadas y el mayor número de plantas muertas.
Las cinco cepas nativas de Trichoderma spp.( Trich12, Trich25, Trich24, Trich21,
Trich16) utilizadas en el ensayo 2, mostraron variación en su capacidad antagonista contra
Fusarium oxysporum, al presentar diferentes niveles de severidad de síntomas de secadera.
Las cepas nativas de Trichoderma spp. utilizadas en ambos ensayos mostraron
variación en su efecto estimulatorio al crecimiento de las plantas de nochebuena.
51
9. PERSPECTIVAS
Las grandes posibilidades de uso de las cepas de Trichoderma spp. en el control de
enfermedades en ornamentales estimula las investigaciones a futuro.
Uno de los objetivos a futuro será el de combinar las diferentes cepas de
Trichoderma y probar su efecto contra la cepa patogénica de Fusarium oxysporum
seleccionada.
Realizar pruebas de las cepas de Trichoderma spp., en diferentes cultivos agrícolas
y ornamentales.
Realizar pruebas de las cepas de Trichoderma spp. con otros fitopatógenos de
importancia agrícola, para identificar las posibles interacciones y antagonismos.
52
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