INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
FACTORES QUE AFECTAN LA SECRECIÓN DE AGPs Y SU
RELACIÓN CON EL CRECIMIENTO Y LA FORMACIÓN DE
AGREGADOS EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTORADO EN CIENCIAS
EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA
I.Q. M.B JACQUELINE CAPATAZ TAFUR
DIRECTORAS
Dra. GABRIELA TREJO TAPIA
Dra. GABRIELA SEPÚLVEDA JIMÉNEZ
Yautepec, Morelos. México. Junio, 2010
Esta tesis corresponde a los estudios realizados con una beca
otorgada a Jacqueline Capataz Tafur por CONACyT
(233250) y del Programa Institucional de Formación de
Investigadores (PIFI). Se contó con los apoyos económicos
de los proyectos SIP-IPN (20070118, 20080101, 20090311)
El trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología
del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi)
del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra.
Gabriela Trejo Tapia y la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez.
A mis padres Tercilia y César Enrique y a mi hermano
César Antonio que desde la distancia estuvieron siempre
conmigo brindándome su amor y apoyo incondicional.
A Paul Mauricio, por su amor y su ternura.
AGRADECIMIENTOS
Mi sincero agradecimiento a todas aquellas personas que de algún modo participaron en la
realización del presente trabajo.
A mis Directoras de tesis, Dra. Gabriela Trejo Tapia y Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez, por
el apoyo que me brindaron durante mi estadía en México, por su paciencia y confianza durante
la realización de este trabajo.
A los miembros de mi comité revisor:
- Dr. Mario Rodríguez Monroy por su amistad y contribución en la realización de este
proyecto de investigación.
- Dra. Kalina Bermúdez Torres, Dr. Alfredo Jiménez Pérez y Dr. Alejandro Zamilpa Álvarez
por las observaciones y opiniones que aportaron y contribuyeron a la mejora del trabajo.
Esta tesis no es el único resultado de mi estancia en el CeProBi, me llevo conmigo la
experiencia compartida con ustedes, con mis compañeros de estudios, docentes de CeProBi y
sobre todo su invaluable amistad.
Agradezco de forma especial al Instituto Politécnico Nacional y al Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología por las becas otorgadas para mis estudios de Doctorado.
CONTENIDO
Página
ÍNDICE DE FIGURAS .............................................................................................................. ii
ÍNDICE DE CUADROS ........................................................................................................... iv
RESUMEN ................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ............................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 3
CAPÍTULO 1. LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANAS EN CULTIVOS DE
CÉLULAS VEGETALES .......................................................................................................... 5
CAPÍTULO 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE SACAROSA EN EL
CRECIMIENTO CELULAR Y LA SECRECIÓN DE AGPs EN SUSPENSIONES
CELULARES DE Beta vulgaris L. .......................................................................................... 24
CAPÍTULO 3. SECRECIÓN DE AGPs EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L. EN
RESPUESTA AL ESTRÉS OSMÓTICO ................................................................................ 43
CAPÍTULO 4. RELACIÓN DE LAS AGPs Y LA AGREGACIÓN CELULAR EN
SUSPENSIONES DE Beta vulgaris L. .................................................................................... 58
DISCUSIÓN GENERAL ......................................................................................................... 81
CONCLUSIONES .................................................................................................................... 85
ANEXOS .................................................................................................................................. 86
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Distribucion y función de las AGPs en las plantas. ..................................................... 6
Figura 2. Representación esquemática de la estructura de las AGPs .......................................... 8
Figura 3. Representación esquemática de la clasificación y de la composición de las AGPs
clásicas y no clásicas. .................................................................................................................. 9
Figura 4. Estructura química de los fenilglucósidos conocidos como el reactivo de Yariv. ..... 10
Figura 5. Representación esquemática del proceso de biosíntesis de las AGPs ....................... 11
Figura 6. Curva tipo de azúcares totales, utilizando como estándar galactosa. ......................... 28
Figura 7. Curva tipo de proteína. ............................................................................................... 29
Figura 8. Curva tipo de goma arábiga para la cuantificación de AGPs por el método de
difusión radial en gel de agarosa. .............................................................................................. 30
Figura 9. Representación esquemática de la electroforesis cruzada. ......................................... 32
Figura 10. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en el crecimiento celular de Beta
vulgaris. ..................................................................................................................................... 33
Figura 11. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en la secreción de AGPs en
suspensiones celulares de Beta vulgaris. ................................................................................... 34
Figura 12. Distribución del tamaño de los agregados celulares de Beta vulgaris a
diferentes concentraciones iniciales de sacarosa ....................................................................... 35
Figura 13. Electrofóresis cruzada de las AGPs de Beta vulgaris obtenidas a diferentes
concentraciones iniciales de sacarosa. ....................................................................................... 36
Figura 14. Fraccionamiento del material extracelular de Beta vulgaris utilizando
cromatografía de interacción hidrofóbica. ................................................................................ 37
Figura 15. Electroforesis cruzada de las fracciones B y C. ....................................................... 38
Figura 16. Curva tipo de sacarosa para la cuantificación de azúcares residuales por el
método fenol-sulfúrico. ............................................................................................................. 47
Figura 17. Cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de células de Beta
vulgaris alimentadas con azúcares ............................................................................................ 49
Figura 18. Cinéticas de secreción y de rendimiento específico de AGPs de Beta vulgaris
alimentadas con azúcares........................................................................................................... 50
Figura 19. Cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de celúlas de Beta
vulgaris alimentadas con NaCl y polietilenglicol ..................................................................... 52
Figura 20. Cinéticas de secreción y de rendimiento específico de AGPs de Beta vulgaris
alimentadas con NaCl y polietilenglicol. ................................................................................... 53
Figura 21. Curva tipo para la cuantificación de las AGPs de pared celular por el método
colorímetrico. ............................................................................................................................. 64
Figura 22. Cinéticas de crecimiento celular de las suspensiones de Beta vulgaris. .................. 67
Figura 23. Contenido de AGPs en las suspensiones de Beta vulgaris. ..................................... 70
Figura 24. Distribución de las fracciones de tamaños de agregados en las suspensiones de
Beta vulgaris. ............................................................................................................................. 73
Figura 25. Fotomicrografías de los agregados celulares de Beta vulgaris durante la cinética
de crecimiento............................................................................................................................ 74
Figura 26. Modelo hipotético para la secreción de AGPs y su relación con el crecimiento y
la agregación celular. ................................................................................................................. 83
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de sacarosa en los parámetros cinéticos de las
suspensiones celulares de Beta vulgaris. ................................................................................... 34
Cuadro 2. Composición de las fracciones del materialextracelular de Beta vulgaris. .............. 37
Cuadro 3. Sustancias utilizadas para llevar el potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1
, en
suspensiones celulares B. vulgaris. ........................................................................................... 46
Cuadro 4. Efecto del aumento del potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1
en la biomasa,
secreción de AGPs y rendimiento de AGPs en suspensiones celulares de Beta vulgaris. ........ 54
Cuadro 5. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la biomasa de las
suspensiones celulares de Beta vulgaris. ................................................................................... 68
Cuadro 6. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en el contenido de AGPs de
la pared y del medio de cultivo de Beta vulgaris. ..................................................................... 71
Cuadro 7. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la formación de agregados
de Beta vulgaris. ........................................................................................................................ 74
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue conocer los factores que influyen en la secreción de
AGPs y su relación con el crecimiento y la agregación celular de los cultivos de células de
Beta vulgaris L. A medida que se incrementó la concentración inicial de sacarosa (CIS) de
43.8 mM a 131.5 mM, los cultivos aumentaron el crecimiento celular y la secreción
volumétrica de AGPs. En respuesta al aumento de la CIS, las células tendieron a agregarse,
coincidiendo con una mayor secreción de AGPs, sugiriendo que estas glicoproteínas funcionan
como moléculas de adhesión celular. Al aumentar el potencial osmótico mediante la adición
de manitol, sorbitol, polietilenglicol y NaCl; las células de B. vulgaris incrementaron la
secreción y la acumulación específica de las AGPs en comparación al cultivo sin adición,
indicando que la secreción de AGPs es parte de la respuesta celular al estrés osmótico. Por
otro lado, a medida que las células tendieron a agregarse se observó un incremento del
contenido de AGPs en la pared celular (PC) y en el medio de cultivo (MC). Cuando la
glicosilación de proteínas fue inhibida con tunicamicina (TM), disminuyó el contenido de
AGPs, tanto en la PC como en el MC. Lo cual se relacionó con una disminución del
crecimiento y en la formación de agregados celulares de menor tamaño. Al retirar la TM de
los cultivos, las células volvieron a sintetizar las AGPs en la PC y secretarlas al MC, y hubo
una recuperación del crecimiento celular y la formación de agregados celulares de mayor
tamaño. La precipitación de AGPs por su interacción con el reactivo de Yariv redujo el
contenido de las AGPs en la PC y su secreción hacia el MC fue totalmente inhibida. Este
evento fue paralelo con la disminución del crecimiento celular y del tamaño de los agregados.
Al retirar el reactivo de Yariv de los cultivos, el contenido de AGPs en la PC y su secreción al
MC no se recuperó al igual que el crecimiento y la formación de agregados. Estos datos
indican que las AGPs de B. vulgaris, son requeridas en la agregación celular.
ABSTRACT
The aim of this study was to determine the factors that influence the secretion of AGPs and
their relationship with growth and cell aggregation of cell cultures of Beta vulgaris L. As the
initial concentration of sucrose (ISC) was increased from 43.8 mM to 131.5 mM, the cultures
enhanced their cell growth and AGPs secretion. In response to the increase in ISC, the cells
tended to aggregate, coinciding with increased secretion of AGPs, suggesting that these
glycoproteins function as cell adhesion molecules. By raising the osmotic potential by the
addition of mannitol, sorbitol, polyethylene glycol and NaCl, the B. vulgaris cells enhanced
the AGPs secretion and specific accumulation of these molecules in relation to the control,
suggesting that the AGPs secretion is part of the cellular response to osmotic stress. On the
other hand, as the cells tended to aggregate, it was observed an increase of the content of
AGPs in the cell wall (CW) and in the culture medium (CM). When protein glycosylation was
inhibited with tunicamycin (TM), there was a reduction in the AGPs content, in both the CW
and the MC. These were associated with a decrease of the cell growth and the formation of
smaller cell aggregates. When TM was removed from the media culture, the cells re-
synthesized AGPs in the CW and secreted them into the MC, and there was a recovery of cell
growth and the formation of larger cell aggregates. The precipitation of AGPs by its
interaction with the Yariv reagent led to the reduction of the content of AGPs in the PC and
their secretion into the CM was completely inhibited. This event was parallel with the
decrease in cell growth and size of the aggregates. After, removing the Yariv reagent, the
content of AGPs in the CW and its secretion to MC did not recover as well as the growth and
formation of aggregates. These data indicate that AGPs of B. vulgaris, are required in cell
aggregation.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son proteoglicanos de alto peso molecular,
ampliamente distribuidos en el reino vegetal y están presentes en la pared celular, en el
apoplasto, en la membrana plasmática y en el medio de cultivo de las células vegetales en
suspensión. Estas moléculas están implicadas en el crecimiento y el desarrollo vegetal, y en la
adhesión célula-célula.
Los cultivos en suspensión de Beta vulgaris L. tienden a acumular AGPs en el medio
extracelular y aumentar el tamaño de sus agregados a lo largo del tiempo del cultivo. Sin
embargo, los estudios de los factores involucrados con la secreción de AGPs son escasos y no
se conoce la relación de estas glicoproteínas con el crecimiento y la formación de agregados
celulares. La producción de arabinogalactanas, el principal polisacárido de las AGPs fue
incrementado al variar la concentración inicial de sacarosa en cultivos celulares de Silene
vulgaris (Moench) Garcke. También, el estrés salino puede ser un factor que afecta el
crecimiento y la secreción de AGPs en los cultivos de células vegetales. Por lo cual es
importante conocer el efecto de la concentración de sacarosa y de estrés osmótico sobre la
secreción de AGPs en cultivos celulares.
En base a las consideraciones expuestas, en el presente trabajo se estudiaron algunos de
los factores que podrían afectar la secreción de las AGPs por las células de B. vulgaris, tales
como la concentración inicial de sacarosa y el estrés osmótico. Así mismo, se estudió la
relación de la acumulación de las AGPs en el medio de cultivo con el crecimiento y la
agregación celular de Beta vulgaris. El documento de tesis se organizó de la siguiente manera:
En el Capítulo 1 se presenta una revisión de las AGPs, en cuanto a su composición,
clasificación y biosíntesis, así como su participación en el crecimiento y la diferenciación de
los cultivos de células vegetales. Además, se señalan algunos de los factores fisicoquímicos
que se podrían considerar en la secreción de las AGPs. Parte de esta revisión fue publicada en
4
la revista Interciencia, mar. 2009, 34(3): 170-176. ISSN 0378-1844.
En el Capítulo 2 se presentan los resultados del efecto de la concentración inicial de
sacarosa (CIS) en el crecimiento celular y la secreción de AGPs de las suspensiones celulares
de Beta vulgaris L. Parte de estos resultados fueron publicados en la revista Acta Physiologiae
Plantarum, doi:10.1007/s11738-010-0460-7.
En el Capítulo 3 se abordó el efecto del estrés osmótico en la secreción de las AGPs en
suspensiones celulares de B. vulgaris elevando el potencial osmótico del medio de cultivo
mediante la adición de manitol, sorbitol, NaCl y polietilenglicol (PEG).
En el Capítulo 4 se estudió la relación de AGPs con la agregación celular, a través del uso
de un inhibidor de la glicosilación de proteínas, la tunicamina (TM) y la reducción de su
acumulación por el tratamiento con el reactivo de Yariv. Estos resultados fueron sometidos
para publicación en la revista Biologia Plantarum.
Finalmente se presenta una discusión general de todos los resultados encontrados y se
propone un modelo de la secreción de las AGPs en respuesta a la CIS y al estrés osmótico, así
como su relación con el crecimiento y la agregación celular.
CAPÍTULO 1. LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANAS EN CULTIVOS DE
CÉLULAS VEGETALES
INTRODUCCIÓN
Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son macromoléculas muy glicosiladas,
distribuidas ampliamente en el reino vegetal y se encuentran prácticamente en todos los
órganos de las plantas, como son las flores, el tallo, las raíces, las semillas y las hojas. Las
AGPs están implicadas en varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas, tales
como la diferenciación de tejidos reproductivos y vegetativos, la expansión y la proliferación
celular y, la muerte celular programada (Figura 1). A nivel celular, estás glicoproteínas se
localizan principalmente en la membrana plasmática, en la pared celular, o como secreciones
en el espacio intercelular (Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000; Showalter, 2001;
Rumyantseva, 2005).
El carbohidrato de las AGPs consiste en arabinogalactanas (AG) del tipo II, de donde
reciben el nombre estas glicoproteínas. Las AGPs pertenecen a la familia de las proteínas ricas
en hidroxiprolina (HRGPs), que también incluye a las extensinas, a las proteínas ricas en
prolina y a las lectinas (Nothnagel, 1997; Majeswska-Sawka y Nothnagel, 2000). Desde un
punto de vista práctico, las AGPs se diferencían de las otras HRGPs, por su capacidad de
unirse a un colorante sintético conocido como el reactivo de Yariv (Yariv et al., 1967).
Asimismo, el reactivo de Yariv, los anticuerpos monoclonales que reconocen a las AGPs y
técnicas genéticas son usados para conocer la participación de las AGPs en los procesos de
crecimiento y desarrollo vegetal (Showalter, 2001; van Hengel y Roberts, 2003; Gaspar et al.,
2004; Seifert y Roberts, 2007).
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
6
Figura 1. Distribución y función de las AGPs en las plantas.
Las AGPs son componentes abundantes de gomas y exudados, y muestran propiedades
funcionales relevantes para la industria de alimentos (Yadav et al., 2007). La goma arábiga de
Acacia senegal L. es uno de los aditivos más utilizados en alimentos por sus propiedades de
emulsión y la capacidad de prevenir la cristalización de azúcares (Verbeken et al., 2003;
Krishnan et al., 2005). La reducción de la acumulación de estas glicoproteínas a través de su
precipitación con el reactivo de Yariv genera cambios en la fisiología celular y que repercuten
en el crecimiento de las células cultivadas in vitro. Este efecto es dependiente de la
concentración y el tiempo que se aplique el reactivo de Yariv y de la etapa de desarrollo del
cultivo, pero si el tratamiento es muy severo puede llevar a la inducción de la muerte celular
programada (Gao y Showalter, 1999; Chaves et al., 2002).
La secreción de las AGPs en los cultivos celulares, podría facilitar su recuperación y su
análisis bioquímico y funcional. Dicho conocimiento es de particular interés por las posibles
aplicaciones biotecnológicas que podrían tener, como es su aplicación en sistemas de
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
7
micropropagación de plantas a través de la inducción de la embriogénesis somática y de la
organogénesis. La adición de AGPs al medio de cultivo puede inducir la embriogénesis de
cultivos que no son embriogénicos y aumentar los rendimientos de los embriones en cultivos
embriogénicos (Kreuger y van Holst, 1993; Kreuger et al,. 2000; Pereira-Netto et al., 2007).
La aplicación exógena de AGPs obtenidas del medio de cultivos embriogénicos induce la
formación de brotes a partir de callos derivados de protoplastos (Wiśniewska y Majewska-
Sawka, 2007). Sin embargo, hay pocos reportes acerca de los factores que puedan afectar su
secreción y como estás moléculas se relacionan con el crecimiento y la agregación celular.
En el presente capítulo se presenta una revisión de las AGPs, su composición,
clasificación y biosíntesis, así como su participación en el crecimiento y la diferenciación de
los cultivos de células vegetales. Además, se señalan algunos de los factores fisicoquímicos
que afectan la secreción de las AGPs.
1.1 GENERALIDADES DE LAS AGPs
1.1.1 COMPOSICIÓN Y CLASIFICACIÓN
Las AGPs son glicoproteínas que contienen en general de 91.0 a 98.5 % de carbohidratos
y de 1.5 a 9.0 % de proteína. El peso molecular de las AGPs se encuentra comprendido en un
intervalo de 60 a 300 kDa. El carbohidrato está compuesto por arabinogalactanas del tipo II y
su tamaño varía en un intervalo de 30 a 150 residuos de azúcares (Serpe y Nothnagel, 1999).
Las arabinogalactanas poseen una cadena lineal de D-galactosas unidas mediante enlaces (1-
3) sustituida en el C (6) por cadenas laterales de (1-6) D-galactosas. Estas cadenas laterales
presentan a menudo residuos terminales de L-arabinosa, L-fucosa, L-ramnosa o D-ácido
glucorónico (Nothnagel, 1997; Gaspar et al., 2001). El carbohidrato generalmente se une a la
proteína a través de la hidroxiprolina, sin embargo, también se reportan uniones a la proteína
vía serina o treonina (Figura 2).
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
8
Figura 2. Representación esquemática de la estructura de las AGPs (Adaptado de Gaspar et
al., 2001).
De acuerdo a su composición de aminoácidos, las AGPs son clasificadas como clásicas y
no clásicas (Figura 3). Las AGPs clásicas presentan dominios ricos en hidroxiprolina, alanina,
serina, treonina y glicina; mientras que las no clásicas tienen dominios pobres en
hidroxiprolina, y son ricos en cisteína o en asparagina (Nothnagel, 1997). Otra diferencia
bioquímica entre ambas clases de AGPs, es la presencia en el dominio C-terminal de una
señal para la unión de un grupo glicosilfosfatidilinositol (GFI), que se encuentra en las AGPs
clásicas y está ausente en las AGPs no clásicas. Desde el punto de vista estructural, la función
del GFI es permitir la unión de las AGPs a la membrana plasmática (Youl et al., 1998; Oxley y
Bacic, 1999). Por lo cual, las AGPs no clásicas que carecen de GFI estarían como moléculas
solubles en la superficie de la pared celular o en el espacio periplasmático (Gaspar et al.,
2001).
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
9
Clásicas
No clásica
Figura 3. Representación esquemática de la clasificación y de la composición de las AGPs
clásicas y no clásicas. En A, B y C se muestran los dominios de las proteínas y en D, E y F se
indica la estructura nativa de las AGPs (Adaptado de Gaspar et al., 2001).
Una característica distintiva de las AGPs es su capacidad para reaccionar con
fenilglucósidos sintetizados químicamente y conocidos como reactivo de Yariv (Yariv et al.,
1967). Se conocen con este nombre a cuatro moléculas diferentes de fenilglucósidos: -(D-
glucosil)3, -(D-galactosil)3, -(D-galactosil)3 y -(D-manosil)3 (Figura 4). De estos cuatro
fenilglucósidos, sólo el -(D-glucosil)3 y el -(D-galactosil)3 reaccionan con las AGPs, mientras
que los dos fenilglucósidos restantes, -(D-galactosil)3 y -(D-manosil)3 no reaccionan con las
AGPs. Sin embargo, son usados como controles negativos en los estudios de la búsqueda de la
función de estas glicoproteínas. El mecanismo de reacción entre las AGPs y el reactivo de
Yariv no es conocido, pero se sugiere que para que esta reacción se lleve a cabo se requiere
tanto de la proteína como del carbohidrato de las AGPs (Nothnagel, 1997).
Señal de secreción Señal para la adición de GFI
Dominio rico en hidroxiprolina Dominio rico en lisina
Anclaje GFI Arabinogalactanas del tipo II
Dominio rico en asparagina
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
10
Figura 4. Estructura química de los fenilglucósidos conocidos como el reactivo de Yariv. En
el recuadro se señalan los grupos químicos que diferencian una molécula de otra (Adaptado de
Showalter, 2001).
La precipitación de las AGPs con el reactivo de Yariv es una metodología para aislar a las
AGPs y realizar su caracterización bioquímica y funcional; así como, la localización y el
estudio de la función de las AGPs en los tejidos vegetales. La formación del precipitado AGP-
Yariv es una forma de inactivar a la glicoproteína en sistemas vegetales, y se usa para conocer
su repercusión en procesos biológicos importantes como la diferenciación y el crecimiento
vegetal.
1.1.2. SÍNTESIS DE LAS AGPs
La biosíntesis de las AGPs es un proceso coordinado en el cual, una vez que se sintetiza
la parte proteica, los residuos de prolina se modifican a hidroxiprolina y son glicosilados
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
11
(Figura 5). La enzima que cataliza la modificación a hidroxiprolina es la peptidil-prolina
hidroxilasa, que se encuentra en el retículo endoplasmático (Wojtaszeka et al., 1999). La
glicosilación de los residuos de hidroxiprolina ocurre en el aparato de Golgi y participan
galactosil transferasas responsables de la síntesis de (1,6)--D-galactana (Rumyantseva, 2005).
El análisis de predicción de secuencias indica que los lugares donde se presentan
hidroxiprolinas aisladas, son glicosilados con unidades de polisacáridos; mientras que sitios
con hidroxiprolinas arregladas en forma consecutiva, son glicosilados con cadenas de
oligoarabinosa (Kieliszewski y Shpak, 2001). Las AGPs sintetizadas son secretadas hacia la
superficie celular a través de vesículas, para ser depositados en la membrana plasmática, en la
pared celular o liberadas al apoplasto (Lamport et al., 2006).
P
P
P
P
P
P
PP
P
P
P
P
P
P
P
P
Figura 5. Representación esquemática del proceso de biosíntesis de las AGPs (Adaptado de
Schultz et al., 1998 y Rumyantseva, 2005).
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
12
En el caso de las AGPs clásicas, se propone que la eliminación del dominio C-terminal
hidrofóbico ocurre en coordinación con la adición del GFI en un aminoácido específico. El
GFI está formado de etanolamina unida a través de un oligosacárido, a un lípido inmerso en la
membrana plasmática. Esto implica que para la liberación de la AGP con GFI de la membrana
plasmática, a la pared celular o al espacio extracelular, se requiere de la actividad de al menos
una fosfolipasa C o D (Rumyantseva, 2005).
1.2 PARTICIPACIÓN DE LAS AGPs EN EL CRECIMIENTO Y LA
DIFERENCIACIÓN DE LOS CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES
El crecimiento celular es uno de los parámetros más importantes a considerar para el
establecimiento de cultivos de células que pueden ser productoras de metabolitos secundarios
de importancia tales como los colorantes y los fármacos. El crecimiento celular involucra los
procesos de división y expansión celular, y es regulado a nivel del ciclo celular, el cual es un
proceso altamente ordenado que da como resultado la formación de células hijas y está
usualmente dividido en 4 fases: G1, S (replicación del ADN), G2 y M (cario y citocinesis) en
donde los puntos de transición claves son G1/S y G2/M (Stals y Inzé, 2001). La progresión del
ciclo celular es controlada por proteínas cinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Diferentes
complejos CDK-ciclina fosforilan un gran número de sustratos en los puntos de transición,
dando lugar a la replicación del ADN y la mitosis, respectivamente (Inzé y De Veylder, 2006).
En cultivos de células vegetales, las AGPs son secretadas al medio de cultivo y se han
relacionado con el crecimiento y la diferenciación celular (Rumyantseva, 2005). La secreción
de las AGPs es un evento que ocurre durante el crecimiento de los cultivos celulares in vitro.
La adición en el medio de cultivo del reactivo de Yariv causa una suspensión del crecimiento
de los cultivos de células en suspensión (Langan y Nothnagel, 1997; Darjania et al., 2002). La
reducción de la acumulación de estas glicoproteínas a través de su precipitación con el
reactivo de Yariv genera cambios en la fisiología celular y que repercuten en el crecimiento de
las células cultivadas in vitro. Este efecto es dependiente de la concentración y el tiempo que
se aplique el reactivo de Yariv y de la etapa de desarrollo del cultivo, pero si el tratamiento es
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
13
muy severo puede llevar a la inducción de la muerte celular programada (Gao y Showalter,
1999; Chaves et al., 2002).
Al respecto, Serpe y Nothnagel (1994) reportaron que el crecimiento celular de los
cultivos de Rosa sp., fue inhibido al adicionar 50 µM del reactivo de Yariv en el medio de
cultivo. En vista de que el tamaño de las células tratadas con el reactivo de Yariv y el control
fue el mismo, se sugirió que la inhibición del crecimiento fue debida a la supresión de la
división celular. Los autores también determinaron que el 95% del reactivo se encontraba
asociado a la pared celular, mientras que el 5% restante se asoció a la superficie externa de la
membrana plasmática. Sin embargo, los autores sugieren que la inhibición de la división
celular pudo ser consecuencia de la interacción del reactivo de Yariv con las AGPs presentes
en la pared celular, en la membrana plasmática o de ambas.
Los mecanismos celulares que se proponen por los que el reactivo de Yariv inhibe la
división celular son diversos. Por un lado, se sugiere que la inhibición de la división celular
quizás es causada por la desorganización de la membrana plasmática, derivada de la
asociación del reactivo de Yariv con las AGPs presentes en ésta. Otra explicación es que la
unión Yariv-AGPs afecta la extensibilidad de la pared celular, limitando el crecimiento. Por
último se propone que la unión Yariv-AGPs altera la organización del citoesqueleto,
impidiendo el crecimiento celular (Serpe y Nothnagel, 1994).
La inhibición de la división celular por la interacción de las AGPs-Yariv depende de la
etapa del ciclo celular. Langan y Nothnagel et al. (1997) encontraron en cultivos de Rosa sp.,
que la inactivación de las AGPs con el reactivo de Yariv, ocasionó que las células detuvieran
su crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. El mecanismo molecular propuesto incluye que
las AGPs son moléculas señal de elementos regulatorios del ciclo celular como son las ciclinas
o las CDKs. Por otro lado, Guan y Nothnagel (2004), señalan que en cultivos de Arabidopsis
thaliana (L.) Heynh., el reactivo de Yariv provocó una disminución en la transcripción de
genes regulatorios del ciclo celular, entre ellos los genes codificantes para ciclinas, así como la
expresión de genes relacionados a respuesta de herida y de los genes codificantes de las
proteínas de la pared celular y de los componentes de la transducción de señales.
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
14
La inhibición del crecimiento celular por el reactivo de Yariv también puede presentarse a
nivel de la expansión celular. En este contexto, la expansión de las células de Nicotiana
tabacum L. se inhibió en un 30% con respecto al control por la presencia del reactivo de
Yariv. Las células de N. tabacum tratadas con el reactivo de Yariv permanecieron de forma
esférica, a diferencia de las células control que fueron células elongadas. A través de la tinción
de las células con una solución de rojo Congo, se determinó que la adición del reactivo de
Yariv interfirió con el depósito de celulosa en la pared celular, que es necesario para la
expansión (Vissenberg et al., 2001). En forma similar, Willats y Knox (1996) también
reportaron la inhibición de la expansión de las células de Daucus carota L. agregando en el
medio de cultivo el reactivo de Yariv, sugiriendo la participación de las AGPs en la expansión
celular. Al respecto Lamport et al. (2006), señalan que las AGPs podrían estar actuando como
plastificantes de las pectinas de la pared celular, pero no se indica cómo podrían estar
modulando la expansión de la pared celular. Estos resultados son consistentes con los
reportados por Shibaya y Sugawara (2007), quienes demostraron que las AGPs son moléculas
fundamentales en la regeneración de la pared celular en cultivos de protoplastos de
Marchantia polymorpha L. En dicho estudio, la adición del reactivo de Yariv indujo una
disminución del índice de supervivencia de los protoplastos y una reducción de la
acumulación de callosa en las membranas de las células regeneradas.
Por otro lado, también se ha relacionado a las AGPs con los procesos de embriogénesis y
de diferenciación celular. Los estudios realizados por Immerzeel (2005) con cultivos de
células de D. carota indican que las AGPs controlan la embriogénesis somática, ya que las
AGPs secretadas por cultivos embriogénicos de D. carota son capaces de inducir este proceso
en cultivos no embriogénicos de esta misma especie vegetal. Resultados similares fueron
reportados por Pereira-Netto et al. (2007), quienes demostraron que una AGP aislada de
Anacardium occidentale L. puede estimular el desarrollo de embriones somáticos de cultivos
de D. carota en un período de 2 a 3 semanas, además de que favorece la conversión de los
embriones a plántulas.
En cuanto a la organogénesis, Wiśniewska y Majewska-Sawka (2007) reportaron que las
AGPs de cultivos embriogénicos de B. vulgaris, promovieron la organogénesis de callos e
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
15
incrementaron el número de brotes. La adición de AGPs provenientes de goma arábiga
comercial, previenen la muerte de los cultivos de microesporas de Triticum aestivum L., lo que
permite obtener embriones somáticos y promover el desarrollo de las plantas obtenidas
(Letarte et al., 2006).
En los cultivos de microesporas de Zea mays L., el desarrollo de embriones fue
correlacionado con la adición de AGP de goma arábiga. La adición de las AGPs revirtió el
efecto de inhibición en el desarrollo de los embriones, causado por un inhibidor de la
glicosilación de proteínas. Señalando que este paso de la biosíntesis es necesario para que las
AGPs puedan inducir el desarrollo de los embriones (Borderies et al., 2004).
El conocimiento de los mecanismos bioquímicos y/o moleculares, por los que las AGPs se
relacionan con los procesos de crecimiento y diferenciación en las células vegetales es escaso.
Existen propuestas en base a las características estructurales de las AGPs, a su localización
celular y al conocimiento de los modos de acción de las glicoproteínas participantes en los
procesos de crecimiento y diferenciación de las células animales. Estas propuestas se pueden
clasificar en dos grupos: aquellas que sugieren que las AGPs o los productos de su
degradación funcionan como moléculas señal y las que proponen que las AGPs funcionan
como moléculas de adhesión o de unión celular.
Como moléculas señal, se sugiere que el carbohidrato de las AGPs podría ser degradado
enzimáticamente dando lugar a oligosacáridos; que al unirse a receptores de la membrana
plasmática iniciarían un sistema de transducción de señales. De acuerdo a esta propuesta, las
AGPs portadoras de la molécula señal serían aquellas ubicadas en la membrana plasmática, la
pared celular o en el medio extracelular (Kreuger y van Holst, 1996; Showalter, 2001). Este
mecanismo de acción se podría estar presentando en el control de la embriogénesis en D.
carota, en donde las AGPs que contengan N-acetilglucosamina posiblemente serían las
moléculas portadoras de la señal (Immerzeel et al., 2004).
Por otro lado, en base al mecanismo de participación de glicoproteínas en las cadenas de
señalización de las células animales, Showalter (2001) sugiere que las AGPs de la membrana
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
16
plasmática, las de la pared celular y las extracelulares se unen a receptores de membrana, ya
sea de manera directa o con la ayuda de otras moléculas para el reconocimiento del receptor.
Otro de los mecanismos, propone que las AGPs participan en las interacciones célula-
célula a través de la señalización intercelular. La transmisión de la señal de una célula a otra se
realiza mediante la interacción iónica de las AGPs de la membrana plasmática de ambas
células. Esta interacción llevaría a una desorganización de la membrana celular y/o la apertura
de canales de Ca2+
, lo que se interpretaría como una señal. Por otra parte, probablemente la
AGP secretada al apoplasto se uniría a un receptor presente en la membrana plasmática de una
segunda célula y desencadenaría la señalización intercelular (Kreuger y van Holst, 1996;
Showalter, 2001).
Las AGPs pueden servir como moléculas de adhesión celular en la conexión de la
membrana plasmática con la pared celular. Al respecto, varios autores señalan que el reactivo
de Yariv podría inducir la formación de aglomerados anormales de las AGPs en la superficie
de la membrana plasmática y/o romper las conexiones esenciales de las AGPs requeridas para
el crecimiento y desarrollo normal vegetal (Kreuger y van Holst, 1996; Showalter, 2001). Por
otro lado, Kohorn (2000), ha señalado que los conectores del plasmalema y la pared celular
incluyen: a las cinasas asociadas a la pared celular (WAK), AGPs, pectinas, celulosa sintasa.
Johnson et al. (2003) reportaron que las AGPs tipo fasciclinas (FLAs) tienen, además de las
regiones glicosilada, supuestos dominios de adhesión celular conocidos como dominios
fasciclina. Las fasciclinas son moléculas de adhesión reportadas para las células neurales de la
mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (Hortsch y Goodman, 1990). La precipitación de
las FLAs con el reactivo de Yariv, indica que ellas comparten características estructurales con
las AGPs. Debido a que las AGPs están preferencialmente localizadas en lado exterior del
plasmalema, se sugiere que las AGPs pueden interactuar con los componentes de la pared
celular, principalmente con pectinas y proveer la inserción del plasmalema a la pared celular
(Carpita y Gibeaut, 1993). También se ha señalado, que las arabinogalactanas (AG) están
conjugadas a ácidos fenólicos, que están involucrados en la agregación celular de las células
de arroz (Kato et al., 1994).
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
17
Otros reportes han señalado que las AGPs pueden están involucradas con elementos del
citoesqueleto. Andème-Onzighi et al. (2002) observaron que estos elementos están vinculados
en la morfogénesis de la raíz, en la mutante de A. thaliana. Esta mutante posee un fenotipo de
raíz epidérmica abultada “bulger” (reb1) y mostraron una disminución en la cantidad de AGPs
y desorganización de los arreglos de los microtúbulos (MT) en comparación a la A. thaliana
nativa, esto fue confirmado en estudios en los cuales las AGPs fueron pertubadas
exógenamente con disruptores del citoesqueleto (amiprofosmetil (APM) y citocalasina-D) y
con el reactivo de Yariv (Sardar et al., 2006; Nguema-Ona et al., 2007). Sardar et al. (2006),
propusieron un modelo de red para la superficie celular que implican interacciones entre las
AGPs y elementos del citoesqueleto tales como los microtúbulos (MT) y F-actina. Dichas
interacciones pudiesen estar mediadas por una interacción directa con proteínas de
transmembranas o por una interacción indirecta con los “rafts” (balsas) de lípidos.
Las AGPs son moléculas muy higroscópicas y esta característica las relaciona con la
organización física de la matriz extracelular, o como moléculas de protección como son las
AGPs secretadas por las plantas de Acacia senegal L. En las plantas, ciertas AGPs están
asociadas con el desarrollo del xilema, específicamente con el engrosamiento de la pared
celular y la muerte celular programada (Nothnagel, 1997).
Por otro parte, las AGPs podrían ser señales bioquímicas partícipes en la regulación de la
producción de metabolitos secundarios y en la percepción de estímulos relacionados con
respuestas de defensa. Cheng et al. (2008), mediante el análisis de expresión transiente del
anticuerpo JIM13 (específico para los epítopes β-D-GlcpA-(1→3)-α-D-GalpA-(1→2)-L-Rha y
posiblemente para otros no conocidos de las AGPs) en cultivos de células inmovilizadas de
Taxus cuspidata Siebold & Zucc., propusieron que la producción de taxol y de AGPs pudiesen
estar asociadas, ya que observaron que la acumulación de estas moléculas y del taxol se
incrementó en respuesta a la elicitación con metil jasmonato. Mientras que Mashiguchi et al.
(2008), al aplicar el reactivo de Yariv a células de aleuronas de cebada observaron la represión
en los genes inducidos por las giberelinas y la inducción de represores de la señalización por
las giberelinas, los genes WRKY y de la NAK cinasa. Este mismo efecto fue presentado por el
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
18
ácido jasmónico y un elicitor de quitina, indicando que la señalización por giberelinas está
regulada por la expresión de los genes de defensa.
1.3 ESTUDIOS SOBRE LA SECRECIÓN DE LAS AGPs
Se han reportado tres factores que afectan la secreción de las AGPs, entre ellos: la edad
del cultivo, el estrés salino y estrés hidrodinámico.
Langan y Nothnagel (1997), señalaron la influencia de la edad del cultivo en la liberación
de AGPs en líneas celulares de Rosa sp., de diferente año de descendencia (Rosa 57 y Rosa
93). La línea celular Rosa 57 mostró un mayor crecimiento (1.24 veces) y secreción de AGPs
(2 veces) en comparación a la línea Rosa 93. Por otro lado, el análisis electroforético y de
composición de las AGPs mostró que las líneas Rosa 57 y Rosa 93 difirieron tanto en el
número como en la abundancia de las AGPs aisladas de las paredes celulares y en el medio de
cultivo condicionado.
Zhu et al. (1993) reportaron que el estrés salino causó la reducción de la velocidad de
crecimiento de las células de N. tabacum BY-2 y la disminución del contenido de AGPs en la
membrana plasmática y en su velocidad de liberación al medio de cultivo. Las células
adaptadas a la sal fueron más pequeñas que las células control, y se propuso que las AGPs
pueden facilitar la expansión de las células. Mientras que, Lamport et al. (2006) demostraron
que las suspensiones de células de A. senegal, A.thaliana, Solanum lycopersicum L. y N.
tabacum adaptadas para crecer en la sal, secretaron más AGPs que las células no adaptadas; y
se sugirió que las AGPs migran a través de la pared celular actuando como plastificantes que
incrementan su extensibilidad.
Otros estudios, señalan que el daño mecánico que sufren las células de Beta vulgaris L.
crecidas en biorreactores tipo tanque agitado, puede ser una posible causa de la secreción de
proteínas como consecuencia del esfuerzo de corte (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2000). Esto
podría ser similar a lo que sucede en las plantas de A. senegal, que secretan AGPs como una
respuesta a la herida (Showalter, 2001). El material secretado por las células de B. vulgaris
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
19
reaccionó con el reactivo de Yariv, indicando la presencia de AGPs, que posiblemente
provocó un aumento en la viscosidad de los caldos. La proteína presente en el medio podría
desempeñar una función protectora de la célula permitiéndole desarrollarse a altas
velocidades, ya que al aumentar la viscosidad del medio se reducen las condiciones de
turbulencia en el biorreactor (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999).
Otro de los factores que pudiese afectar la secreción de las AGPs es la fuente de carbono.
Los azúcares no solo funcionan como fuente metabólica y constituyente estructural de las
células, también actúan como importantes reguladores de varios procesos asociados al
crecimiento y desarrollo vegetal (Koch, 1996). Una variedad de genes, cuyos productos están
involucrados en diversas vías metabólicas y funciones celulares, son inducidas o reprimidas
dependiendo de la disponibilidad de los azúcares solubles. En general, se conoce que los
azúcares favorecen la expresión de las enzimas relacionadas con la biosíntesis, uso y
almacenamiento de las reservas (incluyendo el almidón, lípidos y las proteínas), mientras que
reprime la expresión de enzimas involucradas en la fotosíntesis y la movilización de reservas
(Koch, 1996).
Al respecto, Günter y Ovodov (2003) reportaron la influencia de la fuente de carbono en
el crecimiento y la producción del polisacárido arabinogalactana (AG), el principal
polisacárido de las AGPs en cultivos de Silene vulgaris (Moench) Garcke. Los autores
observaron que en presencia de galactosa, la concentración de las AG se incrementó en un
93% pero disminuyó un 83% en presencia de arabinosa. Mientras que en los cultivos celulares
de S. vulgaris, concentraciones de sacarosa de 20 a 50 g L-1
fueron favorables para el
crecimiento celular y la biosíntesis de AG.
CONSIDERACIONES
Las AGPs son macromoléculas formadas por carbohidratos y proteínas. Por su
localización celular y sus características bioquímicas se les asocia con el crecimiento y el
desarrollo celular (Serpe y Nothnagel, 1994; Willats y Knox, 1996; Immerzeel et al., 2004). Se
reporta que los cultivos de células vegetales en suspensión tienden a acumular AGPs en el
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
20
medio extracelular, en donde estas o sus derivados quizás participan como moléculas señal, o
como moléculas de unión entre la membrana plasmática y la pared celular, permitiendo que el
crecimiento celular se lleve a cabo (Showalter, 2001).
Por otro lado, los estudios sobre los factores que afectan la secreción de las AGPs (Zhu et
al., 1993; Langan y Nothnagel, 1997; Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999; Rodríguez-Monroy
y Galindo, 2000; Lamport et al., 2006) no muestran cómo cambia el perfil de acumulación de
estas glicoproteínas a lo largo del tiempo de cultivo. Asimismo, se desconoce si la sacarosa
pudiera ser un factor que afecte la secreción de las AGPs de forma similar a lo reportado con
las AG de S. vulgaris (Günter y Ovodov, 2003). También se desconoce si las AGPs secretadas
pudieran relacionarse con el crecimiento de las células de B. vulgaris, como sucede en otras
especies vegetales tales como, la de A. thaliana (Darjania et al., 2002) y si existe una relación
entre las AGPs con la formación de agregados celulares B. vulgaris.
Al respecto, existen varias preguntas por resolver como son: ¿Puede ser la sacarosa un
factor que afecte el crecimiento y la secreción de AGPs? ¿Actuará la sacarosa como una
fuente de carbono o un agente osmótico? ¿Cambiará la cantidad de AGPs secretadas en
respuesta a un estrés osmótico? ¿Las AGPs secretadas son requeridas para el crecimiento y/o
la agregación celular? ¿Pueden las AGPs transducir señales adhesivas para que la agregación
célula- célula se lleve a cabo? ¿Cómo se relaciona la secreción de AGPs con el crecimiento
celular y la agregación celular?
REFERENCIAS
Andème-Onzighi C, Sivaguru M, Judy-March J, Baskin TI, Driouich A (2002) The reb1-1 mutation of
Arabidopsis alters the morphology of trichoblasts, the expression of arabinogalactan-proteins and the
organization of cortical microtubules. Planta 215: 949-958.
Borderies G, Béchec M, Rossignol, Lafitte C, Deunff E, Beckert M, Dumas C, Matthys-Rochon E (2004)
Characterization of proteins secreted during maize microspore culture: arabinogalactan proteins (AGPs)
stimulate embryo development. Eur J Cell Biol 83: 205-212.
Carpita NC, Gibeaut DM (1993) Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of
molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal 3: 1-30.
Chaves I, Regalado AP, Chen M, Pinto R, Showalter A (2002) Programmed cell death induced by (β-D-
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
21
galactosyl)3 Yariv reagent in Nicotiana tabacum BY-2 suspension-cultured cells. Physiol Plantarum 116 (4):
548-553.
Cheng JS, Lei C, Wu J, Yuan Y (2008) Expression of arabinogalactan proteins involved in taxol production by
immobilized Taxus cuspidata cells. J Biotechnol 133: 96-102.
Darjania L, Ichise N, Ichikawa S, Okamoto T, Okuyama H, Thompson GA (2002) Dynamic turnover of
arabinogalactan proteins in cultured Arapidopsis cells. Plant Physiol Biochem 40: 69-79.
Gao M, Showalter AM (1999) Yariv reagent treatment induces programmed cell death in Arabidopsis cell
cultures and implicates arabinogalactan-protein involvement. Plant J 19: 321-332.
Gaspar YM, Johnson KL, McKenna JA, Bacic A, Schultz CJ (2001) The complex structures of arabinogalactan-
proteins and the journey towards understanding function. Plant Mol Biol 47: 161-176.
Gaspar YM, Nam J, Schultz CJ, Lee L-Y, Gilson PR, Gelvin SB, Bacic A (2004) Characterization of the
Arabidopsis lysine-rich arabinogalactan-protein AtAGP17 mutant (rat1) that results in a decreased efficiency
of Agrobacterium transformation. Plant Physiol 135: 2162-2171.
Guan Y, Nothnagel EA (2004) Binding of arabinogalactan proteins by Yariv phenylglycoside triggers wound-like
responses in Arabidopsis cell cultures. Plant Physiol 135: 1346-1366.
Günter EA, Ovodov YS (2003) Production of polysaccharides by Silene vulgaris callus culture depending on
carbohydrates of the medium. Biochemistry (Moscow) 68: 882-889.
Hernández AM (2007) Acumulación y características bioquímicas de las AGPs secretadas por cultivos de células
de Beta vulgaris L. en suspensión. Tesis de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos.
Institituto Politécnico Nacional. México. 67 p.
Hortsch M, Goodman CS (1990) Drosophila fasciclin I, a neural cell adhesion molecule, has a
phosphatidylinositol membrane anchor that is developmentally regulated. J Biol Chem 265: 15104-15109.
Immerzeel P, Schols HA, Voragen AG, De Vries SC (2004) Different arabinogalactan proteins are present in
carrot (Daucus carota) cell culture medium and in seeds. Physiol Plantarum 122: 181-189.
Immerzeel P (2005) Characterization of carrot arabinogalactan-proteins. Ph.D. Thesis. Wageningen University,
Holanda.
Inzé D, De Veylder L (2006) Cell cycle regulation in plant development. Annu Rev Genet 40: 77-105.
Johnson KL, Jones BJ, Bacic A, Schultz CJ (2003) The fasciclin-like arabinogalactan proteins of Arabidopsis. A
multigene family of putative cell adhesion molecules. Plant Physiol 133: 1911-1925.
Kato Y, Yamanouchi H, Hinata K, Ohsumi C, Hayashi T (1994) Involvement of phenolic esters in cell
aggregation of suspension-cultured rice cells. Plant Physiol 104: 147-152.
Kieliszewski MJ, Shpak E (2001) Synthetic genes for the elucidation of glycosylation codes for arabinogalactan-
proteins and other hydroxyproline-rich glycoproteins. Cell Mol Life Sci 58: 1386-1398.
Krishnan S, Kshirsagar AC, Singhal RS (2005) The use of gum arabic and modified starch in the
microencapsulation of a food flavoring agent. Carboh Polym 62: 309-315.
Koch KE (1996) Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:
509–540
Kohorn BD (2000) Plasma membrane-cell wall contacts. Plant Physiol 124: 31-38.
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
22
Kreuger M, van Holst GJ (1993) Arabinogalactan proteins are essential in somatic embryogenesis of Daucus
carota L. Planta 189(2): 243-248.
Kreuger M, van Holst GJ (1996) Arabinogalactan proteins and plant differentiation. Plant Mol Biol 30: 1077-
1086.
Kreuger M, van Holst GJ, de Vries S (2000) Effect of arabinogalactan-proteins and chitinases on somatic
embriogenesis. In: Nothnagel EA, Bacic A, Clarke A. editors. Cell and Developmental Biology of
Arabinogalactan-Proteins. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York. p: 109-119.
Lamport DT, Kieliszewiski MJ, Showalter (2006) Salt stress upregulates periplasmic arabinogalactan proteins:
using salt stress to analyse AGP function. New Phytol 169: 479-492.
Langan KJ, Nothnagel EA (1997) Cell surface arabinogalactan-proteins and their relation to cell proliferation and
viability. Protoplasma 96: 87-98.
Letarte J, Simion E, Miner, M, Kasha KJ (2006) Arabinogalactans and arabinogalactan-proteins induce
embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) microspore culture. Plant Cell Rep 24: 691-698.
Mashiguchi K, Urakami E, Hasegawa M, Sanmiya K, Matsumoto I, Yamaguchi I, Asami T, Suzuki Y (2008)
Defense-related signaling by interaction of arabinogalactan proteins and β-glucosyl yariv reagent inhibits
gibberellin signaling in barley aleurone cells. Plant Cell Physiol 49: 178-190.
Majewska-Sawka A, Nothnagel EA (2000) The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.
Plant Physiol 122: 3-9.
Nothnagel EA (1997) Proteoglycans and related components in plant cells. Int Rev Cytol 174: 195-291.
Nguema-Ona E, Bannigan A, Chevalier L, Baskin TI, Driouich A. (2007) Disruption of arabinogalactan proteins
disorganizes cortical microtubules in the root of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 52: 240-251.
Oxley D, Bacic A (1999) Structure of the glycosylphosphatidylinositol anchor of an arabinogalactan protein from
Pyrus communis suspension-cultured cells. Proc Natl Acad Sci USA 96: 14246-14251.
Pereira-Netto AB, Pettolino F, Cruz-Silva CT, Simas FF, Bacic A, Carneiro-Leao AM, Iacomini M, Maurer JBB
(2007) Cashew-nut tree exudate gum: Identification of an arabinogalactan-protein as a constituent of the
gum and use on the stimulation of somatic embryogenesis. Plant Sci 173: 468-477.
Rodríguez-Monroy M, Galindo E (1999) Broth rheology, growth and metabolite production of Beta vulgaris
suspension culture: a comparative study between cultures grown in shake flasks and in a stirred tank.
Enzyme Microb Technol 24: 687-693.
Rodríguez-Monroy M, Galindo E (2000) Production of arabinogalactan-proteins in Beta vulgaris cell suspension
cultures: a response to hydrodynamic stress. In: Nothnagel EA, Bacic A, Clarke A. editors. Cell and
Developmental Biology of Arabinogalactan-Proteins. Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York. p:
221-229.
Rumyantseva NI (2005) Arabinogalactan proteins: involvement in plant growth and morphogenesis.
Biochemistry 70: 1301-1317.
Sardar HS, Yang J, Showalter AM (2006) Molecular interactions of arabinogalactan-proteins with cortical
microtubules and F-actin in bright yellow-2 (BY-2) tobacco cultured cells. Plant Physiol 142: 1469-1479.
Seifert GJ, Roberts, K (2007) The biology of arabinogalactan proteins. Annu Rev Plant Biol 58: 137-161.
Capítulo 1. Las AGPs en cultivos de células vegetales.
23
Serpe MD, Nothnagel EA (1994) Effects of Yariv phenylglycosides on Rosa cell suspensions: Evidence for the
involvement of arabinogalactan-proteins in cell proliferation. Planta 193: 542-550.
Serpe MD, Nothnagel EA (1999) Arabinogalactan-proteins in the multiple domains of the plant cell surface. Adv
Bot Res 30: 207-289.
Shibaya T, Sugawara Y (2007) Involvement of arabinogalactan proteins in the regeneration process of cultured
protoplasts of Marchantia polymorpha. Physiol Plant 130: 271–279.
Showalter AM (2001) Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cell Mol Life Sci 58: 1399-
1417.
Schultz C, Gilson P, Oxley D, Youl J, Bacic A (1998) GPI-anchors on arabinogalactan proteins: implications for
signaling in plants. Trends Plant Sci 3: 426-431.
Stals H, Inzé D (2001) When plant cells decide to divide. Trends Plant Sci 6: 359-364.
van Hengel AJ, Roberts K (2003) AtAGP30, an arabinogalactan-protein in the cell walls of the primary root,
plays a role in the root generation and seed germination. Plant J 36: 256–270.
Verbeken D, Dierckx S, Dewettinck K (2003) Exudate gums: occurrence, production, and applications. Appl
Microbiol Biotechnol 63: 10-21.
Vissenberg K, Feijó JA, Weisenseel MH, Verbelen JP (2001) Ion fluxes, auxin and the induction of elongation
growth in Nicotiana tabacum cells. J Exp Bot 52: 2161-2167.
Willats WG, Knox JP (1996) A role for arabinogalactan-proteins in plant cell expansion: evidence from studies
on the interaction of -glucosil Yariv reagent with seedlings of Arabidopsis thaliana. Plant J 9: 919-925.
Wiśniewska E, Majewska-Sawka A (2007) Arabinogalactan-proteins stimulate the organogenesis of guard cell
protoplasts-derived callus in sugar beet. Plant Cell Rep 26: 1457-1467.
Wojtaszeka P, Smith C, Bolwell P (1999) Ultrastructural localization and further biochemical characterization of
prolyl 4-hydroxylase from Phaseolus vulgaris: comparative analysis. Int J Biochem Cell Biol 31: 463-477.
Yadav MP, Igartuburu M, Yan Y, Nothnagel EA (2007) Chemical investigation of the structural basis of the
emulsifying activity of gum arabic. Food Hydrocolloids 21: 297-308.
Yariv JH, Lis E, Katchalshi E (1967) Precipitation of arabic acid and some seed polysaccharides by
glycosylphenylazo dyes. Biochem J 195: 1c-2c.
Youl JJ, Bacic A, Oxley D (1998) Arabinogalactan-proteins from Nicotiana alata and Pyrus communis contain
glycosylphosphatidylinositol membrane anchors. Proc Natl Acad Sci USA 95: 7921-7926.
Zhu JK, Bressan RA, Hasegawa PM (1993) Loss of arabinogalactan proteins from the plasma membrane of
NaCl-adapted tobacco cells. Planta 190: 221-226.
CAPÍTULO 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN INICIAL DE SACAROSA EN
EL CRECIMIENTO CELULAR Y LA SECRECIÓN DE AGPs EN SUSPENSIONES
CELULARES DE Beta vulgaris L.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas arabinogalactanas (AGPs) son proteoglicanos de alto peso molecular, que
consisten en un 90% de carbohidratos y un 10% de proteínas, aproximadamente. Las
arabinogalactanas (AG) tipo II son los principales polisacáridos de las AGPs (Fincher et al.,
1983). Estas glicoproteínas se distribuyen en las flores, tallos, raíces, semillas y hojas de las
plantas. A nivel celular, las AGPs se encuentran en la membrana plasmática, la pared celular o
las secreciones de los espacios intercelulares (Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000;
Showalter, 2001; Rumyantseva, 2005). Mientras que en cultivos de células vegetales, las
AGPs se encuentran en el medio de cultivo lo que representa una gran ventaja, ya que facilita
su recuperación y ha permitido realizar estudios para una mejor comprensión del papel de las
AGPs en el crecimiento de las plantas.
En cultivos de células vegetales, se reporta que hay una relación entre el crecimiento
celular y las AGPs. El tratamiento de suspensiones de células de Rosa sp., con el reactivo de
Yariv, una molécula que se une selectivamente a las AGPs, causó la inhibición del crecimiento
celular; sugiriendo que las AGPs participan en la división celular (Serpe y Nothnagel, 1994).
Otros estudios mostraron que el aumento de las AGPs en el medio de cultivo de células de
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., está estrechamente correlacionado con el aumento del
número de células (Darjania et al., 2002).
Los carbohidratos, especialmente la sacarosa, son fuentes importantes de carbono y
energía. Y ha sido demostrado que la concentración inicial de sacarosa (CIS) puede afectar el
crecimiento, el desarrollo y el metabolismo vegetal (Su-May, 1999). Así como un número de
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
25
parámetros del cultivo tales como la velocidad específica de crecimiento (µ) y el rendimiento
de metabolitos secundarios (Zhong y Yoshida, 1995; Akalezi et al., 1999).
Zhang et al. (1996), reportaron que en suspensiones celulares de Panax notoginseng
(Burk.) F.H. Chen, el máximo crecimiento celular y de producción polisacáridos fueron
alcanzados a una CIS de 116.9 mM de sacarosa. Mientras que a 175.3 mM de sacarosa estos
dos parámetros disminuyeron. Por otro lado, la producción de AG, el principal polisacárido de
las AGPs fue incrementado entre 58.43 a 146.07 mM de sacarosa en cultivos celulares de
Silene vulgaris (Moench) Garcke (Günter y Ovodov, 2003). Sin embargo, el efecto de la
concentración de sacarosa en el crecimiento celular y la secreción de AGPs en cultivos
celulares no ha sido evaluado.
Hernández (2007) reportó que durante toda la cinética de crecimiento de los cultivos de
Beta vulgaris L. con 87.6 mM de sacarosa, secretaron AGPs de peso molecular entre 115 y
159 kDa, alcanzando una acumulación máxima de 45.5 mg L-1
y de 25.1 mg L-1
en un
biorreactor de tipo tanque agitado y a nivel de matraces, respectivamente. Los perfiles de
secreción de las AGPs y del crecimiento de los cultivos fueron similares durante la fase
exponencial, lo que sugirió que la secreción de estas macromoléculas estuvo relacionada con
el crecimiento celular. Sin embargo, se desconoce si el cambio en la CIS pueda afectar las
propiedades electroforéticas de las AGPs.
En el medio de cultivo de suspensiones de células embriogénicas y no embriogénicas de
B. vulgaris se encontró una AGP con propiedades electroforéticas similares pero diferente
capacidad de unión a los anticuerpos JIM7 y LM2 contra pectinas y contra los epítopes JIM 14
y JIM15 (Wiśniewska y Majewska-Sawka, 2007), lo cual sugiere que en los cultivos durante
la biogénesis de las AGPs hay cambios dinámicos en la composición y estructura de los
dominios estructurales que son detectados por anticuerpos específicos.
Por lo cual, el objetivo fue determinar el efecto del aumento de la concentración inicial de
sacarosa sobre el crecimiento celular y la secreción de AGPs en cultivos de B. vulgaris así
como conocer algunas de las características bioquímicas de las AGPs.
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
26
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se utilizó un cultivo celular de Beta vulgaris L. variedad crosby´s Egyptian de fenotipo
rojo obtenido por Ontiveros (1994). Las suspensiones celulares de B. vulgaris fueron
cultivadas según la metodología descrita por Rodríguez-Monroy y Galindo (1999). Las células
fueron cultivadas en medio B5 Gamborg's (Gamborg et al., 1968) suplementado con sacarosa
(87.6 mM), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (0.091 μM) y cinetina (0.465 μM). El pH del medio
se ajustó a 5.5 con NaOH (1 M) antes de la esterilización. Los cultivos se desarrollaron en
matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100 mL de medio de cultivo y se incubaron en un agitador
orbital (modelo 6040, Vichi, México) a 120 rpm, 25 ºC y con un fotoperiodo de 16 h luz/ 8 h
oscuridad (32 W m-2
). La línea celular fue subcultivada cada 14 días.
Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS)
Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL medio cultivo B5, inoculados
con 0.8 g peso fresco de cultivo de células de 7 días de edad. Las concentraciones iniciales de
sacarosa (CIS) ensayadas fueron de 43.8, 87.6 y 131.4 mM (15, 30 y 45 g L-1
,
respectivamente). Se realizaron tres experimentos independientes en los cuales se retiraron tres
matraces cada 2 o 3 días de muestreo para realizar las determinaciones de crecimiento celular
y contenido de AGPs. Los resultados son el promedio de 9 muestras ± el error estándar (EE).
Métodos analíticos
Crecimiento celular
El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS). Para ello, 5
mL del cultivo se filtraron a través de un filtro de papel Whatman No. 1, de peso seco
conocido. Las células se secaron hasta peso constante (70 °C, 1 día) y el PS se calculó por
diferencia de peso.
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
27
La velocidad específica de crecimiento (μ) se calculó mediante un método gráfico. Los
datos en logaritmo natural del crecimiento celular se graficaron contra el tiempo.
Posteriormente, en esta gráfica se identificó la región lineal y se calculó la pendiente de la
recta, la cual correspondió a μ (días-1
).
El rendimiento específico de la biomasa con respecto al sustrato consumido fue calculado
de acuerdo a la siguiente ecuación:
fo
of
SX
SS
XXY
(1)
donde Xf es la biomasa final (g L-1
), Xo es la biomasa inicial (g L-1
), So es el sustrato
inicial (g L-1
); y Sf es el sustrato final (g L-1
).
Viabilidad celular
La integridad de la membrana fue medida mediante el test de exclusión del colorante de
azul de Evans (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999). Las células fueron incubadas con 0.25%
(p V-1
) de azul de Evans (Sigma-Aldrich) durante 5 min. Se contaron un total de 500 células
en el microscopio (Iroscope MG-110) con el objetivo de 10×. El porcentaje de viabilidad de
una muestra fue calculado basado en el número de células no teñidas (viables) en relación a las
células totales.
Distribución del tamaño de los agregados
La distribución de tamaño de los agregados celulares fue determinado en el día 15 del
cultivo utilizando la metodología reportada por Trejo-Tapia et al. (2003). Se utilizó un
conjunto de tamices metálicos con luz de malla de diferentes tamaños estándar: 125, 250, 500
y 1000 µm. Estos tamices permitieron la separación de la población de células en cuatro
fracciones: 125-250, 250-500, 500-1000, y >1000 µm. Una muestra de 10 mL se suspensión
celular se pasó suavemente a través del tamiz de 125 µm y se lavó tres o cuatro veces con agua
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
28
desionizada. Las células y los agregados que pasaron a través del tamiz se recolectaron por
filtración en un papel Whatman No. 1 previamente pesado. Las células retenidas en el tamiz
de 125 µm se resuspendieron en agua desionizada y luego se pasaron por el tamiz de 250 µm.
El procedimiento se repitió con los tamices de 500 y1000 µm. Las células y agregados de
células retenidas en cada tamiz fueron sometidos a análisis de peso seco, a fin de obtener la
distribución de tamaño global en términos de los porcentajes de peso seco.
Recuperación del material extracelular (MEC)
Las células fueron removidas del medio de cultivo a través de un filtro Whatman No. 1. El
filtrado obtenido fue dializado contra agua destilada por 48 h a 4 °C, utilizando membranas de
celulosa (Sigma, Chemical Company) de peso molecular de corte de 12 kDa. Luego el
dializado fue concentrado por liofilización, obteniéndose el material extracelular (MEC) que
se almacenó a -20 ºC hasta su análisis.
Determinación de azúcares totales
Los azúcares totales fueron determinados mediante el método de fenol-sulfúrico (Dubois
et al., 1956). La Figura 6 muestra la curva tipo de calibración para la cuantificación de
azúcares utilizando galactosa como estándar.
y = 0.0091x + 0.0126
R² = 0.9990
µg Galactosa
0 50 100 150 200
Asb
49
0 n
m
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Figura 6. Curva tipo de azúcares totales, utilizando como estándar galactosa. Las barras de
error representan el E.E. (n=3)
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
29
Determinación de proteína
La determinación de proteína se realizó mediante el método de Bradford (1976). Para
obtener los valores de concentración de proteína de las muestras, se empleó una curva tipo de
proteína realizada con albúmina de suero bovino (Figura 7).
y = -0.0290+0.0136x
R² = 0.9986
µg Proteína
0 5 10 15 20 25
Ab
s 5
95
nm
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Figura 7. Curva tipo de proteína, utilizando como estándar albúmina de suero bovino. Las
barras de error representan el E.E. (n=3).
Cuantificación de AGPs
La cantidad de AGPs en el MEC se cuantificó utilizando la prueba de difusión radial en
gel de agarosa descrita por van Holst y Clarke (1985). Para ello, se elaboraron geles de
agarosa (1% p V-1
) con un contenido de NaCl (0.15 M), NaN3 (0.02% p V-1
) y 10 µg mL-1
de
β-glucosil Yariv (7.7 × 2.6 × 0.1 cm). En el gel solidificado se realizaron dos filas de 7 pozos,
cada uno de 1.2 mm de diámetro y una separación de un centímetro entre cada pozo y entre las
filas. En cada pozo se colocó 1 µL de una solución del material recuperado a través de la
diálisis y la liofilización. La concentración de las soluciones fue de 1 mg L-1
o 2 mg L-1
dependiendo del día de cultivo.
Los geles se incubaron en una cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 20 h.
Posteriormente se tomaron imágenes con un microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1500
(Tokio, Japón) con un objetivo de 1.5 ×, el cual tenía acoplada una cámara 3CCD (MTI,
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
30
Michigan, EEUU). La imágenes fueron adquiridas mediante el Software MetaVue v7.5.0. El
diámetro de los halos de precipitación formados por la reacción de las AGPs con el reactivo de
Yariv, fue medido utilizando el programa ImageJ v1.40 (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).
El área del halo se calculó mediante la ecuación del área de un círculo. Para calcular el
contenido de AGPs en las muestras, se realizó una curva estándar por triplicado utilizando la
goma arábiga (Sigma). La goma arábiga posee galactosa y arabinosa como los principales
monosacáridos neutros (Gal: Ara = 1:1) (van Holst y Clarke, 1985) (Figura 8).
y = 21.829x + 0.293
R² = 0.997
AGPs (µg µL-1)
0.0 0.2 0.4 0.6
Aréa
(m
m2
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Figura 8. Curva tipo de goma arábiga para la cuantificación de AGPs por el método de
difusión radial en gel de agarosa. Las barras de error representan el E.E. (n=3).
El rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X) y la productividad de AGPs (QAGPs) se
calcularon de acuerdo con las siguientes ecuaciones:
of
of
XX
AGPsAGPs
XAGPs
Y
(2)
)X(Xt
AGPsAGPsQ
of
of
AGPs
(3)
donde AGPsf son las AGPs final (mg L-1
), AGPso son las AGPs inicial (mg L-1
), Xf es la
biomasa final (g L-1
), Xo es la biomasa inicial (g L-1
); y t es tiempo final (días).
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
31
Fraccionamiento del MEC utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH)
El fraccionamiento por CIH fue realizado según la metodología reportada por Orozco-
Villafuerte et al. (2003). Para ello, se utilizó como soporte una columna empacada con metil
Macro-Prep® (Kit Econo-Pac® Methyl CIH Cartridges, 5 mL, Bio-Rad Laboratories) con un
diámetro de partícula de 50 μm (nominal) y un tamaño de poro de 1.000 Å. Como efluente se
utilizó NaCl 4.2 M. Una solución del MEC dializado y liofilizado se preparó al 4.0 % p V-1
(600 mg de MEC en 15 mL de NaCl 4.2M), que fue degasificada y filtrada a través de un filtro
Millipore de 0.45 µm. 10 mL de la solución de MEC en NaCl 4.2 M fue pasada a través de la
columna por gravedad, con una velocidad de flujo de 40 cm3 h
-1. La absorbancia fue
monitoreada a 280 nm utilizando un sistema de cromatografía de baja presión (Biologic LP,
Bio-Rad, CA, USA).
La mayoría de la muestra que pasó a través de la columna fue colectada y se le denominó
como la fracción A. Una parte de la muestra que fue absorbida en el gel de metil Macro-
Prep®, fue desorbida por elución con NaCl (2.0 M). El NaCl de la columna y el resto de la
muestra fue desorbida por elución con agua destilada, para obtener dos fracciones más
llamadas fracciones B y C. Las tres fracciones recuperadas fueron dializadas contra agua
desionizada, liofilizadas y se almacenaron a -20 ºC hasta su empleo. El contenido de proteínas,
azúcares y AGPs fueron determinados en cada fracción.
Electroforesis cruzada
Para la electroforesis cruzada se empleó el método descrito por Van Holst y Clarke (1986).
En la Figura 9 se muestra la representación esquemática de este procedimiento. Los geles de
6.5 x 6.5 cm fueron preparados con agarosa al 1%, Tris 0.025 M y glicina 0.2 M a un pH de
8.3. En el gel solidificado y con ayuda de una pipeta Pasteur se realizaron pozos, cada uno de
5.5 mm de diámetro. En un pozo se colocaron 15 μL de una solución de azul de bromofenol
(0.2 mg mL-1
) en Tris-HCl 50 mM a un pH de 8.0. En un segundo pozo se colocaron 15 μL de
la muestra (14-16 μg de AGP disueltos en una solución de Tris-HCl 50 mM), pH de 8.0 más
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
32
0.8 μL de una solución de azul de bromofenol (3 mg mL-1
). La solución de corrida fue Tris
(0.025 M) y glicina (0.2 M), a pH 8.3. El gel se corrió a 250 V por 14 minutos.
Después de la primera electroforesis, la porción del gel donde se separaron las AGPs (1.5 x
6.5 cm) se cortó y se alineó en un segundo gel (6.5 x 6.5 cm) que consistía de agarosa al 1%,
Tris al 0.025 M, glicina al 0.2 M, a un pH de 8.3 y 30 μg mL-1
del reactivo de Yariv β-(D-
glucosil)3. El segundo gel se corrió a 127 V por 24 minutos y después de este tiempo se lavó
con una solución de NaCl al 1% pV-1
, hasta eliminar el exceso del reactivo de Yariv.
A B C
Figura 9. Representación esquemática de la electroforesis cruzada. (A) La muestra de AGPs
se coloca en el gel de agarosa al 1%. (B) Las AGPs se someten a un campo eléctrico y migran
hacia el ánodo permitiendo su separación. La porción del gel donde se separaron estas
glicoproteínas se corta, se gira en un ángulo de 90º y se coloca en un segundo gel que contiene
el reactivo de Yariv. (C) Las AGPs se someten a un campo eléctrico por segunda vez y
durante su migración hacia el ánodo, interaccionan con el reactivo de Yariv contenido en el
gel formando una línea de precipitado rojo (complejo AGP-Yariv) y en forma de campana,
que es roja después de eliminar el exceso Yariv con NaCl al 1% pV-1
. (─) Cátodo, (+) Ánodo
(Tomado de Hernández, 2007).
Análisis estadístico
A los datos de los parámetros cinéticos a las diferentes CIS se les realizó un análisis de
varianza ANOVA simple para medidas repetidas y la comparación de medias fue realizada
con una prueba de Tukey utilizando con el programa SigmaStat v3.5.
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
33
RESULTADOS
Efecto de la CIS en el crecimiento celular.
La respuesta de los cultivos de suspensiones celulares de B. vulgaris a la CIS evaluadas se
muestran en la Figura 10. El crecimiento celular se incrementó a medida de que la
concentración de sacarosa aumentó. Las células cultivadas en la CIS más baja (43.8 mM)
mostraron una μ = 0.10 días-1
y alcanzaron una biomasa máxima de 10.33 g L-1
(día 11). En
contraste, con 87.6 mM y 131.4 mM de sacarosa, las células crecieron más rápido con una μ =
0.13 y 0.15 días-1
, respectivamente y la biomasa máxima fue de 15.97 g L-1
y 23.68 g de L-1
,
respectivamente.
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Bio
ma
sa (
g L
-1)
0
5
10
15
20
25
43.8 mM
87.6 mM
131.4 mM
Figura 10. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en el crecimiento celular de
Beta vulgaris. Las barras de error representan el E.E. (n=9).
El rendimiento máximo de biomasa (YX/S) fue de 0.66 a la CIS de 131.4 mM (Cuadro 1).
La viabilidad celular fue del 80% y no cambió a lo largo de la cinética del crecimiento en las
diferentes concentraciones de azúcar evaluadas (datos no mostrados).
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
34
Cuadro 1. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en la biomasa (X), velocidad
específica de crecimiento (µ), rendimiento de biomasa (YX/S), secreción de AGPs (AGPs),
rendimiento de AGPs (YAGPs/X) y productividad de AGPs (QAGPs) en suspensiones celulares de
Beta vulgaris.
Sacarosa
(mM)
X
(g L-1
)
µ
(días-1
)
YX/S
(g g-1
)
AGPs
(mg L-1
)
YAGPs/X
(mg g-1
)
QAGPs
(mg L-1
días-1
)
43.8 10.33 ± 0.18a 0.10
a 0.38 ± 0.01
a 13.49 ± 0.11
a 1.45 ± 0.03
a 0.11 ± 0.00
a
87.6 15.97 ± 0.93b 0.13
b 0.52 ±0.04
b 59.12 ± 0.18
b 4.48 ± 0.52
b 0.27 ± 0.03
b
131.4 23.68 ± 0.81c 0.15
c 0.66 ± 0.01
c 67.80 ± 0.10
c 4.45±0.30
b 0.26 ± 0.01
b
Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente
significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=9).
Efecto de la CIS en la secreción de AGPs
La Figura 11 muestra el efecto de la CIS sobre la secreción de AGPs. A medida de que la
concentración de sacarosa se incrementó, aumentó la secreción volumétrica de esta
glicoproteína. La máxima secreción de AGPs fue de 13.49, 59.12 y 67.80 mg L-1
con 43.8,
87.6 y 131.4 mM de sacarosa, respectivamente (Cuadro 1). La máxima productividad de
AGPs (QAGPs) fue de 0.11 y 0.27 mg g-1
día-1
con la CIS de 43.8 y 87.6 mM, respectivamente,
pero con 131.4 mM de sacarosa fue de 0.26 mg g-1
día-1
(Cuadro 1).
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
AG
Ps
(mg
L-1
)
0
10
20
30
40
50
60
70
43.8 mM
87.6 mM
131.4 mM
Figura 11. Efecto de la concentración inicial de sacarosa (CIS) en la secreción de AGPs en
suspensiones celulares de Beta vulgaris. Las barras de error representan el E.E. (n=9).
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
35
Efecto de la CIS en el tamaño de agregados celulares.
La Figura 12 muestra la distribución del tamaño de los agregados de B. vulgaris en
respuesta a la CIS. En todos los tratamientos, el tamaño de los agregados fue >250 µm. A una
concentración de 43.8 mM de sacarosa, 24.3% de los agregados midieron entre 250-500 µm,
28.3% entre 500-1000 µm y 47.3% de los agregados fueron >1000 µm. A medida que la CIS
aumentó, la fracción de los agregados >1000 µm fue más alta, indicando un incremento en el
tamaño de los agregados. A la CIS de 87.6 mM, la fracción >1000 µm constituyó el 61.4% y
alcanzó un 76% cuando la CIS fue de 131.4 mM. Estos resultados indican que un efecto de
CIS es la formación de grandes agregados celulares. La tendencia a la agregación celular
coincidió con aumento de la secreción de AGPs, señalando un posible papel de las AGPs
como moléculas de adhesión celular.
Concentración de sacarosa
43.8 mM 87.6 mM 131.4 mM
Agre
ga
dos
(% P
eso s
eco)
0
20
40
60
80
100
250-500 µm
500-1000 µm
>1000 µm
Figura 12. Distribución del tamaño de los agregados celulares de Beta vulgaris a diferentes
CIS. El porcentaje en peso seco que corresponde a cada tamaño de agregado fue mostrado
como función de la concentración de biomasa seca. Las barras de error representan el E.E.
(n=9).
Características bioquímicas de las AGPs secretadas
Para cada CIS, se analizó la muestra del MEC del día en que hubo mayor cantidad de
AGPs. Las electroforesis cruzadas de las muestras, mostró la presencia de un solo pico; lo que
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
36
indica que se tratan de una sola AGP con un factor de retención (Rf) de 0.52 (Figura 13) lo
que sugiere que las AGPs secretadas en cada CIS podrían ser iguales en su composición.
Figura 13. Electroforesis cruzada de las AGPs de Beta vulgaris obtenidas a diferentes CIS.
Fraccionamiento por cromatografía de interacción hidrofóbica del MEC
Debido a que no se observaron diferencias en el Rf de las AGPs de las diferentes CIS, una
muestra del material glicoproteico (400 mg) obtenido con 87.6 mM de sacarosa, fue separado
en tres fracciones (A, B y C), en base a su hidrofobicidad mediante CIH, utilizando como
eluentes NaCl 4.2M, NaCl 2.0 M y agua respectivamente (Figura 14).
Rf=0.52
Rf=0.52
Rf=0.52
A. 43.8 mM
B. 87.6 mM
C. 131.4 mM
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
37
Tiempo (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Ab
s (2
80
nm
)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
A B C
NaCl 4.2 M
NaCl 2.0 MH2O
Figura 14. Fraccionamiento del MEC de Beta vulgaris utilizando cromatografía de
interacción hidrofóbica (CIH).
La composición de cada una de las fracciones es mostrada en el Cuadro 2. La fracción A,
presentó un bajo contenido de carbohidratos y de proteínas, con un 5.16 y 0.46%
respectivamente. En ésta fracción no se detectaron AGPs.
El análisis de composición de las fracciones B y C, mostraron una relación de
carbohidratos y proteínas de 9:1 y fueron positivas para AGPs. El contenido de AGPs para la
fracción B y C fue de 13.63 y 10.71%, respectivamente.
Cuadro 2. Composición de las fracciones obtenidas después de la CIH del MEC de Beta
vulgaris.
Fracción Carbohidratos totales
(%)
Proteínas
(%)
AGPs
(%)
A 5.16 0.46 n.d
B 23.25 2.57 13.63
C 54.28 5.95 10.71
n.d: no detectado
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
38
La electroforesis cruzada de las fracciones B y C, reveló la presencia de un solo pico de la
AGP en cada fracción, mientras que se observó diferencia en su posición con un Rf de 0.19 y
de 0.33 para la proteína de las fracciones B y C, respectivamente (Figura 15), sugiriendo que
los cultivos de B. vulgaris secretan al medio de cultivo dos AGPs.
Figura 15. Electroforesis cruzada de las fracciones B y C.
DISCUSIÓN
El aumento de la CIS de 43.8 a 131.4 mM en las suspensiones celulares de B. vulgaris
favoreció los valores de: rendimiento celular (2.3 veces), μ (1.15 veces), y YX/S (1.7 veces)
(Cuadro 1). Estos resultados indican que el incremento de la CIS favoreció el crecimiento de
las células de B. vulgaris en forma similar a lo reportado en otras especies, como P.
notoginseng (Zhang et al., 1996) y S. vulgaris (Günter y Ovodov, 2003).
Los perfiles de secreción de AGPs en los cultivos de B. vulgaris con CIS de 87.6 a 131.4
mM mostraron que este fue un evento parcialmente asociado al crecimiento durante la fase
exponencial (Figura 10 y 11). Hernández (2007) demostró que las AGPs son moléculas
fundamentales para el crecimiento celular de B. vulgaris, adicionando el reactivo de Yariv
para inhibir a las AGPs. Los resultados mostraron que la presencia de Yariv redujo el
crecimiento celular en forma no reversible; sin embargo, la viabilidad, el tamaño y la
morfología de las células no se modificaron. Lo cual sugirió que la reducción de la secreción
de las AGPs no indujo la muerte celular ni cambios en la expansión de las células, y que la
Rf=0.19 Rf=0.32
Fracción B Fracción C
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
39
secreción de AGPs en los cultivos de B. vulgaris quizás está relacionada a eventos de división
celular (Hernández, 2007).
Los resultados de esta investigación muestran que la sacarosa es un factor que favorece la
secreción de las AGPs en los cultivos de B. vulgaris. Se observó que la acumulación
volumétrica de las AGPs en el medio de cultivo fue mejorada (5 veces) como consecuencia
del incremento de la CIS de 43.8 a131.4 mM. Mientras, que el rendimiento específico de las
AGPs (YAGPs/X) fue incrementada 3 veces entre las CIS de 43.8 a 87.6 mM. Sin embargo, la
CIS de 131.4 mM no tuvo efecto en YAGPs/X, ya que mostró un valor similar al obtenido con la
CIS de 87.6 mM. Un comportamiento similar fue obtenido con la productividad de las AGPs
(QAGPs) (Cuadro 1). Por otro lado, no es claro si la secreción de las AGPs al incrementar la
CIS, es debido a un efecto de la sacarosa como fuente de carbono o al estrés osmótico dado
por los cambios en la concentración del sustrato.
En el presente trabajo, a través de la electroforesis cruzada del MEC obtenido con las
diferentes CIS, se observó que las células de B. vulgaris secretaron una AGP con un Rf de
0.52 (Figura 13). Sin embargo, al fraccionar el MEC, se obtuvieron dos fracciones ricas en
AGPs (B y C) (Figura 14 y Cuadro 2) las cuales difirieron en su Rf (Figura 15), sugiriendo
que los cultivos de B. vulgaris secretan dos AGPs como mezcla al medio del cultivo y que
podrían corresponder a las AGPs de 115 a 159 KDa identificadas previamente por Hernández
(2007).
Wiśniewska y Majewska-Sawka (2007), reportaron que las suspensiones embriogénicas y
no embriogénicas de B. vulgaris secretaron una AGP con un Rf de 0.55. Mientras que,
Kjellbom et al. (1997) reportaron que la membrana plasmática de hojas de B. vulgaris cv.
Hilma, contienen dos subfamilias de AGPs, con peso moleculares de 82 y 97 kDa. Cada
subfamilia consiste de isoformas ácidas de AGPs, reconocidas por los anticuerpos
monoclonales MAC207 y JIM8 que reconocen a los epítopes de los carbohidratos β-D-GlcpA-
(1→3)-α-D-GalpA-(1→2)-L-Rha, β-D-GlcpA (1-O-Me), L-Ara, D-GlcA y otros posiblemente
desconocidos de las AGPs (Yates et al., 1996). Mientras que, Langan y Nothnagel (1997)
reportaron que la suspensiones de Rosa sp. 57 secretaron una AGP con un Rf de 0.35 y que
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
40
este pico al parecer contiene dos AGPs relacionadas, la AGP-(a) y AGP-(b), reportadas
previamente por Komalavilas et al. (1991). La AGP-(a) presentó un Rf de 0.16 y la AGP-(b)
de 0.23, con una relación Gal: Ara de 1.6: 1 para la AGP-(a) y de 1.8: 1 para la AGP-(b).
Por otro lado, se observó que el cultivo presentó una tendencia a agregarse como un efecto
del aumento de la CIS (Figura 12). Este fenómeno coincidió con la mayor secreción de AGPs
y sugiere un posible papel de la AGPs como moléculas de adhesión celular. Así, Showalter
(2001) señaló que las AGPs sirven como moléculas de adhesión celular necesaria para el
crecimiento y desarrollo normal. El papel de las AGPs en la adhesión entre la pared celular y
la plasmalema se puso de manifiesto con los datos obtenidos con tomate transgénico. Los
autores utilizaron una construcción de genes de LeAGP_1, que produce una AGP extracelular
de tomate para obtener una línea transgénica de Nicotiana tabacum BY-2 (Zhao et al., 2002).
Durante la plasmólisis celular, las AGPs fueron encontradas en las hebras Hectian, líneas de
conexión de la pared celular y del plasmalema. Estos sitios pueden ser el resultado de la
adhesión de las regiones de la AGPs del plasmalema y de la pared celular. Estas zonas pueden
estar involucradas en el ensamble de la pared celular y el metabolismo (García-Gómez et al.,
2000) o como sitios de anclaje, que facilitan la mitosis y la citocinesis (Cleary, 2001). Por lo
tanto, las AGPs pueden servir como moléculas de adhesión celular que conectan la membrana
celular con la pared celular.
Al cambiar la CIS, la productividad de las AGPs fue mejorada, lo que es importante si se
considera que estas moléculas pueden tener una aplicación en el desarrollo de los sistemas de
micropropagación de plantas.
En conclusión, la secreción volumétrica de las AGPs en las suspensiones celulares de B.
vulgaris, se favoreció al incrementar la CIS. Las AGPs secretadas por B. vulgaris están
parcialmente relacionadas con el crecimiento celular y pueden jugar un papel como moléculas
de adhesión en los agregados celulares. Estos hallazgos son importantes para la comprensión
de los factores implicados en la secreción de las AGPs en cultivo de células vegetales.
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
41
REFERENCIAS
Akalezi CO, Liu S, Li QS, Yu JT, Zhong JJ (1999) Combined effects of initial sucrose concentration and
inoculum size on cell growth and ginseng saponin production by suspension cultures of Panax ginseng.
Process Biochem 34: 639-642.
Cleary AL (2001) Plasma membrane-cell wall connections: Roles in mitosis and cytokinesis revealed by
plasmolysis of Tradescantia virginiana leaf epidermal cells. Protoplasma 215: 21-34.
Bradford V (1976) A rapid and sensitive method for the quantitative of micrograms quantities of protein utilizing
the principle of protein binding. Anal Biochem 72: 248-254.
Darjania L, Ichise N, Ichikawa S, Okamoto T, Okuyama H, Thompson GA (2002) Dynamic turnover of
arabinogalactan proteins in cultured Arabidopsis cells. Plant Physiol Biochem 40: 69-79.
Dubois M, Gilles A, Smith, F (1956) Colorimetric method determination of sugars and related substances. Anal
Chem 28: 350-356.
Fincher GB, Stone BA, Clarke AE (1983) Arabinogalactan-proteins: structure, biosynthesis, and function. Annu
Rev Plant Physiol 34: 47-270.
Gamborg O, Miller R, Ojima, K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp
Cell Res 50: 151-158.
García-Gómez BL, Campos F, Hernández M, Covarrubias AA (2000) Two bean cell wall proteins more abundant
during water deficit are high in proline and interact with a plasma membrane protein. Plant J 22: 277-288.
Günter EA, Ovodov YS (2003) Production of polysaccharides by Silene vulgaris callus culture depending on
carbohydrates of the medium. Biochemistry (Moscow) 68: 882-889.
Hernández AM (2007) Acumulación y características bioquímicas de las AGPs secretadas por cultivos de células
de Beta vulgaris L. en suspensión. Tesis de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos.
Institituto Politécnico Nacional, México. 67 p.
Kjellbom P, Snogerup L, Stöhr C, Reuzeau C, McCabe PF, Pennell RI (1997) Oxidative cross-linking of plasma
membrane arabinogalactan proteins. Plant J 12: 1189-96.
Komalavilas P, Zhu JK, Nothnagel EA (1991) Arabinogalactan- proteins from the suspension culture medium
and plasma membrane of rose cells. J Biol Chem 266: 15956-15965.
Langan KJ, Nothnagel EA (1997) Cell surface arabinogalactan-proteins and their relation to cell proliferation and
viability. Protoplasma 96: 87-98.
Majewska-Sawka A, Nothnagel EA (2000) The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.
Plant Physiol 122: 3-9.
Ontiveros J (1994) Aislamiento de líneas celulares de Beta vulgaris productoras de betalainas. Tesis de
Licenciatura. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, México.
Orozco-Villafuerte J, Cruz-Sosa F, Ponce-Alquicira E, Vernon-Carter EJ (2003) Mesquite gum: fractionation and
characterization of the gum exuded from Prosopis laevigata obtained from plant tissue culture and from
wild trees. Carboh Polym 54: 327-333.
Capítulo 2. Efecto de la CIS en el crecimiento celular y la secreción de AGPs.
42
Rodríguez-Monroy M, Galindo E (1999) Broth rheology, growth and metabolite production of Beta vulgaris
suspension culture: a comparative study between cultures grown in shake flasks and in a stirred tank.
Enzyme Microb Technol 24: 687-693.
Rumyantseva NI (2005) Arabinogalactan proteins: involvement in plant growth and morphogenesis.
Biochemistry (Moscow) 70: 1301-1317.
Serpe MD, Nothnagel EA (1994) Effects of Yariv phenylglycosides on Rosa cell suspensions: evidence for the
involvement of arabinogalactan-proteins in cell proliferation. Planta 193: 542-550.
Su-May Y (1999) Cellular and genetic responses of plants to sugar starvation. Plant Physiol 121:687-693.
Showalter AM (2001) Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cell Mol Life Sci 58: 1399-
1417.
Trejo-Tapia G, Hernández-Trujillo R, Trejo-Espino JL, Jimenéz-Aparicio A, Rodríguez-Monroy M (2003)
Analysis of morphological characteristics of Solanum chrysotrichum cell suspension cultures. World J
Microbiol Biotechnol 19: 929-932.
van Holst GJ, Clarke A (1985) Quantification of arabinogalactan-protein in plant extracts by single radial
diffusion gel. Anal Biochem 148: 446-450.
van Holst GJ, Clarke A (1986) Organ-specific arabinogalactan-proteins of Lycopersicum peruvianum (Mill)
demonstrated by crossed electrophoresis. Plant Physiology 80: 786-789.
Wiśniewska E, Majewska-Sawka A (2007) Arabinogalactan-proteins stimulate the organogenesis of guard cell
protoplasts-derived callus in sugar beet. Plant Cell Rep 26: 1457-1467.
Yates EA, Valdor JE, Halsam SM, Morris HR, Dell A, Mackie W, Knox JP (1996) Characterization of
carbohydrate structural features recognized by anti-arabinogalactan-protein monoclonal antibodies.
Glycobiology 2: 31-39.
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1996) Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax
notoginseng: manipulation of medium sucrose. J Biotechnol 51: 49-56.
Zhao ZD, Tan L, Showalter AM, Lamport DTA, Kieliszewski MJ (2002) Tomato LeAGP-1 arabinogalactan-
protein purified from transgenic tobacco corroborates the Hyp contiguity hypothesis. Plant J 31: 431-444.
Zhong JJ, Yoshida T (1995) High-density cultivation of Perilla frutescens cell suspensions for anthocyanin
production: effects of sucrose concentration and inoculum size. Enzyme Microb Technol 17: 1073-1079.
CAPÍTULO 3. SECRECIÓN DE AGPs EN CULTIVOS DE Beta vulgaris L. EN
RESPUESTA AL ESTRÉS OSMÓTICO
INTRODUCCIÓN
El estrés osmótico es el resultado de un cambio en la concentración de soluto alrededor de
una célula, causando un cambio en el movimiento de agua a través de la membrana celular
(George et al., 2008). El potencial osmótico regula el balance de agua en las células, proceso
celular crucial en la vida de las plantas (Wu et al., 2005).
Los cambios en el potencial osmótico son generados en las células vegetales utilizando
agentes osmóticos tales como polioles (manitol y sorbitol, azúcares no metabolizables), sales
(cloruro de sodio, NaCl), o agentes no-permeabilizantes (polietilenglicol, PEG). El NaCl se
utiliza comúnmente para generar estrés osmótico, pero puede afectar la extensibilidad de la
pared celular y el crecimiento celular (Zhu et al., 1993). Por otro lado, un incremento en la
presión osmótica con manitol favoreció la producción de polisacáridos en suspensiones
celulares de Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen (Zhang et al., 1995). Una mayor
producción de metabolitos primarios y secundarios a partir de cultivos de tejidos in vitro bajo
un estrés osmótico ha sido reportada en algunas especies vegetales tales como P. notoginseng,
Taxus chinensis (Pilger) Rehd y Cistanche deserticola Y. C. Ma (Zhang y Zhong, 1997; Kim
et al., 2001; Liu y Cheng, 2008).
El estrés osmótico puede ser un factor que afecta el crecimiento y la secreción de AGPs
en los cultivos de células vegetales. En este sentido, Iraki et al. (1989a) observaron que el
crecimiento celular de Nicotiana tabacum cv W38, fue similar al control en los cultivos
expuestos a un estrés osmótico con polietilenglicol (PEG) (-23 bar), mientras que en presencia
de un estrés impuesto con NaCl (-28 bar), se observó una reducción del crecimiento. Iraki et
al. (1989b) reportaron que las características bioquímicas de las AGPs cambiaron ante un
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
44
estrés osmótico. En dicho estudio se muestra que los cultivos de N. tabacum crecidos bajo
estrés impuesto por la presencia de NaCl o de PEG, secretan una AGP con un contenido de
arabinosa y galactosa mayor al de aquella secretada por los cultivos crecidos sin NaCl o PEG.
Sin embargo, la diferencia en el contenido de carbohidratos no muestra una relación clara con
los cambios en los pesos moleculares de las glicoproteínas. Las AGPs liberadas en
condiciones sin y con un estrés salino, mostraron un peso molecular de 35 kDa, mientras que
la AGP liberada por los cultivos crecidos con PEG presentó un peso molecular <17kDa.
Por otro lado, Zhu et al. (1993) reportaron que el estrés salino causa la reducción de la
velocidad de crecimiento de las células de Nicotiana tabacum BY-2 y la disminución del
contenido de AGPs en la membrana plasmática y en su velocidad de liberación al medio de
cultivo. Las células adaptadas a la sal fueron más pequeñas que las células del control, y se
propuso que las AGPs pueden facilitar la expansión de las células. Lamport et al. (2006)
demostraron que las suspensiones de células de Acacia senegal L., Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh., Solanum lycopersicum L. y N. tabacum adaptadas para crecer en la sal, secretaron
más AGPs que las células no adaptadas. Al respecto, se sugirió que las AGPs migran a través
de la pared celular actuando como plastificantes que incrementan la extensibilidad de la pared.
En el capítulo 2, se mostró que un incremento en la concentración inicial de sacarosa
(CIS) estimuló la secreción de las AGPs al medio de cultivo en las suspensiones celulares de
Beta vulgaris L. Sin embargo, no se observaron diferencias en el rendimiento específico y la
productividad de las AGPs en las concentraciones de 87.6 y 131.4 mM, por lo que no se pudo
discernir si dicho efecto en la secreción de las AGPs fue en respuesta a un efecto nutricional u
osmótico dado por el incremento de la sacarosa.
Los azúcares no solo funcionan como fuente metabólica y constituyente estructural de las
células, también actúan como importantes reguladores del varios procesos asociados al
crecimiento y desarrollo vegetal (Koch, 1996). La sacarosa puede actuar como un agente de
estrés osmótico y servir como una fuente vital de carbono y de energía. Un incremento del
potencial osmótico con azúcares no metabolizables (el manitol y el sorbitol) y el PEG han
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
45
mejorado la acumulación de polisacáridos en suspensiones celulares de P. notoginseng (Zhang
et al., 1995).
En el presente trabajo, se evaluó el efecto del estrés osmótico en la secreción de las AGPs
en suspensiones celulares de B. vulgaris elevando el potencial osmótico del medio de cultivo
mediante la adición de polioles (manitol y sorbitol), NaCl y PEG.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo de células de B. vulgaris
Las células de B. vulgaris fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100
mL de medio de cultivo y mantenidas bajo las condiciones de incubación indicadas en el
capítulo 2.
Para los experimentos se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL de medio
cultivo B5 suplementado con 43.8 mM de sacarosa (15 g L-1
), inoculados con 0.8 g de células
(base húmeda) de 7 días de edad. Se realizaron tres experimentos independientes y se retiraron
tres matraces cada 2 o 3 días para realizar las determinaciones de crecimiento celular y la
cantidad de AGPs secretadas hacia el medio de cultivo. Los resultados son el promedio de 9
muestras ± el error estándar (E.E).
Efecto osmótico
La condición de estrés osmótico se generó en suspensiones celulares de 7 días de edad.
Para ello, se elevó el potencial osmótico del medio de cultivo de 23.78 mOsm kg-1
(equivalente a 21.74 mM de sacarosa residual en el día 7) a 95.97 mOsm kg-1
(equivalente a
87.6 mM de sacarosa) adicionando de manera independiente varios compuestos: sacarosa,
manitol, sorbitol, NaCl y PEG-4000 (Cuadro 3). Todos ellos, previamente esterilizados
mediante autoclave. Como control se utilizaron los cultivos con 43.8 mM de sacarosa y sin
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
46
adición de los compuestos arriba señalados. Los resultados obtenidos son el promedio de 9
muestras ± el error estándar (E.E).
Cuadro 3. Sustancias utilizadas para llevar el potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1
, en 30
mL de medio de cultivo en suspensiones celulares de Beta vulgaris de 7 días de edad.
Sustancias
Utilizadas
Concentración madre
(M)
Volumen adicionado
(mL)
Concentración final
(mM)
Sacarosa 0.584 3.384 65.91
Manitol 1.098 1.985 72.62
Sorbitol 1.098 1.985 72.62
NaCl 3.422 0.318 36.34
PEG 4000 0.050 8.722 14.54
El potencial osmótico dado por la sacarosa fue calculado mediante la ecuación de Van’t
Hoff reportada por de Paiva Neto y Otoni (2003)
(1) iCRTψ
Donde ψ es el potencial osmótico (MPa), i es el índice de disociación (1.095 para
sacarosa, 1 para manitol y sorbitol, 2 para el NaCl), C es la concentración molar (mol L-1
), R
es la constante universal de los gases (0.00831 L MPa mol-1
K-1
); y T es la temperatura (K).
El potencial osmótico fue convertido en unidades de osmolalidad utilizando el factor de
conversión reportado por George et al. (2008): 1 mOsm kg-1
= 2.4789 MPa.
Métodos analíticos
Biomasa
El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS), descrito en el
capítulo 2.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
47
Determinación de azúcares residuales
La concentración de azúcar residual fue determinada mediante el método fenol-sulfúrico
reportado por Dubois et al. (1956), utilizando sacarosa como estándar (Figura 16).
y = 0.0088x - 0.0302
R² = 0.9967
µg Sacarosa
0 50 100 150 200
Asb
49
0 n
m
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Figura 16. Curva tipo de sacarosa para la cuantificación de azúcares residuales por el
método fenol-sulfúrico. Las barras de error representan el E.E. (n=3).
Cuantificación de las AGPs en el medio de cultivo
La cantidad de AGPs del medio de cultivo (MC) fue cuantificada mediante el test de
difusión radial en agarosa descrito por van Holst y Clarke (1985) y detallado en el capítulo 2.
El rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X) se calculó de acuerdo a la ecuación (2)
detallada en el capítulo 2.
Análisis estadístico
A los datos de los parámetros cinéticos con las diferentes sustancias alimentadas para
elevar el potencial osmótico se les realizó un análisis de varianza ANOVA simple para
medidas repetidas y la comparación de medias fue realizada con una prueba de Tukey
(p<0.05) utilizando el programa SigmaStat v3.5.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
48
RESULTADOS
Efecto de la sacarosa y de azúcares no metabolizables en el crecimiento celular y la
secreción de AGPs
La Figura 17 muestra las cinéticas de crecimiento celular y de azúcar residual de las
suspensiones celulares de B. vulgaris expuestas a un incremento del potencial osmótico con
sacarosa, manitol y sorbitol.
Los cultivos alimentados con sacarosa mostraron un aumento de 2 veces en la biomasa,
alcanzando un máximo de 21.56 g L-1
. En contraste, los cultivos tratados con manitol y
sorbitol alcanzaron una biomasa máxima de 11.17 g L-1
, valor similar al crecimiento que se
observó en el cultivo no alimentado (10.62 g L-1
) (Figura 17A).
Los azúcares residuales permanecieron alrededor de 12 g L-1
después de 18 días de cultivo
en los tratamientos con manitol y sorbitol, confirmando que estos azúcares no son
metabolizables en las suspensiones celulares, mientras que las células alimentadas con
sacarosa, mostraron un consumo total del carbohidrato (Figura 17B).
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
49
Bio
ma
sa (
g L
-1)
0
5
10
15
20
25
Control
Sacarosa
Manitol
Sorbitol
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Azú
car
resi
du
al
(g L
-1)
0
5
10
15
20
25
30Control
Sacarosa
Manitol
Sorbitol
A
B
Figura 17. Cinéticas de crecimiento celular (A) y de azúcar residual (B) de células de Beta
vulgaris alimentadas con sacarosa, manitol y sorbitol. La flecha indica el día 7 del cultivo, en
el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1
. Las barras de error representan el
E.E. (n=9).
La Figura 18 muestra las cinéticas de acumulación de AGPs y de rendimiento específico
(YAGPs/X). La secreción de AGPs en los cultivos alimentados con sacarosa fue de 78.24 mg L-1
,
mientras que los cultivos alimentados con manitol o sorbitol secretaron 84.19 mg AGPs L-1
.
Esto indica que las células alimentadas secretaron 6 veces más AGPs, en relación al cultivo no
alimentado que secretó 13.91 mg AGPs L-1
(Figura 18A).
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
50
En los cultivos alimentados con sacarosa se observó un aumento de 3 veces en el YAGPs/X
(4.51 mg g-1
PS). Mientras que con manitol y sorbitol se alcanzó un YAGPs/X de 9.20 mg g-1
PS, es decir 6 veces más al alcanzado con el cultivo no alimentado que fue de 1.52 mg g-1
PS
(Figura 18B).
AG
Ps
(mg
L-1
)
0
20
40
60
80 Control
Sacarosa
Manitol
Sorbitol
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
YA
GP
s/X
(m
g g
-1 P
S)
0
2
4
6
8
10
12
A
B
Control
Sacarosa
Manitol
Sorbitol
Figura 18. Cinéticas de secreción (A) y de rendimiento específico de AGPs (B) de células de
Beta vulgaris alimentadas con sacarosa, manitol y sorbitol. La flecha indica el día 7 del
cultivo, en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1
. Las barras de error
representan el E.E. (n=9).
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
51
Efecto del PEG y el NaCl en el crecimiento celular y la secreción de AGPs
Para confirmar el efecto del potencial osmótico dado por los azúcares no metabolizables
en la secreción de las AGPs, se analizó el efecto del potencial osmótico generado por otras
sustancias químicas tales como el PEG-4000 y el NaCl.
La Figura 19 muestra el comportamiento de crecimiento celular y del azúcar residual de
los cultivos suplementados con PEG y NaCl. En los cultivos tratados con el PEG, que es un
agente osmótico no permeablizante, el crecimiento celular fue similar al del cultivo no
alimentado, alcanzando una biomasa máxima de 10.43 g L-1
(Figura 19A). El comportamiento
de los azúcares residuales también fue similar al cultivo no alimentado. En ambos casos se
observó un agotamiento de la disponibilidad de la fuente de carbono (Figura 19B).
Las células alimentadas con NaCl, disminuyeron 1.9 veces su crecimiento en relación al
cultivo control (10.62 g L-1
), alcanzando una biomasa máxima de 9.74 g L-1
(Figura 19A). El
contenido de azúcares residuales fue de 2.3 g L-1
en los cultivos con NaCl, mientras que en el
cultivo no alimentado se agotaron los azúcares (Figura 19B).
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
52
Bio
ma
sa (
g L
-1)
0
2
4
6
8
10
12
Control
NaCl
PEG
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Azú
ca
r r
esi
du
al
(g L
-1)
0
5
10
15
Control NaCl PEG
A
B
Figura 19. Cinéticas de crecimiento celular (A) y de azúcar residual (B) de los cultivos Beta
vulgaris alimentados con NaCl y polietilenglicol (PEG). La flecha indica el día 7 del cultivo,
en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1
. Las barras de error representan el
promedio ± E.E. (n=9).
La Figura 20 muestra el comportamiento de la secreción y del rendimiento específico de
las AGPs. La máxima secreción de AGPs en los cultivos tratados con PEG fue de 64.70 mg
L-1
, es decir 4.65 veces mayor a la encontrada en el cultivo sin alimentación (13.91 mg L-1
)
(Figura 20A). Por otro lado, se observó un aumento de 6 veces en el YAGPs/X (9.15 mg g-1
PS)
con respecto al cultivo no alimentado (1.52 mg g-1
PS) (Figura 20B). Estos resultados sugieren
que el incremento en la secreción de las AGPs fue provocado por un estrés osmótico.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
53
Los cultivos alimentados con NaCl, secretaron un máximo de 103.83 mg L-1
de AGPs, lo
cual fue 7.46 veces mayor con respecto al control (13.91 mg L-1
) (Figura 20A). Esto
correspondió a un aumento de 11.34 veces en el YAGPs/X, que fue de 17.23 mg g-1
PS, mientras
que el cultivo no alimentado fue de 1.52 mg g-1
PS (Figura 20B).
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
YA
GP
s/X
(m
g g
-1 P
S)
0
5
10
15
AG
Ps
(mg
L-1
)
0
20
40
60
80
100Control
NaCl
PEG
A
B
Control
NaCl
PEG
Figura 20. Cinéticas de secreción (A) y de rendimiento específico de AGPs (B) de células de
Beta vulgaris alimentadas con NaCl y polietilenglicol (PEG). La flecha indica el día 7 del
cultivo, en el cual se elevó el potencial osmotico a 95.97 mOsm kg-1
. Las barras de error
representan el E.E. (n=9).
En el cuadro 4 se resumen las principales variables determinadas en los tratamientos
utilizados.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
54
Cuadro 4. Efecto del aumento del potencial osmótico a 95.97 mOsm kg-1
en la biomasa
máxima (X), secreción máxima de AGPs (AGPs) y rendimiento máximo de AGPs (YAGPs/X)
en suspensiones celulares de Beta vulgaris.
Tratamiento X
(g L-1
)
AGPs
(mg L-1
)
YAGPs/X
(mg g-1
)
*Control 10.62 ± 0.21a 13.91 ± 0.28
a 1.52 ± 0.15
a
Sacarosa 21.56 ± 0.36b 78.24 ± 2.32
b 4.51 ± 0.32
b
Manitol 11.17 ± 0.81a 84.19 ± 0.30
c 9.20 ± 0.30
c
Sorbitol 11.15 ± 0.84a 84.16 ± 0.25
c 9.18 ± 0.34
c
PEG 10.43 ± 0.89a 64.69 ± 0.10
d 9.15 ± 0.30
c
NaCl 10.62 ± 0.17c 103.83 ± 1.07
e 17.23 ± 0.42
d
*Control: cultivo no alimentado.
Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente
significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=9).
DISCUSIÓN
Debido a que el manitol y el sorbitol son azúcares no metabolizables, no fueron utilizados
para el crecimiento celular de B. vulgaris (Figura 17). Sin embargo, la secreción de AGPs se
estimuló 6 veces en relación al del cultivo no alimentado (Figura 18 A). Cuando los cultivos
de B. vulgaris fueron tratados con el PEG que es agente no permeabilizante, no se observaron
cambios en el crecimiento celular (Figura 19A), pero si un incremento de 4.65 veces en la
secreción de AGPs (Figura 20A). Mientras que el rendimiento específico de AGPs (YAGPs/X)
fue favorecido de forma similar a lo observado con los azúcares no metabolizables (Figura
20B). Estos resultados sugieren que la secreción de AGPs fue parte de la respuesta osmótica
de las células de B. vulgaris. De igual manera, Iraki et al. (1989a) observaron que el
crecimiento de células de N. tabacum tratadas con PEG fue similar al del cultivo sin
tratamiento. Sin embargo, la secreción de polisacáridos extracelulares conteniendo una
pequeña cantidad de AGP (<17kDa) se redujo en presencia de PEG y fue consistente con la
restricción de la porosidad de la pared celular. Los autores señalan que esto probablemente fue
debido a un efecto detergente del PEG más que un resultado de la disminución del potencial
acuoso del medio o a una inhibición específica del metabolismo.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
55
En el caso de la adición de NaCl se observó un incrementó en la secreción y el
rendimiento especifico de las AGPs, sin embargo el crecimiento celular disminuyó (Figuras
19A y 20). Las AGPs secretadas pueden estar relacionadas a la repuesta de adaptación al
estrés impuesto por el NaCl. Lamport et al. (2006) y Zagorchev et al. (2008) también
observaron que el estrés salino favoreció la secreción de AGPs en suspensiones de N. tabacum
y de Dactylis glomerata L.
La secreción de AGPs en repuesta al estrés osmótico puede estar relacionada con el
mantenimiento de la homeóstasis celular. Iraki et al. 1989(a) y Zhu et al. 1993 señalaron que
las células de N. tabacum se adaptaron rápidamente al estrés inducido por sal, aumentando su
concentración de sales en las vacuolas, conllevando a un incremento en la presión de turgencia
varias veces más alto que las células no adaptadas al estrés salino. Mientras que, Lamport et
al. (2006) mostraron que en suspensiones de N. tabacum no adaptadas, el tiempo de residencia
de las AGPs enlazadas a la membrana celular fue 10 veces mayor que el encontrado en las
células adaptadas al NaCl. Lo cual llevo a sugerir que un tiempo de residencia corto de las
AGPs en la membrana plasmática es consistente con una mayor velocidad de secreción de las
AGPs al medio de cultivo. Así mismo los autores propusieron dos posibles funciones de las
AGPs secretadas en las suspensiones celulares de N. tabacum expuestas a estrés salino. En
primer lugar, las AGPs pueden actuar como un amortiguador periplásmico para la
estabilización de la interfase entre la membrana plasmática y la pared celular, de las células
sometidas a alta presión hidrostática interna. Otro postulado implica que las AGPs actúan
como moléculas plastificantes en la red de pectinas, con lo que se aumentaría la porosidad de
la pared celular mediante el relajamiento de las pectinas.
En este trabajo se desconoce si las AGPs que se secretan al medio de cultivo son del tipo
clásicas, pero la liberación de éste tipo de AGPs podría estar regulado por estrés osmótico. Las
AGPs clásicas presentan en el dominio C-terminal una señal para la unión de un grupo
glicosilfosfatidilinositol, el cual permite su anclaje a la membrana plasmática (Youl et al.,
1998). Las AGPs clásicas de la superficie celular, pueden ser secretadas al espacio extracelular
a través de la acción de una fosfolipasa C o D activadas probablemente por estrés osmótico
(DrØbak y Watkins, 2000; Munnik et al., 2000). Esta liberación de las AGP ancladas a la
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
56
superficie celular podría ser un mecanismo para regular la cantidad de las AGPs en la
superficie celular o su secreción dentro de la matriz extracelular, donde actuarían como una
señal soluble para las células vecinas (Schultz et al., 1998).
En conclusión, los cultivos celulares de B. vulgaris secretaron AGPs en repuesta al estrés
osmótico dado por el manitol, sorbitol, PEG y NaCl.
REFERENCIAS
de Paiva Netto VB, Otoni WC (2003) Carbon sources and their osmotic potential in plant tissue culture: does it
matter? Sci Hort 97:193-202.
DrØbak B.K, Watkins PA (2000) Inositol (1, 4, 5) trisphosphate production in plant cells: an early response to
salinity and hyperosmotic stress. FEBS Lett 481: 240-244.
Dubois M, Gilles A, Smith, F (1956) Colorimetric method determination of sugars and related substances. Anal
Chem 28: 350-356
George EF, Hall MA, de Klerk GJ (2008) The components of plant tissue culture media. II: Organic additions,
osmotic and pH effects and support systems. In: George EF, Hall MA, de Klerk GJ (eds) Plant Propagation
by Tissue Culture. Vol.1 The Background, 3rd edn. Springer, Berlin, pp 115-173.
Iraki NM, Bressan RA, Hasegawa PM, Carpita NC (1989a) Alteration of the physical and chemical structure of
the primary cell wall of growth-limited plant cells adapted to osmotic stress. Plant Physiol 91: 39-47.
Iraki NM, Bressan RA, Carpita NC (1989b) Extracellular polysaccharides and proteins of tobacco cell cultures
and changes in composition associated with growth-limiting adaptation to water and saline stress. Plant
Physiol 91: 54-61.
Kim S-I, Choi H-K, Kim J-H, Lee H-S, Hong S-S (2001) Effect of osmotic pressure on paclitaxel production in
suspension cell cultures of Taxus chinensis. Enzyme Microb Technol 28: 202-209.
Koch KE (1996) Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:
509-540.
Lamport DT, Kieliszewiski MJ, Showalter AM (2006) Salt stress upregulates periplasmic arabinogalactan
proteins: using salt stress to analyse AGP function. New Phytol 169: 479-492.
Liu C-Z, Cheng X-Y (2008) Enhancement of phenylethanoid glycosides biosynthesis in cell cultures of
Cistanche deserticola by osmotic stress. Plant Cell Rep 27: 357-362.
Munnik T, Meijer HJG, ter Riet B, Hirt H, Frank W, Bartels D, Musgrave A. (2000) Hyperosmotic stress
stimulates phospholipase D activity and elevates the levels of phosphatidic acid and diacylglycerol
pyrophosphate. Plant J 22: 147-154.
Schultz C, Gilson P, Oxley D, Youl J, Bacic A (1998) GPI-anchors on arabinogalactan proteins: implications for
signaling in plants. Trends Plant Sci 3: 426-431.
Capítulo 3. Secreción de AGPs en respuesta al estrés osmótico.
57
van Holst GJ, Clarke A (1985) Quantification of arabinogalactan-protein in plant extracts by single radial
diffusion gel. Anal Biochem 148: 446–450.
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Enhancement of saponin production in Panax ginseng cell culture by
osmotic stress and nutrient feeding. Enzyme Microb Technol 36:133-138.
Youl JJ, Bacic A, Oxley D (1998) Arabinogalactan-proteins from Nicotiana alata and Pyrus communis contain
glycosylphosphatidylinositol membrane anchors. Proc Natl Acad Sci USA 95: 7921-7926.
Zagorchev L, Petrova S, Odjakova M (2008) Arabinogalactan proteins in salt-adapted suspension cultures of
Dactylis glomerata L. Gen Appl Plant Physiol 34: 159-168.
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Effect of osmotic pressure on cell growth and production of ginseng saponin
and polysaccharide in suspension cultures of Panax notoginseng. Biotechnol Lett 17: 1347-1350.
Zhang YH, Zhong JJ (1997) Hyperproduction of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation
of Panax notoginseng cells. Enzyme Microb Technol 21: 59-63.
Zhu JK, Bressan RA, Hasegawa PM (1993) Loss of arabinogalactan proteins from the plasma membrane of
NaCl-adapted tobacco cells. Planta 190: 221-226.
CAPÍTULO 4. RELACIÓN DE LAS AGPs Y LA AGREGACIÓN CELULAR EN
SUSPENSIONES DE Beta vulgaris L.
INTRODUCCIÓN
Los cultivos de células vegetales están formados por células meristemáticas, es decir
células no diferenciadas, que no se separan después de la división y forman agregados
multicelulares de diferente tamaño y forma (Meyer et al., 2002). Los agregados pueden incluir
hasta 100 células, tener diámetros milimétricos y tienden a sedimentar (Kieran et al., 1997). El
fenómeno de agregación es común en las células vegetales y la secreción de polisacáridos
extracelulares, especialmente en las últimas etapas del crecimiento puede contribuir a su
aumento (Taticek et al., 1991, Kolewe et al., 2010).
Los patrones de formación de agregados varían dependiendo de la línea celular, la edad
del cultivo y las condiciones de cultivo; por lo cual, cualquier cambio en dichos patrones
puede ser un indicativo de las variaciones del cultivo como respuesta a factores ambientales
(Kieran et al., 1997). En general, la formación de agregados celulares promueve la
organización y la diferenciación celular que resulta en una mejor producción de metabolitos
secundarios. La agregación celular también puede afectar la transferencia de masa del
oxígeno, de nutrientes o de inductores químicos importantes para el crecimiento de los
cultivos de células (Kieran et al., 2000; Trejo-Tapia y Rodríguez Monroy, 2007; Kolewe et al.,
2010). El fenómeno de agregación es uno de los factores limitante en el escalamiento de los
procesos, ya que juega un papel importante en el diseño del reactor, escalado y separación
(Hsu et al., 1993). Por lo cual, es importante conocer los factores biológicos y químicos
involucrados en la formación de los agregados celulares.
En el caso de las células vegetales en suspensión, se conoce que durante su cultivo,
secretan una matriz de polisacáridos y de proteínas hacia el medio extracelular que son
similares a las que forman la pared celular. Así las xiloglucanas (Bauer et al., 1973, Hayashi et
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
59
al., 1986), arabinoxilanas y galacturonanas (Webster et al., 2008) y, las proteínas
arabinogalactanas (AGPs), han sido identificadas en el medio de cultivo (Langan y Nothnagel,
1997; Darjania et al., 2002; Lamport et al., 2006; Hernández, 2007).
En particular, las AGPs están codificadas por una gran familia de genes en las
angiospermas y pueden desempeñar múltiples funciones en el desarrollo de plantas, tales
como en el crecimiento y el desarrollo vegetal y en la adhesión célula-célula (Majewska-
Sawka y Nothnagel, 2000, Showalter, 2001). Johnson et al. (2003) reportaron que las AGPs
tipo fasciclinas (FLAs) tienen, además de las regiones glicosiladas, supuestos dominios de
adhesión celular conocidos como dominios fasciclina. La precipitación de las FLAs con el
reactivo de Yariv, indica que ellas comparten características estructurales con las AGPs
(Johnson et al., 2003). Debido a que las AGPs están preferencialmente localizadas en el lado
exterior del plasmalema, se sugiere que las AGPs pueden interactuar con los componentes de
la pared celular, principalmente con pectinas y proveer la inserción del plasmalema a la pared
celular (Carpita y Gibeaut, 1993). Sin embargo, son escasos los estudios que muestran la
relación de las AGPs con el proceso de agregación celular que ocurre en los cultivos de células
vegetales.
La glicosilación proteica es importante para el correcto plegamiento, la estabilidad de la
conformación y la actividad biológica de las proteínas, y para la protección contra la
degradación proteolítica (Martínez y Chrispeels, 2003; Mitra et al., 2006). La tunicamicina
(TM) es un antibiótico que se utiliza para modular el proceso de glicosilación. La TM inhibe
la UDP-N-acetil-D-glucosamina: fosfato de dolicol N-acetil-D-glucosamina-1-fosfato
transferasa (GPT), la enzima que transfiere la primera N-acetil-D-glucosamina al dolicol
fosfato (Koizumi et al., 1999). Hori y Elbein (1981) reportaron que la TM inhibió la síntesis
de oligosacáridos unidos a lípidos y la incorporación de [3H] manosa en la pared celular y en
las macromoléculas extracelulares en suspensiones celulares de Glycine max L. También la
TM afectó la adhesión célula-célula en el moho de limo, Polysphondylium pallidum (Nakata y
Ochiai, 1996). Por otro lado, Borderies et al. (2004), mostraron que la adición de AGPs en el
medio de cultivo de embriones somáticos de Zea mays L. revierte el efecto de inhibición
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
60
causado por la TM en el desarrollo de los embriones. Lo cual indicó que la glicosilación de
las AGPs es necesaria para que estas moléculas puedan inducir el desarrollo de los embriones.
Por otra parte, el reactivo de Yariv (Yariv et al., 1962), que se une selectivamente a las
AGPs, es usado para conocer algunas de las funciones de las AGPs. La formación del
precipitado AGP-Yariv es una manera de inactivar a las AGPs en el cultivo de células
vegetales, que conlleva a conocer la repercusión de su ausencia en los procesos biológicos
importantes como es la diferenciación y el crecimiento vegetal (Serpe y Nothnagel, 1994;
Willats y Knox, 1996; Showalter, 2001; Guan y Nothnagel, 2004).
Las células de Beta vulgaris L. son de forma esférica con diámetros alrededor de 20 μm y
pueden crecer en forma de agregados de 200 - 500 μm, tanto en cultivos desarrollados en
matraces como en biorreactor (Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999). Los agregados celulares
de B. vulgaris, cambian su tamaño a lo largo del tiempo de cultivo, alcanzando su máximo
tamaño durante la fase exponencial, pero disminuyen su tamaño en la fase estacionaria
(Jiménez, 2005). Una tendencia a la agregación fue observada como un efecto del aumento de
la concentración inicial de sacarosa. Y este fenómeno coincidió con la mayor secreción de
AGPs, sugiriendo un posible papel de la AGPs como moléculas de adhesión celular
(resultados del Capítulo 2). Por lo cual, podrían ser un modelo de estudio para conocer la
relación de las AGPs con la formación de los agregados en cultivos de células vegetales.
En este estudio, a través del uso de la TM y del reactivo de Yariv se evaluó el efecto de
reducir el contenido de las AGPs sobre el crecimiento y los perfiles de agregación celular de
las suspensiones celulares de B. vulgaris.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
61
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo de células de B. vulgaris
Las células de B. vulgaris fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer (500 mL) con 100
mL de medio de cultivo y mantenidas bajo las condiciones de incubación indicadas en el
capítulo 2.
Para los experimentos se utilizaron matraces Erlenmeyer de 125 mL con 30 mL de medio
de cultivo B5 suplementado con 131.4 mM de sacarosa (45 g L-1
), inoculados con 0.8 g de
células (base húmeda) de 7 días de edad. Se realizaron dos experimentos independientes y se
retiraron tres matraces cada 2 o 3 días para realizar las determinaciones de crecimiento celular,
distribución del tamaño de los agregados y el contenido de AGPs en la pared y en el medio de
cultivo. Los resultados son el promedio de 6 muestras ± el error estándar (E.E).
Tratamiento con tunicamicina
Las suspensiones de 5 días de edad fueron tratadas con tunicamicina (TM) (Sigma), un
agente conocido por prevenir la glicosilación proteica (Koizumi et al., 1999). Se adicionaron
60 L de una solución stock de TM a 60.56 µM preparada en buffer de fosfato de sodio (BF)
10 mM en agua (pH 10.5) y esterilizada mediante filtración, para alcanzar una concentración
final de 1.21 µM. Se tomaron muestras durante 3 días, mientras las células estuvieron en
contacto con el inhibidor para evaluar el crecimiento, el contenido de AGPs y la distribución
del tamaño de los agregados.
Después de la exposición a TM, los cultivos se lavaron dos veces con medio fresco,
utilizado para el crecimiento de las células. En el primer lavado bajo condiciones de
esterilidad, el medio de cultivo conteniendo el inhibidor fue retirado por decantación y se
agregaron 50 mL de medio de cultivo fresco. Posteriormente, el cultivo se colocó en agitación
orbital a 120 rpm por 30 min. Pasado este tiempo se procedió a eliminar nuevamente por
decantación el medio de cultivo y se adicionaron 50 mL de medio fresco, se agitó ligeramente
y el contenido del matraz se filtró con un tamiz.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
62
Las células filtradas fueron transferidas a un matraz de 125 mL, conteniendo 30 mL de
medio fresco de cultivo. Las condiciones de crecimiento del cultivo fueron 25 ºC ± 2 °C,
fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad y agitación a 120 rpm. Se tomaron las muestras en los
días 1, 3, 5 y 7 posteriores al tratamiento para evaluar el crecimiento, el contenido de AGPs y
la distribución del tamaño de agregados. Como controles se utilizaron los cultivos sin TM
(control positivo) y con BF (control negativo), los cuales fueron sometidos a todo el
procedimiento anterior. Los resultados son el promedio de 6 muestras ± el error estándar
(E.E).
Tratamiento con el reactivo de Yariv
Las suspensiones celulares de B. vulgaris de 5 días de edad fueron tratadas con el reactivo
de Yariv (Biosupplies Australia Pty, Ltd.), el cual se enlaza a las AGPs (Yariv et al., 1962). Se
adicionaron 576 L de una solución de reactivo de Yariv a 1041.67 M, previamente
esterilizada mediante autoclave, para alcanzar una concentración final de 20 M. Las muestras
para los análisis fueron tomadas diariamente durante el tratamiento con el inhibidor (3 días).
El reactivo de Yariv fue retirado de los cultivos de forma similar a la descrita para el
tratamiento con TM. Se tomaron muestras en los días 1, 3, 5 y 7 después de retirar el
inhibidor. Los cultivos celulares sin reactivo de Yariv (control positivo) y con un análogo del
reactivo de Yariv, el (β-D-manosil)3, fenilglicósido Yariv (β-D-ManY)3 (control negativo), que
no se enlaza a las AGPs; fueron utilizados como controles. Los resultados son el promedio de
6 muestras ± el error estándar (E.E).
Métodos analíticos
Biomasa
El crecimiento celular se evaluó por la determinación del peso en seco (PS), descrito en el
capítulo 2.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
63
Viabilidad celular
La integridad de la membrana fue medida mediante el test de exclusión del colorante de
azul de Evans según la metodología reportada por Rodríguez-Monroy y Galindo (1999) y
descrita en el capítulo 2.
Distribución del tamaño de los agregados
La distribución del tamaño de los agregados fue determinada según la metodología
reportada por Trejo-Tapia et al. (2003). Se utilizó un tamiz metálico con luz de malla de
tamaño estándar: 500 µm, que permitió la separación de la población de células en dos
fracciones: <500 y >500 µm. Una muestra de 20 mL de suspensión celular se pasó suavemente
a través del tamiz de 500 µm y se lavó tres o cuatro veces con agua desionizada. Las células y
los agregados retenidos (fracción >500 µm) y que pasaron a través del tamiz (fracción <500
µm) se recolectaron por filtración en un papel Whatman No. 1 previamente pesado. Las
células y agregados de células de cada una de las fracciones fueron sometidas a análisis de
peso seco, a fin de obtener la distribución de la fracciones en términos de los porcentajes de
peso seco.
Cuantificación de las AGPs de la fracción de la pared celular
La fracción de la pared celular (PC) de B. vulgaris fue obtenida mediante el método
reportado por Lamport et al. 2006. Las células fueron removidas del medio de cultivo
mediante filtración a través de un filtro Whatman No. 1 y se lavaron rápidamente con NaCl al
1% para eliminar macromoléculas débilmente unidas. Alícuotas de células (30-100 ±0.2 mg de
peso fresco) fueron transferidas a microtubos de 2 mL y las células fueron rotas mediante
sonicación en 1 mL de NaCl al 1% (frío), a 40 kHz a 150 Watts por 60 s (Bransonic Ultrasonic
cleaner, modelo 2510, Lorain Road Cleveland, USA). Los precipitados de pared celular fueron
recuperados mediante centrifugación a 1000 g por 10 min, se lavaron y centrifugaron 10
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
64
veces con NaCl al 2% y agua destilada para obtener las fracciones de la pared celular. Después
de cada lavado, se descartó el sobrenadante.
Las AGPs de la PC fueron cuantificadas mediante el ensayo de colorimetría con el
reactivo de Yariv. Para esto, los pellets obtenidos fueron incubados con 200 µg del reactivo de
Yariv por una hora en 750 L de NaCl al 1% a temperatura ambiente, o con el (β-D-ManY)3,
como control. El reactivo de Yariv no permeabiliza la membrana plasmática intacta, pero se
asocia específicamente con las arabinogalactanas de las cadenas laterales de las AGPs de la
superficie celular formando un complejo AGPs-Yariv insoluble en sal, que se disocia
rápidamente en 0.02 M NaOH acuoso (Jermyn y Yeow, 1975). Luego se le adicionó 1 mL de
NaOH 20 mM al complejo AGPs-Yariv, y la absorbancia fue medida a = 457 nm (Lamport
et al., 2006). Para calcular el contenido de AGPs en las muestras de pared celular, se realizó una
curva estándar (Figura 4.1). Las unidades de absorción fueron convertidas a µg de AGPs de
B. vulgaris utilizando un factor de corrección de 1.61, el cual fue obtenido a partir de la
absorbancia de 20 µg de AGPs de goma arábiga (0.798 AU) y de 20 µg de AGPs del medio de
cultivo de B. vulgaris (0.495 AU).
y = 0.004x - 0.045
R² = 0.995
mg células frescas
0 20 40 60 80 100
AG
Ps
de
pared
cel
ula
r (A
U)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Figura 21. Curva tipo para la cuantificación de las AGPs de pared celular por el método
colorímetrico. Las barras de error representan el E.E. (n=3).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
65
Cuantificación de las AGPs en el medio de cultivo
La cantidad de AGPs del medio de cultivo (MC) fue cuantificada mediante el test de
difusión radial en agarosa descrito por van Holst y Clarke (1985) y detallado en el capítulo 2.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza ANOVA simple para medidas repetidas y la comparación
de medias fue realizada con una prueba de Tukey realizado con el programa SigmaStat v3.5
para los datos de los cuadros 5, 6 y 7.
RESULTADOS
Crecimiento celular de las suspensiones celulares de B. vulgaris
La Figura 22A muestra la cinética de crecimiento celular de B. vulgaris sin inhibidor, en
donde se observa que no hay una fase de adaptación celular. Las células crecieron de forma
lineal hasta el día 13 del cultivo, con una velocidad de crecimiento de μ = 0.13 días-1
y un
tiempo de duplicación de 5.3 días, alcanzando una biomasa máxima de 23.82 g L-1
a los 15
días del cultivo (Cuadro 5).
El crecimiento celular de B. vulgaris fue reducido durante la exposición a TM (Figura
22B). A los tres días de exposición con TM (día 8 de crecimiento) el cultivo alcanzó una
biomasa de 7.09 g L-1
; mientras que en los cultivos controles, la biomasa fue de 12.03 g L-1
(Cuadro 5). Esto indica que hay una reducción del 42 % en el crecimiento de los cultivos en
presencia de TM. Sin embargo, la viabilidad celular no fue afectada por la presencia del
inhibidor, ya que con TM la viabilidad (75.6 %) fue muy similar a la encontrada en los
controles (70 a 80%).
Después de la exposición a TM, las células de B. vulgaris fueron transferidas a medio de
cultivo fresco y crecidas durante 7 días (hasta el día 15 de la cinética del cultivo). Los cultivos
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
66
tratados con TM presentaron una recuperación del crecimiento celular alcanzando una
biomasa de 19.75 g L-1
hacia el final del cultivo. Sin embargo fue menor a la encontrada en los
cultivos control (sin TM, 23.45 g L-1
) (Cuadro 5).
En la Figura 22C se muestra el crecimiento de los cultivos al ser expuestos al reactivo de
Yariv durante tres días del cultivo. El tratamiento con éste reactivo provocó un menor
crecimiento de los cultivos comparados con el control, (β-D-ManY)3. Este efecto es más
evidente al tercer día de exposición con el reactivo de Yariv. En el día 8, el crecimiento de los
cultivos con tratamiento fue de 5.52 g L-1
, mientras que el de los controles (β-D-ManY)3 fue de
11.96 g L-1
. Esto indica que hubo una reducción del 55 % en el crecimiento de los cultivos en
presencia del reactivo de Yariv. Después de retirar el reactivo de Yariv los cultivos de B.
vulgaris, no recuperaron su crecimiento; mientras que los cultivos controles (con (β-D-
ManY)3) alcanzaron una biomasa máxima para el día 15 de 23.29 g L-1
(Cuadro 5).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
67
0
5
10
15
20
25
Control
Bio
ma
sa (
g L
-1)
0
5
10
15
20
25 TM (-)
TM (+)
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
5
10
15
20
25 Yariv (-)
Yariv (+)
A
B
C Tiempo de
exposición
Tiempo de
exposición
Figura 22. Cinética de crecimiento celular de las suspensiones de Beta vulgaris tratadas con
tunicamicina (B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin inhibidores; TM (-), con
buffer fosfato (BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), (β-D-ManY)3; Yariv (+), con
reactivo de Yariv. Las barras de error representan el E.E. (n=6).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
68
Cuadro 5. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la biomasa de las
suspensiones celulares de Beta vulgaris.
Tratamiento Biomasa (g L-1
)
Día 8
† Día 15
Control 12.15 ± 0.47a 23.82 ± 0.45
a
TM (-) 12.08 ± 0.44a 24.45 ± 0.47
a
TM (+) 7.09 ± 0.54b 19.75 ± 0.55
b
Yariv (-) 11.96 ± 0.34a 23.29 ± 0.48
a
Yariv (+) 5.52± 0.27c 5.51 ± 0.18
c
† 3 días después del tratamiento.
Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente
significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=6).
Contenido de AGPs en la pared celular y en el medio de cultivo de células de B. vulgaris.
La Fig. 23A muestra los perfiles del contenido de AGPs en la fracción de pared celular
(PC) y la secretada al medio de cultivo (MC) de B. vulgaris. La concentración de AGPs de la
PC se incrementó durante el tiempo del cultivo, alcanzando en el día 15 una concentración de
0.33 mg AGPs g-1
de células secas (Cuadro 6). Sin embargo, los niveles de AGPs fueron más
altos en el MC con una concentración máxima de 1.53 mg g-1
. Estos resultados sugieren que la
mayor parte de las AGPs de B. vulgaris son secretadas al medio de cultivo durante el
crecimiento del cultivo.
La exposición por tres días con el inhibidor TM, causó que los cultivos de B. vulgaris
presentaran una reducción del contenido de las AGPs tanto en la PC como en el MC (Figura
23B). En el día 8 del cultivo, los contenidos de las AGPs en la PC y en el MC fue de 0.085 mg
g-1
y de 0.34 mg g-1
, respectivamente. Mientras que los controles (con BF) presentaron
contenidos de AGPs de 0.16 mg g-1
y de 0.95 mg g-1
en la fracción de PC y del MC,
respectivamente (Cuadro 6). Sin embargo, después de eliminar el inhibidor, las suspensiones
de B. vulgaris presentaron nuevamente una tendencia a incrementar el contenido de las AGPs
tanto en la fracción de la PC como las secretadas al MC. En el día 15 del cultivo, el contenido
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
69
de AGPs en la PC y en el MC con TM fueron de 0.27 mg g-1
y de 1.12 mg g-1
,
respectivamente (Cuadro 6).
La Figura 23C muestra los resultados del contenido de AGP en la fracción de PC y las
secretadas hacia el MC cuando los cultivos fueron tratados con el reactivo de Yariv. El
contenido de las AGPs enlazadas a la PC disminuyó considerablemente con el tiempo de
exposición al reactivo de Yariv. Para el día 8, se encontró una reducción hasta del 62% de las
AGPs de la PC en comparación a los cultivos control tratados con (β-D-GlcM)3. La secreción
de las AGPs al MC fue inhibida hasta en un 99% en los cultivos tratados con el reactivo de
Yariv. Después del contacto de las células con el reactivo de Yariv, las células transferidas
nuevamente a medio fresco no recuperaron su capacidad para acumular AGPs tanto en la
fracción de PC como en el MC (Cuadro 6).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
70
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
PC Control
MC Control
AG
Ps
(mg
g-1
PS
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6PC TM (-)
MC TM (-)
PC TM (+)
MC TM (+)
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
PC Yariv (-)
MC Yariv (-)
PC Yariv (+)
MC Yariv (+)
Tiempo de
exposición
Tiempo de
exposición
B
A
C
Figura 23. Contenido de AGPs en las suspensiones de Beta vulgaris tratadas con tunicamicina
(B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin inhibidores; TM (-), con buffer fosfato
(BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), (β-D-ManY)3; Yariv (+), con reactivo de Yariv.
Las barras de error representan el E.E. (n=6).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
71
Cuadro 6. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en el contenido de AGPs de la
pared (PC) y del medio de cultivo (MC) de Beta vulgaris.
Tratamiento AGPs en la PC (mg g-1
) AGPs en el MC (mg g-1
)
Día 8† Día 15 Día 8
† Día 15
Control 0.160 ± 0.017a 0.330 ± 0.015
a 0.962 ± 0.008
a 1.534 ± 0.013
a
TM (-) 0.158 ± 0.015a 0.325 ± 0.017
a 0.957 ± 0.009
a 1.532 ± 0.017
a
TM (+) 0.085 ± 0.018b 0.273 ± 0.014
b 0.344 ± 0.008
b 1.124 ± 0.012
b
Yariv (-) 0.157 ± 0.009a 0.323 ± 0.013
a 0.959 ± 0.009
a 1.529± 0.013
a
Yariv (+) 0.061 ± 0.005c 0.059± 0.006
c 1.083 ± 0.007
c 0.006± 0.001
c
† 3 días después del tratamiento.
Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente
significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=6).
Distribución del tamaño de los agregados
La distribución del tamaño de los agregados cambió a lo largo de la cinética de cultivo
(Figura 24). En el cultivo control, se observó al inicio del cultivo, que la fracción <500 µm
representó el 43.3 % del peso seco (PS); mientras que al día 15, disminuyó a un 6.8% del PS.
Por el contrario, al inicio del cultivo la fracción con agregados >500 µm fue del 56.7% y se
incrementó en el día 15 del cultivo hasta un 93.2% del PS (Cuadro 7). Estos resultados indican
que las suspensiones de B. vulgaris tienden a formar agregados más grandes conforme avanza
la cinética de crecimiento (Figuras 24A y 25A-C).
La Figura 24B muestra el perfil de distribución del tamaño de los agregados en presencia
de TM y el control respectivo (con BF); y el aspecto al estereomicroscopio de estos agregados
es mostrado en la Figura 25D-F. En el día 8 del cultivo, tiempo en el que las suspensiones
celulares habían sido tratadas con TM por tres días, se encontraron cambios en la proporción
de los agregados celulares en comparación al control. En el cultivo tratado con TM, ambas
fracciones, >500 y < 500 μm, se presentaron en una proporción similar (50%), mientras que
en el cultivo no tratado (control con BF) la fracción mayoritaria fue la de >500 μm (75.3%)
(Cuadro 7). Lo cual significa que en presencia de TM hay una disminución del tamaño de los
agregados, estos cambios son mostrados en la figuras 25D-E. Este efecto de TM fue
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
72
reversible, ya que después de retirar el inhibidor se observó una tendencia de reiniciar la
agregación celular. En el día 15 del cultivo, la fracción de los agregados >500 μm constituyó
el 89.7% del PS de los agregados. La Figura 25F muestran el cambio del tamaño de los
agregados después de la exposición con TM.
Los resultados del tratamiento de las suspensiones celulares con el reactivo de Yariv y
como control manosil Yariv se muestran en las figuras 24C y 25G-I. Al término del
tratamiento (día 8 del cultivo), en los controles, la fracción de los agregados celulares >500
μm fue del 76.3% del peso seco. Esta fracción con el tratamiento del reactivo de Yariv se
redujo a un 36.9 %. Mientras que la fracción de los agregados de menor tamaño (<500 μm)
aumentó de 23.7% del PS a 63.1% del PS (Cuadro 7). La Figura 25H muestra la disminución
del tamaño de los agregados durante su exposición al reactivo de Yariv.
Después de retirar el reactivo de Yariv, la fracción con agregados de mayor tamaño mostró
una tendencia a disminuir con el tiempo de cultivo, alcanzando en el día 15 un valor de 16.5
%. La fracción con agregados de menor tamaño continuó aumentando con el tiempo de cultivo
y al final de la cinética representó el 83.5 % del PS (Figura 25I). Un comportamiento contrario
fue observado en los controles, donde para las fracciones de <500 μm y >500 μm
representaron el 6.8 y del 93.2 % del PS, respectivamente (Cuadro 7).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
73
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
20
40
60
80
100
< 500 m Yariv (+)
> 500m Yariv (-)
< 500m Yariv (+)
> 500 m Yariv (+)
Ag
reg
ad
os
(% P
S)
0
20
40
60
80
100Tiempo de
exposición
Tiempo de
exposiciónC
B0
20
40
60
80
100
< 500 m Control
> 500 m Control
A
< 500 m TM (-)
> 500 m TM (-)
< 500 m TM (+)
> 500 m TM (+)
Figura 24. Distribución de las fracciones de tamaños de agregados en las suspensiones de
Beta vulgaris expuestos a tunicamicina (B) y el reactivo de Yariv (C). Control (A), células sin
inhibidores; TM (-), con buffer fosfato (BF); TM (+), con tunicamicina; Yariv (-), con (β-D-
ManY)3; Yariv (+), con reactivo de Yariv. Las barras de error representan el E.E. (n=6).
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
74
Cuadro 7. Efecto de la tunicamicina y del reactivo de Yariv en la formación de agregados de
Beta vulgaris.
Tratamiento Día 8†
Día 15
< 500 µm > 500 µm < 500 µm > 500 µm
Control 23.7 ± 1.54a 76.29 ± 2.64
a 6.79 ± 2.64
a 93.21 ± 2.49
a
TM (-) 24.7 ± 1.47a 75.30 ± 2.43
a 7.10 ± 2.42
a 92.90 ± 2.53
a
TM (+) 50.5 ± 1.48b 49.50 ± 2.61
b 10.30 ± 2.16
b 89.70 ± 2.55
b
Yariv (-) 24.20 ± 1.54a 75.80 ± 2.68
a 7.00 ± 2.36
a 93.00 ± 2.49
a
Yariv (+) 63.10 ± 1.53c 39.90 ± 2.64
c 83.50± 2.27
c 16.50 ± 2.38
c
† 3 días después del tratamiento.
Las letras iguales dentro de cada una de las columnas indican que no hay diferencias estadísticamente
significativas. ANOVA (Tukey, p <0.05) (n=6).
Día 3 Día 8 Día 15
Control
TM
Reactivo de
Yariv
Figura 25. Fotomicrografías (2×) de los agregados celulares de Beta vulgaris durante la
cinética de crecimiento. Cultivo control a los 3 días del cultivo (A) a los 8 días del cultivo (B)
y a los 15 días del cultivo (C). Cultivo a los 3 días antes de agregar TM (D) y con TM por 3
días (E) y después de retirar TM a los 15 días del cultivo (F). Cultivo antes de incubar con el
reactivo de Yariv (G), incubado por 3 días (H, día 8 de cultivo) y después de retirar el reactivo
de Yariv en el día 15 del cultivo (I). Barras: 10 µm.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
75
DISCUSIÓN
Un incremento en la agregación celular fue observada durante el crecimiento de B.
vulgaris (Figuras 22A y 24A). Al respecto, Jiménez (2005), reportó que los agregados
celulares de B. vulgaris, cambian su tamaño a lo largo del crecimiento celular. Al inicio del
cultivo, los agregados fueron pequeños, de contorno irregular y de compactación media, pero
alcanzan su máximo tamaño durante la fase exponencial con contornos poco irregulares y de
aspecto compacto.
El incremento en la formación de agregados de mayor tamaño estuvo asociada con un
incremento en el contenido AGPs en la PC y en el MC (Figuras 23A y 24A). Estos eventos
ocurrieron principalmente durante la fase exponencial, a partir del día 5 al 9 del crecimiento
celular. Las suspensiones celulares de B. vulgaris también presentaron una tendencia a
agregarse como un efecto del incremento de la concentración inicial de sacarosa, lo cual
coincidió con una aumento en la secreción de AGPs (resultados del Capítulo 2). Sin embargo,
Leboeuf et al. (2004) reportaron que las células en suspensión de Arabidopsis thaliana (L.)
Heynh., mostraron una disminución de la adhesión celular durante las etapas exponencial
tardía y estacionaria y esto estuvo relacionado con un aumento de la secreción de las AGPs al
medio de cultivo.
Es probable que las AGPs desempeñen un papel en la vinculación de las macromoléculas
de la pared celular, principalmente con pectinas y de esta forma facilitar la conexión entre el
plasmalema y la pared celular (Rumyantseva, 2005).
Los datos de esta investigación muestran que cuando la glicosilación de proteínas fue
inhibida con TM, hay una disminución del contenido de AGPs en la PC y en el MC (Figura
23B). Lo cual se relacionó con una disminución del crecimiento y en la formación de
agregados celulares de menor tamaño (Figuras 22B, 24B y 25E). Estos resultados sugieren que
al afectar el contenido de las AGPs tanto en PC como su secreción al MC, el crecimiento y la
agregación celular de los cultivos no es sostenible. Otros estudios han señalado que la TM
puede afectar la síntesis de glicoproteínas relacionadas con la agregación celular. Yamada et
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
76
al. (1982) observaron que la TM afectó la biosíntesis de las glicoproteínas involucradas en la
agregación celular de Dictyostelium discoideum y evidenciaron que varias proteínas de la
membrana celular desaparecieron en presencia de TM. Mientras que Nakata y Ochiai (1996)
reportaron que en las células de P. pallidum, la disminución de la adhesión celular coincidió
con una reducción en el contenido de la glicoproteína gp64.
Cuando la TM fue retirada de los cultivos de B. vulgaris y estos fueron transferidos a
medio de cultivo fresco, las células volvieron a sintetizar las AGPs en la PC y secretarlas al
MC (Figura 23B), lo cual coincidió con una recuperación en el crecimiento celular y la
formación de agregados celulares de mayor tamaño (Figura 22B, 24B y 25F). Así fue claro
que hay un paralelismo entre la síntesis de las AGPs con la recuperación de la agregación
celular. De forma similar, Nakata y Ochiai (1996) observaron que al eliminar la TM de las
células de P. pallidum, comenzaron a agregarse nuevamente lo que estuvo acompañado de un
incremento de la glicoproteína gp64. Por otro lado, Borderies et al. (2004) observaron que el
desarrollo de microsporas de Z. mays es bloqueado al aplicar TM y que dicha inhibición fue
suprimida cuando los cultivos fueron trasferidos a medios de cultivo ricos en AGPs o en una
solución de goma arábiga, sugiriendo que las AGP son glicoproteínas requeridas en el
desarrollo de las microesporas. Las AGPs como componentes integrales de la superficie
extracelular de las unidades embriogénicas podrían ser importantes para la adhesión célula-
célula de dichas unidades, así como para la señalización de célula-célula y reconocimiento
(Sămaj et al., 1999).
La precipitación de AGPs por su interacción con el reactivo de Yariv fue otro mecanismo
para reducir la acumulación de las AGPs de B. vulgaris. Cuando las células permanecieron en
contacto con el reactivo de Yariv, se observó una reducción de las AGPs de la PC mientras
que su secreción hacia el MC fue totalmente inhibida (Figura 23C). Estos eventos fueron
paralelos a la reducción del crecimiento celular y a la disminución del tamaño de los
agregados (Figura 22C, 24C y 25H). La inhibición del crecimiento y de la agregación celular
no se debió a una disminución en la viabilidad celular, ya que con y sin el reactivo de Yariv
los cultivos mostraron una viabilidad similar. En los cultivos de Rosa sp., también se encontró
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
77
que la disminución del crecimiento celular no es consecuencia de una reducción en la
viabilidad celular (Serpe y Nothnagel, 1994).
Al retirar el reactivo de Yariv de los cultivos, los cultivos no recuperaron la producción
de AGPs en la PC ni su secreción al MC, por lo tanto la inhibición del crecimiento y la
agregación celular no fueron eventos reversibles. Estos datos sugieren que la presencia de las
AGPs es fundamental para el crecimiento y la agregación celular. Al respecto, Hernández
(2007) reportó que después de eliminar el reactivo de Yariv en los cultivos de B. vulgaris hay
una inhibición en el crecimiento celular, una disminución en el tamaño de los agregados y un
cambio en la forma de los mismos.
Las AGPs como moléculas de adhesión celular podrían ser capaces de formar una
conexión esencial entre la membrana y la pared celular requeridas para el crecimiento y
desarrollo normal, estas conexiones pueden involucrar a las AGPs de la pared celular y a otras
moléculas de la pared, tales como las pectinas (Showalter, 2001). Aunque el mecanismo
exacto entre AGPs-Yariv, es desconocido, la configuración estructural del reactivo de Yariv le
permite asociarse a las moléculas de AGPs para formar un precipitado dando el complejo
AGP-Yariv. Además, el reactivo de Yariv es capaz de entrar a la pared celular donde se
encuentran enlazadas las AGPs con otros componentes moleculares de la pared y de la
membrana plasmática (Serpe y Nothnagel, 1994). Así al adicionar el reactivo de Yariv, se
puede inducir una agregación “anormal” de las moléculas de las AGPs en la superficie de la
membrana plasmática y/o romper las conexiones de las AGPs requeridas para el crecimiento
“normal”.
En conclusión, estos resultados indican que las AGPs de B. vulgaris son requeridas en la
agregación celular.
REFERENCIAS
Bauer, WG, Talmadge KW, Keegstra K, Albersheim P (1973) The structure of plant cell walls IT. The
hemicellulose of the walls of suspension-cultured sycamore cells. Plant Physiol 51: 174-187.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
78
Borderies G, Béchec M, Rossignol, Lafitte C, Deunff E, Beckert M, Dumas C, Matthys-Rochon E (2004)
Characterization of proteins secreted during maize microspore culture: arabinogalactan proteins (AGPs)
stimulate embryo development. Eur J Cell Biol 83: 205-212.
Carpita NC, Gibeaut DM (1993) Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of
molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal 3:1–30.
Darjania L, Ichise N, Ichikawa S, Okamoto T, Okuyama H, Thompson GA (2002) Dynamic turnover of
arabinogalactan proteins in cultured Arabidopsis cells. Plant Physiol Biochem 40:69-79.
Guan Y, Nothnagel EA (2004) Binding of arabinogalactan proteins by Yariv phenylglycoside triggers wound-like
responses in Arabidopsis cell cultures. Plant Physiol 135:1346-1366.
Hayashi T, Polonenko DR, Camirand A, Maclachan G (1986) Pea xyloglucan and cellulose. IV. Assembly of 0-
glucans by pea protoplasts. Plant Physiol 82: 301-306.
Hernández AM (2007) Acumulación y características bioquímicas de las AGPs secretadas por cultivos de células
de Beta vulgaris L. en suspensión. Tesis de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos.
Institituto Politécnico Nacional, México. 67 p.
Hori H, Elbein AD (1981) Tunicamycin inhibits protein glycosylation in suspension cultured soybean cells. Plant
Physiol 67: 882-886.
Hsu J-P, Hsu W-C, Tsao H-K (1993) Diffusion-enhanced bioreactions: a hypothetical mechanism for plant cell
aggregation. Bull Math Biol. 55:869-889.
Jermyn MA, Yeow YM (1975) A class of lectins present in the tissues of seed plants. Austr J of Plant Physiol 2:
501-531.
Jiménez CA (2005) Aplicación de la geometría fractal a agregados Celulares de Beta vulgaris L. crecidos en
suspensión (matraces y biorreactor tipo tanque agitado). Tesis de Maestría en Ciencias en Desarrollo de
Productos Bióticos. Institituto Politécnico Nacional, México. 82 p.
Johnson KL, Jones BJ, Bacic A, Schultz CJ (2003) The fasciclin-like arabinogalactan proteins of Arabidopsis. A
multigene family of putative cell adhesion molecules. Plant Physiol 133: 1911-1925.
Kieran PM, MacLoughlin PF, Malone DM (1997) Plant cell suspension cultures: some engineering
considerations. J Biotechn 59: 39-52.
Kieran PM, Malone DM, MacLoughlin PF (2000) Effect of hydrodynamic and interfacial forces on plant cell
systems. pp. 139-177. In: T. Scheper, K. Schugerl, and G. Kretzmer (eds). Adv Biochem Eng/Biotechnol
Vol 67, Springer-Verlag, Berlin, Germany.
Koizumi N, UjinoT, Sano H, Chrispeels, MJ (1999) Overexpression of a gene that encodes the first enzyme in the
biosynthesis of asparagine linked glycans makes plants resistant to tunicamycin and obviates the
tunicamycin-induced unfolded protein response. Plant Physiol 121:353-361.
Kolewe ME, Henson MA, Roberts SE (2010) Characterization of aggregate size of Taxus suspension cell culture.
Plant Cell Rep 29: 485–494.
Lamport DT, Kieliszewiski MJ, Showalter AM (2006) Salt stress upregulates periplasmic arabinogalactan
proteins: using salt stress to analyse AGP function. New Phytol 169:479-492.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
79
Langan KJ, Nothnagel EA (1997) Cell surface arabinogalactan-proteins and their relation to cell proliferation and
viability. Protoplasma 96:87-98.
Leboeuf E, Thoiron S, Lahaye M (2004) Physico-chemical characteristics of cell walls from Arabidopsis thaliana
microcalli showing different adhesion strengths. J Exp Bot 55(405): 2087-2097.
Majewska-Sawka A, Nothnagel EA (2000) The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development.
Plant Physiol 122:3–9.
Martínez IM, Chrispeels MJ (2003) Genomic analysis of the unfolded protein response in Arabidopsis shows its
connection to important cellular processes. Plant Cell 15: 561-576.
Meyer JE, Pépin MF, Smith MAL (2002) Anthocyanin production from Vaccinium pahalae limitations of the
physical microenvironment. J Biotechnol 93: 45-57.
Mitra N, Sinha S, Ramya TNC, Surolia A (2006) N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding,
form and function, Trends Biochem Sci 31: 156-163.
Nakata N, Ochiai H (1996) Inhibitory Effects of tunicamycin on cell-cell adhesion and cell reaggregation of the
cellular clime mold, Polysphondylium pallidum. J Plant Res 109: 193-199.
Rodríguez-Monroy M, Galindo E (1999) Broth rheology, growth and metabolite production of Beta vulgaris
suspension culture: a comparative study between cultures grown in shake flasks and in a stirred tank.
Enzyme Microb Technol 24:687-693.
Rumyantseva NI (2005) Arabinogalactan proteins: involvement in plant growth and morphogenesis.
Biochemistry (Moscow) 70: 1301-1317.
Sămaj J, Baluška F, Bobák M, Volkmann D (1999) Extracellular matrix surface network of embryogenic units
of friable maize callus contains arabinogalactan-proteins recognized by monoclonal antibody JIM4. Plant
Cell Rep 18: 369-374
Serpe MD, Nothnagel EA (1994) Effects of Yariv phenylglycosides on Rosa cell suspensions: evidence for the
involvement of arabinogalactan-proteins in cell proliferation. Planta 193:542–550.
Showalter AM (2001) Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cell Mol Life Sci 58:1399–
1417.
Taticek RA, Moo-Young M, Legge RL (1991) The scale-up of plant cell cultures: engineering considerations.
Plant Cell Tiss Org Cult 24: 139-158.
Trejo-Tapia G, Hernández-Trujillo R, Trejo-Espino JL, Jimenéz-Aparicio A, Rodríguez-Monroy M (2003)
Analysis of morphological characteristics of Solanum chrysotrichum cell suspension cultures. World J
Microbiol Biotechnol 19:929–932.
Trejo-Tapia G, Rodríguez-Monroy M (2007) Cellular aggregation in secondary metabolite production in vitro
plant cell cultures. Interciencia 32: 669-674.
van Holst GJ, Clarke A (1985) Quantification of arabinogalactan-protein in plant extracts by single radial
diffusion gel. Anal Biochem 148:446–450.
Webster J M, Oxley D, Pettolino FA. and Bacic A (2008) Characterisation of secreted polysaccharides and
(glyco) proteins from suspension cultures of Pyrus communis. Phytochemistry 69:873–881.
Capítulo 4. Relación de las AGPs y la agregación celular.
_________________________________________________________________________
80
Willats WG, Knox JP (1996) A role for arabinogalactan-proteins in plant cell expansion: evidence from studies
on the interaction of β-glucosil Yariv reagent with seedlings of Arabidopsis thaliana. Plant J 9:919–925.
Yamada H, Hirano T, Toshio Miyazaki
T, Akira Takatsuki
A, Tamura G (1982) Effects of tunicamycin on cell
adhesion and biosynthesis of glycoproteins in aggregation-competent cells of Dictyostelium discoideum. J
Biochem 92: 399-406.
Yariv J, Rapport MM, Graf L (1962) The interaction of glycosides and saccharides with antibody to the
corresponding phenylazo glycosides. Biochem J 85: 383-388.
DISCUSIÓN GENERAL
Los cultivos de B. vulgaris crecidos con 87.6 mM (30 g L-1
) de sacarosa, alcanzaron una
biomasa máxima de 15.97 g L-1
(Figura 10) con una velocidad específica de crecimiento (μ)
de 0.13 días-1
y un tiempo de duplicación (td) de 5.3 días. Los valores de μ y td fueron
diferentes a los reportados por Rodríguez-Monroy y Galindo 1999 (μ de 0.06 días-1
con un td
de 11.6 días) y por Hernández (2007) (μ de 0.12 días-1
con un td de 5.8 días). Estas diferencias
probablemente fueron debidas al tamaño del inóculo, a la edad de la línea celular empleada y
a la posible adaptación de las células de B. vulgaris a las condiciones de cultivo como
consecuencia de su resiembra periódica. La línea celular usada en este trabajo, es la misma a la
empleada por aquellos autores, lo cual implica que tiene al menos 12 años de resiembras. Sin
embargo, en un estudio realizado por Jiménez (2005), el cultivo de B. vulgaris presentó una μ
de 0.172 días-1
y el td de 4 días.
Así mismo, en este trabajo se encontró que los cultivos crecidos con 87.6 mM de sacarosa
mostraron una acumulación de AGPs de 59.12 mg L-1
(Figura 11). Este contenido fue 2.84
veces mayor a lo reportado por Hernández (2007), que fue de 20.8 mg L-1
; sugiriendo que la
edad del cultivo puede inducir una mayor secreción de las AGPs. Al respecto, Langan y
Nothnagel (1997), señalaron que líneas celulares de Rosa sp. con diferente año de
descendencia (Rosa 57 y Rosa 93) mostraron diferencias en su secreción de AGPs al medio de
cultivo. Las suspensiones celulares de mayor edad, Rosa 57, secretaron mayor contenido de
AGPs que la de Rosa 93. Mientras que las células de Rosa 93 incrementaron en 1.5 veces su
secreción de AGPs a medida que se aumentó el número de subcultivo.
A través de la electroforesis cruzada, se observó que las células de B. vulgaris secretaron dos
AGPs (Figura 15) que pudieran corresponder a las AGPs de 115 a 159 kDa identificadas
previamente por Hernández (2007).
Discusión general
82
El perfil de acumulación de las AGPs secretadas por los cultivos de B. vulgaris, presentó
una asociación parcial al crecimiento celular, especialmente en la fase exponencial de la
cinética de crecimiento. Este comportamiento en la secreción de AGPs también ha sido
reportado por otros autores. Darjania et al. (2002) señalan un aumento en la acumulación de
las AGPs secretadas por los cultivos de A. thaliana conforme al crecimiento celular del
cultivo. En forma semejante, en los cultivos de Rosa sp., la acumulación de las AGPs ocurre
durante el crecimiento de los cultivos (Komalavilas et al., 1991).
Los resultados de esta investigación mostraron que la secreción de las AGPs en los
cultivos de B. vulgaris se incrementó en respuesta al aumento de la concentración inicial de
sacarosa (CIS) y al estrés osmótico (Figuras 11, 18 y 20). El crecimiento celular y la
acumulación volumétrica de las AGPs en el medio de cultivo fueron mejorados como
consecuencia del incremento de la CIS. Mientras, que la acumulación específica de las AGPs
aumentó 3 veces al cambiar la CIS de 43.8 a 87.6 mM. Sin embargo, la CIS de 131.4 mM no
tuvo efecto en el rendimiento y la productividad de las AGPs (Cuadro 1), sugiriendo un
posible efecto osmótico por el incremento de la CIS. Cuando los cultivos fueron sometidos a
estrés osmótico mediante la adición de manitol, sorbitol, PEG y NaCl, la secreción de AGPs se
incrementó entre 6 a 7.46 veces, sin embargo, el crecimiento celular fue similar o disminuyó
en relación a los cultivos no alimentados (Figuras 17 y 19). Estos resultados indican que la
secreción de AGPs por las células B. vulgaris pueden estar relacionados con el crecimiento
pero también son parte de la respuesta celular al estrés osmótico.
Por otro lado se observó, que los células de B. vulgaris en medio líquido presentaron una
tendencia a agregarse como un efecto del aumento de la CIS y que este fenómeno coincidió
con la mayor secreción de AGPs sugiriendo un posible papel de la AGPs como moléculas de
adhesión celular (Figura 12). Los experimentos con tunicamicina (TM) y el reactivo de Yariv,
demostraron que las AGPs son requeridas para el crecimiento y la agregación celular de B.
vulgaris (Figuras 22-24).
Basados en los resultados de esta investigación se propone un modelo hipotético de cómo
las AGPs pueden ser secretadas en respuesta a la CIS y/o al estrés osmótico y cómo estás
Discusión general
83
moléculas participarían en el crecimiento y en la formación de agregados de B vulgaris
(Figura 26).
La sacarosa presenta una acción dual. Una como fuente carbono, estimulando el
crecimiento y la secreción de AGPs en las células de B. vulgaris. La otra, ejerce un efecto
osmótico incrementando la secreción de AGPs de forma similar a los agentes osmóticos tales
como el manitol, sorbitol, PEG y NaCl. Así, la secreción de AGPs tiene un efecto positivo en
el crecimiento y la formación de agregados. Por otro lado, cuando se disminuye parcial o
totalmente la cantidad de AGPs en los cultivos celulares, por exposición a la acción de
inhibidores como la TM y el reactivo de Yariv, se inhibe el crecimiento y la agregación
celular de B. vulgaris.
Figura 26. Modelo hipotético para la secreción de AGPs en respuesta al incremento de la CIS
y al estrés osmótico y su relación con el crecimiento y la agregación celular. Las líneas indican
el efecto positivo (+) y las líneas discontinuas el efecto negativo ().
En este trabajo se observó que los cultivos en suspensión de B. vulgaris secretan dos
AGPs en repuesta a la CIS y al estrés osmótico, además su acumulación en el medio de cultivo
está relacionada con el crecimiento y la agregación celular. Sin embargo, aún falta por conocer
Discusión general
84
la composición química de estas glicoproteínas, lo que ayudaría a precisar si se trata de AGPs
clásicas o no clásicas. Conociendo que tipo son las AGPs secretadas por los cultivos, se podría
inferir cuál es su localización celular antes de ser secretadas, lo que proporcionaría indicios de
los mecanismos de su secreción y de su relación con el crecimiento celular y la agregación
celular. Esto llevaría a contestar preguntas como: ¿Las AGPs secretadas por los cultivos de B.
vulgaris actúan como una señal?, sí es así ¿En qué parte de la molécula reside esa señal?, o
¿Se tratan de AGPs estructurales que interaccionan con el citoesqueleto o la pared celular y
que permiten que el crecimiento celular se lleve a cabo? ¿Son las AGPs secretadas moléculas
de adhesión entre célula-célula? ¿Si sirven como moléculas de adhesión celular, la presencia
del anclaje GFI y su subsecuente procesamiento, facilitarán el remodelamiento de la pared
celular? ¿Compartirán dominios similares a los de otras moléculas de adhesión celular, tales
como las fasciclinas?
El estudio de la secreción de AGPs por los cultivos de B. vulgaris podría dirigirse también
desde un enfoque biotecnológico, estas moléculas pueden ser utilizadas como sustancias
inductoras de la embriogénesis somática en programas de micropropagación de plantas. La
adición de AGPs al medio de cultivo puede inducir la embriogénesis en cultivos que no son
embriogénicos y aumentar el rendimiento en cultivos embriogénicos (Kreuger et al., 2000;
Pereira-Netto et al., 2007). Sin embargo, es escaso el conocimiento del mecanismo por el cual
las AGPs participan en estos cambios de diferenciación, como también si tales efectos son
atribuidos a un solo tipo de AGP o una mezcla de AGPs y cuáles características bioquímicas
particulares presentan.
También se ha reportado que las AGPs poseen actividad inmunoestimulante (Yamada,
2000), lo que despierta el interés de producirlas a escala comercial. La alimentación con
sacarosa sería una estrategia futura a evaluar en la secreción de AGPs, en un sistema de mayor
escala como los biorreactores de tipo tanque agitado. El hecho de que los cultivos de B.
vulgaris secreten AGPs al medio de cultivo, facilitaría la recuperación y posterior purificación
de esta glicoproteína redundando en una disminución de costos.
85
CONCLUSIÓN
En respuesta al incremento de la concentración inicial de sacarosa, los cultivos de Beta
vulgaris L. en suspensión aumentaron la secreción volumétrica de AGPs, lo cual coincidió con
un mayor crecimiento y la formación de agregados celulares. La secreción de AGPs también
fue parte de la respuesta celular al estrés osmótico impuesto por el manitol, sorbitol, NaCl y
polietilenglicol. Y la inhibición del contenido de estas glicoproteínas, demostró que las AGPs
son requeridas para el crecimiento y la agregación celular de B. vulgaris.
86
ANEXOS
Anexo 1. Portada del artículo de revisión: Las proteínas arabinogalactanos en cultivos de
células vegetales.
Anexo 2. Portada del artículo: Sucrose induces arabinogalactan protein secretion by Beta
vulgaris L. cell suspension cultures.
170 MAR 2009, VOL. 34 Nº 3
PALABRAS CLAVE / AGPs / Cultivo de Células / Embriogénesis Somática / Proteínas Extracelulares /
Recibido: 20/05/2008. Modificado: 21/02/2009. Aceptado: 26/02/2009.
Arianna Michelle Hernández Sánchez. Maestra en Ciencias, Centro de Desarrollo de Produc-tos Bióticos, Instituto Politécnico Nacional (CeProBi-IPN), México. e-mail: [email protected]
Jacqueline Capataz Tafur. Estudiante de Doctorado en Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN), México. e-mail: [email protected]
Mario Rodríguez-Monroy. Doctor en Ciencias, Universidad Autónoma de México (UNAM), México. Investigador, CeProBi-IPN, México. e-mail: [email protected]
Gabriela Sepúlveda Jiménez. Doctora en Ciencias, UNAM, México. Investigador, CeProBi-IPN, México. Dirección: Departamento de Biotecnología, CeProBi-IPN. Apdo. Postal 24. Carretera Yautepec-Jojutla Km. 8.5. Yautepec, Morelos. México. C.P. 62730. e-mail: [email protected]
LAS PROTEÍNAS ARABINOGALACTANOS EN CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES
ARIANNA MICHELLE HERNáNDEz SáNCHEz, JACqUELINE CAPATAz TAfUR, MARIO RODRÍGUEz-MONROy
y GABRIELA SEPúLVEDA-JIMÉNEz
as proteínas arabinoga-lactanos (AGPs) son ma-cromoléculas glicosila-
das, distribuidas ampliamente en el reino vegetal, que se encuentran prácticamente en todos los órganos de las plantas. Las AGPs están implicadas en varios aspectos del crecimiento y el desarrollo de las plantas, tales como la diferenciación de tejidos reproductivos y vegetativos, la ex-pansión y la proliferación celular, y la muerte celular programada (Figura 1). A nivel celular, estas glicoproteínas se loca-lizan principalmente en la membrana plas-
0378-1844/09/03/170-07 $ 3.00/0
mática, en la pared celular, o como secre-ciones en el espacio intercelular (Majews-ka-Sawka y Nothnagel, 2000; Rumyantse-va, 2005). El carbohidrato de las AGPs consiste en arabinogalactanos del tipo II, de donde reciben el nombre estas glico-proteínas. Las AGPs pertenecen a la fami-lia de las proteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs), que también incluye a las ex-tensinas, a las proteínas ricas en prolina y a las lectinas (Majewska-Sawka y Nothna-gel, 2000). Desde un punto de vista prác-tico, las AGPs se pueden diferenciar de las otras HRGPs por su capacidad de
unirse a un colorante sintético conocido como el reactivo β-glicosil Yariv (Yariv et al., 1967). Asimismo, el reactivo de Yariv y anticuerpos monoclonales que reconocen a las AGPs son usados para conocer la participación de las AGPs en los procesos de crecimiento y desarrollo (Seifert y Ro-berts, 2007).
Las AGPs son componen-tes abundantes de gomas y exudados, y muestran propiedades funcionales relevan-tes para la industria de alimentos; por ejemplo, la goma arábiga de Acacia sene-gal es usada por sus propiedades de emul-
RESUMEN
Las proteínas arabinogalactanos (AGPs) son macromoléculas que se encuentran prácticamente en todos los órganos de las plantas, siendo asociadas con varios aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal. Estas moléculas se caracterizan bioquímica-mente por contener carbohidratos y proteínas en relación 9:1. El carbohidrato está compuesto principalmente por arabinogalacta-nos tipo II; mientras que la parte proteica está organizada en dominios que definen a las AGPs como clásicas o no clásicas. Las primeras se caracterizan además por presentar una secuen-cia C-terminal que predice la incorporación de un grupo gli-cosilfosfatidilinositol (GFI), que permite su unión a la membrana plasmática. En cultivos de células vegetales se reportan varias especies que liberan AGPs al medio de cultivo. Se presenta una revisión de las características bioquímicas de las AGPs liberadas
al medio y de las propuestas sobre los mecanismos bioquímicos y celulares por los cuales las AGPs participan en la diferencia-ción y crecimiento de las células vegetales. Los cultivos de célu-las liberan al medio de cultivo AGPs clásicas y no clásicas, y se propone que podrían provenir de la membrana plasmática o la pared celular. Las AGPs intervienen en el control del crecimien-to celular, además de estar relacionadas con la embriogénesis somática y la organogénesis, procesos de diferenciación celular importantes en los sistemas de micropropagación de plantas. El mecanismo bioquímico por el cual las AGPs participan en el crecimiento celular y la diferenciación implica que éstas, o los productos de su degradación, quizás actúen como moléculas de señalización.
ORIGINAL PAPER
Sucrose induces arabinogalactan protein secretionby Beta vulgaris L. cell suspension cultures
Jacqueline Capataz-Tafur • Arianna M. Hernandez-Sanchez •
Mario Rodrıguez-Monroy • Gabriela Trejo-Tapia •
Gabriela Sepulveda-Jimenez
Received: 3 August 2009 / Revised: 9 December 2009 / Accepted: 13 January 2010
� Franciszek Gorski Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Krakow 2010
Abstract The aim of this study was to determine if the
increase of the initial sucrose concentration (ISC) improves
cell growth and arabinogalactan protein (AGP) secretion of
Beta vulgaris L. cultures. ISC tested were 43.8, 87.6 and
131.4 mM. Cell growth and specific growth rate were
improved increasing the ISC. Cell cultures grown with ISC
43.8 mM were fed with sucrose, and cellular growth was
enhanced twofold, revealing the stimulatory effect of
sucrose on cell growth. The AGP secretion was stimulated,
increasing the ISC. This event was partially associated with
the exponential growth phase of the culture. AGP precip-
itation with Yariv reagent of cell cultures inhibited cell
growth without changes in viability. The assay of sucrose
feeding confirmed the relationship between cell growth and
AGP secretion. These observations suggest that AGPs may
be required for cell division. The increase of AGP secretion
by ISC coincided with a higher cellular aggregation, sug-
gesting a possible role of AGP as cellular adhesion mole-
cules. To determine whether AGP secretion is also
stimulated by an osmotic effect, mannitol was fed to raise
the osmotic potential from 23.78 to 95.97 mOsm kg-1.
Mannitol was not used for cell growth, but AGP secretion
was stimulated sixfold in relation to the control. These
results are important for understanding the possible factors
involved in the AGP secretion of plant cell culture and that
may be considered to improve the AGP production.
Keywords Cell growth � Osmotic potential �Cellular aggregates � Adhesion molecules
Abbreviations
AG Arabinogalactans
AGPs Arabinogalactan proteins
DW Dry cell weight
ISC Initial sucrose concentration
QAGPs AGP productivity
l Specific cell growth rate
YX/S Specific biomass yield with respect to sucrose
consumed
YAGPs/X Specific arabinogalactan protein yield
Introduction
Arabinogalactan proteins (AGPs) are high molecular
weight proteoglycans consisting of *10% protein and 90%
carbohydrates. Arabinogalactan (AG) type II are the
polysaccharides mainly found in AGPs (Fincher et al.
1983). These glycoproteins are distributed in flowers,
stems, roots, seeds, and leaves of plants. At the cellular
level, AGPs are located on the plasma membrane, the cell
wall or as secretions of the intercellular spaces (Majewska-
Sawka and Nothnagel 2000; Showalter 2001; Rumyantseva
2005). While in the plant cell culture, AGPs are found in
the culture medium. This represents a biological system
that facilitates AGP recovery and is used to perform studies
for a better understanding of the role of AGPs on plant
growth.
AGPs have a structural role as plant cell wall compo-
nents and may be active in signaling mechanisms. AGPs
Communicated by E. Lojkowska.
J. Capataz-Tafur � A. M. Hernandez-Sanchez �M. Rodrıguez-Monroy � G. Trejo-Tapia �G. Sepulveda-Jimenez (&)
Departamento de Biotecnologıa, Centro de Desarrollo de
Productos Bioticos, Instituto Politecnico Nacional,
P.O. Box 24, Yautepec, Morelos 62730, Mexico
e-mail: [email protected]
123
Acta Physiol Plant
DOI 10.1007/s11738-010-0460-7