EXTRACCIÓN DE ADN
•Es un ácido capaz de formar sales con iones cargados positivamente (cationes).
• Es soluble en soluciones concentradas de sales.
•Es insoluble en alcoholes (tipo etanol o isopropanol).
•El ADN es destruido (depurinado) a pH ácido (menor de 4,0), es insoluble a pH 5.6, pero es soluble a pH 8,0.
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
CONCENTRACIÓN SALINA
La mayor concentración de iones positivos en elmedio neutraliza la carga negativa de losfosfatos del esqueleto fosfodiester,disminuyendo las fuerzas de repulsión yestabilizando la estructura de la doble hélice.
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
HIDROLISIS QUIMICA
La hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas(hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y las bases púricas) sin afectar las uniones fosfodiéster del esqueleto nucleotídico.
A pH alcalino, el ADN es resistente, mientras que el ARN se hidroliza completamente (presencia de –OH en el C2 de la pentosa).
OBTENCIÓN DEL ADN
SELECCIÓN DEL MATERIAL DE DONDE PODEMOS AISLAR EL ADN DE INTERÉS
SELECCIÓN DEL MÉTODO ADECUADO PARA LA EXTRACCIÓN DEL ADN
MATERIAL DE ORIGEN DE LA MUESTRA
Sangre
Bacterias
Orina
Pelos
Tejidos
Plantas
Hisopados bucales
Mancha hematica
ETAPAS GENERALES DE LA EXTRACCIÓN
•ROMPER PARED CELULAR Y/O LAS MEMBRANAS PLASMATICAS
•ROMPER LA MEMBRANA NUCLEAR
•PROTEGER AL ADN DE ENZIMAS QUE PUEDAN DEGRADARLO
•PRECIPITAR EL ADN
LISIS DE TEJIDOS O CÉLULAS
Tiene que ser suficientemente fuerte para romper elmaterial inicial complejo (Ej: un tejido), pero suficientementesuave para preservar el ácido nucleico.
•rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.)
•tratamiento químico (detergentes, reducción con tioles, etc.)
•digestión enzimática (Proteinasa K, etc.)
PROTEGER AL ADN DE ENZIMAS QUE PUEDAN DEGRADARLO
DNA debe ser disociado de :
•Proteínas
•Ciertas enzimas (ej nucleasas) deben ser inactivadas por desnaturalización : •Detergentes ej: Dodecil sulfato sódico
(SDS) • Enzimas ej: Proteinasa K • Solventes ej: Cloroformo, Fenol •Sales ej: acetato de amonio, NaCl
ADN
Proteínas
PRECIPITAR EL ADN
La precipitación permite su purificación y concentración
Se basa en la deshidratación de la molécula mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol, lo cual lleva a su precipitación.
La precipitación es un fenómeno reversible.
Precipitado de ADN
EVALUACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO
ESPECTROFOTOMETRIA ELECTROFORESIS
Espectrofotometría (260/280 nm)
Evalúo cantidad de ADNNo evalúo calidad
Gel de Agarosa / Poliacrilamida
Evalúo cantidad de ADN Evalúo calidad
ELECTROFORESISLa electroforesis en gel es un método utilizado para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas.
CORRIDA ELECTROFORÉTICA EN GEL DE AGAROSA
Buena resolución
Separación de moléculas grandes (200-50000 pb)
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
Alta resolución
Sus Componentes son tóxicos
Separación menor de 500 pb
COLORANTE
Los fragmentos , una vez teñidos, pueden ser visualizados utilizando un Transiluminador de Luz Ultravioleta
Intercalantede bases Bromuro de EtGelRed
Gel de Poliacrilamida revelo con luz UV
ETAPAS DE LA MUESTRA
Extracción de ADN
Obtención del ADN
Evaluación del ADN obtenido
Uso posterior (PCR, clonación, RT-PCR, transferencia, etc.)