Esp. Graciela Rodriguez JTP. Curso Parasitología.UNSL.
DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
• Recolección de muestras de materia fecal.
En fresco. Con conservantes.
• Procesamiento de muestras fecales.• Técnicas de concentración: Sedimentación: -Carles-Barthelemy.
-Teleman modificado. Flotación: -Método de Willis.
-Método de Sheather.-Método de Faust.
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE MATERIA FECAL
Recolección de materia fecal para exámen directo o fresco:
Permite observar trofozoítos móviles. Observar dentro de los 30 minutos de
emitida. Muestra de materia fecal del tamaño de una
cucharadita de café en recipiente limpio. Evitar contaminación con orina
En pacientes que usen pañales tomar la muestra de las nalgas, nunca del pañal.
Recolección de materia fecal en conservantes:
Se usa cuando: -No se puede procesar dentro de los 30 minutos.
-Facilitar el transporte. -Conservar varios meses.
Muestra de materia fecal recién emitida en recipiente con solución conservante. Evitar contaminación con orina. ( 1 porción de materia fecal en 3 volúmenes de solución conservante)
Conservantes para muestras fecales
Conservante Ventajas Desventajas
Solución salina formolada (5 o 10 %)
-Fácil preparación-Larga duración-Buen preservante para quistes de protozoarios, larvas y huevos de helmintos
-Inapropiado para preservar trofozoítos de protozoarios-No apropiado para algunas coloraciones permanentes
MIF ( Merthiolate iodo
formaldheído)
-Fácil preparación-Larga duración-Fija y colorea los organismos
-Inapropiado para coloración permanente con técnica tricrómica-No conserva morfología de trofozoítos-El iodo distorsiona protozoarios
SAF (Acetato de sodio
ácido acético formaldheído)
-Fácil preparación -Larga duración-Apropiado para coloraciones ácido alcohol resistentes
-Requiere aditivos (albúmina- glicerina) para la adhesión de las muestras al portaobjetos-Coloraciones permanentes no tan buenas como con PVA
PVA(Alcohol
polivinílico)
-Buen preservante para trofozoítos y quistes de protozoarios. Tipificación de amebas.-Fácil preparación de preparados para coloraciones permanentes (preserva y fija)
-Inadecuada preservación de morfología de huevos de helmintos, larvas, coccidios y microsporidios-Contiene cloruro mercúrico-Difícil preparación
Solución de dicromato de
potasio
-Útil para estudio de coccidios-Apropiado para esporulación-Impide crecimiento bacteriano
-No es fijador
FRECUENCIA DE LA RECOLECCIÓN
Muestra única: en pacientes hospitalizadosMuestra seriada: - En el lapso de 7 días, no
mayor de 15 días, recoger una pequeña porción de cada deposición espontanea (mínimo 6 muestras). Mezclar con la solución conservadora. ( De esta manera se evitan las fases negativas de las parasitosis).
- Evitar ingesta de bismuto, antidiarreicos no absorbibles, aceites minerales, soluciones de contraste para radiografías (interfieren en la detección)
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS FECALES
Muestras recolectadas en fresco:
- Examen macroscópico: consistencia (sólidas, semisólidas, pastosas, líquidas), olor, color, sangre, moco, proglótides, parásitos adultos, etc.
- Examen microscópico de trofozoítos móviles entre porta y cubreobjetos.
Fase previa en los métodos de concentración: Homogeneización y filtración
FILTRADO
A
TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
Métodos de sedimentación- centrifugación:
Teleman modificado.Carles-Barthelemy.
Métodos de flotación- centrifugación:
Método de Willis.Método de Faust.Método de Sheather.
Procedimiento:
1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas en solución formolada.
2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en tubo de centrífuga.
3. Agregar 2 ml de éter.4. Centrifugar a 1000-1500 rpm durante 3-5 minutos.5. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.6. Tomar con pipeta pasteur una pequeña cantidad del
sedimento y colocar en portaobjetos.7. Agregar una gota de lugol y sellar con un
cubreobjeto.
Método de Teleman modificado
Método de Teleman modificado
3 a 5 min1000-1500 rpm
Volcar sobrenadante
Éter sulfúrico
Lugol
100x / 400x
2 ml
Líq. ASol. salina formolada (densidad 1,010)
Procedimiento: 1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas
en solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa
en tubo de centrífuga.3. Centrifugar 2 a 3 minutos a 2000 rpm.4. Volcar sobrenadante. Disolver sedimento en
solución B. Agitar. Agregar 2 a 3 ml de éter sulfúrico. Agitar fuertemente. Reposar
5. Centrifugar 2 minutos a 1500 rpm. 6. Romper el anillo (capa éter) con varilla de vidrio.
Evitar que se mezcle con el sedimento.7. Centrifugar 2 minutos a 1500 rpm.8. Observar sedimento.
Método de Carles-Barthelemy
Método de Carles-Barthelemy
Líq. ASol. salina formolada
Diluir
2 a 3 min2000 rpm
Volcar sobrenadante
Éter sulfúrico
Líq. B: Sol. de Ácido cítrico, formolada (Densidad: 1.047)
2 a 3 cc
Agitar
1 min
1000 rpmTirar
Sob.
Lugol
100x / 400x Densidad 1,050-1,150
Procedimiento:1. Colocar en el frasco una muestra de materia
fecal del tamaño de un garbanzo.2. Agregar solución salina sobresaturada. Mezclar.3. Colocar un portaobjetos sobre el borde superior
del frasco y completar con la misma solución hasta que la película superficial haga contacto con el portaobjetos.
4. Dejar la solución 10 minutos a 1 hora ( 20 minutos).
5. Levantar rápida y verticalmente el portaobjetos, invirtiéndolo y colocar un cubreobjetos.
6. Observar al microscopio con bajo aumento.
Método de Willis
Método de Willis
FILTRADOSolución NaCl (densidad 1,200)
Homogeneizar
30 a 45 min
Lugol
100x / 400x
Procedimiento:1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas en
solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en
tubo de centrífuga.3. Centrifugar 2 minuto a 2000 rpm.4. Volcar el sobrenadante5. Disolver el sedimento en agua destilada6. Centrifugar 2 minuto a 2000 rpm. Repetir hasta que el
sobrenadante quede límpido.7. Volcar el sobrenadante. Agregar al sedimento 3 a 4 ml
de solución sulfato de cinc al 33%8. Centrifuar 2 minutos a 2000 rpm.9. Tomar con pipeta pasteur o ansa el material que flota.10. Observar al microscopio.
Método de Faust
Método de Faust
2 a 3 min2000 rpm
Volcar sobrenadante
Solución de ZnSO4
(33%) (d: 1,180)
Gota de Lugol
100x / 400x
Filtrado
H2O
2 a 3 min2000 rpm
Sacar de la superficie con ansa
Procedimiento:1. Homogenizar con varilla de vidrio las heces fijadas
en solución formolada.2. Filtrar a través de un embudo con una doble gasa en
tubo de centrífuga.3. Agregar 2 ml de éter.4. Centrifugar 3 a 5 minutos a 1000-1500 rpm.5. Eliminar con golpe seco el sobrenadante.6. Tomar una parte del sedimento y resuspenderlo en 1
ml de solución de azúcar.7. Dejar reposar 3 minutos.8. Tomar una muestra de la superficie de la solución
con pipeta pasteur y colocar en portaobjetos.9. Observar al microscopio.
Método de Sheather
Los ooquistes de Cryptosporidium spp se observan de color rosado y las levaduras de color verdoso.
Método de Sheather
3 a 5 min1000-1500 rpm
Volcar sobrenadanteÉter
sulfúrico
Lugol
100x / 400x
2 ml
Solución de sheather (sacarosa-fenol- H2O d)
1 ml
Reposar 3 minutos
Tomar con pipeta pasteur de la superficie
NORMAS DE BIOSEGURIDAD(BIOSEGURIDAD NIVEL II)
A)- Utilización de guantes protectores y ropa protectora cuando se procesan las muestras.B)- Usar cabinas de bioseguridad si es necesario.C)- Descontaminar la superficie de trabajo al comienzo y final del procesamiento de las muestras.D)- No beber, no fumar, no comer o manipular lentes de contacto en el área de trabajo.E)- Al retirarse los guantes lavarse las manos.
¨UN BUEN DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO COMIENZA CON UNA BUENA MUESTRA Y UNA BUENA MUESTRA COMIENZA CON UNA BUENA EXPLICACIÓN Y UNA BUENA EXPLICACIÓN TERMINA CUANDO NOS HEMOS ASEGURADO QUE EL PACIENTE NOS COMPRENDIÓ¨