Download - Enzimas de diagnostico
TEMA-22. ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA
1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico
Mejor conocimiento molecular metabolismo
Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas
2. Herramientas analíticas Purificación de enzimas
3. Terapia enzimática Industria Biotecnológica
8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)
Conocimiento estructural y funcional
1. Determinación de actividades enzimáticas para el diagnostico clínico
a) La enzima debe estar presente en fluido biológico
b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida
c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlación con los valores patológicos.d) La enzima debe ser estable
Tipos de fluidos: Suero (Más común) y Orina
LCF, Pleura, Sinovial, etc
SUERO
1. Enzimas específicas
2. Enzimas no específicas
Enzimas su función radica en el plasma
Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc
Enzimas que son secretadas por los tejidos.
Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc.
Enzimas intracelulares. Daño Tisular Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo. Proliferación Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente
DIAGNOSTICOEnzima específica de tejidos (Raro)-Abundancia relativa Fosfatasa ácida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)
- Patrón de enzimas característico- Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..
Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa ácida, etc.
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO
Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía
Creatina QuinasaAspartato aminotransferasaLactato deshidrogenasa
Valor en plasmaConcentración en tejidoVelocidad del vertidoGrado de degradación
Vida media 10 –130 horas
Test depende del tiempo del infartoCreatina Quinasa mas específicaLDH se puede diferenciar por electroforesis
Músculo esqueléticoMúsculo cardiaco (Mayor concentración)CerebroNo en el hígadoProteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B Músculo M-M (99%) y M-B (1%)Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%)Cerebro B-B (100%)
Pequeño Infarto M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)
Creatina quinasa
Lactato deshidrogenasa
Hígado, Corazón Inmunoblotting LDH-1Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.85 Normal >1 Enfermo
Transaminasas (ALT y AST)
Se utilizan poco actualmenteHígado AST/ALT (3-5)Corazón AST/ALT (20-25)
ENZIMOLOGIA CLÍNICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICASAspartato aminotransferasa (AST ó GOT)Alanina aminotransferasa (AST ó GPT)Fosfatasa alcalinaγ-Glutamil transferasa
Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etcTransaminasas
Fosfatasa alcalinaγ-Glutamil transferasa
4-nitrofenil fosfato Visible
Enfermedades hepáticas HepatitisCirrosisTumoresObstrucción del conducto biliar
CrónicasAgúdas Intermitentes
USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS
-Diagnóstico de enfermedades-Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas)-Seguimiento de operaciones hepáticas
TRANSAMINASASNo específicas del plasma
Células parenquimales Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Vertido al plasma
Hepatitis, cirrosis Progreso de la enfermedad
FOSFATASA ALCALINANo específicas del plasma
Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos ISOENZIMAS
Daños en las células del conducto biliar
Ratio Fosf.Alc/TransaminasasHepatitis 0,2-0,6Obstrucción del 10-20conducto biliar
γ-GLUTAMIL TRANSFERASA
Cataliza reacciones de destoxificaciónutilizando glutation
CarcinogénicosAgentes de quimioterapiaParacetamolXenobióticosContenido alto 5%
Vida media corta 90 minMarcador muy rápido y sensible de daño hepático
GLUTATION TRANSFERASA
Alcoholismo crónico
Incremento síntesis y en la secreción
Cirrosis
Tiempo de la ProtrombinaFunción hepáticaTiempo requerido para la activación de la protrombina en TrombinaIndica grado de funcionamiento hepáticoFactores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la sangre
Trombina Cataliza el proceso de coagulación
OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO
α-AMILASAPáncreasGlándulas salivares
Suero normal Baja actividadSuero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular
CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASAIndicadores de desordenes en la musculatura esquelética
Músculo esquelético, cardiaco, CerebroCreatina quinasa
Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso, infarto de miocardio, daño cerebral, etcISOENZIMAS
Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos)Significado clínico menor Precaución (contaminación Glb rojos)
FOSFATASA ALCALINADiagnóstico de obstrucción del conducto biliar Enfermedades de huesosIncremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos)
Osteomalacia RaquitismoHiperparatiroidismoEnfermedad denominada hipofosfatasia Actividad
Pirofosfatos inorgánico (substrato) Crecimiento cristales de hidroxiapatitoNo estrictamente Isoenzimas Osteoblastos, Hígado, Intestino, Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciación Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores, Calor
FOSFATASA ACIDALocalización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc Diagnostico de carcinoma de PróstataPrecaución en el muestreo - Lábil - Contaminación con FA de eritrocitos
Diferenciación isoformas - Sensibilidad sustratos - Uso de inhibidores específicos: Formaldehido eritrocitos
2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN
DE METABOLITOSUso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analíticamente
VentajasLa enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de otras sustancias Evita la purificación necesaria en un análisis químico
Sustancias lábiles
InconvenientesEl costo de la enzimas Inmovilización Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo
Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc
Puntos importantes para utilizar una enzima1. La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido
Equilibrio no favorablea) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática
b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa
2. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km.
3. La especificidad de la enzima debe ser conocida
4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)
Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosaDeterminación de glucosa
Métodos enzimáticos1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa
NADPH Cambio 340 nmEspecificidad segundo paso
Visible (Más utilizado)Más interferencias productos
sangre3. Glucosa deshidrogenasa
Determinación de ácido úrico
Diagnóstico de la gotaMétodo químico y enzimático
Actualmente sólo se utiliza el enzimáticoAbsorbancia (293 nm) Alantoina; Consumo de O2Acoplado a peroxidasa (H2O2)
Falta especificidad
Determinación de urea
Determinación de colesterol y trigliceridos
Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardioMétodo químico (colorimétrico) No específico, contaminante
EsteresaColesterol oxidasaPeroxidasa
Absorción a 500 nmTrigliceridos
Colesterol
Test de la función renal: Suero y orina Capacidad de filtración glomerular
UREA Carbonato amónico. NH4 Acoplado con glutamato DH NADH
Ureasa
Seguimiento: Diabetes Mellitus, Nefrosis, obstrucción biliar, etc
Otros metabolitosCreatinaCreatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa
Amonio Glutamato deshidrogenasa
Tiamina difosfato en eritrocitosEnsayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminasEnsayo diagnostica deficiencia en vitaminas
MalnutriciónEncefalopatía de Wernicke´sTransquetolasa Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina Enfermos : Actividad al añadir Tiamina
ENZIMA INMUNOENSAYO
Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal
Hormonas, drogas,proteínas, etc Identifican con un anticuerpo.
Anticuerpos son unidos a una enzima: Fácilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. etc
Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,
3. Terapia enzimática
Principales áreas de trabajo - Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre - Enfermedades genéticas - Cáncer
Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina, Bromelaina, Hialuronidasa).
Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.
Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas
Forma de administración Eliminación de metabolitos (sangre) Endógena: Estreptoquinasa
Exógena: Ureasa Bilirrubina oxidasaPosibilidad de usar enzimas inmovilizadas
Tratamiento de Enfermedades genéticas
Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas Enfermedad de Gauchers GlucosilceramidasaAcumula un glucocerebrosido en los macrófagos Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes
Pancreatitis Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan
Fibrosis císticaDefecto genético proteína transmembrana (1/2000).Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etcConducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitisTubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).
Xeroderma pigmentosoDefecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UVDefecto mecanismo reparador del ADNTratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas
Cáncer
Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica Leucemia aguda granulocítica
Tumores Necesitan asparraginaEnzima en plantas, animales y bacteriasAusente del suero de los mamiferosTratamiento en combinación con quimioterapia
Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.
Glutaminasa
Serina hidratasa
Fenilalanino amonio liasa
Leucina dehidrogenasa
Experimentación posibles agentes anticancerígenos
Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero
Activación de prodrogas
Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta que son específicamente activadas.Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicasMetrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN
EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS
Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT
Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPTLa enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector
4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS
Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticosMás de 400 deficiencias
Identificación de un metabolito Ej. Fenilcetonuria FenilpiruvatoBiopsia del tejido y medida de la actividadPruebas en el ADN
FENILCETONURIADéficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa
Retraso mental Prevención dieta
Detección precoz es muy importante
INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)
Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa
Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre
Inhibición de la xantina oxidasaGota Niveles de ácido úrico Metabolismo de las Purinas
Xantina Ácido úrico
Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa
Inhibidores antiretrovirales
nhibidores de la proteasa.
Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.Enzima proteasa cataliza la ruptura de la poliproteína que encápsula el virus.
Necesarios para completar su proceso de replicación dando lugar a nuevos virus
Dimero de 99 aminoacidos
Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa
Centro activo en el centro de la molécula
Inhibidores análogos del substrato Cambio en el enlace peptídico por un isoester
Conclusiones
Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico
Enzimas estimación de metabolitos
Equipamiento más sofisticado gran automatización Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN
Procesos tecnológicos:
Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc
Estudios estructurales Diseño de inhibidores
Terapia enzimática Tecnología de ADN