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Enzimas
Curvas temporales de actividad enzimática de LDH
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Función de las proteínasCentro de acción en procesos biológicos.
• Catalizan el conjunto de reacciones químicas a las que de manera general nos referimos como vida.
• Regulan: directamente como enzimas o indirectamente en forma de mensajeros químicos (hormonas, receptores, transportadores).
• Dan soporte: fibras musculares, micro fibrillas en ciclo celular, etc.
• En defensa: anticuerpos (inmunoglobulinas). • Papel pasivo: colágeno en huesos, tendones, ligamentos.
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Proteínas
En términos de estructura: relaciones tridimensionales entre los componentes atómicos de una proteína:
• Estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.
• Grupos prostéticos• Modificaciones covalentes
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Catalizador
Molécula inorgánica u orgánica que incrementa notablemente la velocidad de una reacción química sin ser modificada o consumida en la reacción.
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Enzimas Son catalizadores biológicos . Disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero NO modifican la constante de equilibrio.
• Ej. Constante de equilibrio de una reacción: Keq = = = 100
Reacción catalizada por una enzima acelera la reacción 10,000 veces
Keq = = = 100K1
K-1
10 -3
10-5
K1
K-1
10
10-2
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La reacción en que una molecula de orotidina monofosfato pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa que cuando no es catalizada.
1017 = 100,000,000,000,000,000
CIEN MIL BILLONES DE VECES MÁS RÁPIDA
Ejemplo
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Ventajas de enzimas sobre catalizadores inorgánicos
• EFICIENCIAVelocidades de reacción elevadas
• CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓNTemperatura, pH, presión
• ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓNUnión a sustrato
• CAPACIDAD DE REGULACIÓNControl alostérico, modificación covalente, Síntesis-degradación
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Sitio catalítico o sitio activo
Es una región tridimensional de la proteína que une específicamente al sustrato, mediante un reconocimiento estructural complementario.Contiene a los grupos catalíticos y los cofactores/coenzimas.
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La catálisis enzimática requiere:
• - Unión específica de la proteína al sustrato y a moléculas reguladoras.
• - Reactividad específica de la proteína con su sustrato.
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Dos teorias para explicar la unión específica enzima-sustrato:
– TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
– TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
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TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
E. Fisher, 1894
La enzima tiene un sitio (sitio activo) en el que “encaja” perfectamente el sustrato, al unirse ambos se lleva a cabo la catálisis
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TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
La unión del sustrato al sitio activo de la enzima promueve un cambio conformacional de la enzima para que al unirse ambos se lleva a cabo la catálisis
D. Koshland, 1958
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En general, los nombres de las enzimas se forman añadiendo el sufijo “asa” al nombre de la sustancia en la que actúan
CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
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Iones metálicos como Fe2+, Zn2+, Mg2+
Coenzimas Moléculas orgánicas
Flavin mononucleótido o FMN Flavin adenin dinucleótido o FAD+, Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD+ Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP+
Grupo prostético Asociado de modo permanente a la enzima.
En algunas reacciones enzimáticas es necesaria la presencia de cofactores o coenzimas para llevar a cabo la catálisis.
Sitio activo de la enolasa que utiliza Mg 2+ como cofactor
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Las enzimas disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan
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Es el estudio de la velocidad a la cual se lleva a cabo una reacción catalizada por una enzima y de los factores que la afectan.
Cinética enzimática
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Velocidad y actividad enzimática son sinónimos para describir la cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por unidad de tiempo, durante una reacción catalizada por una enzima.
Actividad enzimática = Velocidad
Por tanto sus unidades son cantidad de producto o sustrato sobre unidad de tiempo
Hora Minuto Segundo
moles µmoles nmoles gramos miligramos µgramos
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Progreso de la reacción enzimática
Fase de pre estado estacionario (mseg)
Estado estacionario Es aquel en que la concentración del complejo ES permanece constante
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El patrón hiperbólico de velocidad de una enzima vs la concentración de sustrato se describe en el modelo de Michaelis-Menten
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Condiciones en las que aplica la ecuación de Michaelis-Menten
Velocidad inicial
No añadir producto al medio de ensayo
Concentraciones de sustrato muy superiores a la concentración de la enzima
La concentración de sustrato debe permanecer “casi” constante durante el periodo de tiempo en que se mide la reacción
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Velocidad inicial• La velocidad de una reacción (no orden cero) disminuye a medida que ésta progresa ya que la concentración del reactante(s) disminuye, y porque si la reacción es reversible inicia la reacción inversa.
• Por ello es conveniente medir la velocidad inicial (v0) de la reacción: la velocidad antes de que la concentración de los reactantes disminuya significativamente y que los productos alcancen una concentración que produzca una reacción inversa significativa.
• En las reacciones catalizadas por enzimas, dos razones que hacen conveniente medir velocidades iniciales:
1) el producto puede ser un inhibidor de la reacción, aún cuando la reacción no sea reversible.
2) la enzima puede ser inestable en el medio de reacción.
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Parámetros cinéticos Velocidad máxima
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Constante de Michaelis-Menten (Km)
La Km es la concentración de sustrato a la cual la velocidad es: Vmax/2
Es un parámetro de afinidad de la enzima por el sustrato
Km ↑= baja unión al sustrato, baja afinidad por el sustrato Km ↓= alta unión al sustrato, alta afinidad por el sustrato
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Concentración de sustrato / cofactores Concentración de enzima Inhibidores Activadores pH Temperatura
Factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas
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La actividad específica es la velocidad de una reacción enzimática expresada en términos de la cantidad de enzima.
Actividad específica
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Diseño de un ensayo enzimático
Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza: A) Cuáles son las especies que se requieren: sustrato, la o las
coenzimas, el o los cofactores, entre otros.
B) La estequiometría de la reacción C) Los efectos de pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima.
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Monitoreo de actividad enzimática
Espectrofotometría
HPLC
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Radioensayos
Monitoreo de actividad enzimática
TLC
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LDH(EC 1.1.1.27). Enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración de ATP.
El piruvato es reducido a lactato gracias a la oxidación de NADH a NAD+
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¿Qué hacer en la práctica?
1. Cambiar el switch mental y enfocar los pensamientos en BIOQUÍMICA!
2. Recordar los pasos a seguir para realizar las curvas temporales (determinar actividad por espectrofotometría)
3. ¡Mantener los tubos en hielo!
4. Determinar la actividad de la LDH mediante curvas temporales
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