DISEÑO E IMPLEMENTACIÒN DE UNA METODOLOGIA PARA LA POLIMERIZACION Y CARACTERIZACION FISICOQUIMICA DE
HEMOGLOBINA LIBRE DE ESTROMA COMO UN TRANSPORTADOR DE OXIGENO INTRAVASCULAR
JULIAN GUILLERMO CRUMP LOMBANA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA BOGOTA D.C
2004
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INTRODUCCION
La hemoglobina es la mayor proteína encontrada en la sangre, que es
responsable por el transporte de oxígeno. Pero, existen dos grandes razones por
las cuales la hemoglobina que es extraída de los glóbulos rojos no puede ser
utilizada como transportador de oxígeno intravascular; primero, la hemoglobina se
parte en dímeros después de su infusión, por lo tanto es toxica para el organismo
y causa vasoconstricción por su tamaño; y la segunda, es que la hemoglobina
afuera del glóbulo rojo, no tiene acceso al cofactor 2,3-DPG, que facilita la unión
con el oxígeno en los pulmones y su adecuada liberación en los tejidos. Diferentes
soluciones de carácter biotecnológico son propuestas en este trabajo. La primera
es la reacción con piridoxal 5’ fosfato que es un análogo al cofactor 2,3-DPG y
facilita la unión y liberación de oxígeno. La segunda solución es la polimerización
de hemoglobina con glutaraldehido para formar polihemoglobina soluble la cual
no se parte en dímeros, y como se incrementa el tamaño de la partícula diluida,
tanto la presión oncótica ejercida por la hemoglobina es disminuida a niveles
normales, como la vasoconstricción es controlada, debido a que la molécula de
polihemoglobina ya no es capaz de atravesar la paredes vasculares.
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Otra grandiosa característica de este transportador de oxígeno intravascular, es la
posibilidad de ser esterilizado, por micro filtración y/o in activación viral, procesos
con los cuales se puede remover a los microorganismos responsables del VIH,
hepatitis etc. También, como este no posee antígenos de membrana que
determinan el grupo sanguíneo, no hay necesidad de tipificación. Esto ahorra
tiempo y dinero y facilita transfusiones in-situ. Además, el transportador de
oxígeno intravascular puede ser liofilizado y almacenado por largos periodos de
tiempo como un polvo seco y estable que puede ser reconstituido con solución
salina justo antes de su utilización.
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1. OBJETIVOS
Este trabajo de grado fue llevado acabo teniendo como referencia los siguientes
objetivos.
1.1. Objetivo global
Diseñar y implementar una metodología para el entrecruzamiento intermolecular e
intramolecular de hemoglobina libre de estroma y su caracterización físico-
química, para que pueda ser utilizada como un transportador de oxígeno
intravascular.
1.2. Objetivos específicos
• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento
intermolecular de hemoglobina libre de estroma.
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• Diseñar e implementar una metodología para el entrecruzamiento
intramolecular de hemoglobina libre de estroma.
• Diseñar e implementar pruebas físico-químicas a la hemoglobina libre de
estroma entrecruzada (polihemoglobina)
• Caracterizar la hemoglobina libre de estroma entrecruzada (polihemoglobina).
• Apropiar tecnología de carácter extranjero a las condiciones tecnológicas
accesibles en Colombia.
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2. MARCO TEORICO
2.1. Transportadores de oxígeno intravascular (Hemosustitutos)
Las ventajas de un hemosustituto que pueda ser almacenado fácilmente y a
seguramente en cualquier momento y lugar indiferentemente de la cantidad y el
tipo de sangre, son mas que evidentes para cualquier persona. Debido a las
diferentes y complejas funciones se la sangre, el pensar en el desarrollo de un
sustituto que supla adecuadamente todas las funciones de la sangre, esta lejos de
la tecnología de hoy, pero características diferentes pueden ser suministradas por
diferentes sustitutos, que al ser combinados pueden hacer las funciones de un
hemosustituto. Las funciones de cada componente sanguíneo y su sustituto
correspondiente se describen en la tabla 11.
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Tabla 1. Funciones de los componentes sanguíneos y sus sustitutos
Componente sanguíneo Función Sustituto
Proteínas
plasmáticas
Albúmina Mantenimiento del volumen sanguíneo Expansor plasmático
Fibrinogeno Factor de coagulación (dextrano, hidroxietil almidón)
Globulina Anticuerpo Antibióticos
Plasma Electrolitos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO4
2-)
55% Osmoregulador, transporte de CO2 Reaprovisionado electrolítico
Lípidos (ácidos grasos, colesterol, grasa neutra, lecitina)
Nutrición Microesferas lipídicas
Carbohidratos Nutrición Inyección de glucosa
Glóbulo rojo
Hemoglobina Transporte de O2 y CO2 Glóbulo rojo artificial
Células
Anhidrasa
carbónica Acrecentar la eliminación de CO2
45%
Glóbulo blanco Fagocitosis, producción de anticuerpos Antibióticos, agentes
Quimioterapéuticos
Plaquetas coagulación (hemostasis) Coagulantes sanguíneos
Entonces, si un transportador de oxígeno intravascular o un glóbulo rojo artificial
son desarrollados, las demandas de los sustitutos sanguíneos serian
completamente establecidas.
1 Referencia 1 pg 117-118
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21
2.1.1. Areas potenciales de aplicación
“Debido a que los transportadores de oxígeno intravascular persisten en
circulación por 30 horas, sus aplicaciones clínicas potenciales, actualmente se ven
restringidas a cinco áreas, las cuales son descritas a continuación.” 2
2.1.1.1. Cirugía
“Es especialmente importante en cirugía de bypass cardiopulmonar, trauma,
cáncer, ortopedia y otras cirugías de carácter electivo. Por ejemplo, en cirugía
traumática el reemplazo de sangre llega hasta 100 unidades en algunos casos,
donde un transportador de oxígeno intravascular puede ser utilizado y al final de la
cirugía, sangre autóloga puede ser administrada.”2
2.1.1.2. Resucitacion de emergencia por hemorragia traumática
“Ejemplos incluyen accidentes de transito, desastres naturales como terremotos,
accidentes aéreos, casualidades civiles y no civiles en conflictos de carácter
mayor y menor. En estos casos, un transportador de oxígeno intravascular puede
ser utilizado para reemplazar perdida de sangre en shock hemorrágico. Es
importante en situaciones donde no hay tiempo y no existen facilidades para la
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tipificación sanguínea y la oferta de sangre donada no es la suficiente para suplir
las necesidades del momento.” 2
2.1.1.3. Soporte de glóbulos rojos a corto termino para otras condiciones
“Un ejemplo es anemia hemolítica severa. Otro ejemplo es soporte hasta que el
transplante de medula ósea o eritropoyetina humana recombinante comienzan sus
efectos esperados, además que puede estimular eritropoyesis en la medula ósea.
Otro ejemplo es el soporte para tipos sanguíneos atípicos y por lo tanto poco
accesibles en los bancos de sangre.” 2
2.1.1.4. Aplicaciones medicas donde los transportadores de oxígeno
intravascular pueden ser mas efectivos que los glóbulos rojos
“Transportadores de oxígeno intravascular en solución serian superiores a los
glóbulos rojos en perfusión a través de vasos obstruidos. Ejemplos incluyen infarto
del miocardio. Los usos potenciales de transportadores de oxígeno intravascular
en la preservación de órganos y en esas situaciones donde la hipotermia es usada
son otros ejemplos, esto es porque los glóbulos rojos no liberan oxígeno de una
manera adecuada a bajas temperaturas, en comparación con los transportadores
2 Referencia 2 pg 3-5
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23
de oxígeno intravascular, los cuales pueden ser preparados con un P50 aceptable
a bajas temperaturas.” 2
2.1.2. Disminuyendo los riesgos de infección
Actualmente, el sustituto de la hemoglobina es sangre donada, la transfusión
sanguínea a partir de sangre donada puede causar diferentes problemas como
hemólisis, coagulación e infección, aunque esto es bien manejado actualmente
pero a altos costos. La sangre donada no puede ser esterilizada actualmente, la
transmisión de infecciones son posibles todavía con las siguientes
probabilidades3:
Tabla 2. Probabilidades de transmisión de diferentes infecciones en unidades de sangre donada4
infección Probabilidad de transmisión
VIH 1/225,000 unidades
Hepatitis B 1/200,000 unidades
Hepatitis (otras) 1/3,300 unidades
HTLV I/II 1/50,000 unidades
Actualmente, una unidad de sangre donada después de todas la pruebas de
laboratorio y todos los requerimientos regulatorios son realizados, tiene un costo
3 Referencia 2 pg 6
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24
en el Mercado de aproximadamente US$250, sin incluir las demandas de las
personas que recibieron sangre infectada4.
2.1.3. Disminuyendo la carga en el sistema de sangre
“El nivel mínimo de glóbulos rojos en los pacientes antes de realizarles una
transfusión ha ido decayendo, debido a la probabilidad y el riesgo de infección.
Esto causa una mala oxigenación de los tejidos en pacientes con problemas
cardiovasculares o pulmonares, es aquí donde los transportadores de oxígeno
intravascular pueden proveer un margen de seguridad mucho mayor para estos y
cualquier otro paciente.” 5
“Para administrar sangre antóloga después de una cirugía, se requiere recoger
entre 4 y 6 unidades del paciente varias semanas antes de la cirugía, pero, en
cirugías mayores de carácter traumático, cardiovascular u ortopédico, el tiempo
para la recolección de sangre antóloga no es el adecuado, y por lo tanto el
proceso de recolección no puede ser llevado acabo.” 6
En la actualidad, el incremento paulatino de las necesidades para una población
en constante aumento y con un mayor tiempo de vida, ha hecho que aumenten las
necesidades de tratamientos médicos, donde se incluye la quimioterapia, el
4 Referencia 21
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25
transplante de órganos y la terapia de VIH. Esto ha hecho que los márgenes entre
la demanda y la oferta de sangre se haya estrechado a niveles no deseados, sin
incluir demandas inesperadas en el sistema de sangre causados por accidentes
de transito o aéreos, desastres como terremotos o conflictos armados6, este
ultimo, el cual se sufre actualmente en nuestro país Colombia. La posibilidad de
escalar a producción en planta industrial un producto como lo es el transportador
de oxígeno intravascular, es la solución, no solo disminuiría el margen entre la
demanda y oferta de sangre, pero también haría que los costos por unidad de
sangre sean menores, no solo por el tipo de producción a gran escala sino
también por la eliminación de las pruebas de laboratorio utilizadas para la
detección de infecciones. La única pieza faltante es la fuente de hemoglobina
necesaria para producción a gran escala, en primera instancia seria de sangre
donada vencida, pero otros grupos están trabajando con hemoglobina
recombinante, hemoglobina bovina y hemoglobina humana transgénica.
2.1.4. Atributos de un transportador de oxígeno intravascular
“En la tabla 3 se muestran algunos atributos de un transportador de oxígeno
intravascular que pueden ser relacionados por su uso cuando se consideren o
referencien las posibles aplicaciones en cirugía. El reemplazo es visto como una
función primaria y la mejor manera de aparear un “hemosustituto” con su función
5 Referencia 2 pg 7
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resultara cuando la necesidad y las propiedades especificas del caso sean
determinadas. El nivel de detalle y refinamiento no es obvio actualmente. Mas aún,
con la variedad de “hemosustitutos” que están siendo evaluados actualmente no
es confiable una comparación debido a que los elementos únicos pueden o no ser
conocidos. La función es clara: volumen y entrega de oxígeno. Otros efectos
farmacológicos pueden ser evaluadas una vez se tengan documentados y
establecidos. Por lo tanto el potencial para posterior refinamiento es real y
promisorio.”6
Tabla 3. Algunas propiedades físicas de un transportador de oxígeno intravascular9 Concentración de hemoglobina Capacidad de transporte de O2 Afinidad de la oxihemoglobina P50, función alostérica, cooperatividad Concentración de metahemoglobina presión osmótica coloidal Viscosidad pH Composición Electrolitos, Ca, Mg Tiempo de retención en plasma T1/2 Mecanismo de metabolización Mecanismo de excreción Aditivos
6 Referencia 17
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2.2. Matriz bidimensional de usos de los transportadores de oxígeno
intravascular
En la tabla 4 se muestra un modelo de matriz bidimensional de las opciones de un
transportador de oxígeno intravascular para usos actuales de donación sanguínea,
la “√’ indica las áreas de posible aplicación y la “X” refleja las áreas donde su uso
es menos viable.7
Tabla 4. Matriz bidimensional del uso de transportadores de oxígeno intravascular10
CASOS OPCIONES Preoperativo Intraoperativo Postoperativo
Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente Emergencia Electiva Urgente EmergenciaAutóloga Predeposito + EPO √ √ X √ √ X √ √ √ Hemodilución: Norvolémica aguda X X X √ √ √ X X X hipovolémica aguda X X X √ √ √ X X X Salvamento intraoperativo X X X √ √ √ X X X Salvamento postoperativo X X X X X X √ √ √ Diluyente para predeposito √ √ X X X X X X X Alogénica Tipo y cross match √ √ √ √ √ √ √ √ √ Tipo especifico √ √ √ √ √ √ √ √ √ Donante universal √ √ √ √ √ √ √ √ √ Glóbulos rojos procesados √ √ √ √ √ √ √ √ √ Sangre total X X √ X X √ X X √
Como se puede ver, en un poco mas del 60% de los casos clínicos tratados
actualmente, un transportador de oxígeno intravascular es viable, lo que justifica
su desarrollo además de las características mencionadas anteriormente.
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2.3. Transportadores de oxígeno
Diferentes investigaciones en posibles transportadores de oxígeno, han cerrado el
desarrollo a dos sustitutos que son utilizados actualmente y algunos están ya en
pruebas clínicas y listos para ser accesibles en el mercado: hemoglobina
modificada y perfluorocarbonos, que a diferencia de los glóbulos rojos, estos
pueden ser pasteurizados, filtrados o limpiados químicamente como la inactivación
viral, par volverlos estériles. Además, como estos no tienen antígenos de grupo
sanguíneo, su caracterización no es necesaria. Esto ahorra tiempo y dinero y
permite transfusiones in-situ en emergencias reduciendo el tiempo de respuesta,
que puede ser clave salvando la vida de una persona herida. Aun mas, estos
pueden ser almacenados por mas de un año, comparado con aproximadamente
un mes para sangre donada por métodos estándares8, que puede ser aumentado
por métodos muy laboriosos y costosos en donde la sangre es congelada para
almacenamiento a largo plazo9, este procedimiento es realizado para tipos de
sangre raros como B- y AB.
7 Referencia 17 8 Referencia 22 9 Referencia 2 pg 8
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2.4. Hemoglobina
“La ecuación de equilibrio para la unión de oxígeno con un material (M), puede ser
representada simplemente por:
Como k es la constante de unión al oxígeno, el oxígeno se une con M en una pO2
alta y se disocia de M a pO2 bajas. La presión parcial de oxígeno P50 a la cual la
mitad de las moléculas de M unen oxígeno es usualmente usada para expresar la
afinidad del oxígeno con el material M. En el caso de los glóbulos rojos, el material
con alta afinidad por el oxígeno es la proteína hemoglobina”.10
Las diferentes investigaciones llevadas a cabo con el fin de encontrar el mayor
transportador de oxígeno ha mostrado que ningún material conocido por la
humanidad actualmente, transporta oxígeno tan eficientemente como lo hace la
hemoglobina, la cual puede ser extraída de los glóbulos rojos. Perutz11 ha llevado
a cabo extensos trabajos sobre la función y estructura de la hemoglobina. En una
descripción corta, la hemoglobina esta encapsulada dentro del glóbulo rojo con el
fin de trabajar durante la circulación sin presentar problemas, el glóbulo rojo tiene
10 Referencia 1pg 9 11 PERUTZ M.F., Proc. R. Soc. Land. B, 1980, 208, 135
bO
aba
tcons
baK
PMOM
K
OMbOaM
)(][])()[(
)()(
2
2)tan(
22
=
⎯→←+
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30
en su membrana proteínas, lípidos y colesterol, la suma de estos tres
componentes se le conoce como estroma12. La hemoglobina es un tetrámero que
consta de cuatro subunidades: dos unidades α y dos unidades β que se
encuentran unidas por enlaces no covalentes, que son el resultado de puentes de
hidrógeno y fuerzas de Van der Waals13. Una representación esquemática de la
molécula de hemoglobina se muestra en la figura 1.
Figura 1. Representación esquemática de la molécula de hemoglobina14
Cada unidad de globina a consiste de 141 aminoácidos y tiene un peso molecular
de 15,126 Daltons, cada subunidad de globina b tiene 146 aminoácidos y tienen
12 Referencia 1 13 Referencia 3 col 3- 20 14 Referencia 2 pg 10
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31
un peso molecular de 15,867 Daltons15. Una molécula de hemoglobina pesa
61,986 Daltons.
Cada subunidad contiene un grupo hemo (hierro-protoporfirina IX), que es el sitio
de unión del oxígeno, tiene un hierro central con un bajo estado de oxidación
(bivalente) que permite la unión reversible del oxígeno.
“Debido a la atmósfera hidrofóbica que se encuentra en el bolsillo de la
hemoglobina, el hierro no se oxida a su estado trivalente, y por lo tanto, no pierde
su capacidad de unir oxígeno reversiblemente, cuando esto une el oxígeno tan
fuertemente que bloquea la transferencia de oxígeno. A este tipo de hemoglobina
en su estado trivalente se le conoce con el nombre de metahemoglobina.”16
“La hemoglobina constituye alrededor del 90% de toda la proteína que se
encuentra en un glóbulo rojo”17. “Un glóbulo rojo puede transportar 23 ml de
oxígeno por cada 100 ml de sangre, esto es alrededor de 80 veces mas alto que la
solubilidad física del oxígeno en el plasma”18. “La hemoglobina esta “oxi”, relajada
o en su estado R cuando transporta oxígeno (oxihemoglobina). Para liberar el
oxígeno, la hemoglobina conlleva un cambio conformacional con una rotación de
15°, así la molécula esta “deoxi”, tensa o en su estado T (deoxihemoglobina).”17
15 www.msstate.edu/org/MAS/julyjournal/hamil.htm 16 Referencia 1pg 6-8 17 Referencia 3 col. 3 : 33-34
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32
“El cofactor 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) es el causante de este cambio
conformacional, debido a sus capacidades alostéricas . Por lo tanto, en presencia
de el cofactor 2,3-DPG, la hemoglobina puede liberar oxígeno mas fácil y
activamente a mayores tensiones de oxígeno tisular.”19
2.4.1. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo
Dentro del glóbulo rojo, la hemoglobina forma un tetrámero, y la membrana celular
retiene el cofactor 2,3 DPG para que pueda interaccionar con la hemoglobina. La
concentración de hemoglobina dentro del glóbulo rojo es de 35 g/L (14 g/L en la
sangre total) que es posible porque la hemoglobina no ejerce presión osmótica en
el plasma fuera del glóbulo, únicamente el glóbulo rojo completo ejerce presión
osmótica. Los glóbulos rojos tienen un tiempo medio de vida de alrededor de 100
días20.
“El diámetro de un glóbulo rojo es de 8.5 µm, y la forma geométrica es de una
vesícula en forma de disco, bicóncavo, con un grosor mínimo de 1 µm y máximo
de 2.4 µm” 21 como se muestra en la figura 3.
18 Referencia 1pg 8 19 Referencia 2 pg 10 20 Referencia 2 pg 11 21 Referencia 1 pg 6
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33
Figura 2. Representación esquemática de la estructura y función de un glóbulo rojo.22
El volumen total de sangre en una persona es alrededor de 4 litros, lo que implica
una cantidad de hemoglobina de aproximadamente 650 g, claramente con
diferencias individuales19.
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34
“Un glóbulo rojo encapsula diferentes iónes , reguladores y enzimas, al igual que
hemoglobina. Aparte del cofactor 2,3-DPG, el glóbulo rojo transporta anhidrasa
carbónica para acrecentar el transporte de dióxido de carbono, superóxido
dimutasa y catalasa disminuir la formación de radicales de oxígeno, y sistemas
enzimáticos para reducir la formación de metahemoglobina y metabolitos
glicolíticos”.19
2.4.2. La hemoglobina como un hemosustituto
Obviamente, la primera reacción en busca del desarrollo de un transportador de
oxígeno intravascular es administrar directamente hemoglobina como
transportador de oxígeno. Pero la hemoglobina fuera del glóbulo rojo presenta
diferentes problemas que se describirán a continuación.
Cuando lo eritrocitos hemolizados son administrados, se ha encontrado que los
componentes de estroma son extremadamente tóxicos, resultando en
coagulopatía y una falla renal asociada23. “Esto fue solucionado por Rabiner en
1967 cuando preparo una solución de hemoglobina libre de estroma (SF-Hb) por
procedimientos de ultrafiltración y centrifugación.”23,24 Inclusive otros problemas
aparecen cuando se administra SF-Hb como transportador de oxígeno. Cuando se
22 Referencia 1 pg 8 23 Referencia 3 pg 4-5 24 Referencia 4
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35
extrae la hemoglobina de su microatmósfera celular, liga oxígeno tan fuertemente
que este no es liberado en los tejidos a los niveles requeridos25, esto pasa debido
a la ausencia del cofactor 2,3-DPG en el plasma sanguíneo, el cual regula la
liberación y unión del oxígeno.
“Además, el tetrámero se dimeriza, donde cada dímero contiene una unidad alfa y
una beta, y estos son filtrados rápidamente por los riñones y eliminados del
sistema circulatorio. Estos dímeros son tóxicos para los riñones, causan falla renal
y tienen un tiempo medio en la circulación de tan solo 2 horas. “26
El oxido nítrico posee un papel importante en el control del tono vascular, su
disminución resulta en la vasoconstricción, y su aumento resulta en la
vasodilatación. Las uniones intercelulares del endotelio celular permiten que la
hemoglobina tetramérica cruce desde la circulación debido a su tamaño. “La
hemoglobina tiene también una alta afinidad por el oxido nítrico y actúa como un
sifón removiendo oxido nítrico y dando como resultado la vasoconstricción.”27
“La concentración del numero de partículas solubles decide la cantidad de presión
osmótica. La hemoglobina dentro del glóbulo rojo esta separada del plasma y no
disuelto en el. Por lo tanto no ejerce presión osmótica. Por el contrario,
25 Referencia 3 col. 4 : 15-18 26 Referencia 2 pg 12 27 Referencia 23
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36
hemoglobina libre cuando es administrada como solución, se comporta como una
proteína disuelta en el plasma y cada hemoglobina se comporta como una
partícula soluble por lo que incrementa la presión osmótica.”28
“Para mantener el punto isoosmótico del plasma, una solución de hemoglobina a
una concentración de 7 g/dl debe ser administrada, reduciendo la capacidad de
transporte de oxígeno a la mitad, ya que la concentración normal de hemoglobina
es de 14 g/dl.”27
Como se comento anteriormente, la hemoglobina dentro del glóbulo rojo
interacciona con superóxido dimutasa y catalasa y con sistemas enzimáticos para
reducir la oxidación del hierro central, y entonces, evitar la formación de
metahemoglobina. Cuando se administra hemoglobina libre en el plasma, no tiene
ningún tipo de interacción con estos compuestos y tiende a formar
metahemoglobina.
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37
2.5. Que se puede hacer para solucionar estos problemas
2.5.1. Piridoxilación de hemoglobina libre de estroma
“La afinidad de la hemoglobina es regulada por un fosfato orgánico como el 2,3-
DPG. Benesch y Benesch demostraron en 1967, que en la presencia del cofactor
2,3-DPG, la hemoglobina tiene un P50 mas alto. Este fosfato orgánico altamente
aniónico esta presente en los glóbulos rojos en la misma concentración molar que
la hemoglobina. La hemoglobina puede entonces puede liberar mas fácil y
efectivamente el oxígeno en los capilares que suplen los tejidos.”29
“El sitio de unión del cofactor 2,3-DPG es importante ya que en el se encuentra la
base para diferentes modificaciones para formar transportadores de oxígeno
intravascular basados en hemoglobina modificada. El bolsillo del cofactor 2,3-DPG
es la cavidad central de la deoxihemoglobina, y consiste de tres residuos cargados
positivamente en la cadena β: el grupo α-amino, lisina EF6 y la histidina H21.
Estos grupos cargados positivamente en al cavidad central de la hemoglobina
interactúan con la fuerte y negativamente cargada molécula de 2,3-DPG. De esta
manera, el 2,3-DPG estabiliza la estructura cuaternaria de la deoxihemoglobina
28 Referencia 2 pg. 35 29 Referencia 2 pg 23
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38
entrecruzando las monómeros β de la hemoglobina. Esto lleva al equilibrio hacia la
forma tensa o T de la hemoglobina”30.
“La perdida del cofactor 2,3-DPG y otros ligandos orgánicos de tipo fosfato,
conlleva en soluciones de hemoglobina con una afinidad por el oxígeno mucho
mayor que la de la sangre total. La alta afinidad puede ser disminuida por la
modificación química de la hemoglobina con piridoxal 5’ fosfato” 31. “Benesch en el
año 1975 hizo este importante descubrimiento, y mostró que el piridoxal 5’ fosfato
es análogo al cofactor 2,3-DPG, por lo que mejora el P50 de la hemoglobina libre
de estroma.” 32
“Benesch descubrió que una variedad de derivados del piridoxal que contienen un
grupo aniónico en la posición 5’ reaccionan con la grupo amino terminal NH2 de la
hemoglobina humana. Sus estudios muestran que el piridoxal 5’ fosfato reacciona
con el tetrámero de la deoxihemoglobina para formar una base de Schiff
específicamente con el grupo amino terminal NH2 de una cadena β. En la figura 3
se muestra la reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la
hemoglobina para formar la polihemoglobina.
30 Referencia 2 pg 24 31 Referencia 5 32 Referencia 2 pg 21
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39
Figura 3. Reacción de la base de Schiff entre el glutaraldehido y la hemoglobina para formar polihemoglobina
Esta imina puede ser convertida a la correspondiente y estable amina secundaria
por la reducción con borohidruro de sodio dando como resultado un tetrámero
monosustituido” 33. En la figura 4 se puede ver una representación esquemática de
la hemoglobina libre de estroma piridoxilada (PLP-SFHb).
Figura 4. Representación de la hemoglobina piridoxilada
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40
2.5.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada
Como se explico anteriormente, cuando la hemoglobina es administrada
directamente, esta se dimeriza causando falla renal. La principal razón por la cual
se polimeriza la hemoglobina es formar una macromolécula, que no se dimeriza,
evitando así la falla renal y además, se aumenta su vida media en circulación de 2
a 30 horas. Claramente aumenta su tamaño molecular, previniendo que la nueva
macromolécula de hemoglobina cruce las uniones intercelulares del endotelio y
retire el oxido nítrico, el cual es el responsable de regular la vasoconstricción. En
la figura 5 se muestra una representación esquemática de la hemoglobina
polimerizada con un agente bifuncional: cloruro de sebacilo.
Figura 5. Hemoglobina polimerizada con un agente bifuncional (Cloruro de sebacilo).34
33 Referencia 6 34 Reeference 2 pg 16
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41
2.5.2.1. Agentes de polimerización, regulación y terminación del proceso
de polimerización
"Los agentes bi- o polifuncionales convenientes para la polimerización deben ser
solubles en agua, y reactivos con los sitios de entrecruzamiento de la
hemoglobina, para producir un producto polimerizado soluble en agua. Los
agentes de polimerización no deben afectar la hemoglobina de una manera
adversa como desnaturalizándola, afectando su solubilidad o su función de unir
reversiblemente el oxígeno para suplirlo a los tejidos y órganos. Los agentes bi- o
polifuncionales tienen al menos dos grupos funcionales , que pueden ser iguales o
diferentes. Estos grupos son capaces de reaccionar y entrecruzarse con los
grupos amino y otros sitios de entrecruzamiento de la molécula de hemoglobina.
Por grupo amino se quiere decir el grupo alfa N-terminal de las cadenas de la
hemoglobina, y aquellos de los residuos básicos de aminoácidos como la lisina y
la arginina.
Los grupos funcionales del agente de polimerización pueden estar unidos
covaléntemente entre ellos o pueden estar separados por un anillo alifático o
aromático. Ejemplos de grupos funcionales aromáticos estabilizados son azo y
halo activados con un grupo nitro. Estos incluyen compuestos con un anillo
heterocíclico con grupos reactivos unidos al anillo. Por ejemplo, triazinas con la
formula:
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42
Figura 6. Formula de la triazina.35
Donde R1 es un halógeno como fluor, cloro y bromo, y R2 es un sustituto
nucleofílico como un grupo alifático o aromático, un halógeno, o un alquilo menor
de 1 a 8 carbonos, y aminas. Agentes de polimerización que caen dentro de este
grupo son 2-amino-4,6-dicloro-s-triazina y cloro-s-triazina. Los agentes de
polimerización incluyen agentes estabilizados aromáticos preparados por la
diazotación de una diamina aromática, por ejemplo, bencidina y sus derivados
con ácido nitroso para producir bis-diazobenzidinas de la formula:
Figura 7. Formula de la bis-diazobencidina.31
35 Referencia 7
IQ-2003-02-08
43
Donde R3 es un miembro del grupo que consiste de un enlace covalente, alquileno
de 1 a 5 carbonos, fenileno, éter, sulfona y secamina, R4 es un halógeno o nitro,
R5 es un hidrógeno, nitro, alquilo menor de 1 a 8 carbonos, sulfonato (SO3H) y
carboxilato, y R6 es un halógeno, diazo (-N:N-), isocianato (NCO), e isotiocianato
(NCS). Agentes de polimerización representativos de esta formula incluyen
bisdiazobenidina 2,2-ácido sulfónico , 4,4’-difluoro-3,3’-dinitrofenilsulfona y difenil-
4,4’-diisocianato.
Agentes de polimerización incluyen compuestos de la formula:
Figura 8. 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno.36
Donde R7 es un halógeno y R8 un nitro, o un hidrogeno con al menos un nitro en
R8, como el agente comercial halogenado activado 1,5-difluoro-2,4-
dinitrobenceno.
36 Referencia 7
IQ-2003-02-08
44
Agentes de polimerización también incluyen compuestos de la formula (R9)2C=O
donde R9 es un hidrogeno o un halógeno, y los compuestos de la formula
R10−(CH2)n−R10 donde R10 es el mismo o diferente y n esta entre 1 y 8. los
agentes de polimerización también incluyen compuestos que contienen un grupo
funcional unido a cicloalquilos representados por la formula:
Figura 9. Formula del cicloalquilo.37
Donde R10 es igual o diferente, p varia entre 0 y 4, y q varia entre 1 y 4. Los
agentes de entrecruzamiento incluyen compuestos que tienen grupos funcionales
unidos a una cadena alifática interrumpida con un grupo no funcional o que tienen
grupos no funcionales unidos a la cadena como se representa en los compuestos
con formula R10−(CH2)x−R11−(CH2)x−R10 donde R10 es igual o diferente, R11 es
seleccionado del grupo que consiste en un puente de éter, una amina divalente y
una sulfona, y x es un alquileno de 1 a 5 átomos de carbono, con cada x igual o
diferente. Compuestos representativos del grupo funcional que abarca R10 incluye
isocianato, vinilo, imina, isotiocianato, isocianuro, aldehído, epóxido, cloroformato,
tiocloroformato, imido esteres de alquilo menores y tiolactonas de la formula:
37 Referencia 7
IQ-2003-02-08
45
Figura 10. Formula de la tiolactona.30
Donde a varia entre 1 y 3. R10 también puede ser un grupo activado formado al
reaccionar ácido carboxílico con haluro de tionilo o haluro de fósforo, o un grupo
activado formado al reaccionar una amida o un ester de alquilo del ácido
carboxílico con hidracina y después con ácido nitroso para generar el
correspondiente grupo activado COR12 donde R12 es un halógeno o una azida. El
grupo activado puede ser formado también reaccionando el ácido carboxílico con
N,N'-carbonil diimidazola de la formula R13−N=C=N−R13 donde R13 es igual o
diferente y son un alquilo menor, un cicloalquilo menor, amino alquileno menor, y
heterocíclico alquilo menor . R12 puede ser también
Figura 11. Formula de alquilo menor.38
Un alquilo menor, y
IQ-2003-02-08
46
Figura 12. Otra posibilidad para R12.34
Donde n varia entre 1 y 2.
Reactivos para entrecruzamiento disponibles comercialmente abarcados por la
formula anterior incluyen divinil sulfona, epiclorohidrina, butadieno diepóxico, etilen
glicol diglicil éter, glicerol diglicil éter, dimetil suberimidato dihidrocoloruro, dimetil
malonimidato dihicrocloruro, y dimetil adipimidato dihidrocloruro.
Ejemplos de los compuestos que incluyen un grupo funcional isocianato o
isotiocianato son los compuestos listados abajo. Adicionalmente, los isocianatos o
tioisocianatos pueden ser sintetizados reaccionando un alquilo o aril amina con
fosfogén o tiofosfogén. Los isocianatos usados para entrecruzamiento son
diisocianatos y reaccionan con el grupo amino libre de la hemoglobina
produciendo sitios de unión tipo urea o tiourea. Compuestos típicos incluyen ácido
difenil-4,4'-diisotiocianato-2,2'-disulfónico, tolueno diisocianato, tolueno-2-
38 Referencia 7
IQ-2003-02-08
47
isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4,4'-diisocianato, propileno
diisocianato, butileno diisocianato y hexametileno diisocianato.
Ejemplos de agentes de entrecruzamiento que contienen el grupo funcional
aldehído o dialdehído incluyen formaldehído, paraformaldehído, ureas activadas
de formaldehído como 1,3-bis(hidroximetil)urea, N,N'-di(hidroximetil)
imidazolidinona preparadas de la condensación del formaldehído con urea según
la formula:
CH2O+R16HN−CO−NHR16 → HOCH2NR16−CO−NR16−CH2OH
Donde R16 es un hidrogeno, alquilo, arilo o un anillo heterocíclico. Otros agentes
de entrecruzamiento tipo dialdehído incluyen aquellos de la formula
OCH−R17−HCO donde R17 es un miembro seleccionado del grupo que consiste de
un enlace covalente y una cadena de alquileno lineal o ramificada de 1 a 8
carbonos. Dialdehídos encontrados dentro de este grupo incluyen gloxal,
dialdehído malónico, dialdehído succínico, glutaraldehido, adipaldehído, 3-
metilglutaraldehido, propiladipaldehido, dialdehído ftálico, tereftaldehido y aldehído
malónico.
Otros agentes de entrecruzamiento incluyen derivados de ácidos carboxílicos y
sus residuos de hemoglobina activados in situ para dar un reactivo derivativo de
hemoglobina que se entrecruzara con las aminas de otras hemoglobinas. típicos
IQ-2003-02-08
48
ácidos carboxílicos utilizados para este propósito tienen la formula
CO2H(CH2)nCO2H, y [(CH2)nCOOH]3CH donde n varia entre 1 y 8. Los ácidos
carboxílicos incluyen cítrico, malónico, adípico y succínico. Iniciadores del ácido
carboxílico incluyen cloruro de tionilo, carbodiimidas, N-etil-5-fenil-isoxazolium-3'-
sulfonato (reactivo K de Woodward), N,N'-carbonildiimidazola, N-t-butil-5-
metilisoxazolium perclorato (reactivo L de Woodward), 1-etil-3-dimetil
aminopropilcarbodiimda, 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida meto-p-
tolueno sulfonato. La reacción de entrecruzamiento cuando se usa un ácido
carboxílico se puede representar por la ecuación:
Otros grupos de entrecruzamiento que pueden ser usados son preparados de
esteres y tioésteres activados por tiolactonas, hidroxisuccimida ester, esteres de
ácidos carboxílicos halogenados e imidatos.
El reactivo de entrecruzamiento puede ser un dialdehído precursor que forma un
dialdehído bifuncional en el medio de reacción. Estos precursores incluyen dímero
de acroleina o 3,4-dihidro-1,2-piran-2-carboxaldehido que conlleva a un clivaje de
anillo en un ambiente acuoso para dar alfa-hidroxi-adipaldehido. Otros
precursores, que en hidrólisis producen un agente de polimerización, incluyen 2-
etoxi-3,4-dihidro-1,2-piran que produce glutaraldehido, 2-etoxi-4-metil-3,4-dihidro-
1,2-piran que produce 3-metil glutaraldehido, 2,5-dietoxi tetrahidrofurán que
HbHRCONRCOXHRCO NHHbactivator −−⎯⎯⎯ →⎯⎯⎯⎯ →⎯ − 22
IQ-2003-02-08
49
produce dialdehído succínico y 1,1,3,3-tetraetoxipropano que produce dialdehído
malónico y formaldehído de trioxano. Similarmente, los agentes de polimerización
pueden ser preparados por procedimientos de síntesis conocidos como
malonaldehído de tetraetil acetal, succinaldehido de dietoxitetrahidrofurán y
adipaldehído de la oxidación de ciclohexanodiol.
En la formula anterior, la expresión “un alquileno que varia entre 1 a 8 carbonos”
se incluyen cadenas lineales y ramificadas como el metileno, etileno, propileno,
isopropileno y hexileno. La expresión “alquilo menor de 1 a 8 carbonos” incluye
cadenas lineales y ramificadas como metil, etil, propil, isopropil y hexil.
Las aminas de bajo peso molecular adicionadas al proceso de polimerización para
regular el entrecruzamiento o terminarlo, es un agente mono-, di- o multifuncional,
preferiblemente una amina primaria de la fórmula R-NH2. La amina debe ser
soluble en solución acuosa para asistir en el mantenimiento de las características
de solubilidad de la hemoglobina polimerizada. Aminas de bajo peso molecular
típicas utilizadas para desactivar el exceso de agente de entrecruzamiento son
glicina, lisina, serina, treonina, alanina, etanolamina, ácido 2-aminoadípico y
glutationa. Otros compuestos capaces de desactivar los agentes polimerizantes
son terminadores tales como bisulfitos y dioles capaces de desactivar aldehídos,
IQ-2003-02-08
50
alcoholes de bajo peso molecular para desactivar ácidos carboxílicos activos,
haluros e isocianatos activos, y sulfhidrilos para desactivar epóxidos y vinilos.” 39
2.5.2.2. Que agentes para entrecruzamiento, regulación y terminación
serán utilizados
La selección de los agentes de polimerización o entrecruzamiento, regulación y
terminación, dependió de su facilidad de adquisición, y que algún tipo de
comparación pudiera ser realizada con otros grupos que ya han polimerizado
hemoglobina libre de estroma, los grupos de N.P. Kuznetsova40, L.R. Sehgal41,
Alza Corporation42 y T.M.S. Chang43,44 usan como agente de polimerización el
glutaraldehido y como agente de regulación y terminación la lisina
monohicrocloruro, por lo tanto estos agentes serán utilizados en el presente
trabajo para que haya manera de comparar con estos otros trabajos. El resultado
final es hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada (Poly-PLP-
SFHb), un diagrama esquemático puede ser visto en la figura 12.
39 Referencia 7 40 Referencia 8 41 Referencia 9 42 Referencia 7 43 Referencia 2 pg 30-31 44 Referencia 10
IQ-2003-02-08
51
Figure 13. Resultado final, hemoglobina libre de estroma polimerizada y piridoxilada.45
2.5.3. Cinética de la reacción de polimerización
2.5.3.1. Definición de la velocidad de reacción
“La velocidad con que se efectúa una reacción química se puede expresar de
varias maneras. Se puede expresar como la velocidad de desaparición de los
reactivos o como la velocidad de formación de los productos. La polihemoglobina
se produce a partir de hemoglobina libre de estroma y glutaraldehido.
HBNHCOCHCONHHBNHHBHCOCHCOH −−−−−−⎯→⎯−+−−−− 32232 )()(
45 Referencia 2 pg 21
IQ-2003-02-08
52
Si el símbolo A representa al glutaraldehido, el valor numérico de la velocidad de
reacción –rA, se define como el numero de moles de glutaraldehido que
reaccionan (desaparecen) por unidad de tiempo por unidad de volumen
(mol/dm3s).” 46
2.5.3.2. La ecuación general de balance de moles
“Para realizar el balance de moles en un sistema, hay que especificar sus
fronteras. El volumen del sistema esta delimitado por estas fronteras. Se realiza un
balance de moles de la especie j, que representa la especie química a analizar.
Un balance de moles de la especie j en cualquier instante de tiempo t da la
siguiente ecuación:
velocidad de velocidad de velocidad de velocidad de flujo de j hacia generación de j flujo de j desde acumulación el sistema + por reacción - el sistema = de j dentro (moles/tiempo) química dentro (moles/tiempo) del sistema del sistema (moles/tiempo) (moles/tiempo) entrada + generación - salida = acumulación Fj0 + Gj - Fj = dNj/dt
46 Referencia 16 pgs. 2-4
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53
Donde Nj representa el numero de moles de la especie j en el sistema en el
tiempo. Si todas las variables del sistema (p.e. temperatura, actividad catalítica,
concentración de la especie química) son espacialmente uniformes dentro de todo
el volumen del sistema, la velocidad de generación de la especie j, Gj, es el
producto del volumen de reacción, V, por la velocidad de formación de la especie j,
rj.
volumenvolumentiempo
molestiempomoles
VrG jj
⋅⋅
=
⋅=
Si se supone que la velocidad de formación de la especie j para la reacción varia
con la posición en el volumen del sistema , la velocidad de generación ∆Gj1, en
términos de rj1 y el subvolumen ∆V1 es:
111 VrG jj ∆=∆
Se pueden escribir expresiones similares para los demás subvolumenes del
sistema ∆Vi. La velocidad total de generación dentro del volumen del sistema es la
suma de todas las velocidades de generación de cada uno de los subvolumenes.
Si el volumen total del sistema se divide en M subvolumenes, la velocidad total de
generación es:
IQ-2003-02-08
54
∑∑==
∆=∆=M
iiji
M
ijij VrGG
11
Si se toman los limites apropiados (es decir M → ∞ y ∆V → 0) y usando la
definición de integral, se puede rescribir la expresión anterior de la forma:
∫=V
jj dVrG
Esta ecuación dice que rj es una función indirecta de la posición, puesto que las
propiedades de los materiales que reaccionan (p.e. temperatura, concentración)
pueden tener diferentes valores en diferentes puntos del reactor. Ahora si se
sustituye esta expresión en la ecuación de balance de moles, tenemos:” 47
dtdN
dVrFF jV
jjj =+− ∫0
2.5.3.3. Reactor por lotes
“Un reactor por lotes no tiene flujo de entrada ni flujo de salida de productos
mientras la reacción se esta efectuando: Fj0 = Fj = 0. El balance general de moles
de la especie j es entonces:
47 Referencia 16 pgs. 6-8
IQ-2003-02-08
55
∫=V
jj dVr
dtdN
Si la mezcla de reacción es perfectamente homogénea, y por lo tanto no hay
variación en la rapidez de reacción en todo el volumen del reactor, en la ecuación
de balance de moles rj es constante y la integral de dV es V:” 48
Vrdt
dNj
j =
2.5.3.4. Cinética de reacciones no elementales de polimerización por pasos
o también conocida como reacción de condensación
“Un polímero es una molécula formada por unidades estructurales que se repiten
llamadas monómeros (p.e. la hemoglobina libre de estroma es el monómero de la
polihemoglobina).
La polimerización es el proceso por el cual los monómeros se enlazan por
reacción química para formar cadenas largas. Estas cadenas largas diferencian a
los polímeros de otras especies químicas y les confiere propiedades y
características determinadas que los diferencian entre si. Las reacciones de
48 Referencia 16 pgs. 8-9
IQ-2003-02-08
56
polimerización se dividen en reacciones por pasos o reacciones de condensación
y reacciones en cadena o reacciones de adición. La polihemoglobina es formada
por reacción por pasos o condensación. Las reacciones por pasos requieren
monómeros bi- o polifuncionales. Los grupos funcionales que reaccionan se
encuentran en monómeros diferentes, el grupo amina (NH2) en la hemoglobina y
el grupo aldehído (COH) en el glutaraldehido., que al unirse forman la unidad
estructural repetitiva de la polihemoglobina o monómero de polihemoglobina. Para
el caso de la polimerización de hemoglobina libre, si hacemos:
COCHCORHB
NHHBNHRHA
−−==
−−==
322
1
)(
Monómero A-R1-B + B-R2-B → A-R1-R2-B
Dímero A-R1-R2-B + A-R1-R2-B → A-(R1-R2)2-B
Trímero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)3-B
Tetrámero A-R1-R2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)4-B
A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)2-B → A-(R1-R2)4-B
Pentámero A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)5-B
A-R1-R2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)5-B
Hexámero A-(R1-R2)3-B + A-(R1-R2)3-B → A-(R1-R2)6-B
A-(R1-R2)2-B + A-(R1-R2)4-B → A-(R1-R2)6-B
A-(R1-R2)1-B + A-(R1-R2)5-B → A-(R1-R2)6-B
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57
Al hablar del avance de una polimerización por pasos no tiene sentido usar la
conversión de monómero como medida, porque la reacción continua aunque se
haya consumido todo el monómero., ya que todavía hay grupos funcionales A y B
que pueden reaccionar. El avance de la polimerización se mide con el parámetro p
que es la fracción de grupos funcionales, A, B, que han reaccionado.
0
0
MMM
p−
=
Que es la fracción de grupos funcionales A o B que han reaccionado y M es la
concentración de grupos funcionales A o B (mol/dm3).
Si suponemos que la velocidad de desaparición es de primer orden con respecto a
A y B, el balance de A es:
]][[][ BAkdtAd
=−
Si la alimentación molar es igual tenemos
∫∫ −=
−=
==
t
t
M
M
kadtMdM
akMdt
dMAM
BaA
00
2
2
][][][
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58
Si t0=0 entonces al integrar a ambos lados resulta
takMM
M
MaktM
M
Makt
M
aktMM
0
0
0
0
0
0
1
11
11
11
+=
+=
+=
==−
En términos de la conversión fraccionaria de grupos funcionales, p,
11
10 +=
−takM
p
El grado de polimerización es el promedio numérico es el numero promedio de
unidades estructurales por cadena.
pX n −
=1
1
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59
El peso molecular promedio numérico es el peso molecular promedio de una
unidad estructural Ms, multiplicado por el promedio de unidades estructurales de
cadena Xn, mas el peso molecular de los grupos del extremo Mge.” 49
gesnn MMXM +=
2.5.3.5. Determinación de las concentraciones de polímeros en
polimerización por pasos
“Para determinar la concentración y fracción molar de los polímeros con cadena
de longitud j en términos de la concentración inicial de ARB, M0, la concentración
de grupos funcionales que no ha reaccionado (M), la constante de propagación (k)
y el tiempo t, entonces sea P1=A-R-B, P2=A-R2-B,...,Pj=A-Rj-B, tenemos:
reacción Leyes de velocidad
(1) 2P1 → P2 -r1P1 = 2kP12, r1P2 = -0.5r1P1 = kP1
2
(2) P1 + P2 → P3 -r2P1 = -r2P2 = r2P3 = 2kP1P2
(3) P1 + P3 → P4 -r3P1 = -r3P3 = r3P4 = 2kP1P3
(4) P2 + P2 → P4 -r4P2 = 2kP22, r4P4 = -0.5r4P2 = kP2
2
49 Referencia 16 pgs. 354-358
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60
El factor 2 en el termino de desaparición se debe a que hay dos formas en que A y
B pueden reaccionar
A - Rn - B
A - Rm – B
Las velocidades de reacción netas de P1, P2 y P3 para las reacciones de (1) a (4)
son:
3231213
2221
212
31212
11
222
22
222
3
2
1
PkPPkPPkPrr
kPPkPkPrr
PkPPkPkPrr
P
P
p
−−=≡
−=−=≡
−−−=≡
Si se continúan de esta manera se comprobará que la velocidad de formación neta
de P1 es
∑∞
=
−=1
121
jjP PkPr
Sin embargo la sumatoria de Pj no es mas que la concentración total de grupos
funcionales de A o B, que es M.
MkPrP 121
−=
De forma similar, podemos generalizar las reacciones (1) a (4) para obtener la
velocidad de formación neta del j-mero, para j ≥ 2.
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61
MkPPPkr j
j
ijij 2
1
11 −= ∑
−
=−
En un reactor por lotes, el balance de moles de P1 para eliminar M da:
2
001
0
011
1
11
122
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=
+−=−=
ktMMP
despejandotkM
MkPMkP
dtdP
Al despejar P1, se puede usar rj para despejar sucesivamente Pj
20
0
4
0
202
212
2
112
112 P
ktMkM
ktMkMMkPkPr
dtdP
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=−==
con P2 = 0 en t = 0, entonces
1
0
02
002 11
1−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=j
ktMktM
ktMMP
Continuando de esta manera se puede generalizar que
1
0
02
00 11
1−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=j
j ktMktM
ktMMP
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62
Si recordamos que
120
0
0
)1( −−=
−=
jj ppMP
entoncesM
MMp
La fracción molar del polímero con longitud de cadena j es simplemente
MP
y jj =
Recordando que M = M0(1-p), se obtiene
1)1( −−= jj ppy
Esta es la distribución de Flory-Schulz.” 50
2.5.3.6. Distribución de pesos moleculares
“Lo que le confiere a un polímero sus propiedades únicas son la concentración de
polímero, el peso molecular promedio y la distribución de longitudes de cadena.
50 Referencia 16 pgs. 358-360
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63
En la figura 14 se muestra unas distribución típica de las longitudes de cadena
para todos los Pj (j = 1 a j = n).
Figura 14. Distribución típica de pesos moleculares de un polímero
Si dividimos el eje y entre la concentración total de polímero, ∑Pj, ese eje se
convierte en la fracción molar del polímero con j unidades repetidas incorporadas
en el, es decir yj.
Los parámetros que se obtienen de la distribución de pesos moleculares de los
polímeros y que podemos utilizar para cuantificar la distribución que se muestra en
la figura 13 son:
• Los momentos de la distribución
∑∞
=
=1n
jn
n Pjλ
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64
• El momento cero es la concentración total de polímero
∑∞
=
==1
0j
j PPλ
• El primer momento esta relacionado con el numero total de unidades de
monómero
∑∞
=
=1
1n
jjPλ
• El primer momento dividido entre el numero cero de la longitud de cadena
media numérica (NACL), µn
∑∑===
j
jn P
jPNACL
0
1
λλ
µ
Que también se le conoce como el grado de polimerización. Es el numero
promedio de unidades estructurales por cadena y también se puede calcular a
partir de
pX nn −
=≡1
1µ
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65
• El peso molecular promedio numérico
snn MM µ=
donde Ms es el peso molecular promedio de las unidades estructurales.
• El segundo momento da preponderancia a las cadenas mas largas
∑∞
=
=1
22
jjPjλ
• La masa por unidad de volumen de cada especie polimérica es MsjPj. La
longitud de cadena promedio por masa es el cociente del momento 2 entre
el momento 1
∑∑===
j
jw jP
PjWACL
2
1
2 µλλ
• El peso molecular promedio por peso es
wsw MM µ=
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66
• El índice de polidispersidad (D) es
21
20
λλλ
µµ
==n
wD
Una polidispersidad de 1 implica que todos los polímeros tienen la misma longitud,
y una polidispersidad de 3 implica que existe una distribución muy amplia de
tamaños de polímero. El valor típico se encuentra entre 2 y 10.” 51
2.5.3.7. Estadísticas de Flory de la distribución de pesos moleculares
“La fracción molar de polímero con longitud de cadena j es
1)1( −−= jj ppy
En términos de la concentración de polímero
120 )1( −−== j
jj ppMMyP
El peso molecular promedio numérico es
51 Referencia 16 pgs. 370-372
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67
∑∑ ∑ =−
=−
−=−=== −∞
=
∞
=
sns
sj
sj j
sjjjn MXp
Mp
pMjppMMjyMyM1)1(
1)1()1( 21
1 1
La fracción por peso de polímero con longitud de cadena j es
12
21
1
1
12
12
111
)1(
)1(1
)1(
)1(
−
∞
=
−
∞
=
−
−
∞
=
∞
=
∞
=
−=
−=
−
−====
∑
∑∑∑∑
jj
j
j
j
j
j
jj
j
jjs
sj
jjj
jjj
ppjw
pjpdonde
jpp
ppj
jP
jP
jPM
MjP
MP
MPw
El peso molecular promedio por peso es” 52
∑ ∑∞
=
∞
= −
+===
1 1 )1(
)1(
js
jjsjjw
p
pMjwMMwM
2.5.3.8. Variaciones en la velocidad de reacción de la polimerización de
hemoglobina libre de estroma
La manipulación de las diferentes variables de polimerización, puede tener efectos
sobre la velocidad de reacción. Uno de los principales requisitos para el escalado
52 Referencia 16 pg. 373
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68
industrial de un proceso, es hacer mas eficiente el proceso con respecto a sus
costos y su tiempo de desarrollo, esto hace que el estudio de la cinética de
polimerización sea un proceso muy importante en el desarrollo de transportadores
de oxigeno intravascular basados en la polimerización de hemoglobina libre de
estroma.
2.5.3.8.1. Efecto de la razón molar de hemoglobina a glutaraldehido
La variación en concentración de los dos agentes que hacen parte del proceso de
polimerización, el glutaraldehido y la hemoglobina, causan variaciones sobre la
velocidad de reacción de la polimerización. Al aumentar la cantidad de
glutaraldehido y manteniendo la cantidad de hemoglobina estable, se supone que
el proceso de polimerización se ve acelerado, ya que se aumenta la probabilidad
de encuentro entre los grupos amino de la hemoglobina y el grupo aldehído del
glutaraldehido que causan el entrecruzamiento.
Hay que tener en cuenta que el glutaraldehido es un agente desnaturalizante de la
hemoglobina, y que su razón molar con relación a la hemoglobina no puede ser
aumentada de manera infinita ya que el efecto deseado seria el contrario, y la
polimerización no se llevaría acabo, desnaturalizando la hemoglobina, y haciendo
inutilizable el producto de polimerización. Chang, a modificado recientemente el
proceso de polimerización aumentando la razón molar de agente de
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69
polimerización a hemoglobina de 16:1 a 17:1 y con una concentración de
glutaraldehido de 0.5 M, obteniendo tiempos de polimerización de 5 horas,
comparado con tiempos previos de 12 a 18 horas.53,54
2.5.3.8.2. Efecto de la variación del pH
La hemoglobina tiene 44 grupos amino que se encuentran ionizados (NH3+) y
cuatro grupos amino terminales que no se encuentran ionizados (NH2) a pH = 7.4.
los grupos amino no ionizados son los que reaccionan con el glutaraldehido
formando la base de Schiff permitiendo el proceso de polimerización.
La hipótesis presentada en este trabajo, es el manejo del pH de la solución de
hemoglobina libre de estroma, ya que la velocidad de reacción se puede ver
acelerada, al aumentar el numero de sitios activos donde el glutaraldehido puede
reaccionar. Al variar el pH de la solución de hemoglobina libre de estroma, los
grupos amino que se encuentran ionizados se pueden desionizar y se convierten
en un sitio activo de polimerización. La formación de los puentes intermoleculares
depende en el numero total de grupos amino reactivos y en particular de su
distribución en la superficie de la hemoglobina.
53 Referencia 18 54 Referencia 9
IQ-2003-02-08
70
Existen limitaciones en el proceso de variación de pH, ya que la hemoglobina
conserva su estructura cuaternaria entre pH’s entre 6 y 8, por debajo o por encima
de estos valores la hemoglobina se desnaturaliza haciendo inutilizable el producto
de polimerización.
2.5.4. Otros procesos utilizados
Durante la producción de la solución de hemoglobina libre de estroma
polimerizada y piridoxilada, otros procesos son necesarios, diferentes a los de
piridoxilación y polimerización de la hemoglobina, para preparar una adecuada
solución de hemoglobina para el siguiente paso.
2.5.4.1. Ultrafiltración
2.5.4.1.1. Definición
“La ultrafiltración es un proceso de membrana a baja presión usado para separar
compuestos de alto peso molecular la una línea de alimentación. La ultrafiltración
tiene poros de mayor diámetro que la nanofiltración y osmosis reversa y es por lo
tanto la menos costosa de las tres. Como resultado, la ultrafiltración requiere de
menores elementos de membrana y menores requerimientos de presión para su
operación. La ultrafiltración es excelente para separar materiales delicados, como
IQ-2003-02-08
71
proteínas, ya que es un método de separación no desnaturalizante. En general,
sales y especies de bajo peso molecular pueden pasar a través de la membrana
mientras los sólidos suspendidos van aumentando su concentración en el otro
lado de la membrana. El flujo tangencial al poro es comúnmente utilizado para la
concentración y purificación de proteínas y otras partículas biológicas de
suspensiones. La ultrafiltración es capaz de concentrar bacterias, proteínas como
la hemoglobina y constituyentes que tiene pesos moleculares mayores a 10,000
Daltons. La ultrafiltración es independiente de la carga de la partícula y es mas
concerniente con el tamaño de esta.” 55
2.5.4.1.2. Proceso de ultrafiltración
El proceso es llevado acabo en una unidad de ultrafiltración, que básicamente
consta de un medio mecánico que genera presión como bombas de
desplazamiento positivo y/o de vacío, y un ultraflitro el cual separa las fases. Esta
puede ser llevada acabo en una unidad de diálisis que debe ser bypaseada y
ningún tipo de solución de diálisis es puesta en contacto en contraflujo con la
solución a ultrafiltrar. El tamaño de poro del ultrafiltro depende en las propiedades
de la solución que es ultrafiltrada, y de que se quiere separar en esta solución, lo
cual depende del tamaño de la proteína o proteínas a concentrar.
55 http://www.osmonics.com/products/page835.htm y http://www.rpi.edu/dept/chem-
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72
2.5.4.2. Diálisis
2.5.4.2.1. Definición
“La diálisis es un proceso que separa electrolitos y coloides que se encuentran en
disolución, dependiendo de su velocidad de difusión a través de una membrana
semipermeable. La solución que debe ser dializada es introducida entre la
membrana semipermeable y los electrolitos pasan a través de la membrana que
retiene los coloides.” 56
2.5.4.2.2. Proceso de diálisis
Remover el exceso de reactivos es muy importante. Diálisis contra Lactato de
Ringer remueve glutaraldehido libre y el exceso de lisina, además que permite que
los electrolitos sean ajustados a condiciones y niveles fisiológicos57. El proceso de
diálisis es llevado acabo usando un tubo de membrana de diálisis, como los de
celulosa regenerada. Es recomendado permitir una buena relación superficie-
volumen para un adecuado proceso de diálisis, para esto, pequeños volúmenes,
por ejemplo 10 ml , son colocados en el tubo y dejados en diálisis por lo menos 3
horas, en este tiempo el dializado se equilibra con la solución de diálisis.
eng/BiotechEnviron/Projects00/memfilt/ultrafiltration.htm 56 Referencia 11 volume 4 pg 1207 57 Referencia 2 pg 31
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73
2.5.4.3. Electroforesis SDS-PAGE
2.5.4.4. Definición
“La base de la separación de proteínas con el procedimiento de SDS-PAGE, es
recubrir las proteínas con dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate) para
que todas las proteínas tengan una carga uniforme. Por lo tanto la separación es
dependiente de tamaño del complejo proteína - dodecil sulfato de sodio. Este
detergente aniónico se une fuertemente a la mayoría de proteínas a una razón de
1.4 mg SDS/mg de proteína, dándole a todas la proteínas una carga negativa. El
SDS interrumpe todos los enlaces no covalentes y causa que las moléculas se
desdoblen. Las partículas cargadas son forzadas a girar hacia el electrodo de
carga positiva bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado externamente. Las
fuerzas generadas por el campo eléctrico son contrarrestadas por las
interacciones con la matriz de gel de poliacrilamida, que actúa como un tamiz. La
fuerza generada por el campo eléctrico y la fuerza opuesta generada por la matriz
de gel resultan en diferentes tasas de migración para las diferentes proteínas.
Para obtener un campo eléctrico con magnitud y dirección constante a través de
un volumen de espacio especifico, dos placas planas de metal son colocadas
paralelamente, como se indica en la figura 15. Cuando las terminales de una
terminal de poder con un voltaje V son conectadas a estos platos, como se indica
IQ-2003-02-08
74
en la figura, un campo eléctrico uniforme E es producido entre los platos. Afuera
de estos platos y cerca de los extremos el campo no es uniforme.
Figura 15. Diagrama de una electroforesis55
Por lo tanto, todas las proteínas recubiertas por SDS (cargadas negativamente),
migran hacia el ánodo a tasas inversamente proporcionales al logaritmo de su
peso molecular. Esto es:
donde r es la tasa de migración y PM es el peso molecular. Las proteínas de bajo
peso molecular migran mas rápido que las de mayor peso molecular. El peso
molecular es determinado por medio de comparación con estándares de peso
molecular.
)log(1PM
r =
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75
Generalmente la electroforesis en SDS-PAGE es realizado en geles horizontales.
Este tipo de electroforesis es un sistema discontinuo compuesto por dos geles
diferentes: un gel de separación o inferior y un gel superior o de apilamiento. Los
geles se funden con diferentes porosidades, pH’s y fuerzas iónicas.” 58
58 ntri.tamuk.edu/electrophoresis
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76
3. METODOLOGIA
3.1. Piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma
La primera modificación realizada a la hemoglobina libre de estroma es la
piridoxilación, este proceso, como se explico anteriormente, mejora el P50 de la
hemoglobina libre de estroma entrecruzando intermolecularmente las dos
subunidades β de la hemoglobina formando un puente de fosfato entre ellas.
3.1.1. Materiales y equipo
3.1.1.1. Reactivos
• TRIS-HCl buffer (polvo)
• NaOH (pellets)
• Piridoxal 5’ fosfato (polvo)
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77
• Glucosa (polvo)
• Glutationa
• ácido ascórbico (polvo)
• Gas nitrógeno
• Borohidruro de sodio (polvo)
• HCl (liquido)
• Agua destilada
3.1.1.1.1. Equipo
• Balanza de peso
• pH-metro
• Flujómetro de nitrógeno conectado a un dispersor de burbujas por medio de
una manguera.
• Material de laboratorio como pipetas, vasos, erlenmeyers, vasos volumétricos
etc. Sus capacidades dependen de la cantidad de hemoglobina libre de
estroma a ser piridoxilada.
• Medidor de concentración de hemoglobina.
• Agitador magnético con su barra de agitación.
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78
3.1.2. Preparación de soluciones utilizadas
Además de la solución de hemoglobina libre de estroma, se necesita una solución
de NaOH 2 M, para ajustar el pH de la solución de hemoglobina al valor deseado.
Durante todo el proceso de piridoxilación y polimerización, se puede decir que
para una cantidad de 500 ml de hemoglobina libre de estroma, no mas de 30 ml
son necesarios generalmente. Por cada mililitro de NaOH 2 M a preparar se pesan
80 mg de NaOH y se añade agua hasta alcanzar un volumen de un mililitro. Se
recomienda trabajar con una solución de hemoglobina libre de estroma con una
concentración inicial de 18 g/dl, con el fin de que al terminar los procesos de
piridoxilación y polimerización la concentración final de hemoglobina este en 14.5
g/dl.
3.1.3. Proceso de piridoxilación
Todo el proceso debe ser llevado a cabo a 4°C, de lo contrario la formación de
metahemoglobina será marcada durante el proceso. La solución de hemoglobina
libre de estroma es agitada continuamente. Se mide la concentración de
hemoglobina con la ayuda de un medidor de concentración de hemoglobina total.
Por cada 100 ml de hemoglobina libre de estroma al 18% w/v, se añaden se
añaden 1.576 g de TRIS-HCl buffer para obtener una concentración final de 0.1 M.
Se ajusta el pH de la solución a 7.4 ya sea con NaOH, HCl o ácido láctico (este
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79
ultimo es preferible). Por cada gramo de hemoglobina presente en la solución, se
añaden 17.11 mg de piridoxal 5’ fosfato para obtener una relación molar de 4:1
con la hemoglobina (PM = 61986 Da). Se añade glucosa y glutationa hasta
obtener una concentración de 2 g/L, y de ácido ascórbico para obtener una
concentración de 1 g/L. Estos se añaden para minimizar la formación de
metahemoglobina. Se pueden añadir antibióticos para remover cualquier
contaminante, así: 50,000 unidades/L de penicilina, 50 mg/L de gentamicina y 50
mg/L de streptomicina para así garantizar la esterilidad. Se revisa nuevamente el
pH y se ajusta a 7.4, nuevamente con NaOH, HCl o ácido láctico. La solución de
hemoglobina se desoxigena por 2 horas, se debe tener cierta precaución, ya que
la hemoglobina produce espuma durante el proceso de desoxigenado. El enlazado
covalente de la hemoglobina con el piridoxal 5’ fosfato se lleva acabo añadiendo
12.206 mg de NaBH4 (96%) por cada gramo de hemoglobina presente en la
solución para obtener una razón molar de NaBH4 a hemoglobina de 20:1, diluido
en un volumen manejable pero mínimo de NaOH 0.001 M, que es preparado
diluyendo 2000 veces una parte de NaOH 2 M en agua destilada.
El burbujeo con nitrógeno se continua por otras 12 horas, para que la formación
del enlace entre la hemoglobina y el piridoxal 5’ fosfato se lleve acabo. En el
apéndice I se muestra un diagrama de flujo del proceso de piridoxilación.
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80
3.2. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada
La segunda modificación realizada a la ahora hemoglobina libre de estroma
piridoxilada, es el entrecruzamiento intermolecular de los tetrámeros de
hemoglobina para formar una hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada (Poly-PLP-SFHb). Este proceso previene la dimerización de la
molécula de hemoglobina.
3.2.1. Materiales y equipo
3.2.1.1. Reactivos
• Glutationa
• L-lisina monoclorhidrato
• Buffer de fosfato (K2HPO4 y KH2PO4)
• Glutaraldehido (liquido al 25%)
• Agua destilada
3.2.1.2. Equipos
• Balanza de peso
• pH-metro
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81
• Agitador magnético con su barra de agitación.
• Equipo de laboratorio como pipetas, vasos, erlenmeyers etc. Sus capacidades
dependen de la cantidad de hemoglobina libre de estroma piridoxilada a
polimerizar.
• Medidor de concentración de hemoglobina
• Filtro de ultrafiltración y equipo de diálisis.
• Osmómetro
3.2.2. Preparación de las soluciones utilizadas
Las siguientes soluciones son preparadas, debido a que son necesarias durante el
proceso de polimerización.
3.2.2.1 Hemoglobina libre de estroma piridoxilada
Es recomendado trabajar con una solución de hemoglobina a una concentración
inicial de 16 g/dl de hemoglobina, que generalmente resulta después del proceso
de piridoxilación al iniciar con una concentración de hemoglobina libre de estroma
de 18 g/dl. De lo contrario, se puede ultrafiltrar o diluir la hemoglobina piridoxilada
a 16 g/dl o al final del proceso de polimerización se puede ultrafiltrar o diluir hasta
obtener una concentración de 14.5 g/dl, que es la concentración fisiológica de
hemoglobina.
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82
3.2.2.1.1. Solución de lisina
Esta solución es usada como agente regulador y como agente de terminación de
la polimerización. Un mililitro de esta solución se prepara como se describe a
continuación: se añaden 237.44 mg de L-lisina monoclorhidrato para obtener una
concentración final de 1.3 M, se añaden 87.09 mg de K2HPO4 y 68.04 mg de
KH2PO4 para obtener una concentración final de 0.5 M de buffer de fosfato y todo
se lleva a un volumen de 1 ml. Se ajusta el pH de esta solución a 7.4 adicionando
NaOH 2M, HCl o ácido láctico. Por cada 100 ml de hemoglobina al 16% w/v a
polimerizar, se necesitan 3.25 ml de la solución de lisina.
3.2.2.1.2. Solución de glutaraldehido
El glutaraldehido es el agente de polimerización que es utilizado. Esta solución se
prepara diluyendo una solución de glutaraldehido al 25% en un volumen igual de
buffer de fosfato 0.5 M. Un mililitros de la solución de glutaraldehido se prepara
como se describe a continuación: se añaden 43.54 mg de K2HPO4 y 34.02 mg de
KH2PO4 y se lleva a un volumen de 0.5 ml para obtener una concentración final de
buffer de 0.5 M con agua destilada. Se añaden 0.5 ml de la solución de
glutaraldehido al 25% y se obtienen de esta manera 1 ml de la solución de
glutaraldehido para polimerizar. Por cada 100 ml de hemoglobina al 16% w/v a
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83
polimerizar, se requieren 3.33 ml de la solucion de glutaraldehido, esto quiere
decir que por cada gramo de hemoglobina presente en la solución a polimerizar,
se necesitan 0.208 ml de la solución de glutaraldehido preparada anteriormente, lo
que resulta en una razón de hemoglobina a glutaraldehido de 1:16. El pH de la
solución se ajusta a 7.4 ya sea con HCl, NaOH o ácido láctico.
3.2.3. Proceso de polimerización
Todo el proceso es llevado acabo a 4°C, de lo contrario la formación de
metahemoglobina será marcada durante la reacción. La solución de hemoglobina
libre de estroma piridoxilada es agitada continuamente. Todas las cantidades
descritas a continuación se basan trabajando con 100 ml de la solución de
hemoglobina libre de estroma piridoxilada a una concentración inicial de
hemoglobina de 16 g/dl. Primero ajuste el pH de la solución de hemoglobina a 7.4
adicionando NaOH 2 M, HCl o ácido láctico y mida su osmolaridad. Luego añada
1.25 ml de la solución de lisina preparada anteriormente para obtener una razón
molar de hemoglobina a lisina de aproximadamente 17:107. Se añaden 150 mg de
glutationa para minimizar la formación de metahemoglobina y obtener una
concentración de 1.5 g/L. Se añade 3.3 ml de la solución de trabajo de
glutaraldehido, de una manera lenta, preferiblemente por goteo para evitar la
desnaturalización de la hemoglobina. La osmolaridad de la solución es medida
periódicamente hasta alcanzar el nivel isoosmótico de 300 mOsm/kg, usualmente
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84
este nivel es alcanzado en un periodo de 12 a 18 horas. Para terminar la reacción,
se añaden 2 ml de la solución de trabajo de lisina, para obtener una razón molar
de hemoglobina a lisina de aproximadamente 1:10 y se pasa directamente a
ultrafiltración y así retirar los reactivos en exceso que se tienen en la hemoglobina
libre de estroma polimerizada. Después se reconstituye el ultrafiltrado por medio
de diálisis contra lactato de Ringer por tres horas a 4°C. Esto remueve el exceso
de glutaraldehido y el exceso de lisina y permite que los electrolitos se ajusten a
condiciones y concentraciones fisiológicas. En el apéndice II se muestra un
diagrama de flujo del proceso de polimerización.
3.3. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina
modificada.
3.3.1. Concentración de hemoglobina
3.3.1.1. Definición
Como se explico anteriormente, la hemoglobina es la proteína responsable de la
distribución de oxígeno a los tejidos. Alrededor de 23 ml de oxígeno por cada 100
ml de plasma son necesarios para lograr una adecuada oxigenación a los tejidos.
Basados en la capacidad de transporte de oxígeno de la hemoglobina, su
IQ-2003-02-08
85
concentración en el plasma debe estar dentro del rango de 13.5 a 17.5 g/dl en los
hombres y en el rango de 12 a 16 g/dl para las mujeres59. La concentración media
de hemoglobina en el plasma es de 14.7 g/dl. Su determinación se obtiene con
medidores de concentración de hemoglobina que la determinan por métodos
espectofotométricos.
3.3.2. Presión osmótica coloidal
3.3.2.1. Definición60
“La presión osmótica a través de una membrana es ejercida por un soluto
impermeable o inequilibrado. La presión necesaria para detener el movimiento
osmótico de agua a una solución, es conocido como presión osmótica”61. Bajo
condiciones fisiológicas, las proteínas del plasmas son los únicos solutos que no
pueden pasar velozmente a través de las paredes capilares. Por lo tanto, las
proteínas del plasma ejercen una presión osmótica coloidal conocida como
presión oncótica. Bajo condiciones fisiológicas, el efecto neto de la presión
oncótica es el movimiento del fluido dentro de los capilares.
59 Referencia 12 pg 48 60 Referencia 2 pg 35 61 Referencia 13 pg 160
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86
La concentración de proteína en el plasma es alrededor de 7 g/dl. La hemoglobina
dentro del glóbulo rojo se encuentra separada del plasma y no esta disuelta en
este. Por lo tanto, no ejerce presión oncótica.
La concentración de numero de partículas solubles decide la cantidad de presión
oncótica. Cada tetrámero de hemoglobina libre se comporta como una partícula.
Una molécula de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada
formada por partículas entre una a cuatro o mas hemoglobinas se comporta como
una partícula, debe ejercer una menor presión oncótica que los tetrámeros de
hemoglobina libres. En términos generales, 14 g/dl de hemoglobina libre de
estroma piridoxilada y polimerizada ejercen la misma presión oncótica que 7 g/dl
de hemoglobina libre. Son por lo tanto isooncóticas en el plasma, como las
sintetizadas en este trabajo.
3.3.2.2. Determinación
Durante los proceso de polimerización de la hemoglobina libre de estroma
polimerizada, el único soluto presente en la solución que ejerce una presión
osmótica coloidal significante es la hemoglobina. La presión isoosmótica del
plasma es alrededor de 300 mOsm/kg, y la de la sangre varia entre 275 y 295
mOsm/kg. Cuando la presión osmótica coloidal alcanza el punto isoosmótico, el
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87
proceso es detenido. Este se mide con la ayuda de un Osmómetro de punto de
congelación.
3.3.3. Densidad
3.3.3.1. Definición
Como es bien conocido, la densidad es la relación entre la masa y el volumen de
un cuerpo o una solución, esta representa la cantidad de masa presente por
unidad de volumen. La densidad de la sangre humana varia entre 1.40 y 1.85
g/cm3.62
3.3.3.2. Determinación
La determinación de la densidad de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada o de cualquier otro fluido se realiza con la ayuda de un picnómetro,
este recipiente, generalmente fabricado de vidrio, es calibrado a un volumen
predeterminado al cual el picnómetro debe ser llenado con el fluido al cual la
densidad se quiere determinar. El picnómetro es pesado antes y después de ser
llenado con el fluido, la diferencia entre estas dos mediciones es la masa del fluido
62 Referencia 19
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88
que se encuentra dentro del picnómetro. Por lo tanto, la relación entre masa y
volumen del fluido determina su densidad.
3.3.4. P50
3.3.4.1. Definición
“La afinidad de la hemoglobina por el oxígeno es caracterizada con el P50. El P50
es la presión parcial de oxígeno a la cual la hemoglobina se encuentra saturada al
50%.
La hemoglobina se encuentra saturada al 100% a una pO2 de 108 mmHg63. El P50
mide la facilidad de la hemoglobina para descargar el oxígeno como es requerido
en los capilares que suplen los tejidos.
La hemoglobina dentro del glóbulo rojo tiene un P50 de alrededor de 26 mmHg” 64.
Una curva de disociación de oxígeno es útil para medir diferentes características
de las soluciones de hemoglobina, como el P50 (ver figura 15).
63 Referencia 12 64 Referencia 2 pg 23
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89
Figura15. Típica curva de disociación de oxígeno.65
3.3.4.2. Determinación66,67,68
Para obtener el P50 de cualquier solución de hemoglobina, como la hemoglobina
libre de estroma piridoxilada y polimerizada, una curva de disociación de oxígeno
debe ser obtenida. Para su obtención, la solución de hemoglobina debe ser
tonometrada con un gas con diferentes concentraciones de oxígeno y condiciones
estándares de pCO2 y temperatura (pCO2 = 40 mmHg y T= 37°C) y luego el pH el
65 Referencia 2 pg 24 66 Referencia 9 67 Referencia 10 68 Referencia 5
IQ-2003-02-08
90
pCO2 y el pO2 son medidos en un analizador de gases arteriales y corregidos a las
condiciones estándar de pH y pCO2 (pH = 7.4 y pCO2 = 40 mmHg).
3.3.5. Coeficiente de Hill
3.3.5.1. Definición
“El oxígeno se une cooperativamente a la hemoglobina debido a que la unión de
oxígeno a un monómero del tetrámero de la molécula de hemoglobina, facilita la
unión de mas oxígeno a los otros tetrámeros de la misma molécula. La razón para
este efecto es que durante la unión al oxígeno, el monómero del tetrámero de la
molécula de hemoglobina lleva acabo un cambio conformacional. Por lo tanto,
existe una comunicación entre los grupos hemo de toda la molécula de
hemoglobina.” 69
“La medida cuantitativa de la cooperatividad de la hemoglobina es el coeficiente
de Hill “n”. “n” se incrementa con el incremento de cooperatividad. El máximo valor
de “n” es el numero de sitios de unión al oxígeno en una molécula de
hemoglobina, que son en total cuatro, uno por cada monómero del tetrámero. Un
coeficiente de Hill n = 1 indica que no existe cooperatividad alguna entre los
69 Referencia 2 pg 25
IQ-2003-02-08
91
monómeros del tetrámero de la molécula de hemoglobina. Para la sangre, es
coeficiente de Hill es alrededor de n = 2.8.”57
3.3.5.2. Determinación70
El coeficiente de Hill se determina a partir de la curva de disociación de oxígeno a
condiciones estándar de pH = 7,4 pCO2 = 40 mmHg y T = 37°C, con la ecuación
de Hill:
Donde %sat es el porcentaje de saturación de oxígeno a una pO2 fijada.
Varios puntos de cada lado del P50 de la curva de disociación de oxígeno, son
acomodados a la ecuación de Hill por medio de una regresión lineal. La pendiente
de esta regresión indica el coeficiente de Hill de la solución de hemoglobina
analizada.
3.3.6. pH
3.3.6.1. Definición
70 Referencia 9
502 loglog%100
%log PnpOnsat
sat−=⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛
−
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92
El pH indica la concentración de iones hidrogeno en una disolución, por lo que
mide la acidez de una disolución. El pH se defino como:
Donde [H+] es la concentración de hidrogeno en moles/L71. El pH de la sangre esta
en el rango entre 7.35 y 7.4572.
3.3.6.2. Determinación
La determinación se realiza normalmente con la ayuda de un pHimetro, que
realiza la medición de pH basándose en la conductividad de la disolución
3.3.7. Efecto de Bohr
3.3.7.1. Definición
“La habilidad de la hemoglobina de liberar oxigeno se ve afectada por el pH, CO2 y
por las diferencias en la concentración de oxigeno entre los pulmones y los tejidos.
El pH en los tejidos es considerablemente mas bajo (mas ácido) que en los
71"pH", Enciclopedia Microsoft® Encarta® 98 © 1993-1997 Microsoft Corporation. 72 Referencia 12 pg 76
[ ]+−= HpH log
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93
pulmones. Se generan protones por la reacción entre dióxido de carbono y agua
para formar bicarbonato:
+− +→+ HHCOOHCO 322
Esta acidez funciona para dos propósitos. El primero, es que los protones
disminuyen la afinidad de la hemoglobina por el oxigeno, permitiendo una
liberación mas fácil en los tejidos. Cuando las cuatro moléculas de oxigeno se
liberan, la hemoglobina se une con dos protones, ayudando a mantener el
equilibrio hacia el lado derecho de la ecuación. Este efecto se conoce como el
efecto de Bohr, y es vital para remover el dióxido de carbono como desecho,
debido a que el CO2 es muy poco soluble en el plasma., pero el ion bicarbonato es
mucho mas soluble y puede ser transportado hacia los pulmones. Si la
hemoglobina no pudiera unirse a los dos protones, el equilibrio se desplazaría
hacia la izquierda, y el dióxido de carbono no podría ser removido.
En los pulmones el efecto trabaja en la dirección opuesta. En la presencia de altas
concentraciones de oxigeno, la afinidad por los protones decrece y estos son
liberados, el equilibrio de la reacción se desplaza hacia la izquierda y se forma
CO2 como gas insoluble que es expulsado al exterior a través de los pulmones.
La afinidad de la hemoglobina por el oxígeno se ve modificada por el pH y la
concentración de dióxido de carbono. Bajo condiciones fisiológicas, la disminución
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94
del pH aumenta el P50 y la curva de disociación de oxígeno es desplazada hacia la
derecha (ver figura 13). El incremento de dióxido de carbono sin modificación del
pH también desplaza la curva de disociación de oxígeno a la derecha. Esta
propiedad de desplazamiento hacia la derecha causada por disminución de pH o
incremento de dióxido de carbono es conocida como el efecto de Bohr. Esto tiene
una importante significancia fisiológica. Tejidos activos como un músculo en
contracción, libera mayores cantidades de dióxido de carbono y ácido, por lo que
el efecto de Bohr le permite a la hemoglobina descargar mas oxígeno, el cual es
requerido por tejidos activos.” 73
3.3.7.2. Determinación
“El efecto de Bohr es determinado ajustando el pH de las muestras tonometradas
a condiciones estándar (pCO2 = 40 mmHg, T = 37°C) con la ayuda de un ácido
como el ácido láctico o el ácido clorhídrico, o una base como es hidróxido de
sodio, y después obteniendo la curva de disociación de oxígeno como se explico
anteriormente, en un rango de pH entre 6 y 8. Una grafica de log P50 vs. pH es
obtenida y la pendiente de esta curva representa el efecto de Bohr.” 74
73 Referencia 2 pg 25 74 Referencia 9
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95
3.3.8. Viscosidad
3.3.8.1. Definición
“La viscosidad es la propiedad de los fluidos a oponerse a su sentido flujo cuando
una fuerza es aplicada a este. La fuerza con la cual una capa de fluido en
movimiento se arrastra con su capa adyacente determina la viscosidad del fluido.
Basados en la teoría molecular, cuando un fluido se mueve influenciado por la
gravedad, las moléculas de las capas estacionarias tienen que cruzar una frontera
o limite para entrar en la región de flujo. Una vez que este limite es cruzado, estas
moléculas reciben energía de las moléculas en movimiento y empiezan a fluir. Al
mismo tiempo, las moléculas que se encuentran en la capa de movimiento
transmiten un impulso a las molécula estacionarias. El resultado global es que el
fluido reduce su velocidad, y el fluido estacionario empieza a fluir, y las capas en
movimiento adquieren una velocidad media.
Para mantener una capa de fluido en movimiento a una mayor velocidad que otra
capa, es necesario aplicar una fuerza continua. La viscosidad en poises es
definida como la magnitud de la fuerza necesaria para mantener en equilibrio una
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96
diferencia de velocidad de 1 cm/s entre capas separadas por un centímetro. La
viscosidad es medida con la ayuda de un equipo llamado viscosímetro.” 75
3.3.8.2. Determinación
La determinación de la viscosidad de la Poly-PLP-SFHb se realiza con la ayuda de
un viscosímetro Brookfield modelo DV-III. El protocolo para la utilización de este
equipo se describe a continuación.
3.3.8.2.1. Materiales y equipos
• Jeringas desechables
• Guantes quirúrgicos
• Agua destilada
• Agua
• Toallas absorbentes
• Computador con software Rheocalc V2.3: Rheometer #1.
• Viscosímetro Brookfield modelo DV-III
• Baño de Temperatura Controlada modelo TC-101
• Kit de Spindle SC4-18 con su recipiente y tapa
75"Viscosidad", Enciclopedia Microsoft® Encarta® 98 © 1993-1997 Microsoft Corporation.
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97
3.3.8.2.2. Encendido de Equipos
3.3.8.2.2.1. Encendido del Viscosímetro
Accionar el interruptor localizado en la parte posterior del viscosímetro; La pantalla
mostrará el nombre y modelo del viscosímetro de la siguiente manera: Brookfield
Rheometer Model DV-III.
Iniciar el computador después de encender el viscosímetro y esperar hasta que se
encuentre bajo ambiente Windows. Activar el software Rheocalc V2.3: Rheometer
#1, navegando por las ventanas auxiliares, con ayuda del mouse o del teclado,
como indica el protocolo de la figura 16:
Figura 16. Protocolo para activar el software Rheocalc V2.3: Rheometer #1
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98
3.3.8.2.2.2. Encendido del baño de temperatura controlada
Encender el baño de temperatura usando dos interruptores: el primero ubicado en
la parte posterior del controlador y el segundo en la parte frontal. Accionar primero
el interruptor de la parte posterior y luego el de la parte frontal.
3.3.8.2.3. Montaje de la muestra en el viscosímetro
3.3.8.2.3.1. Montaje de la muestra en el recipiente
Colocar en el recipiente del Spindle SC4-18 el fluido a trabajar, la cantidad
aproximada de fluido debe ser de 5 ml.
3.3.8.2.3.2. Montaje Spindle en el recipiente
Después de haber agregado el fluido a trabajar, colocar el Spindle SC4-18 en el
recipiente.
3.3.8.2.3.3. Montaje del recipiente en el viscosímetro
Insertar el recipiente con el Spindle y la muestra dentro un cilindro que tiene un
pin. El pin asegura que el recipiente con el Spindle y la muestra, no se caigan del
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99
montaje. Introducir el recipiente por la parte inferior del cilindro hasta que la
ranura de dicho recipiente encaje con el pin.
3.3.8.2.4. Condiciones de trabajo
3.3.8.2.4.1. Temperatura de trabajo
En el controlador de temperatura encontrado en baño de temperatura, oprimir el
botón SET/ENTER y con la perilla, graduar la temperatura deseada. Oprimir
nuevamente SET/ENTER y esperar a que el tablero muestre la temperatura
establecida. Esta temperatura tiene un rango de variación entre 0.1 a 0.4 ºC
aproximadamente.
Para realizar las mediciones del fluido, esperar de 15 a 25 minutos, de esta
manera, la muestra en el recipiente adquirirá la temperatura establecida por el
baño de temperatura y las mediciones serán más confiables.
Conectar el cable de temperatura del viscosímetro a la celda del recipiente del
Spindle. Donde va la muestra para llevar el registro de temperatura de dicha
muestra.
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100
3.3.8.2.4.2. Unidades de trabajo
En el menú dashboard del software en uso, seleccionar las unidades de
temperatura y las unidades de medición. Con el botón izquierdo del mouse pulsar
en la opción para escoger las unidades de temperatura (Temperature Units),
repitiendo el mismo procedimiento para escoger las unidades de medición
(Measurements Units).
Figura 17. Menú Dashboard
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3.3.8.2.5. Inicialización del viscosímetro
Con ayuda del mouse, hacer clic en la opción de inicializar (zero) del menú
dashboard. Esta opción se encuentra ubicada en la parte inferior izquierda en
recuadro blanco como esta indicado en menú dashboard que se muestra en la
figura 17.
3.3.8.2.6. Ensamble del Spindle
3.3.8.2.6.1. Unión del Spindle con el soporte
El Spindle va unido a un soporte que a su vez es acoplado al mecanismo de
rotación del viscosímetro. Efectuar la unión entre el soporte y el Spindle por medio
de un adaptador.
3.3.8.2.6.2. Unión del soporte con el mecanismo de rotación
El mecanismo de rotación se encuentra localizado en la parte inferior del tablero
del viscosímetro y es el encargado de hacer girar el Spindle a las diferentes
revoluciones que necesite; es un adaptador con rosca externa que se une con el
soporte del Spindle. Esta unión debe efectuarse por medio de roscado ya que el
soporte tiene una rosca interna.
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3.3.8.2.6.3. Colocación de la tapa
Terminado el montaje, colocar una tapa. La tapa permite que no entre ningún
agente externo, como se puede ver en la figura 18.
Figura 18. Montaje del viscosímetro
3.3.8.2.7. Implementación del programa
En el menú programs se encuentran los diferentes parámetros para cargar el
programa. Ver figura 19.
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Figura 19. Menú programs
3.3.8.2.7.1. Organización de los parámetros en el programa
Los parámetros para correr el programa son seis en total y deben colocarse en el
siguiente orden: 1. SSN, 2. LSC, 3. WTI, 4. DSP, 5. SSI y 6. LEC.
3.3.8.2.7.2. Significado de los parámetros escogidos
Los significados de los parámetros escogidos son los siguientes:
• SSN: Indica la velocidad de arranque.
• LSC: Indica el número de intervalos.
• WTI: Indica el tiempo de cada intervalo.
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• DSP: Toma la medida en cada intervalo.
• SSI: Indica el incremento de velocidad por intervalo.
• LEC: Finaliza el conteo y comienza una nueva corrida.
De los parámetros escogidos, LEC y DSP son parámetros fijos que no pueden
variar, en cambio, los otros parámetros varían dependiendo el tipo de fluido a
analizar.
3.3.8.2.7.3. Parámetros del programa
En el menú programs que se encuentra en la figura 19, en la parte superior
derecha del menú se encuentra la lista de los diferentes parámetros necesarios
para correr el programa que realiza las mediciones. En la parte superior izquierda
del menú programs, se encuentra un panel al cual se llevan los parámetros de la
lista. Para llevar estos parámetros, con ayuda del mouse, pulsar en el parámetro
escogido y nuevamente con el mouse, pulsar en el comando de insertar (insert)
que se encuentra en la parte superior derecha del panel.
En caso de haber cometido un error insertando un parámetro diferente u ordenado
de otra manera, con el mouse, seleccionar el parámetro equivocado en el
recuadro y luego, con el mouse nuevamente, pulsar en el comando para borrar
(delete) que se encuentra debajo del comando de insertar localizado en el panel.
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105
3.3.8.2.8. Corrida del programa
Después de cargar el programa, en el menú programs se presenta la opción de
guardar save, esta opción sirve para grabar el programa en la memoria del
computador. Después de grabar, en el menú dashboard se encuentra la opción de
correr el programa (run) para que el programa comience a correr.
Para volver a cargar el programa sin necesidad de volver a repetir los pasos
anteriores, en el menú programs se encuentra la opción de cargar (load). Con el
mouse hacer clic en load y de esta manera llamar el programa que se guardó
anteriormente.
En el instante que empieza a correr el programa el viscosímetro también corre.
3.3.8.2.9. Finalización de la corrida
3.3.8.2.9.1. Recolección de los datos obtenidos
Cuando el programa termine de correr, dirigirse al menú view/edit donde
aparecen todos los datos en forma de tabla como se ve en la figura 20. En este
menú se encuentran todos los valores calculados a las distintas velocidades
utilizadas en la corrida del programa. Los datos que aparecen después de
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106
realizarse las mediciones, se pueden guardar en el computador, exportándolos a
Excel. Para exportar los datos, en el menú view/edit en la parte inferior, localizar el
comando de exportar (export) y con el mouse pulsar en este comando; se
grabarán dichos datos.
Con estos datos se pueden hacer graficas para estudiar el comportamiento del
fluido del punto de vista grafico, Y el análisis el comportamiento del fluido desde
un punto de vista matemático, además muestra la confiabilidad de las mediciones
realizadas.
Figura 20. Menú view/edit
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3.3.8.2.9.2. Gráficas
En el menú plot mostrado en la figura 21, en la parte derecha se observa un
cuadro el cual tiene coordenadas X, Y. En la parte izquierda del cuadro se
encuentran dos recuadros especificando los parámetros del eje X y Y. Estos
parámetros pueden variar dependiendo el tipo de gráfica que se quiera estudiar.
Para seleccionar el tipo de gráfico con el mouse se pulsa en el recuadro amarillo
tanto para el eje X como para él Y, y se seleccionan los parámetros a medir
pulsando con el Mouse sobre dicho parámetro.
El software hace las gráficas automáticamente al realizar la primera corrida,
cuando se cambian los parámetros de la gráfica también sé gráfica
automáticamente. Para una nueva corrida, en la parte inferior del menú se
encuentra la opción de graficar nuevamente (replot), con el mouse pulsar sobre la
opción y automáticamente hace la gráfica. Para graficar con otros parámetros se
hace el procedimiento anterior, dado que al usar la función de graficar nuevamente
quedan los valores de la corrida nueva.
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Figura 21. Menú plot
3.3.8.2.9.3. Análisis
En el menú analysis mostrado en la figura 22. En este menú aparece en la parte
de derecha un cuadro con coordenadas X, Y, en la parte superior izquierda se
encuentran diferentes tipos de modelos matemáticos que son utilizados para
analizar el comportamiento del fluido estudiado. En parte inferior izquierda se
observa el cuadro de los resultados obtenidos después de realizar el análisis. Para
el análisis con el mouse se escoge el modelo a utilizar pulsando sobre él círculo
que aparece al lado izquierdo del modelo. Ya escogido el modelo nuevamente con
el mouse pulsando en la opción calcular (calculate).
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Los modelos son escogidos dependiendo el tipo de fluido utilizado, y los
resultados del análisis se muestran en una gráfica que muestran el
comportamiento del fluido, muestra la viscosidad promedio y el intervalo de
confianza de la muestra.
Figura 22. Menú Analysis
3.3.8.2.9.4. Corrida nueva
En caso de ser necesarias nuevas corridas para el programa, se presenta la
opción en el menú programs; con el mouse, pulsando en la opción run; este
proceso puede repetirse varias veces. Los criterios para realizar nuevas corridas
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dependen del tipo de estudio realizado al fluido. Si se quiere estudiar el
comportamiento estadístico de una muestra para su caracterización se deben
realizar varias corridas.
3.3.8.2.10. Factores que afectan las pruebas
3.3.8.2.10.1. Tipos de fluidos
El tipo de fluido es un factor muy importante dado que no todos los fluidos tienen
el mismo comportamiento.
3.3.8.2.10.2. Temperatura
La temperatura de trabajo depende mucho del fluido, hay fluidos que a ciertas
temperaturas cambian su estructura molecular y por lo tanto las pruebas pueden
resultar no válidas.
Cuando se trabaja con temperaturas mayores a la temperatura ambiente (27ºC),
las condiciones ambientales de las instalaciones no resultan relevantes, sin
embargo, si se va a trabajar a temperatura ambiente, las instalaciones deben tener
temperatura controlada, para que los cambios bruscos no afecten las mediciones.
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3.3.8.2.10.3. Número de corridas
Este factor depende del tipo de fluido y de la temperatura a la cual se trabaja ya
que, en fluidos como la sangre, si se hacen muchas corridas, teniendo en cuenta
la temperatura a la que se realizan las mediciones, se va solidificando, cambiando
bruscamente la medición.
3.3.8.2.11. Finalización de la medición
3.3.8.2.11.1. Cierre del programa
Al terminar las mediciones en cualquiera de los menús, en la parte inferior
derecha, se encuentra la opción de salir del programa (exit). Al hacer clic con el
mouse en esta opción, el software se cierra automáticamente.
3.3.8.2.11.2. Apagado de los equipos
Después de haber cerrado el software, apagar los equipos; para apagar el baño
de temperatura, accionar primero el interruptor de la parte frontal del controlador,
luego el interruptor ubicado en la parte posterior del controlador de temperatura
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Para apagar el viscosímetro, accionar el interruptor ubicado en la parte posterior.
Con los equipos debidamente apagados, efectuar la limpieza.
3.3.8.2.12. Limpieza del Viscosímetro
3.3.8.2.12.1. Retiro del recipiente
Para retirar el recipiente, primero se retira la tapa que cubre el recipiente del
Spindle, luego desenroscar el soporte que se conecta al mecanismo de rotación y
retirar de la celda el cable de temperatura. Luego, desencajar el recipiente del pin
que tiene el cilindro y sacarlo por la parte inferior.
3.3.8.2.12.2. Retiro de la muestra
Luego de retirar el recipiente, sacar el Spindle del recipiente y colocarlo en papel
de secar; retirar la muestra utilizada con una jeringa desechable y volverla a
colocar en su envase de almacenamiento original.
3.3.8.2.13. Lavado de los implementos
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Para lavar el recipiente es necesario el uso de jeringas desechables para que no
entre agua en la celda del recipiente del Spindle. Después de limpiar el interior de
este recipiente se seca con toallas absorbentes
Colocar el Spindle en un recipiente lleno de agua y enjuagar hasta que quede
totalmente limpio; secar con toallas absorbentes.
3.3.8.2.14. Normas para colocar y retirar la muestra
Para la colocación y el retiro de la muestra es necesario utilizar siempre los
guantes quirúrgicos, lo mismo en el momento en que se están lavando los
implementos.
3.4. Determinación de la cinética de polimerización
La determinación de la cinética de polimerización de la Poly-PLP-SFHb se realiza
haciendo un seguimiento al cambio o aumento de peso molecular durante el
tiempo que se encuentra reaccionando con el agente de polimerización utilizado,
que para este caso es el glutaraldehido. Para mirar el cambio en la velocidad de
reacción dependiente del pH, se realizan polimerizaciones a diferentes pH
variando entre 6 y 8, donde la hemoglobina conserva su estructura cuaternaria.
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114
3.4.1. Preparación de los lotes de polimerización
Se preparan cuatro lotes de 100 ml de hemoglobina libre de estroma piridoxilada,
cada lote se prepara siguiendo la metodología propuesta en el numeral 3.2,
adicionando 1.576 g de TRIS-HCl para obtener una concentración final de 0.1 M.
Con la ayuda de NaOH, HCl o ácido láctico (este ultimo es preferible) para llevar el
pH de dos lotes a 6 y el pH de los otros dos lotes a 8. El proceso de polimerización
se continua como se describe en el numeral 3.2, excepto que la solución de
glutaraldehido también debe ser llevada a pH 6 u 8 con la ayuda de NaOH, HCl o
ácido láctico, dependiendo del lote al que vaya a ser adicionado respectivamente.
Al iniciar la adición de la solución de glutaraldehido, se inicia el conteo de tiempo
de polimerización. Cada lote es polimerizado durante 12 horas.
3.4.2. Muestreo
Para determinar la cinética de polimerización en el tiempo, es necesario tomar
muestras periódicas de la solución de hemoglobina que se encuentra
polimerizando a un pH determinado.
Se realizan polimerizaciones de los cuatro diferentes lotes durante 12 horas y se
toma una muestra cada hora, deteniendo la polimerización en la muestra con la
adición de exceso de solución de lisina 1.3 M. En viales con capacidad de 1.5 ml
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se adicionan 0.6 ml de lisina 1.3 M y se adicionan 0.6 ml de la muestra de
hemoglobina para detener la polimerización. Estos viales son agitados y
conservados a 4°C.
3.4.3. Electroforesis SDS-PAGE
3.4.3.1. Preparación de los patrones de peso molecular
Los patrones de peso molecular deben ser diluidos y desnaturalizados con la
ayuda de un buffer. Su preparación se describe a continuación en la tabla 5.
Tabla 5. Reactivos para la preparación del buffer de la muestra Reactivo Cantidad
Agua desionizada 3.8 ml Tris-HCl 0.5 M pH 6 1.0 ml Glicerol 0.8 ml SDS 10% (W/V) 1.6 ml 2-mercaptoetanol 0.4 ml Azul de bromofenol 1% (w/v) 0.4 ml
El patrón de peso molecular se diluye 4:1 en el buffer, con el fin de obtener una
concentración de proteínas de aproximadamente 0.25 g/L. Luego los patrones de
peso molecular son calentados a 95°C durante 4 minutos. Se recomienda seguir
las instrucciones del proveedor de peso molecular a utilizar para la preparación de
los patrones.
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116
3.4.3.2. Preparación del gel de poliacrilamida al 7.5%
Para la preparación de 5 ml de gel al 7.5%. Con el cual se forma el gel donde se
realiza la corrida se necesitan los reactivos que se describen a continuación en la
tabla 6. La poliacrilamida es una sustancia toxica, por lo tanto se recomienda el
uso de guantes de cirugía y mascara.
Tabla 6. Reactivos para la preparación del gel de poliacrilamida al 7.5% Reactivos Cantidad
Agua bidestilada 2.42 ml Tris – HCl 1.5 M pH 8.8 1.25 ml SDS 10% (w/v) 50 µl Solución de acrilamida/bisacrilamida al 30% 1.25 ml Persulfato de amonio 10% (recién preparado) 25 µl TEMED 10 µl
Una vez agregado el TEMED, el gel debe ser colocado rápidamente entre las
laminas de vidrio.
3.4.3.3. Preparación de del stacking gel al 4%
El stacking gel, es el gel que se utiliza para armar el “recipiente” donde se
adicionan las muestras que van a ser corridas en la electroforesis. En la tabla 7 se
describen los reactivos necesarios para la preparación de este gel.
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Tabla 7. Reactivos para la preparación del stacking gel Reactivo Cantidad
Agua bidestilada 1.6 ml Ttris-HCl 0.5 M, pH 6.8 625 µl SDS 10% (W/V) 25 µl Acrilamida + Bisacrilamida (30 g + 1.6 g)/100 ml - 375 µl Persulfato de amonio 10% (recién preparado) 21 µl TEMED 28 µl
Este gel debe ser colocado encima del gel de poliacrilamida al 7.5% y se coloca la
peineta que forma los pozos donde se coloca la muestra de proteína a correr. Se
debe esperar 30 min a que este gel se endurezca.
3.4.3.4. Preparación del buffer de la muestra
Las muestras de hemoglobina polimerizada deben ser diluidas y desnaturalizadas
con un buffer. Su preparación se describe a continuación en la tabla 8.
Tabla 8. Reactivos para la preparación del buffer de la muestra Reactivo Cantidad
Agua desionizada 3.8 ml Tris-HCl 0.5 M pH 6 1.0 ml Glicerol 0.8 ml SDS 10% (W/V) 1.6 ml 2-mercaptoetanol 0.4 ml Azul de bromofenol 1% (w/v) 0.4 ml
Las muestras se encuentran inicialmente a una concentración de 8 g/dl
aproximadamente, ya que se diluyo la Poly-PLP-SFHb, que se encontraba a 16
g/dl durante el proceso de polimerización, y se diluyeron en un volumen igual de
lisina 1.3 M para detener la polimerización, como se describe en el numeral 3.4.2.
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Las muestras se diluyen 80:1 con agua destilada para obtener una concentración
de hemoglobina de 1 g/L, y luego se diluyen 4:1 con el buffer para obtener una
concentración final de 0.25 g/L. Las muestras son calentadas a 95°C durante 4
minutos.
3.4.3.5. Preparación del buffer de corrida
El buffer donde se genera el campo eléctrico se prepara como se describe a
continuación en la tabla 9.
Tabla 9. Reactivos para la preparación del buffer de corrida Reactivo Cantidad
Glicina 14.4 g Trizma base 3.03 g SDS al 20% 5 ml Agua desionizada completar a 1000 ml
En el gel de poliacrilamida se colocan en cada pozo 20 µl de muestra y se dejan
dos carriles donde se adiciona 20 µl de patrón de peso molecular. Luego la
cámara se tapa y se verifica el color de los electrodos para que el campo eléctrico
tenga el sentido correcto de flujo. Se aplica el buffer de corrida cubriendo los
electrodos y se coloca el sistema a 18 mA constantes hasta que las muestras
lleguen al final del gel.
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3.4.3.6. Fijación de las proteínas
Una vez terminada la electroforesis, se sumergen los vidrios con el gel durante 5
minutos en la solución de fijado ( metanol, agua, ácido acético 25:75:7) luego con
ayuda de una micro-espátula se despegan los vidrios y se libera el gel en la
solución y se deja allí por más de 1 hora.
3.4.3.7. Tinción de proteínas
Después de la fijación, se sumerge el gel en solución de azul de coomassie al
0.2% durante media hora. (Se disuelven 0.2 g de azul de coomassie en 50 ml de
metanol , 5 ml de ácido acético glacial y se lleva a 100 ml con agua destilada).
3.4.3.8. Decoloración del gel
Se sumerge el gel coloreado en solución de ácido acético al 10% y 30% de
metanol. La solución se cambia unas 3 o 4 veces hasta obtener una buena
coloración.
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3.4.4. Determinación del peso molecular promedio
Para la determinación del peso molecular se utiliza el software Quantity One de
BIO-RAD. La polihemoglobina sigue una curva de distribución desde hemoglobina
tetramérica hasta pesos moleculares mas altos. La determinación del peso
molecular promedio se realiza calculando un promedio ponderado con cada
fracción de hemoglobina que se genera en el gel de SDS-PAGE. El Software
calcula la fracción de cada peso molecular por densidad óptica y por el área de la
banda que se este analizando y genera una curva de distribución de peso
molecular. Luego, conociendo el peso molecular de las diferentes bandas, ya que
todas son múltiplos de el peso molecular de una sola molécula de hemoglobina
(62,000 Da) se puede determinar el peso molecular, al multiplicar el peso
molecular de la banda correspondiente por su fracción. Un ejemplo de esta
determinación se muestra en la tabla 10.
Tabla 10. Calculo de peso molecular promedio Peso Molecular fracción Peso ponderado
744000 10% 74400434000 23% 99820248000 39% 96720124000 21% 2604062000 7% 4340
TOTAL 100% 301320
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3.4.4.1. Abrir la imagen
Se selecciona la opción de “open” en el file menu o se presiona el icono de “open”
en los file commands como se muestra a continuación en la figura 23.
Figura 23. Barra principal
Luego le aparecerá la ventana de “open dialog box”, donde se escoge la imagen
del gel que va a analizar y se presiona el icono de “open” para cargar la imagen.
Esta ventana se muestra a continuación en la figura 24.
Figura 24. Ventana “open dialog box”
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122
3.4.4.2. Definir los carriles
Después de escanear el gel, y cargar la figura escaneada del gel en el software, lo
primero que hay que hacer el definir los carriles que se encuentran en el gel. Los
carriles pueden ser generados por el mismo software con la ayuda del con la
ayuda del icono “Auto Frame Lanes” como se muestra en la figura 25.
Figura 25. Auto Frame Lanes
El gel va a quedar marcado junto con sus carriles como se muestra en la figura 26.
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Figura 26. Característica de los Frame Lanes
3.4.4.3. Definir las bandas
Después de definir los carriles, se deben definir las bandas. Para identificar las
bandas, se utiliza la herramienta de detección de bandas, como se muestra en la
figura 27.
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Figura 27. Menu da bandas y barra de herramientas de bandas
Se selecciona la opción o se prime el botón de detección de bandas, y se abre
automáticamente el dialogo de detección de bandas, como se muestra en la figura
28.
Figura 28. Dialogo de detección de bandas
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125
Y se presiona el icono de detectar, así el software identificara las bandas en el gel.
3.4.4.4. Generar distribución de densidad
Para obtener el dato de distribución de densidad de las bandas y poder calcular la
fracción a la que cada banda corresponde sobre el 100% del carril, se selecciona
la banda que se quiere analizar y se la opción de atributos de banda del menu de
banda de la barra de herramientas y se abre automáticamente el dialogo de
atributos como se muestra en la figura 29.
Figura 29. Dialogo de atributos de banda
Se selecciona la opción de “Relative Qty” y se presiona OK, y aparecerá la
fracción que tiene la banda seleccionada con respecto a todo el carril.
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126
Al realizar este procedimiento con todas las bandas se tiene la fracción
correspondiente a cada banda de cada carril, y se puede calcular el peso
molecular promedio ponderado como se explico anteriormente.
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127
4. RESULTADOS
4.1. Piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma
El proceso es llevado acabo a 4°C, con la ayuda de un pequeño refrigerador, en
donde se pueden introducir el vaso de reacción y el agitador magnético. Las
soluciones utilizadas en este proceso fueron mantenidas previo a la piridoxilación
a esta misma temperatura para evitar cambios bruscos de temperatura. La
desoxigenación fue llevada acabo por medio de una manguera de látex que
transportaba el oxígeno dentro del refrigerador al vaso de reacción, como se
muestra en la figura 30.
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128
Figura 30. Representación esquemática del proceso de piridoxilación.
Siguiendo el método de preparación descrito en el numeral 4.1, 485 ml de
hemoglobina libre de estroma preparados previamente como se describe en la
referencia 4 fueron utilizados.
TRIS-HCl buffer (Applichem GmbH) fue añadido como polvo hasta obtener una
concentración de 0.1 M. Como es bien conocido, la molaridad se define como:
Entonces, para 485 ml de hemoglobina libre de estroma, 0.0485 moles de TRIS-
HCl buffer eran necesarios, el peso molecular del TRIS-HCL buffer es de 157.6
litromolesMolaridad =
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129
g/mol con una pureza del 99.5%, por lo que la cantidad de TRIS-HCL necesarios
en gramos fueron:
En una balanza de peso, 7.667 g de TRIS-HCl buffer fueron pesados, y esto fue
añadido a la solución de hemoglobina libre de estroma.
después, el pH de la solución fue medido tres veces con la ayuda de un pHimetro,
con una media de 6.5 y una desviación estándar de 8,54x10-2, que da un intervalo
de confianza del 95% de 6.50 ± 0.14, calculado con una prueba estadística t-
student de dos grados de libertad.
El pH de la solución debía ser llevado a un pH fisiológico de 7.4, con la adición de
NaOH 2 M (Merck & Co. Inc.). 30 ml de esta solución fueron preparados. Para
obtener una concentración de 2 M, 0.06 moles fueron necesarias:
El peso molecular del NaOH es de 40 g/mol, por lo que la cantidad necesaria en
gramos de NaOH fue:
( ) gpurezapureza
molesmol
ggTRIS 682,7
%5,99%100
0485,06,157][ =⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
moleslitrosMvolumenmolaridadmoles 06,0)03,0)(2())(( ===
( ) gmolesmolg
gNaOH 4,206,040][ =⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
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130
En una balanza de peso, 2.391 g de NaOH fueron pesados y puestos en un vaso
volumétrico de 100 ml. Luego se adiciono agua destilada hasta la marca de 30 ml.
Esta solución de NaOH va a ser utilizada durante los procesos de piridoxilación,
polimerización y obtención de curvas de disociación de oxígeno, que serán
explicados posteriormente.
Con la ayuda de una pipeta, volúmenes de 0.5 ml fueron añadidos hasta que el pH
de la solución de hemoglobina libre de estroma estuviera alrededor de 7.4. Un
total de 4.5 ml de NaOH fueron necesarios. El pH fue medido tres veces dando un
pH medio de 7.42 con una desviación estándar de 4,51x10-2, que da un intervalo
de confianza de 7.42 ± 0.07, calculado con una prueba estadística t-student de
dos grados de libertad.
La concentración de hemoglobina fue medida con la ayuda de un medidor de
concentración de hemoglobina (β-hemoglobina Test System, Hemocue) dando un
valor de 10.0 g/dl. Esto significa que en el volumen total de 485 ml de hemoglobina
libre de estroma había 48.5 g de hemoglobina, como el peso molecular de la
hemoglobina es de 64,459 g/mol, el numero total de moles presentes se pudo
calcular como sigue:
( ) molesx
molgg
WMHb
Hbhemoglobin
gramsmoles
41052,7/458,64
5,48..
−===
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131
Piridoxal 5’ fosfato monohidratado (Applichem GmbH) debía ser añadido a la
solución de hemoglobina a una razón molar de piridoxal a hemoglobina de 4:1. Por
lo tanto, las moles de piridoxal 5’ fosfato monohidratado necesarias son cuatro
veces las de hemoglobina presente, estas son 3x10-3 moles. El peso molecular del
piridoxal 5’ fosfato es 265.16 g/mol con una pureza del 98%, por lo que la cantidad
de piridoxal 5’ fosfato monohidratado necesario es:
En una balanza de peso, 0.816 g de piridoxal 5’ fosfato fueron pesados y luego
añadidos a la solución de hemoglobina libre de estroma. El pH fue nuevamente
medido dando como resultado una media de 6.97 con una desviación estándar de
3,94x10-2, que da un intervalo de confianza de 6.97 ± 0.07, calculado con una
prueba estadística t-student de dos grados de libertad.
Esta solución fue nuevamente llevada a un pH de 7.4 con la adición de NaOH 2 M
preparado anteriormente, dando como resultado un pH de 7.39 con una
desviación estándar de 3.4 x 10-2, que da un intervalo de confianza de 7.39 ± 0.06,
calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad.
La hemoglobina libre de estroma ya con el piridoxal 5’ fosfato añadido, fue
desoxigenada durante dos horas con la ayuda de gas nitrógeno (AGA FANO S.A.)
( ) gpurezapureza
molesmol
ggpyridoxal 814,0
%98%100
003,016,265][ =⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠⎞
⎜⎝⎛=
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132
como se muestra en la figura 14. Durante la desoxigenación, espuma es
producida, por lo que la solución debe ser continuamente agitada para reducir los
niveles de espuma.
Para lograr la unión del piridoxal 5’ fosfato a la hemoglobina, NaBH4 (Applichem
GmbH) debe ser añadido a una razón molar de NaBH4 a hemoglobina de 20:1,
como se calculo anteriormente, por lo tanto, 1.50x10-2 moles de NaBH4 son
necesarios. El peso molecular del NaBH4 es de 37.83 g/mol con una pureza del
96%. La cantidad de NaBH4 necesario en gramos se puede calcular:
En una balanza de peso 0.602 g fueron pesados y fueron diluidos en 3 Ml de
NaOH 0.001 M, que fueron preparados añadiendo 1.5 µL de NaOH 2 M en 3 ml de
agua destilada. Esto fue añadido a la solución de hemoglobina libre de estroma
El burbujeo con nitrógeno fue continuado por 10 minutos adicionales, para poder
dejar este proceso sin ningún tipo de vigilancia, y debido a la falta de un sistema
para controlad la espuma formada, la manguera de látex fue localizada de tal
manera que el nitrógeno entrara en contacto superficial con la solución de
hemoglobina libre de estroma, pero que en ningún momento entrara en contacto
( ) gpurezapureza
molesxmol
ggNaBH 591,0
%96%100
105,183,37][ 24 =⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠⎞
⎜⎝⎛= −
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133
con esta, como se muestra en la figura 31. Este proceso se dejo por otras 18
horas adicionales para permitir la unión covalente del piridoxal 5’ fosfato a la
hemoglobina.
Figura 31. Proceso de desoxigenación realizado con nitrógeno para prevenir la formación de
espuma en la solución de hemoglobina libre de estroma. La manguera es colocada justo encima de
la superficie de la solución.
4.2. Ultrafiltración de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada
después del proceso de piridoxilación, la concentración de hemoglobina fue
medida tres veces con la ayuda del medidor de concentración de hemoglobina,
dando una media de 6.4 y una desviación estándar de 5,8x10-2, que da un
intervalo de confianza de 6.4 ± 0.11, calculado con una prueba estadística t-
student de dos grados de libertad. Para el proceso de polimerización, la
concentración de hemoglobina en la solución debe estar alrededor de 16 g/dl, por
lo que un proceso de ultrafiltración es necesario. Este proceso fue llevado acabo
IQ-2003-02-08
134
en un equipo de hemodiálisis Baxter modelo 1550 con un filtro de ultrafiltración C-
110 de Baxter (Este equipo fue facilitado por RTS Ltda. en asociación con la
Fundación Cardio-infantil). El equipo fue bypaseado, para que ninguna solución
dializante entrara en contacto con la solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada, y las líneas arterial y venosa fueron colocadas en el mismo reservorio
con el fin de formar un circuito cerrado, como se muestra en la figura 32.
Figura 32. Proceso de ultrafiltración en circuito cerrado realizado a la hemoglobina libre de estroma
piridoxilada.
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135
El equipo de diálisis es programado para que retire la cantidad necesaria de
kilogramos de agua por hora y así la presión transmembrana es ajustada
automáticamente y se programa el tiempo total de ultrafiltrado. Durante este
proceso especifico de ultrafiltración, el equipo no puedo controlar de manera
adecuada la cantidad de agua retirada, debido al pequeño volumen que fue
ultrafiltrado, y burbujas de aire se crearon en el circuito cerrado. Aunque el agua a
ser retirada programada, era el necesario para llevar la concentración de
hemoglobina a 18 g/dl, la concentración final de hemoglobina tenia una media de
24.5 con una desviación estándar de 2,08x10-1 , y dando un intervalo de confianza
de 24.5 ± 0.35 g/dl, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados
de libertad. El volumen final fue de 105 ml, y se diluyo a 160 ml con la adición de
lactato de Ringer, para obtener una concentración final de 16.0 ± 0.4 g/dl a un
nivel de confiabilidad del 95%, calculado con una prueba estadística t-student con
dos grados de libertad.
4.3. Polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada
El proceso fue llevado acabo a 4°C, con la ayuda de un pequeño refrigerador. Las
soluciones utilizadas durante el proceso de polimerización fueron preparadas con
anterioridad y fueron almacenadas a esta misma temperatura, para evitar choques
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136
térmicos al ser adicionadas a la solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada.
Del proceso de ultrafiltración, la hemoglobina libre de estroma piridoxilada tiene un
volumen de 160 ml y una concentración de 16.0 ± 0.4 g/dl a un nivel de
confiabilidad del 95%, calculado con una prueba estadística t-student de dos
grados de libertad.
Siguiendo el proceso de polimerización descrito en el numeral 4.4, primero, la L-
lisina monohidroclorato (Merck & Co. Inc.) fue preparada. Para los 160 ml de
hemoglobina libre de estroma piridoxilada, un volumen total de 32 ml fueron
necesarios. Por cada mililitro de solución de lisina, 239.84 mg de lisina son
necesarios para obtener una concentración final de 1.3 M, por lo que un total de
7.675 g fueron necesarios. En una balanza de peso 6.678 g fuero pesados en un
vaso de vidrio. Luego el buffer de fosfato debe ser añadido. Por cada mililitro de
solución de lisina, 87.09 mg de K2HPO4 y 68.04 mg de KH2PO4 son necesarios
para dar una concentración final de 0.5 M. En una balanza de peso, 87.12 mg de
K2HPO4 y 68.14 mg de KH2PO4 fueron pesados en el mismo vaso donde se
encuentra la lisina. Luego, este vaso fue llevado a un volumen final de 32 ml
añadiendo agua destilada. El pH fue medido dando un valor de 6.37, por lo que 5
ml de NaOH 2M debieron ser añadidos para dar al final un pH con 7.35 y
IQ-2003-02-08
137
desviación estándar de 0,02 obteniendo un intervalo de confianza al 95% de 7.35
± 0.034, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad.
Luego la solución de trabajo de glutaraldehido debía ser preparada. Para los 160
ml de solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada, se necesitan 5.3 ml.
El glutaraldehido debe ser diluido en un buffer de fosfato, 461.58 mg de K2HPO4 y
360.61 mg de KH2PO4 deben ser añadidos a este volumen para obtener una
concentración final de buffer de 0.5 M, en una balanza de peso 0.463 g de K2HPO4
y 0.363 mg de KH2PO4 fueron pesados y 3.8 ml de agua destilada fueron añadidos
con pipeta. 1.3 ml de glutaraldehido al 50% fueron medidos en una pipeta y
añadidos a la solución de buffer. El pH fue medido dando una media de 7.41 con
una desviación estándar de 0.02, obteniendo un intervalo de confianza al 95% de
7.35 ± 0.034, calculado con una prueba estadística t-student con dos grados de
libertad.
A la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada se le midió el pH dando
un valor de 7.1, por lo que 2 ml de NaOH 2 M fueron añadidos dando un pH con
media de 7.37 y desviación estándar de 0.03, obteniendo un intervalo de confianza
del 95% de 7.37 ± 0.05, calculado con una prueba estadística t-student de dos
grados de libertad.
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138
La osmolaridad de la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada fue
medida tres veces con la ayuda de un Osmómetro (ONE-TEN osmometer, Fiske),
dando una media de 727 mOsm/kg y una desviación estándar de 8 mOsm/kg,
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139
ultrafiltración. La solución de hemoglobina libre de estroma fue ultrafiltrada como
se describe en el numeral 5.2 para eliminar el exceso de reactivos. En la tabla 11,
se muestra el comportamiento del descenso de la osmolaridad durante la reacción
y en la figura 33 estos datos están graficados.
Tabla 11. medición de osmolaridad
durante el proceso de polimerización
Tiempo [h] Osmolaridad [mOsm/kg]
0 727
1 712
2 704
3 691
4 662
5 647
6 616
7 587
8 553
9 497
10 472
11 395
12 352
13 338
14 312
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140
300350400450500550600650700750
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo [h]
Osm
olar
idad
[mO
sm/k
g]
Figura 33. Comportamiento de la osmolaridad durante el proceso de polimerización de la
hemoglobina libre de estroma piridoxilada vs. el tiempo de la reacción.
después de realizar el proceso de ultrafiltración, con la modificación de añadir
cada media hora 200 ml de lactato de Ringer tres veces, para lavar la solución de
hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada, se midió la
concentración de hemoglobina dando una concentración media de 22 g/dl con una
desviación estándar de 0.4 con un intervalo de confianza del 95% de 22 ± 0,7 g/dl
calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de libertad, con un
volumen final de 99 ml. La solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada fue diluida a una concentración final de 14.5 g/dl ml con la adición de
51 ml de lactato de Ringer.
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141
4.4. Diálisis de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada
El proceso final realizado a la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada es una diálisis contra lactato de Ringer. Este proceso ayuda a
remover el glutaraldehido y la lisina que se encuentran en exceso que no
reaccionaron durante el proceso de polimerización y no fueron removidas durante
la ultrafiltración, y su eliminación es muy importante. Además, este proceso de
diálisis permite ajustar los electrolitos a condiciones y concentraciones fisiológicas
normales.
El proceso es llevado acabo a 4°C, y la solución dializadora es lactato de Ringer
(Baxter Laboratories) a esa misma temperatura. El volumen total de hemoglobina
libre de estroma piridoxilada y polimerizada es de 150 ml, por lo que se divide este
volumen en 6 volúmenes parciales de 20 ml y uno final de 30 ml. La membrana de
acetato de celulosa regenerada (Fisher Scientific) es preparada para que todos los
restos de sulfuro y metales pesados sean retirados, como se describe en el
“Ensayo sensitivo de pretratamiento de la membrana”, que se encuentra en el
boletín instructivo. Por cada 20 ml de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada, 16 cm de membrana son utilizados, esta longitud permite que la
membrana sea sellada en sus extremos con la ayuda de grapas plásticas, y se
necesitan 2 L de lactato de Ringer. Este proceso es llevado acabo por tres horas
por lo menos, que garantiza que ocurra el equilibrio electrolítico. Al final del
IQ-2003-02-08
142
proceso de diálisis la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada
tenia una concentración con media de 14.5 g/dl y desviación estándar de 0.4 con
un intervalo de confianza del 95% de 14.5 ± 0.7 g/dl y un pH con media de 7.166 y
desviación estándar de 0.0224 con un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ±
0.184, ambos datos calculados con una prueba estadística t-student de dos
grados de libertad.
4.5. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina
libre de estroma piridoxilada y polimerizada
4.5.1. Curvas de disociación de oxígeno
Para la evaluación del P50, el coeficiente de Hill y el efecto de Bohr, curvas de
disociación de oxígeno de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada debían ser obtenidas. Estas curvas fueron descritas anteriormente en
el numeral 4.3.4.1
4.5.1.1. Equipos y reactivos
• Agitador magnético con su barra de agitación y control de temperatura
• Analizador de gases arteriales
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143
• Jeringas
• Tanques de gas calibrado con pCO2 = 40 mmHg, y pO2 con rangos desde 0
mmHg hasta 100 mmHg balanceados en nitrógeno.
• solución de NaOH 2M.
• HCl 2 M.
4.5.1.2. Soluciones utilizadas
Las soluciones de NaOH 2 M y HCL 2 M utilizadas anteriormente serán utilizadas
durante este procedimiento, para variar el pH de la solución de hemoglobina libre
de estroma piridoxilada y polimerizada a los valores deseados, para la
determinación del efecto de Bohr, coeficiente de Hill y p50.
4.5.1.3. Gases calibrados
Os gases calibrados que fueron utilizados fueron obtenidos de Oxígenos de
Colombia S.A. Un total de seis tanques con composiciones conocidas de oxígeno
y pCO2 = 40 mmHg balanceados en nitrógeno fueron solicitados. La tabla 12
resumen la información de la composición solicitada y la composición entregada
en tanques de 1 m3.
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144
Tabla 12. Gases de calibración balanceados en nitrógeno76
OXÍGENO DIOXIDO DE CARBONO
PORCENTAJE presión [mmHg] Porcentaje presión [mmHg] Tanque Teórico Real Teórico Real Teórico Real Teórico Real
1 1.32 1.35 10.03 10.26 5.26 5.30 40 40.28
2 1.77 1.85 13.45 14.06 5.26 5.18 40 39.37
3 2.24 2.25 17.02 17.10 5.26 5.34 40 40.58
4 2.70 2.77 20.52 21.05 5.26 5.30 40 40.28
5 3.16 3.21 24.02 24.40 5.26 5.27 40 40.05
6 3.68 3.68 27.97 27.97 5.26 5.25 40 39.90
4.5.1.4. Procedimiento para la obtención de las curvas de disociación de
oxígeno
Debido a que la determinación de efecto de Bohr se necesitan curvas de la
solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada a diferentes
pH’s, tres soluciones fueron preparadas. Se uso una solución con el pH obtenido
después del proceso de diálisis, esta tiene una media de 7.166 con una desviación
estándar de 0.2044 dando un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ± 0.1502.
Otras dos muestras fueron preparadas, una con pH medio de 6.961 y desviación
estándar de 0.1016 dando un intervalo de confianza del 95% de 6.961 ± 0.0746 y
otra con media de 6.824 con desviación estándar de 0.1378 dando un intervalo de
76 Ver apéndice III para los análisis de cromatografía realizados por Oxigenos de Colombia S.A.
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145
confianza del 95% de 6.824 ± 0.1012, todas calculadas con una prueba estadística
t-student de dos grados de libertad. Estas fueron preparadas adicionando HCl 2 M.
Luego, cada una de las tres soluciones fue colocada en el agitador magnético. El
control de temperatura fue programado a 50°C, y la temperatura fue revisada
constantemente con la ayuda de un termómetro de mercurio para mantenerla a
37°C.
Cada una de las tres muestras de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada fue tonometrada con los seis gases calibrados por 10 minutos con
cada tanque, empezando con el tanque de menor concentración de oxígeno y
cambiando el tanque hasta que el ultimo con la mayor concentración de oxígeno
fue burbujeado. Después de 10 minutos de burbujeo con cada tanque, con la
ayuda de una jeringa, una muestra del fondo del recipiente fue tomada e
inmediatamente tapada para prevenir el contacto directo con oxígeno, debido a
que la concentración de oxígeno en el aire es mucho mayor que la concentración
de cualquiera de los seis tanques, y la difusión de oxígeno en la hemoglobina es
muy alta, por lo que podía ganar oxígeno del aire modificando la concentración de
oxígeno conocida y los resultados de saturación de oxígeno serian incorrectos.
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146
El pO2, pCO2, pH y concentración de hemoglobina de cada una de las muestras
fue medida con la ayuda de un analizador de gases arteriales (Blood Gas Analyzer
BMG 1312, Instrumentation Laboratory).
El resultado de pCO2 medido con el analizador de gases arteriales era diferente de
las condiciones estándares de los tanques de gas calibrados, por lo que cada
muestra debió ser normalizada a la condición estándar de pCO2 = 40 mmHg. El
proceso de normalización se realizo de la siguiente manera: si el resultado de
pCO2 medido por el analizador de gases arteriales era de 32 mmHg y el pO2
medido era de 45 mmHg, para normalizarlos fueron multiplicados por un factor de
corrección definido por:
Para este ejemplo, un factor de corrección de 1.25 es usado, por lo que las
presiones normalizadas son:
Para determinar la desviación estándar de la población, para la primera muestra
medida, se realizaron tres repeticiones dando una desviación estándar
normalizada de 1.42, esto se muestra en la tabla 13.
medidopCOmmHgFC
,2
40.. =
mmHgpOmmHgpCO
onormalizad
onormalizad
25.5640
,2
,2
=
=
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147
Tabla 1377. Determinación de la desviación estándar (Todas la
presiones en mmHg)
Repetición pCO2 pO2,hemoglobina
Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina
1 34.9 25 1.15 40 28.65
2 36.7 24 1.09 40 26.16
3 35 25 1.14 40 28.57
desviación estándar 1.42
Por lo que para cada muestra tonometrada y analizada, el intervalo de confianza
del 95% para la pO2 es de ± 2.4, calculado con una prueba estadística t-student de
dos grados de libertad.
Para determinar el porcentaje de saturación de oxígeno de la hemoglobina, se
asumió que a 108 mmHg en nivel de saturación de la hemoglobina era del 100%78.
Por lo que para determinar el porcentaje de saturación de cada muestra una
simple regla de tres es necesaria.
Todos estos cálculos se resumen en la tabla 14, tabla 15 y tabla 16.
77 ver Apendice III 78 Referencia 12
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148
Tabla 1479. solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada a un pH = 7.166 (todas la presiones en mmHg)
normalización
Muestra pO2,gas pH pCO2 pO2,hemoglobina Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina % sat O2
Tanque 1 10.26 6.583 30.4 20 ± 2.4 1.32 40 26.32 ± 2.4 24.37 ± 2.2
Tanque 2 14.06 6.805 60.2 59 ± 2.4 0.66 40 39.20 ± 2.4 36.30 ± 2.2
Tanque 3 17.1 7.123 51.4 64 ± 2.4 0.78 40 49.81 ± 2.4 46.12 ± 2.2
Tanque 4 21.052 7.684 54.1 79 ± 2.4 0.74 40 58.41 ± 2.4 54.08 ± 2.2
Tanque 5 24.396 7.677 51.8 90 ± 2.4 0.77 40 69.50 ± 2.4 64.35 ± 2.2
Tanque 6 27.968 7.125 42 83 ± 2.4 0.95 40 79.05 ± 2.4 73.19 ± 2.2
Tabla 1580. solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada a un pH = 6.961 (todas la presiones en mmHg)
normalización
Muestra pO2,gas pH pCO2 pO2,hemoglobina Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina % sat O2
Tanque 1 10.26 6.886 35.53 22 ± 2.4 1.13 40 24.77 ± 2.4 22.93 ± 2.2
Tanque 2 14.06 7.115 53 41 ± 2.4 0.75 40 30.94 ± 2.4 28.65 ± 2.2
Tanque 3 17.1 6.816 54.7 52 ± 2.4 0.73 40 38.03 ± 2.4 35.21 ± 2.2
Tanque 4 21.052 6.786 66.2 78 ± 2.4 0.60 40 47.13 ± 2.4 43.64 ± 2.2
Tanque 5 24.396 7.344 67.2 98 ± 2.4 0.60 40 58.33 ± 2.4 54.01 ± 2.2
Tanque 6 27.968 6.820 46.1 81 ± 2.4 0.87 40 70.28 ± 2.4 65.08 ± 2.2
Tabla 1681. solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada a un pH = 6.824 (todas la presiones en mmHg)
normalización
Muestra pO2,gas pH pCO2 pO2,hemoglobina Factor de normalización pCO2 pO2,hemoglobina % sat O2
Tanque 1 10.26 7.114 50.6 28 ± 2.4 0.79 40 22.13 ± 2.4 20.49 ± 2.2
Tanque 2 14.06 6.548 47.1 32 ± 2.4 0.85 40 27.18 ± 2.4 25.16 ± 2.2
79 Ver apendice IV 80 Ver apendice V 81 Ver apendice VI
IQ-2003-02-08
149
Tanque 3 17.1 6.548 47.9 37 ± 2.4 0.84 40 30.90 ± 2.4 28.61 ± 2.2
Tanque 4 21.052 6.550 55.3 54 ± 2.4 0.72 40 39.06 ± 2.4 36.17 ± 2.2
Tanque 5 24.396 7.093 58.3 72 ± 2.4 0.69 40 49.40 ± 2.4 45.74 ± 2.2
Tanque 6 27.968 7.092 63.9 90 ± 2.4 0.63 40 56.34 ± 2.4 52.16 ± 2.2
De estas tablas, se grafican las tres curves de disociación de oxígeno (ver figura
34).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829
pO2 [mmHg]
%sa
t O2
pH = 7.166
pH = 6.961
pH = 6.824
Figura 34. Curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada a diferentes pH’s.
4.5.2. Efecto de Bohr
El efecto de Bohr fue determinado por el ajuste de pH realizado a las tres
muestras de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada que fueron
tonometradas con los tanques de gas calibrados.
IQ-2003-02-08
150
El P50 para cada curva de pH fue determinado de las curves de disociación de
oxígeno de la figura 18, trazando una línea al nivel de saturación de 50% y
hallando el correspondiente valor de pO2 cuando se intercepta con las curvas de
pH, este punto representa el P50 para cada valor de pH (Ver tabla 17).
Tabla 17. P50 para los diferentes valores de pH de las curves de disociación de oxígeno para la
determinación del efecto de Bohr.
pH P50 log P50
7.166 ± 0.1502 19 ± 2.2 1.28
6.961 ± 0.0746 23.2 ± 2.2 1.37
6.824 ± 0.1012 26.7 ± 2.2 1.43
Luego, una grafica del log P50 vs. pH fue construida y la pendiente de esta recta
(∆log P50/∆pH) representa el efecto de Bohr82, como se puede ver en la figura 35.
1.001.101.201.301.401.50
6.8 6.85 6.9 6.95 7 7.05 7.1 7.15 7.2
pH
Log
p50
Figura 35. Determinación del efecto de Bohr en la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada.
82 Referencia 9
IQ-2003-02-08
151
Se realizo una regresión lineal y la ecuación resultante fue:
Para calcular el intervalo de confianza del efecto de Bohr, se utilizo la definición de
la pendiente de la recta obtenida por regresión lineal:
Donde para este caso “x” representa el pH, “y” representa el log P50 y “n”
representa el numero de datos acomodados en la regresión.
Recordando la propagación de error, cuando dos valores diferentes son
multiplicados o divididos, el error total se define como:
Y el porcentaje de error se define como:
9998.0
3692.44313.02
50
=
+−=
R
pHLogP
−−
−=−
−
−=
∑ ∑∑ ∑ ∑
XbYy
nx
x
nyx
xyslope
int
)( 22
2 22
21 %%% valorvalortotal errorerrorerror +=
valorxerrorerror 100)(% =
IQ-2003-02-08
152
Y cuando los valores son sumado o restados, el error total es simplemente la raíz
cuadrada de la suma de los errores al cuadrado.
En la tabla 18 se puede ver el error y el porcentaje de error para cada valor.
Tabla 18. Error y porcentaje de error para diferentes valores
usados en la determinación de efecto de Bohr.
pH error %error P50 error %error log P50 error %error
7.166 0.1502 2.096 19 2.2 11.579 1.28 0.14806621 11.5789474
6.961 0.0746 1.0717 23.2 2.2 9.4828 1.37 0.12948593 9.48275862
6.824 0.1012 1.483 26.7 2.2 8.2397 1.43 0.11754025 8.23970037
Finalmente, el error total del efecto de Bohr se puede calcular y el intervalo de
confianza del 95% para el coeficiente de Bohr es [-0.40,-0.47], calculado con una
prueba estadística t-student.
Para el calculo de intercepto “y”, Y = 1.36 y X = 6.984, por lo que el intervalo
donde el intercepto “y” debe estar localizado es [4.1535, 4.6423].
4.5.3. Coeficiente de Hill
El coeficiente de Hill se calculo de la curva de disociación de oxígeno a un pH =
7.166, que fue el pH resultante después del proceso de diálisis de la hemoglobina
libre de estroma piridoxilada y polimerizada, con la ayuda de la ecuación de Hill:
IQ-2003-02-08
153
Primero, el P50 fue calculado como se describe en el numeral 4.5.2, y se obtuvo un
valor de 19 ± 2.2 mmHg. Luego, un punto a cada lado del P50 en la curva de
disociación de oxígeno fue acomodado mediante una regresión lineal a la
ecuación de Hill, la pendiente de esta recta representa el coeficiente de Hill para la
solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada (ver tabla
19).
Tabla 19. Determinación del coeficiente de Hill
pO2 % sat log (s/1-s) log pO2 log P50 n
17.1 46.12 -0.07 1.23 1.28 1.48
21.052 54.08 0.07 1.32 1.28 1.60
El coeficiente de Hill resultante, tiene una media de 1.54 con una desviación
estándar de 0.0848, obteniendo un intervalo de confianza del 95% de 1.54 ±
IQ-2003-02-08
154
4.5.4. pH
El pH fue medido a las seis muestras de la solución de hemoglobina libre de
estroma piridoxilada y polimerizada con la ayuda del analizador de gases
arteriales, y se obtuvo un pH con media de 7.166 con desviación estándar de
0.224, y se obtuvo un intervalo de confianza del 95% de 7.166 ± 0.184, calculado
con una prueba estadística t-student de 5 grados de libertad. El pH del plasma se
encuentra en un intervalo de confianza del 95% de 7.40 ± 0.0583.
4.5.5. P50
El P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada
se calculo extrapolando el valor de P50 obtenido en el pH = 7.166 con la ayuda del
efecto de Bohr a las condiciones fisiológicas de pH = 7.4. Para obtener un P50
máximo y un P50 mínimo, la extrapolación se realizo con los valores máximo y
mínimo del efecto de Bohr y el intercepto “y” de la regresión lineal, con la que el
efecto de Bohr fue calculado (ver numeral 4.5.2.). El valor máximo del P50 se
obtiene con el valor máximo del efecto de Bohr, y los mismo se realizo con el valor
mínimo, esto dio como resultado:
83 Referencia 12 pg 76.
IQ-2003-02-08
155
4.5.6. Viscosidad
Las mediciones de viscosidad fueron realizadas con la ayuda de un viscosímetro
(Digital Viscometer model DV-II, Brookfield), con un disco numero 6 y a una
velocidad constante de 100 rpm a 25°C. Primero, se calculo la viscosidad del agua
bajo estas mismas condiciones, y se obtuvo como resultado una media de 11.6 cp
con una desviación estándar de 0.2 y un intervalo de confianza del 95% de 11.6 ±
0.9 cp a 25°C, calculado con una prueba estadística t-student de 2 grados de
libertad. A esta temperatura, se encuentra en la literatura que la viscosidad real
del agua es de 0.9 cp84. Por lo tanto, se puede calcular el factor de corrección con
al ecuación que se describe a continuación:
077.06.119.0.. ===
cpcpCF
medida
real
υυ
84 www.pump.net
mmHgP
mmHgP
ypHBohrP
6,1610
6,1510
int))((log
6423,4)4,7)(47,0(50
1535,4)4,7)(4,0(50
50
==
==
−+=
+−
+−
IQ-2003-02-08
156
Luego se midió la viscosidad de cada muestra de la solución de hemoglobina libre
de estroma piridoxilada y polimerizada, y se corrigió con el factor de corrección
descrito anteriormente. Estos resultados se muestran en la tabla 20.
Tabla 20. Viscosidad de la solución
de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada @ 25°C
viscosidad [cp] normalizada [cp]
70 5.43
60 4.66
60 4.66
70 5.43
Esto da como resultado una viscosidad con media de 5.05 con desviación
estándar de 0.444 y un intervalo de confianza del 95% de 5.05 ± 0.523 cp,
calculada con una prueba estadística t-student de tres grados de libertad.
4.6. Determinación de la cinética de polimerización
Se prepararon cuatro lotes de polimerización, cada uno de 100 ml de hemoglobina
libre de estroma piridoxilada que había sido preparada y almacenada a 4ºC meses
antes. Cada lote tenia una concentración media hemoglobina de 16 g/dl con una
desviación estándar de 0.165, lo que da una intervalo de confianza del 95% de
16.00 ± 0.28 g/dl, calculado con una prueba estadística t-student de dos grados de
IQ-2003-02-08
157
libertad. En la tabla 21 se resumen los datos de pH de los cuatro lotes, calculados
con una prueba t-student de dos grados de libertad al 95%.
Tabla 21. pH's de los diferentes lotes de polimerización
LOTE pH 1 6.06 ± 0.03 2 6.12 ± 0.04 3 7.94 ± 0.03 4 7.92 ± 0.05
Las diferentes soluciones de polimerización fueron preparadas como se describe
en el numeral 3.2. Los cuatro lotes fueron polimerizados por un tiempo de 12
horas, empezando el conteo de tiempo cuando se añade inicialmente la solución
de glutaraldehido, aunque este es añadido por goteo durante la primera media
hora para evitar desnaturalización de la solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada.
Siguiendo el método de electroforesis SDS-PAGE descrito en el numeral 3.4.3 se
prepararon cinco geles de corrida de diez carriles cada uno, junto con las
muestras de hemoglobina polimerizada y los patrones de peso molecular. Se
utilizaron dos patrones de peso molecular, uno de Bio-Rad que varia entre 16,000
– 240,000 Da y otro de Sigma-Aldrich que varia entre 100,000 – 500,000 Da. El
primer patrón se corrió en el carril 1 y el segundo patrón en el carril 6. Una imagen
de uno de los geles se muestra a continuación en la figura 36.
IQ-2003-02-08
158
Figura 36. Corrida en SDS-PAGE de Poly-PLP-SFHb
Como se puede ver en la figura 36, en los carriles donde se corrieron las muestras
de la Poly-PLP-SFHb, no se marca ningún tipo de peso molecular, y las corridas
muestran que la proteína que se esta corriendo tiene un peso molecular promedio
de 48,000 Da, lo cual es totalmente falso, ya que la hemoglobina tiene un peso
molecular de 62,000 Da. Esto mismo sucedió con los otros cuatro geles de
electroforesis, donde se corrieron las muestras de los cuatro lotes de
polimerización.
Inicialmente se pensó que este resultado se debía a que el glutaraldehido que se
estaba utilizando como agente de polimerización tenia fecha de vencimiento de
IQ-2003-02-08
159
octubre del 2002. Se consiguió glutaraldehido con fecha de vencimiento de
octubre 2004, pero los resultados fueron los mismos. Se piensa que la razón para
este resultado es la hemoglobina piridoxilada utilizada no este en las condiciones
adecuadas y probablemente este dimerizada y desnaturalizada por lo que no se
puede polimerizar. Esta conclusión se da por el resultado de las electroforesis, que
muestran rastros de proteína por debajo de los 48,000 Da, y que únicamente
podría ser hemoglobina dimerizada que tiene un peso molecular de 31,000 Da.
Desafortunadamente por cuestiones de tiempo no se pudo purificar y piridoxilar un
nuevo lote de hemoglobina, por lo que la cinética de la polimerización de la
hemoglobina libre de estroma piridoxilada no se pudo determinar.
Es de igual manera interés del departamento de ingeniería química, del grupo de
ingeniería biomédica y de este investigador, determinar la cinética de
polimerización, la cual será desarrollada en próximos meses a la publicación de
esta tesis.
IQ-2003-02-08
160
5. DISCUSION
5.1. Evaluación de las propiedades físico-químicas de la hemoglobina libre
de estroma piridoxilada y polimerizada
5.1.1. Comparación con otros autores
La comparación de los resultados obtenidos se hizo con los resultados obtenidos
en los trabajos de los autores Chang85, Sehgal86, y Alza Corporation87. Los
resultados de estos tres autores se muestran el la tabla 22.
85 Referencia 2 86 Referencia 9 87 Referencia 7
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161
Tabla 22. Resultados de las características de la hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada de diferentes autores.
autor Parámetro Chang Sehgal Alza Corporation Este trabajo
presión osmótica [mOsm/kg] 312 280-310 300 357 ± 13
Coeficiente de Hill 1.88 1.5-2 1.16-1.92
Efecto de Bohr -0.33 y -0.2 -0.40 y -0.47
P50 [mmHg] 15-18 14-16 22 15.6-16.6
pH 7.3-7.4 7.35-7.45 7.1 6.98-7.35
viscosidad [cp] 4.5 4.53-5.57
densidad[gr/cm3] 0.9-1.3
5.1.1.1. Presión osmótica
El resultado final de la presión osmótica de la hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada después del proceso final de diálisis es de 357 ± 13
mOsm/kg. Comparado con los otros tres autores, la presión osmótica final es un
poco elevada pero no critica. Unidades de glóbulos rojos concentrados se
encuentran alrededor de este valor. La presión osmótica se puede disminuir si la
reacción de polimerización es llevada acabo por mas tiempo, aunque el grado de
polimerización afecta el P50, el coeficiente de Hill y el efecto de Bohr88,
decreciendo los tres parámetros. Se debe decidir cual de los efectos tiene menor
significancia en condiciones fisiológicas, cuando esta solución de hemoglobina
modificada sea infusionada, ya sea tener un nivel osmótico un poco elevado, o
nivelar la presión osmótica al nivel isoosmótico de 300 mOsm/kg y tener como
IQ-2003-02-08
162
resultado una disminución que puede ser significante o no en los niveles de P50,
efecto de Bohr y coeficiente de Hill.
De todas formas, se demuestra por la disminución en la presión osmótica inicial de
727 mOsm/kg a la presión osmótica final 357 mOsm/kg que el proceso de
polimerización se llevo acabo adecuadamente, y por lo tanto la concentración de
hemoglobina se pudo aumentar a niveles fisiológicos normales de 14.5 g/dl para
producir una oxigenación correcta en los tejidos. Esto se debe demostrar
posteriormente en modelos animales y pruebas clínicas.
5.1.1.2. Coeficiente de Hill
La medición final de la cooperatividad de la hemoglobina es el coeficiente de Hill,
este determina la afinidad de la hemoglobina por la captación de oxígeno. El
resultado final del coeficiente de Hill después del proceso de polimerización de la
hemoglobina libre de estroma piridoxilada se encuentra en el intervalo de
confianza del 95% de [1.16 – 1.92]. Siguiendo el método de la referencia 14, una
comparación de medias con una prueba-t, donde el valor de comparación es t y
los grados de libertad se definen como:
88 Referencia 9
IQ-2003-02-08
163
Donde xn son las medias a comparar, sn es la desviación estándar de cada
población y nn es el numero de datos de cada población. Realizando estos
cálculos, y teniendo medias de 1.54 para este trabajo y 1.75 para el trabajo de
Sehgal73, con desviaciones estándar de 0.0848 y 0.807 y con un numero de datos
de tres y de 30 respectivamente, se obtiene como resultado un valor de “t” de
comparación de t = -1.2882, con los grados de libertad siendo ν = 1.369 ≈ 2, y el
valor t para estos grados de libertad por tablas de 4.303, se puede concluir que no
existe una diferencia significante entre las dos medias a una confianza del 95%.
Este resultando es entonces comparable al obtenido por el trabajo de Sehgal.
Comparado con el plasma normal, una gran disminución en el coeficiente de Hill
es obtenida debido al proceso de polimerización, ya que el valor del coeficiente de
Hill plasma es de 2.589. Esta perdida se ve reflejada en la perdida de la forma
sigmoidal de la curva de disociación de oxígeno y por lo tanto una disminución de
73 Referencia 9 89 Referencia 2 pg 38.
11 1
2
2
22
1
2
1
21
2
2
212
1
21
1
21
1
21
2
_
1
_
−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
+−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
=
+
−=
nns
nns
ns
ns
ns
ns
xxt
ν
IQ-2003-02-08
164
la pendiente de la curva en valores cercanos al P50, como se puede ver en la
figura 18. Las curvas de disociación de oxígeno en el rengo entre 0 mmHg y 30
mmHg son casi lineales, con ningún inicio sigmoidal diferenciable a simple vista y
sin un cambio diferenciable a simple vista entre otros valores y valores cercanos al
P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma. Esto puede ser causado por el
efecto de polimerización, debido a que le bolsillo donde cada monómero del
tetrámero de la hemoglobina se une al oxígeno de uno u otra forma se encuentra
mas inaccesible en su forma polimerizada que en su forma libre, pero esta
hipótesis debe ser demostrada. Este efecto no ha sido bien establecido aun90.
5.1.1.3. Efecto de Bohr
El resultado final del efecto de Bohr después del proceso de polimerización de la
hemoglobina libre de estroma se encuentra en el intervalo de confianza del 95%
de [-0.40, -0.47]. Comparado con los resultados obtenidos por el trabajo de
Sehgal, el efecto de Bohr es mucho menor. Existen dos posibilidades por las
cuales se da este resultado: la primera, como se explica en el numeral 5.1.1.1. el
grado de polimerización varia el efecto de Bohr, debido a que los grupos amino
terminales, histidina y cisteina, de la hemoglobina son responsables del control del
efecto de Bohr, y son también las responsables en la reacción de polimerización
con el glutaraldehido, sufriendo modificaciones y por lo tanto disminuyendo el
90 Referencia 9
IQ-2003-02-08
165
efecto de Bohr91. La segunda posible explicación es que los tres puntos de las tres
curvas de disociación de oxígeno a diferentes pH’s no son significantes para
realizar la regresión lineal que determina el efecto de Bohr, y por lo tanto mas
curvas de disociación de oxígeno entre pH’s variando desde 6 hasta 8 deben ser
construidas, y el espectro de pH utilizado entre 6.8 y 7.2 no es lo suficientemente
amplio para determinar de una manera más precisa el efecto de Bohr de esta
hemoglobina libre de estroma piridoxilada y polimerizada. Desafortunadamente, el
numero de pruebas realizadas no fue el deseado y el numero de curvas de
disociación de oxígeno no es el necesario para este calculo del efecto de Bohr.
Por esta razón, mas pruebas deben ser llevadas acabo, y calcular el efecto de
Bohr nuevamente para comparar los resultados con los obtenidos en el trabajo de
Sehgal.
5.1.1.4. P50
El proceso de piridoxilación es el responsable de el aumento del P50 a niveles
muchos mas cercanos a los del plasma normal (28 mmHg). Durante el proceso de
piridoxilación, ningún tipo de prueba fue llevada acabo para demostrar que este
proceso estaba ocurriendo de la manera como se deseaba y poder monitorearlo.
Por lo tanto, solo hasta el finadle los proceso de piridoxilación y de polimerización,
cuando las curvas de disociación de oxígeno fueron obtenidas, se obtuvo
91 Referencia 9
IQ-2003-02-08
166
información acerca del proceso de piridoxilación. El P50 es una medida indirecta
del proceso de piridoxilación, ya que este es el que se ve afectado cuando este
proceso es llevado acabo correctamente. Existen otros procedimientos directos
como la electroforesis en geles de acetato de celulosa en EDTA-Tris-borato,
donde la fase de hemoglobina piridoxilada migra mas rápidamente que la fase de
hemoglobina no modificada por la piridoxilación, y se puede determinar el grado
de piridoxilación de la hemoglobina libre de estroma92. Desafortunadamente no
existió la posibilidad de realizar esta prueba durante el proceso de piridoxilación.
El P50 obtenido en este trabajo se encuentra en el intervalo de confianza del 95%
de [15.6 – 16.6]. De todas maneras, cuando se comparan los resultados finales de
los tres autores en la tabla 21 con el presente trabajo, el P50 obtenido cae en el
intervalo obtenido por el trabajo de Chang y es mayor al resultado obtenido por el
trabajo de Sehgal. Esto muestra que el proceso de piridoxilación fue llevado acabo
satisfactoriamente con niveles de piridoxilación comparables a el trabajo de Chang
y mayores a el trabajo de Sehgal. De todas maneras pruebas para determinar la
cinética de la reacción de piridoxilación y la obtención de mayores ratas de
piridoxilación con el fin de elevar al máximo el P50 deben ser llevadas acabo.
5.1.1.5. pH
92 Referencia 5
IQ-2003-02-08
167
El resultado final de pH se encuentra en el intervalo de confianza del 95% de [6.98
- 7.35]. Aunque el resultado final se encuentra por debajo de los niveles normales
del plasma de 7.35 a 7.45, esto no representa ningún problema ya que el pH
puede ser modificado con la adición de una base o un ácido como se explico
anteriormente. También puede ser dejado en diálisis por un mayor tiempo,
cambiando la solución dializadora dos o mas veces hasta nivelar el pH al punto
deseado o se puede llevar acabo una hemodiálisis con el equipo de diálisis como
es utilizado en este trabajo cuando las cantidades producidas sean mayores a las
actuales y los volúmenes sean manejables por un equipo como este.
5.1.1.6. Viscosidad
El resultado final de la viscosidad se encuentra en un intervalo de confianza del
95% de [4.53 – 5.57] cp. Aunque el resultado final es comparable con el de la
sangre normal93, preocupaciones concernientes a efectos cardiacos han sido
propuestos. De todas maneras, la viscosidad es dependiente del tamaño de
partícula de la macromolécula de hemoglobina libre de estroma piridoxilada
obtenida durante la polimerización, proceso que es controlable. Futuras
manipulaciones serán dirigidas a la obtención de tamaños de partícula mas
pequeños y por lo tanto viscosidades controlables.
IQ-2003-02-08
168
Actualmente en la Universidad de California en San Diego, se esta llevando a
cabo un estudio para determinar el efecto de los perfiles de velocidades
generados por diferentes hemosustitutos comparados por el perfil generado por la
sangre normal, ya que existe una hipótesis en la cual el perfil de velocidad afecta
de manera significativa la oxigenación en los diferentes capilares y vasos
sanguíneos del cuerpo humano, y la viscosidad es una variable de la cual
depende el perfil de velocidad generado. Seria interesante ver los resultados de
esta investigación y modificar la solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada para que los perfiles generados por este tipo de
transportador de oxígeno intravascular sean los apropiados.
5.1.1.7. Densidad
Las pruebas de densidad dieron como resultado un intervalo de confianza del 95%
de [0.9 – 1.3] g/cm3, el plasma normal tiene una densidad94 de 1.6 g/cm3. La razón
que explica este resultado, es que la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada no tiene la presencia de otras proteínas como la albúmina, que
ayudan a aumentar su densidad. Esto no debe tener efectos fisiológicos
importantes como no lo tienen otras soluciones intravasculares como la solución
salina y el lactato de Ringer.
93 Referencia 9
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169
5.1.2. Estudio de comparación de costos de obtención
La siguiente tabla (tabla 23) describe todos los reactivos utilizados, sus cantidades
y su costo, sin incluir los costos de los equipos usados durante los procesos de
purificación de hemoglobina, piridoxilación de hemoglobina libre de estroma y
polimerización de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada.
Tabla 23. Costo de los reactivos usados durante la producción de una unidad de hemoglobina libre
de estroma piridoxilada y polimerizada.
Reactivo PresentaciónPrecio en dólares
Cantidad usada
Precio en dólares
NaOH 12 kg $101.40 2.4 g $0.02
TRIS HCl 5 kg $418.95 43.72 g $3.66
Piridoxal 5’ phosphate 25 g $159.05 1.26 g $8.01
HCl 18 L $34.00 20 ml $0.04
NaBH4 500 g $98.45 0.917 g $0.18
Nitrogeno 6.5 m3 $30.00 1.5 m3 $6.92
Lisina monohidroclorato 5 Kg $183.95 30.95 g $1.14
glutaraldehido 3L $97.90 8 ml $0.26
Hemoglobina libre de estroma95 1 unidad $19.00 1 unidad $19.00
Glutationa 25 g $76.20 1.75 g $5.33
Glucosa 5 kg $73.10 1 g $0.01
ácido ascórbico 2 kg $110.20 0.25 g $0.02
Lactato de Ringer unidad $1.00 50 unidades $50.00
TOTAL $94.59
94 Referencia 19 95 Referencia 4
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170
Como se menciono anteriormente, el costo final de una unidad de sangre donada
después de todas la pruebas clínicas es de alrededor de U$ 250 dólares,
comparado con los U$ 94.59 dólares de la hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada. Para una planta de producción de este tipo de
producto, alrededor del 50% de los costos de producción son los costos de los
reactivos. Esto significa que una unidad de sangre donada cuesta alrededor de U$
60.82 dólares mas que una unidad de hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada, esto con reactivos de grado biológico y no de grado U.S.P. que son
muchos mas económicos y las cantidades utilizadas no son significantes para una
reducción en el precio por parte del fabricante. además este tipo de transportador
de oxígeno intravascular tiene las ventajas de ser almacenado hasta por 3 años96,
no tiene ningún tipo de problema referente al tipo de sangre del paciente, puede
ser liofilizado y almacenado en polvo e inclusive transportado en las ambulancias y
reconstituido antes de su uso con solución salina y no presenta ningún tipo de
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171
6. CONCLUSIONES Y COMENTARIOS
Un transportador de oxígeno intravascular debe tener la capacidad normal de
transporte de oxígeno. Los procesos de piridoxilación y polimerización llevados
acabo en este trabajo normalizan la concentración de hemoglobina total mientras
mantiene la capacidad de transporte de oxígeno, la osmolaridad y otras variables
físico-químicas comparables a la sangre total. Esto hace de este transportador de
oxígeno intravascular un excelente sustituto de la sangre donada.
Auque el proceso de piridoxilación fue llevado acabo satisfactoriamente como se
ve en el resultado del P50, que es comparable a los datos obtenidos por los
trabajos de Chang y Sehgal, ni hubo un método directo para controlar y determinar
el grado de piridoxilación obtenido después de las 12 horas de desoxigenación
con nitrógeno y reducción del piridoxal 5’ fosfato con NaBH4, para lograr la unión
covalente entre las dos subunidades β de la hemoglobina. Existe un método
directo para la determinación del grado de piridoxilación obtenida durante el
proceso, y no tener que esperar hasta la obtención de curvas de disociación de
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172
oxígeno. Este método esta basado en una electroforesis en gel de acetato de
celulosa en un buffer de EDTA-Tris-borato a un pH = 8. La fracción piridoxilada
migra a una rata de velocidad mucho mayor que la fracción no piridoxilada de
hemoglobina97. Se recomienda la adquisición de este tipo de tecnología para
determinar el grado de piridoxilación y poder calcular la cinética del proceso de
piridoxilación, para que se puedan optimizar los costos y los tiempos de
producción de hemoglobina libre de estroma piridoxilada pensando en un escalado
a nivel industrial de todo el proceso de producción de hemoglobina libre de
estroma piridoxilada y polimerizada. Normalmente el grado de piridoxilación
obtenido es alrededor del 70%83. Las dos fracciones de hemoglobina pueden ser
separadas por lotes en DEAE-Sephadex a diferentes pH’s, esto puede ser un
buen método para la obtención de una mayor rata de piridoxilación cercana al
100%, que incrementara el P50 de la solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada a niveles mas cercanos a los de la sangre normal.
De todas maneras, aunque en comparación con la sangre, el P50 obtenido es bajo,
alrededor de 16 mmHg de la hemoglobina libre de estroma piridoxilada y
polimerizada contra 28 mmHg de la sangre normal, se ha demostrado en pruebas
in vivo que este P50 permite una liberación de oxígeno adecuada a los tejidos en
97 Referencia 5
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173
ausencia de una membrana que recubra la hemoglobina como en el caso de los
glóbulos rojos98.
Otro inconveniente durante el proceso de piridoxilación es la producción de
espuma, se recomienda para pruebas futuras, que un sistema antiespumante sea
diseñado para el proceso. Esto requiere de un detector de espuma, una bomba de
desplazamiento positivo y un reservorio con un antiespumante que no genere
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174
estroma piridoxilada y polimerizada. La presión osmótica es un parámetro indirecto
de esta medida de presión osmótica coloidal ya que también los iones libres en la
solución ejercen presión osmótica haciendo de la medición de la presión oncótica
inexacta.
Los procesos de piridoxilación y polimerización de la hemoglobina libre de estroma
deben ser llevados acabo a 4°C para controlar la formación de metahemoglobina.
Esta atmósfera se logro con la ayuda de un pequeño refrigerador con el set-point
de temperatura a 4°C. además no hubo ningún tipo de condiciones estériles
durante los procesos de purificación de la hemoglobina, la piridoxilación de la
hemoglobina libre de estroma y la polimerización de la hemoglobina libre de
estroma piridoxilada. Se recomienda la adecuación de un laboratorio a estas
condiciones de temperatura y esterilidad para la consecución de dichos procesos,
o al menos pasar la solución de hemoglobina libre de estroma a través de un filtro
estéril de 22 mm y realizar pruebas de esterilidad con muestras sobre agar e
inoculación con tioglicolato antes de realizar las pruebas animales subsecuentes.
El proceso para la determinación de las curvas de disociación de oxígeno es un
poco inexacto y requiere de demasiado tiempo para su obtención. Esto se debe a
que cuando las muestras que son analizadas posteriormente en el analizador de
gases arteriales son tomadas con la jeringa, aunque se hicieron con cuidado,
existe la posibilidad de que entre en contacto con el oxígeno presente en el aire y
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175
la pO2 fuera modificada y por lo tanto diferente a la presente en los tanques de
gases de tonometría, y como el analizador de gases arteriales no determina la
pO2, el nivel de saturación no era conocido exactamente. Lo que se hizo fue
predecir a la concentración de oxígeno suministrado el nivel de saturación de
oxígeno con las curvas de disociación presentadas por Chang, si los resultados
eran parecidos esa prueba era utilizada, de lo contrario era descartada, por esta
razón muchas muestras tuvieron que ser repetidas por inconsistencia en sus
resultados de saturación de oxígeno. Existen en el mercado equipos para la
determinación de curvas de disociación de oxígeno, como por ejemplo el Hemo-O-
scan o el Hemoxanalyzer. Se recomienda adquirir esta tecnología para futuras
experimentaciones para obtener curvas de disociación de oxígeno mas exactas y
de mayor confianza a las que se obtienen actualmente, además de que son
pruebas realizadas en minutos y no en días como las realizadas en este trabajo.
Existe otro tipo de prueba mucho mas precisa que la presentada por estos
equipos, es un método enzimático para la obtención de curvas de disociación de
oxígeno desarrollado por medio de métodos enzimáticos99, el cual puede ser
implementado en Colombia con la tecnología existente en La Universidad de Los
Andes.
Aunque este es el comienzo para el desarrollo de transportadores de oxígeno
intravasculares basados en hemoglobina modificada en Colombia, los resultados
99 Referencia 20
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176
iniciales son comparables a los parámetros obtenidos por otros autores, y por lo
tanto extremadamente satisfactorios. Existen ciertos requerimientos mencionados
anteriormente, especialmente en la adquisición de tecnología para la
determinación mas precisa de diferentes parámetros y la infraestructura para llevar
acabo este tipo de experimentos.
La determinación del peso molecular promedio de la Poly-PLP-SFHb necesario de
calcular para la determinación de la cinética de polimerización, no tuvo los
resultados deseados. La hipótesis de falla es la utilización de hemoglobina libre de
estroma piridoxilada conservada en frío durante 8 meses. también una segunda
posible razón, es la electroforesis en SDS-PAGE, por razones no conocidas,
ningún grupo a nivel internacional realiza la determinación del peso molecular por
medio de electroforesis, sino por medio de cromatografía en gel de Sephadex.
Desafortunadamente por falta de presupuesto, esta prueba de cromatografía no se
pudo realizar por los costos que tiene el gel en Colombia. Actualmente estamos
esperando financiación de Colciencias y del Banco de la Republica para la
determinación de la cinética y para nuevos procesos de modificación de
hemoglobina como la encapsulación de membranas de fosfolípido y biopolímero
fabricando así glóbulos rojos artificiales. también para la adecuada determinación
de la cinética, se debe estudiar tanto la aparición de macromoléculas de
hemoglobina, como la desaparición del agente de polimerización utilizado, que en
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177
este caso es el glutaraldehido. Nuevamente se recomienda la adquisición de los
equipos y reactivos necesarios para esta determinación.
Un punto muy importante para discutir es el costo de producción de este tipo de
transportadores de oxígeno intravascular, como se puede ver, el costo de
producción de una unidad de solución de hemoglobina libre de estroma
piridoxilada y polimerizada es menor que el costo de una unidad de sangre
donada, sin mencionar que son mucho mas seguras y accesibles.
Trabajo futuro en este tema incluye: producción de hemoglobina conjugada,
producción de hemoglobina encapsulada, obtención de diferentes fuentes de
hemoglobina como de origen bovino o recombinante, pruebas in Vitro y pruebas
animales, con el fin de desarrollar un numero limitado de formulaciones para ser
llevado a pruebas clínicas y comparar entre todos los tipos de transportadores de
oxígeno intravascular basados en hemoglobina modificada, cual es mas factible
para las capacidades y condiciones tecnológicas y de salud presentes en
Colombia. Es el deseo de este autor, del Grupo de Ingeniería Biomédica de La
Universidad de Los Andes y del departamento de Ingeniería Química de La
Universidad de Los Andes, que estas investigaciones sean continuadas, para el
futuro desarrollo a escala industrial de transportadores de oxígeno intravascular en
Colombia y ser lideres en Latinoamérica y en el mundo en este tema. Estudios
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178
posteriores en este tema parecen garantizados debido a los resultados obtenidos
hasta ahora.
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179
Apendice I. Diagrama de flujo del proceso de piridoxilación.
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180
Apendice II. Diagrama de flujo del proceso de polimerización
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181
Apendice III. Datos de cooximetria de las muestras de polihemoglobina, 3
repeticiones para la determinación de la desviación estandar.
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182
Apéndice IV. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de
oxigeno a pH = 7.166
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183
Apéndice V. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de
oxigeno a pH = 6.961
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184
Apéndice VI. Datos de cooximetria para calculo de curva de disociación de
oxigeno a pH = 6.824
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185
ANEXO I. Datos de certificado de análisis de gases de los tanques tonometrados
para la obtención de curvas de disociación de oxigeno (Oxígenos de Colombia).
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191
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