INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
“Diseño de metagenómica funcional de
consorcios microbianos tolerantes a glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES
Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA:
AMÉRICA JAZMÍN COTA ÁLVAREZ
GUASAVE, SINALOA; MÉXICO ENERO 2021
II
CARTA CESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de Guasave, Sinaloa el día 07 del mes enero del año 2021, el que
suscribe América Jazmín Cota Álvarez alumna del Programa de Maestría en Recursos
Naturales y Medio Ambiente, con número de registro B180507, adscrito a CIIDIR
Unidad Sinaloa, manifiesto que es el autora intelectual del presente trabajo de Tesis
bajo la dirección de los Dr. José Luis Acosta Rodríguez, y cede los derechos del trabajo
titulado “Diseño de metagenómica funcional de consorcios microbianos tolerantes a
glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós”, al Instituto Politécnico Nacional para su
difusión, con fines académicos y de investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas
o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o directores del trabajo. Este
puede obtenerse escribiendo a las siguientes direcciones [email protected] y
[email protected]. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el
agradecimiento correspondiente y citar la fuente de este.
_____________________________
América Jazmín Cota Álvarez
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
III
IV
V
RECONOCIMIENTO A PROYECTOS Y BECAS
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola
del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional
(CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección del
Dr. José Luis Acosta Rodríguez. El presente trabajo recibió financiamiento a través del
de proyectos SIP-IPN con el número de registro 20170193 y 20195561, y recursos de
Proyectos de Desarrollos Tecnológicos o Innovación IPN2019 B180507 brindando
apoyo para la realización de estancia de investigación en el extranjero y fondos para
materiales de laboratorio. En el periodo estancia de maestría, la alumna América
Jazmín Cota Álvarez CVU 428184, recibió apoyo beca CONACYT con numero de
apoyo 728842 y financiamiento movilidad extranjera-2019 CONACYT BECA MIXTA
no. 000016-01NACF-03684, y fondos de beca BEIFI-IPN2019-2020.
VI
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Agrogenómica,
Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación
para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico
Nacional (IPN), agradezco en primera instancia al Instituto y a mi director de tesis el
Dr. José Luis Acosta Rodríguez por depositar su confianza en mí para formar parte del
del gran equipo de Agrogenómica, como también reconocimiento por sus
aportaciones, consejos, paciencia y el apoyo brindado a lo largo de mi estancia de
maestría, gracias por forjar y contribuir a mi formación académica.
Al Laboratorio de Biología de Sistemas del Centro Nacional de Biotecnología
(CNB) del Consejo Superior de Investigación Científica (CSIC)-Madrid, España, por
facilitar movilidad estancia en el extranjero con objetivo de desarrollar algunas
metodologías, estableciendo una colaboración con el Dr. Juan Nogales Enrique
agradezco sus aportaciones acertadas y la confianza depositada.
Así como también, me permito agradecer a las diferentes personas que
contribuyeron durante el desarrollo de dicho trabajo.
Al Comité Tutorial integrado por Dra. María Nancy Herrera Moreno, Dr. Jesús
Arturo Fierro Coronado, Dr. Jorge Montiel Montoya y Dra. Josefina León Félix, muchas
gracias por sus contribuciones, su invaluable tiempo y su apoyo.
Por apoyo técnico otorgado agradezco al MC. Mariela Guadalupe Espinoza
Mancillas, Dr. Jesús Arturo Fierro Coronado y MC. Julián Alberto Galaviz Lara.
Al Dr. Blas Blázquez Castiñeira por su asesoría, apoyo técnico, por su atención
prestada y por su apoyo durante la realización de mi estancia en CNB.
Al equipo del Laboratorio de Laboratorio de Agrogenómica, Departamento de
Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo
Integral Regional (CIIDIR).
VII
DEDICATORIA
En principio debo agradecer y dedicar a Dios y a mis padres mi día a día, con
todo el amor, admiración y respecto a Mario Guadalupe Cota y Rosa María Álvarez,
por forjar en mí el carácter de lucha, de trabajo, de esfuerzo, por guiarme, por su apoyo
incondicional en todo este proceso, por creer en mí, este logro lo quiero compartir con
ustedes. ¡Muchas gracias!
A mis tres pedacitos, mis hermanas a las que amo con todo mi corazón: Ivonne,
Yarentzy y María Rosa, por estar siempre conmigo acompañándome en cada
proyecto, por jugar ese papel super bien de hermanas mayores de forma
extraordinaria, por siempre mil gracias por formar parte de mi historia personal, de
tantos momentos y recuerdos. ¡Siempre juntas cuatro de cuatro!
A mis retoños más pequeños; Mariam Camila, Cesar Mateo, Amanda Isabel y
Luis Emilio. Siendo los sobrinos, una hermosa distracción, en particular a mi
“Chiquichi”. Además, hago un espacio a tan especial cuñado, Erick Romero.
A mis tíos Felipe Álvarez y Lucila Ulloa, y a mi primo consentido Felipito, gracias
por la patadita de suerte para mi estancia, en especial tía Luci mil gracias por el detalle
esos 10 € y mi cadenita, cada vez que los miraba en esa cajita me recordaban mi
sueño, ¡te quiero mucho!
¡A toda mi familia gracias!
A mi prima Macoche +, tío “Tato” +, son las estrellas que más brilla en el cielo,
comparto mi trabajo con ustedes sé que lo interpretarían y compartirían esta pación.
En particular a Gabriela Báez “coma” mi hermana, gracias por asistirme en tu
casita cuando tenía que quedarme hasta tarde en Guasave, gracias por compartir tu
comida, tu espacio, tus hijos, tu familia conmigo, sé que lo haces con el corazón. Otra
persona muy muy especial Stephania Perry, en la distancia, pero siempre juntas
gracias por tus videollamadas, gracias por acompañarme en este proceso.
VIII
A Gabriela, Arturo, Goretty, Roxana, Stephanie, Gisel, Joseline, Areli, Carolina,
Yamel y Priscila gracias por su amistad incondicional.
A una persona espacial Bertha Altamirano, gracias por tus consejos, por
acompañarme y por tu cariño.
A mis compañeros de maestría Mario Mario, Dulce y Héctor gracias por
escucharme y acompañarme compartiendo este proceso.
En este tiempo conocí a los Guachupines, gracias por recibirme en su país,
siempre presente en mis recuerdos con mucho cariño, gracias por formar parte de esto
“tus cepitas” mis guachupinas; Lety, Manuela e Inmaculada, ¡gracias por todo! Así
como también a Dani “marroquí” y a la chica 100 % “madrileña” Martha.
A una persona muy especia 23.09.2019 “Siempre Juntos”.
Son muchas las personas especiales a las que me gustaría agradecer su
amistad, apoyo, ánimo y compañía en las diferentes etapas de mi vida. Algunas están
aquí conmigo y otras en mis recuerdos y en mi corazón. Sin importar en dónde estén
o si alguna vez llegan a leer estas dedicatorias quiero darles las gracias por formar
parte de mí, por todo lo que me han brindado y por sus bendiciones.
América Cota
IX
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1
II. ANTECEDENTES ............................................................................................... 5
2.1 Agricultura en el noroeste de México ......................................................... 5
2.1.1 Principales Cultivos en Sinaloa .......................................................... 6
2.1.1.1 Cultivo Maíz (Zea mays) ............................................................ 6
2.1.1.2 Cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) .................................. 6
2.1.2 Principal cultivo en Sonora ................................................................. 7
2.1.2.1 Cultivo de Trigo (Triticum sp.) .................................................... 7
2.2 Control de plagas ....................................................................................... 8
2.3 Generalidades Plaguicida ........................................................................... 9
2.4 Clasificación de los Plaguicidas ............................................................... 12
2.5 Plaguicida, Suelo, Medio Ambiente y Salud ............................................. 15
2.6 Plaguicidas seleccionados ....................................................................... 18
2.6.1 Glifosato ........................................................................................... 18
2.6.1.1 Impacto por el uso de Glifosato ............................................... 20
2.6.1.2 Degradación de glifosato por microorganismos ....................... 20
2.6.2 Carbofurán ....................................................................................... 24
2.6.2.1 Impacto por el uso de Carbofurán ........................................... 25
2.6.2.2 Degradación de carbofurán por microorganismos ................... 25
2.6.3 Permetrina ....................................................................................... 27
2.6.3.1 Impacto por el uso de Permetrina ............................................ 28
2.6.3.2 Degradación de permetrina por microorganismos ................... 29
2.6.4 Clorporifós ........................................................................................ 32
2.6.4.1 Impacto por el uso de Clorpirifós ............................................. 33
2.6.4.2 Degradación de clorpirifós por microrganismos ....................... 35
2.7 Consorcios microbianos ambientales y sintéticos .................................... 39
2.8 Metagenómica Funcional ......................................................................... 42
III. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 44
IV. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 45
V. OBJETIVOS ..................................................................................................... 46
Objetivo General ............................................................................................... 46
Objetivos Específicos ........................................................................................ 46
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 47
6.1 Antecedentes Proyecto (SIP20170193) ................................................... 47
6.2 Producto Químico ..................................................................................... 56
X
6.3 Etapa I ...................................................................................................... 56
6.3.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y
trigo del noroeste de México. ................................................................... 56
6.3.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de
papa (Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum) ...... 56
6.3.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas aislados. .................. 57
6.3.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm
glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.58
6.4 Etapa II ..................................................................................................... 59
6.4.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurá y
glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). .. 59
6.4.1.1 Extracción de ADN .................................................................. 59
6.4.1.2 Amplificación de ADN mediante PCR ...................................... 59
6.4.1.3 Secuenciación ......................................................................... 61
6.4.1.4 Análisis filogenético16S rRNA ................................................. 61
6.5 Etapa III .................................................................................................... 62
6.5.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas
con mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas. ................................... 62
6.5.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes
concentraciones de glifosato. ............................................................... 62
6.5.1.2 Comparación de un consorcio nativo (aislado ambiental) contra
un consorcio artificial en diferentes concentraciones de glifosato ........ 64
6.6 Etapa IV .................................................................................................... 65
6.6.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica
funcional dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas. ....... 65
6.6.1.1 Construcción de la base de datos de genes asociados a la
degradación de plaguicidas .................................................................. 65
VII. RESULTADOS ................................................................................................. 66
7.1 Etapa I ...................................................................................................... 66
7.1.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y
trigo del noroeste de México. ................................................................... 66
7.1.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de papa
Solanum tuberosum L., maíz (Zea mays) y trigo (Triticum) .................. 66
7.1.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas aislados. .................. 69
XI
7.1.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm
glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.76
7.2 Etapa II ..................................................................................................... 78
7.2.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán
y glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). . 78
7.3 Etapa III .................................................................................................... 81
7.3.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas
con mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas. ................................... 81
7.3.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes
concentraciones de glifosato. ............................................................... 81
7.4 Etapa IV .................................................................................................... 86
7.4.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica
funcional dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas. ....... 86
VIII. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 90
IX. CONCLUSIONES ........................................................................................... 101
X. PERSPECTIVAS ............................................................................................ 102
XI. BIBLOGRAFÍA .............................................................................................. 103
XII. ANEXOS ......................................................................................................... 125
XII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Consumo anual total de plaguicidas (1990-2017) a nivel mundial. ........ 10
Figura 2. Distribución del consumo anual para 2017 a nivel mundial representado
en toneladas ........................................................................................... 11
Figura 3. Localización de los sitios identificados en los que se reporta la presencia
y niveles medidos de plaguicidas. .......................................................... 17
Figura 4. Estructura química glifosato; nombre IUPAC [Ácido 2- (fosfonometilamino)
acético] ................................................................................................... 19
Figura 5. Vías metabólicas del glifosato en bacterias............................................ 22
Figura 6. Estructura química de carbofurán; nombre IUPAC [3-hidroxi-2,2-bis
(trideuteriomethyl) -3 H -1-benzofuran-7-il] N metilcarbamato ............... 25
Figura 7. Estructura molecular de permetrina; nombre IUPAC [3- (2,2-dicloroetenil)
-2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo] ............. 28
Figura 8. Vías de degradación microbiana propuestas para piretroides tipo I
representativos. R1 representa diferentes grupos sustituyentes en los
piretroides tipo I ...................................................................................... 30
Figura 9. Árbol filogenético de enzimas funcionales clave involucradas en la
degradación de los piretroides. .............................................................. 31
Figura 10. Estructura molecular de clorpirifós; nombre IUPAC [dietoxi-sulfaniliden-
(3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] ............................................... 33
Figura 11. Vía propuesta para la degradación aeróbica de clorpirifós por bacterias.
............................................................................................................... 37
Figura 12. Vía propuesta para la degradación anaeróbica de clorpirifós ................ 38
Figura 13. Estrategias para seleccionar a los miembros del consorcio ................... 41
Figura 14. Área de estudio ...................................................................................... 48
Figura 15. Aislados de microorganismo de suelos .................................................. 52
Figura 16. Histograma de la abundancia bacteriana de la metagenómica de los tres
sitios muestreados. ................................................................................ 55
Figura 17. Diagrama de ubicación de cebadores de la región 16S rRNA. .............. 60
XIII
Figura 18. Morfología de cepas aisladas de suelos ................................................ 67
Figura 19. Prueba de Hemólisis. ............................................................................. 68
Figura 20. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Guasave (cultivos de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y
Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 70
Figura 21. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Culiacán (cultivos de maíz) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y
Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 71
Figura 22. Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifó
Etil; MM9 200 ppm. ................................................................................ 72
Figura 23. Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de Navojoa
(cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós Etil;
MM9 200 ppm. ....................................................................................... 73
Figura 24. Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de
Guasave (cultivo de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y
Clorpirifós Etil; MM9 200 ppm. ............................................................... 74
Figura 25. Cladograma del alineamiento de secuencias nucleotídicas. Aislados con
capacidad de tolerancia a carbofurán y glifosato Grupo II (por
secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA). .................................... 79
Figura 26. Dendograma aislados identificados asociados a su capacidad de
tolerancia. ............................................................................................... 80
Figura 27. Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium GVE7
y GVE 19 ................................................................................................ 83
Figura 28. Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium cultivo
mixto (Consorcio) ................................................................................... 84
Figura 29. Gráfica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo mixto curva
de crecimiento a 5000 ppm. ................................................................... 85
XIV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas en función de su toxicidad aguda ......... 13
Tabla 2. Clasificación por grupo químico y su modo de acción ............................ 14
Tabla 3. Caracterización del suelo de los puntos de muestreo de los municipios de
Guasave, Culiacán y Navojoa con base a la norma NOM-AA-021-
2001. ...................................................................................................... 49
Tabla 4. Patrones usados para identificación de plaguicidas en suelos de Guasave
............................................................................................................... 50
Tabla 5. Cepas aisladas de los diferentes sitios (Guasave, Culiacán y Navojoa) 53
Tabla 6. Tolerancia a diferentes plaguicidas ........................................................ 54
Tabla 7. Muestras positivas de hongos y bacterias a mix de plaguicidas a 200 y
100 µL/L ................................................................................................. 54
Tabla 8. Diseño experimental ............................................................................... 58
Tabla 9. Cuadro descripción de los cebadores para las regiones de 16S rRNA .. 60
Tabla 10. Condiciones de amplificación de ambas regiones 16S rRNA................. 60
Tabla 11. Diseño Experimental; tratamientos para evaluar M9 3aa+0.2%FC+1vit; 0-
10000 ppm Glifosato; Cepas A y B; Consorcio ...................................... 64
Tabla 12. Prueba de hemólisis de bacterias aisladas Guasave, Culiacán y
Navojoa .................................................................................................. 68
Tabla 13. Cepas del total de los sitios clasificación determinada por las pruebas de
tolerancia al total de los plaguicidas. ...................................................... 75
Tabla 14. Ensayo aumento de concentraciones de plaguicida a 5000 ppm y 10000
ppm de las cepas que presentaron tolerancia a 200 ppm (Grupo I) ....... 77
Tabla 15. Base de datos vías de degradación asociadas a genes de degradación
para Carbofurán, Glifosato, Clorpirifós y Permetrina. ............................. 87
Tabla 16. Diseño de primers para la aplicación metagenómica ............................. 88
XV
GLOSARIO
ADN (ÁCIDO DESOXIRIBONUCLEICO). Es una molécula de ácido nucleico
que basan en largas cadenas de desoxiribunucleótidos polimerizados. En una cadena
doble de ADN, ambas hebras se mantienen unidas a través de enlaces puente de
hidrógeno entre los pares de bases de nucleótidos complementarios.
BIOENSAYO DE TOXICIDAD. Prueba para establecer la magnitud y la
naturaleza del efecto que producirá un agente químico sobre organismos expuestos a
él bajo condiciones específicas.
DEGRADACIÓN. Proceso de descomposición de la materia, por medios físicos,
químicos o biológicos.
ENZIMA. Proteína producida por células vivas que puede catalizar una reacción
química.
GEN. Porción lineal de un cromosoma que determina o condiciona uno o más
caracteres hereditarios. La unidad funcional más pequeña del material genético.
GENOMA. Toda la información genética contenida en una célula u organismo.
MARCADOR GENÉTICO. Segmento de ADN cuya herencia se puede rastrear.
Puede ser un gen o un segmento sin función conocida. Dado que las secuencias de
ADN que se encuentran contiguas en un cromosoma tienden a heredarse juntas, los
marcadores se usan como formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de genes
que aún no se han identificado, pero cuyas ubicaciones aproximadas se conocen.
METAGENÓMICA. Estudio directo de todo el material genético de las muestras
obtenidas en un determinado entorno biológico evitando la necesidad de aislamiento
y cultivo individual.
MICROGRAMO (µg). Unidad de masa equivalente a 0.001 miligramo (mg) y/o
0.000001 gramos (g).
XVI
PARTES POR MILLÓN (ppm). Proporción de la concentración de una
sustancia con respecto a la concentración de otra, como una unidad de soluto disuelta
en un millón de unidades de disolvente. Se puede expresar también en términos de
peso-peso, volumen-volumen o en cualquier otra relación de unidades de medida.
PLAGUICIDA. Sustancia o agente que destruye un grupo determinado de
organismos indeseables.
SIMBIOSIS. Forma de interacción biológica que hace referencia a la relación
estrecha y persistente entre organismos de distintas especies. La interacción biológica
puede ser mutualista, cuando ambos miembros obtienen beneficio, comensal, cuando
uno de los miembros de la simbiosis obtiene beneficio sin generar perjuicio al otro, y
parasitaria, cuando uno de los miembros de la simbiosis obtiene beneficio en
detrimento del otro.
SUELO AGRÍCOLA. Suelo dedicado a la producción de cultivos, forrajes y
pastos cultivados. Es también aquel suelo con aptitud para el crecimiento de cultivos
y el desarrollo de la ganadería. Esto incluye tierras clasificadas como agrícolas, que
mantienen un hábitat para especies permanentes y transitorias, además de flora y
fauna nativa, como es el caso de las áreas naturales protegidas.
TOLERANCIA. Capacidad de una cepa bacteriana de no ser eliminada por un
antibiótico a concentraciones relativamente altas, aunque puede inhibirse a
concentraciones muy inferiores.
XENOBIÓTICO. Compuesto químico elaborado por el hombre o material no
producido por la naturaleza y no considerado de manera normal como un componente
de un sistema biológico.
XVII
RESUMEN
La región noroeste del país representa el 20.9% de esta producción, debido a
empresas agrícolas producción comercial de grandes volúmenes. Sinaloa y Sonora
están dentro de los primeros lugares de los estados con mayor producción. Los
principales cultivos en la región son papa, maíz y trigo, éstos en relación con el uso y
aplicación de plaguicidas específicamente para cultivos de granos es necesario utilizar
productos fitosanitarios que permitan mantener la producción bajo un sistema de
monocultivo. Por otro lado, la actividad agrícola que aplica más plaguicidas por
hectáreas es el cultivo de papa. El uso indiscriminado de plaguicidas como glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós altamente tóxicos y acumulables en suelo, agua
subterránea y manto freático, ha generado impactos ambientales y problemas de salud
al ser humano. Para atender este problema se han generado soluciones en función de
microorganismos con capacidad de degradar estos contaminantes. Por tanto, el
objetivo de la presente investigación fue identificar y caracterizar la capacidad de
tolerancia (CT) a diferentes concentraciones de glifosato, carbofurán, permetrina y
clorpirifós de cepas aisladas de suelos agrícolas. La primera etapa partiendo de 86
aislados no identificados estos se sembraron a concentraciones de 200 ppm de cada
molécula, se clasificaron en función de su CT. Grupo I paso a ensayos a
concentraciones de 5000 ppm y 10000 ppm. Se tienen identificadas las cepas del
Grupo II: se seleccionaron aquellas que presentaron tolerancia a dos plaguicidas en
específico carbofurán y glifosato reportadas como Bacillus subtilis, Bacillus
megaterium, Bacillus toyonensis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus
aryabhattai y Bacillus velenzensis. Se valoró la curva de crecimiento bacteriano del
consorcio artificial (GVE7 y GVE19) ambas Bacillus megaterium en función CT a
concentraciones de 250 a 10000 ppm glifosato como única fuente de carbono estas
presentaron una tolerancia a 5000 ppm valoradas en 24h y se logró validar el método
de valoración en placa como prueba de tolerancia. Por otra parte, diseño de
metagenómica funcional dirigida a un panel de cuatro genes mcd, phnJ, cpd y estP, el
primer diseño de cebadores para apuntar más de un gen asociados a la degradación
para varias familias de plaguicidas en particular para especies del género de Bacillus.
XVIII
Estos resultados sugieren desarrollar cinética de degradación, combinación variable
de consorcios, dejando las bases para el desarrollo de un consorcio con potencial de
aplicación biotecnología en la degradación de estos plaguicidas, así como también
determinar el potencial de degradación para carbofurán, glifosato, clorpirifós y
permetrina en diferentes ambientes.
XIX
ABSTRACT
The northwest region of the country represents 20.9% of this production, due to
agricultural companies whose objective is the commercial production of large volumes.
Sinaloa and Sonora are among the first places of the states with the highest production.
The main crops in the region are potato, corn, and wheat. In relation to the use and
application of pesticides specifically for grain crops, it is necessary to use phytosanitary
products that allow production to be maintained under a monoculture system. On the
other hand, potato cultivation is one of the agricultural activities that consumes the most
pesticides per hectare. The indiscriminate use of pesticides such as glyphosate,
carbofuran, permethrin and chlorpyrifos, which are highly toxic and can accumulate in
the soil, subway water and groundwater, has generated environmental impacts and
health problems for human beings. To address this problem, solutions have been
generated based on microorganisms with the capacity to degrade these pollutants.
Therefore, the objective of this research was to identify and characterize tolerance
capacity (TC) to different concentrations of glyphosate, carbofuran, permethrin and
chlorpyrifos of isolated strains from agricultural soils. The first stage, starting from 86
non identified isolates, these were planted at 200 ppm concentrations of each molecule,
and they were classified according to their CT. Group I went on to trials at
concentrations of 5000 ppm and 10000 ppm. Group II strains have been identified:
there were selected those which showed tolerance to two specific pesticides carbofuran
and glyphosate reported as Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus toyonensis,
Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus aryabhattai and Bacillus velenzensis. It was
evaluated the bacterial growth curve of artificial consortium (GVE7 and GVE19) both
Bacillus megaterium in CT function at concentrations from 250 to 10000 ppm
glyphosate as the only source of carbon. These presented a tolerance at 5000 ppm
valued in 24h and it was possible to validate the method of titration in plate as a
tolerance test. On the other hand, design of functional metagenomics directed to a
panel of four genes mcd, phnJ, cpd and estP, the first design of primers to target more
than one gene associated to degradation for several families of pesticides for species
of the genus Bacillus. These results suggest developing degradation kinetics, variable
XX
combination of consortia, leaving the basis for the development of a consortium with
potential biotechnology application in the degradation of these pesticides, as well as to
determine the degradation potential for carbofuran, glyphosate, chlorpyrifos and
permethrin in different environments.
1
I. INTRODUCCIÓN
En 2018 Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP) reporta
una superficie cultivada de 20.3 millones de hectáreas. Nuestro país se ubica entre
las 12 economías con mayor producción agrícola en el mundo y en la tercera
posición en América Latina. Actualmente, el sector agrícola genera 8.1% del PIB
primario, reportando SIAP en 2018 un valor de producción de este sector por
634,955 millones de pesos, representando la región noroeste el 20.9% de esta
producción, esto debido a empresas agrícolas, empleando gran infraestructura
(FAO, 2017; SIAP, 2018). Los principales estados productores son Sinaloa
ocupando el segundo lugar con una producción de 12.6 millones de toneladas y
Sonora este representa el quinto lugar de los estados con mayor producción
aportando 8.4 millones de toneladas (SIAP, 2018).
En el año 2018 Sinaloa reportó 1,117103 ha, de las cuales el 61% se
destinaron a cultivos de granos, el maíz representa el 41% de valor total de
producción del estado en ese mismo año. La aplicación de paraquat, 2,4-D,
glifosato, paratión metílico, fosfuro de aluminio, monocrotofos y lambda cialotrina
son uno de los principales plaguicidas que se usan en los cultivos de maíz
(Hernández et al., 2019a).
Por otra parte, Sinaloa es el segundo productor a nivel nacional de papa,
seguido de Sonora, con una superficie sembrada de 13,333 ha y un rendimiento de
386,498 ton/ha (SIAP, 2018). El cultivo de papa a nivel mundial es una de las
actividades agrícolas que consume más plaguicidas por hectárea. CIP y FAO, el
alto consumo de plaguicidas es porque cultivo de papa está expuesto al ataque de
diferentes patógenos, plagas y malezas, la mayoría de las cuales aumenta en
condiciones de alta humedad (Ramírez et al., 2014b).
La superficie sembrada de trigo a nivel nacional, para el ciclo otoño-invierno
2017/18, es de 467 mil 319 ha (SIAP, 2018). En el estado de Sonora en el año 2018,
se registra 602,947 ha de superficie sembradas representando 36.9% de cultivos
sembrados de trigo. Los cultivos de maíz y trigo son fundamentales en la producción
agropecuaria mundial tanto por su importancia como alimentos básicos, además de
2
fuente de proteína. Los sistemas productivos de monocultivo como (maíz y trigo)
utilizados mayormente en la región noroeste, para mantener este sistema es
necesario utilización de productos fitosanitarios (agroquímicos como plaguicidas)
que permitan mantener la producción.
El volumen de producción de plaguicidas en México para 2017 fue de 59 157
ton (INEGI, 2018) y del total de plaguicidas utilizados en la zona noroeste, Sinaloa
se aplica cerca del 30% (Leyva et al., 2014). Están autorizados 183 ingredientes
activos de Plaguicidas Altamente Peligrosos (PAPs), los cuales representan el 33%
de los IA publicados en el Catálogo Oficial de Plaguicidas (CICOPLAFEST 2016).
Estos se pueden clasificar como extremadamente peligrosos y mortales si son
inhalados, así como carcinógenos, probables carcinógenos, mutagénicos,
bioacumulables, persistentes en agua, suelo o sedimento, y muy tóxicos en
organismos acuáticos y abejas.
Los estados de Sonora y Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs,
destacando por su alta toxicidad: paratión metílico, malatión, metamidofos,
clorpirifós, monocrotofos, paraquat, glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb,
clorotalonil, dimetoato, carbarilo, atrazina, fosfuro de aluminio, imidacloprid,
cipermetrina, lambda cialotrina y endosulfán (Hernández et al., 2018).
En 2019 el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático, reporta un
panorama amplio y actual sobre las investigaciones y estudios que se han efectuado
en el país para detectar la presencia y cuantificar los niveles de plaguicidas en agua
superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios localizados en 23 estados de la
república, la mayoría de ellos en los estados con mayor actividad agrícola como
Sinaloa y Sonora. Entre todos los sitios identificados se reporta el Valle de Culiacán,
una zona con intensa actividad agrícola de Sinaloa, el mayor número de plaguicidas
detectados, con 31 ingredientes activos y algunos metabolitos.
La acumulación de estos plaguicidas en el ambiente, por diversos procesos,
puede disminuir la capacidad del suelo afectando sus funciones de producción
biológica, protección ambiental y sustento de la salud humana (Vallejo, 2013). Por
3
lo que, en los últimos años se ha dirigido hacia una agricultura sostenible, para
encontrar soluciones biológicas en tema de la degradación de plaguicidas.
Los plaguicidas sus metabolitos son biodegradados del medio ambiente por
microorganismos o completamente biodegradados por un consorcio microbiano
(Ortiz et al., 2013). Esta característica de tolerar y degradar de los microorganismos
está asociada con su adaptación (a largo plazo) a ambientes altamente impactados
por estos contaminantes. Los microbios comúnmente identificados para la
biorremediación de plaguicidas son Pseudomonas sp., Bacillus sp., Klebsiella sp.,
Pandoraea sp., Phanerochaete chrysosporium y Mycobacterium sp. (Odukkathil y
Vasudevan 2013). Dado a que las bacterias podrían inducir fácilmente cepas
mutantes, teniendo así capacidad bioquímica para un entorno adaptativo, y por lo
cual se podrían realizar un estudio más profundo (Racke et al., 1996; Oliveira et al.,
2015).
Bacillus cereus CB4 con capacidad de degradar concentraciones hasta de
12 g/L (12,000 ppm), e identificaron vías metabólicas mediante la actividad de CP
liasa y la actividad de glifosato oxidorreductasa degradando el glifosato a AMPA,
glioxilato, sarcosina, glicina y formaldehído como productos (Fan et al., 2012). Los
consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans, Bacillus
aerophilus y Pseudomonas fulva) podrían degradar el forato (entre 97.65 y 98.31
%) a concentraciones de 100, 200 y 300 mg/kg se encontró en suelos inoculados
con cultivos mixtos. (Villaverde et al., 2017). Por lo que, los microorganismos y
consorcios aislados de suelos impactados por plaguicidas, se consideran como
mejores y efectivos porque tienen una mayor adaptabilidad en una región geográfica
particular (Verma et al., 2014).
Fang et al. (2014), reportaron mediante análisis metagenómico la abundancia
y diversidad de genes lip y mnp, que codifican para la peroxidasa, y el gen carA,
que codifica para la lacasa, detectándose como los genes dominantes para la
degradación de contaminantes orgánicos. Los genes hdt, hdg y atzB, que codifican
hidratasa, deshalogenasa y etilaminohidrolasa, fueron los genes más abundantes
involucrados en la degradación diclorodifeniltricloroetano (DDT),
4
hexaclorociclohexano (HCH) y atrazina (ATZ) en agua dulce y sedimentos marinos,
los conjuntos de datos se derivaron utilizando Illumina secuenciación de alto
rendimiento y se basaron en BLAST.
Debido a la necesidad de resolver problema de acumulación de estos
agroquímicos en los diferentes ambientes, es importante buscar soluciones
sustentables, se propone en el presente trabajo identificar y caracterizar cepas
aisladas de suelos agrícolas con capacidad de tolerancia a diferentes plaguicidas
aplicados en el ámbito agrícola (glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós) ya
que la evolución microbiana y los procesos de biorremediación presentan un
equilibrio natural entre ellas, para diseñar consorcios artificial o natural con
potencial de tolerancia al conjunto de esta moléculas, se requiere interpretar la
interacción entre los integrantes del consorcio artificial o natural con ayuda de las
nuevas herramientas “omicas” como metagenómica funcional dirigida a genes
asociados a la degradación, es posible realizar estudios más profundos y dirigidos
pudiendo descifrar vías metabólicas, ya que es necesario conocer la actividad
enzimática de los organismos que le permite utilizar dichos xenobióticos
(plaguicidas) como única fuente de carbono, energía o nutriente.
5
II. ANTECEDENTES
2.1 Agricultura en el noroeste de México
La agricultura es una de las actividades económicas con el crecimiento más
acelerado en los últimos años a nivel mundo. En 2018, SIAP (Servicio de
Información Agroalimentaria y Pesquera) reporta 21.2 millones de hectáreas de
superficie sembradas y en las que se cosecharon 20.3 millones de hectáreas, por
lo que la agricultura en nuestro país es más que un sector productor importante,
según datos del (SIAP) el campo mexicano se ubica entre las 12 economías con
mayor producción agrícola en el mundo y en la tercera posición en América Latina
(FAO, 2016; SIAP, 2018).
Actualmente, el sector agrícola genera 8.1% del PIB primario, reportando
SIAP en 2018 un valor de producción de este sector por 634, 955 millones de pesos,
representando la región noroeste de México el 20.9% de esta producción, esto
debido a la agricultura de riego, que es llevada a cabo por empresas agrícolas cuyo
objetivo es la producción comercial de grandes volúmenes, esta actividad se
encuentra en los Estados del norte de México utilizando gran infraestructura
(CEDRSSA, 2017). Por tanto, para mantener esta producción es necesario atender
una problemática prioritaria en la agricultura, la cual ha sido la presencia de plagas
en los cultivos, es decir, organismos que interfieren el desarrollo del producto y con
el bienestar humano, lo cuales se combaten regularmente con el uso de
agroquímicos como los plaguicidas. En México, durante varias décadas ha
prevalecido el principal modelo desarrollo agrícola, el cual se ha basado en la
aplicación de plaguicidas, además de otros insumos para garantizar y proteger los
cultivos. Esto ha sido así sobre todo en los estados del norte de la república, como
Sinaloa y Sonora, representando una importante producción agrícola. En el año
2018 Sinaloa ocupa el segundo lugar con una producción de 12,604,945 toneladas
con un valor de 54,166 millones de pesos, con lo que respecta a Sonora este
representa el quinto lugar de los estados con mayor producción aportando
8,438,928 toneladas con un valor de 44,915 millones de pesos (SIAP, 2018; INECC,
2019).
6
2.1.1 Principales Cultivos en Sinaloa
2.1.1.1 Cultivo Maíz (Zea mays)
En el año 2018 Sinaloa cultivó 1,117103 ha, de las cuales 683,826 ha se
destinaron a cultivos de granos generando una producción total de 6,410,871
toneladas de alimento con un valor de 25,114 millones de pesos, dentro de los
cultivos de grano, tan solo el maíz representa el 41% de valor total de producción
del estado en ese mismo año. Recordando que, Sinaloa ocupa el tercer estado con
mayor producción aportando el 8.5% al total nacional (SIAP, 2018). Por lo que, el
estado ocupa el 1ra posición a nivel nacional en la producción de maíz con un
volumen de producción de 5,818,056 toneladas, participando así con un 21.41% a
nivel nacional.
El uso de paquetes tecnológicos basados principalmente en insumos tipo
fertilizantes y plaguicidas químicos van en aumento (Hernández et al., 2019b). En
particular, el cultivo de maíz se aplica principalmente paraquat, 2,4-D, glifosato,
paratión metílico, fosfuro de aluminio, monocrotofos y lambda cialotrina (Bernardino
et al., 2017). El cultivos de maíz durante y posterior a su cosecha requiere la
aplicación de estos plaguicidas, representando un riesgo para la salud y el medio
ambiente, por consiguiente, la detección adecuada de los residuos de este tipo de
sustancias es de gran interés para minimizar el impacto negativo de los plaguicidas
en la salud y calidad de los productos agrícolas (Hernández et al., 2019a).
2.1.1.2 Cultivo de papa (Solanum tuberosum L.)
Sinaloa es el segundo productor a nivel nacional de papa, seguido de Sonora,
con una superficie sembrada de 13,333 ha y un rendimiento de 386,498 ton/ha
(SIAP, 2018). El cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) a nivel mundial es una de
las actividades agrícolas que consume más plaguicidas por hectárea (Ramírez-
Muñoz et al., 2014a). Según CIP y FAO (2008), el alto uso de plaguicidas es debido
a que el cultivo de papa está expuesto al ataque de diferentes patógenos, plagas y
malezas, la mayoría de las cuales se incrementan en condiciones de alta humedad.
7
2.1.2 Principal cultivo en Sonora
2.1.2.1 Cultivo de Trigo (Triticum sp.)
La superficie sembrada de trigo a nivel nacional, para el ciclo otoño-invierno
2017/18, es de 467 mil 319 ha de las cuales se han cosechado 465 mil 997 (99.7%),
con una producción de 2 millones 802 mil 008 toneladas (SIAP-SAGARPA, 2018).
En el estado de Sonora en el año 2018, se registra 602,947 ha de superficie
sembradas representando 36.9% de cultivos sembrados de trigo, generando una
producción de 1,449,714 toneladas, un rendimiento de 6.49 (udm/ha), con un valor
de producción de 5,738,794 millones de pesos. El 83% de la producción de trigo en
la entidad es del tipo cristalino y el 17.0% restante es panificable (SIAP-SAGARPA,
2018).
Las principales enfermedades que atacan a los cultivos de trigo son causadas
por hongos, entre ellas la fusariosis o “golpe blanco” de la espiga, cuyo agente
causal es Fusarium graminearum, afectando el rendimiento. El control químico para
Fusarium se basa en la aplicación de fungicidas del grupo de los triazoles, que se
aplican durante la antesis de las espigas (Strada et al., 2012)
Por otra parte, este tipo de cultivos también se ve afectado por ataque de
plagas como el pulgón de cogollo y cultivos aislados con pulgón de la espiga,
aplicando principalmente insecticidas de los grupos organofosforados y piretroides.
Los plaguicidas organofosforados (OPP), como un pesticida económico, estable y
eficiente, se usan general y ampliamente en la producción agrícola en el mundo.
Los OPP pueden inhibir la actividad de la acetilcolinesterasa y, por lo tanto, se
acumula acetilcolina en el cuerpo, lo que puede tener un efecto grave en el sistema
nervioso central, puede causar síntomas de intoxicación e incluso provocar la
muerte. Debido a su toxicidad y abuso, la contaminación del agua y la tierra por los
OPP también se ha convertido en un problema ambiental grave, que en todo
momento amenaza la vida de las personas (Liu et al., 2018).
8
Los cultivos de maíz y trigo son de importancia a nivel mundial dado que
forman parte los alimentos básicos, además de fuente de proteína para
aproximadamente el 70% de la población humana en el mundo (Strada et al., 2012).
2.2 Control de plagas
La FAO (2016) define el término plaga como “cualquier especie, raza o biotipo
vegetal o animal, o agente patógeno dañino para las plantas o productos vegetales”.
Las pérdidas en la producción agrícola mundial ocasionada por plagas se estiman
una fluctúan entre 20 y 40%, causando pérdidas económicas de miles de millones
de dólares al año. Además, la FAO prevé la necesidad mundial de producir 60%
más de alimentos para el sustento de una población más numerosa en todo el
planeta (Zepeda, 2018). Para 2050, la agricultura tendrá que continuar
suministrando 80% de los alimentos de todo el mundo, minimizar las pérdidas de
productos del campo causadas por las plagas de los cultivos; por consiguiente, es
imprescindible para saciar las necesidades futuras de alimentos (FAO, 2011).
Por tanto, en los últimos años el control de plagas se ha convertido en uno
de los retos de mayor importante en la actividad agroproductiva. Existen diversos
tipos de tácticas que pueden actuar preventiva y/o curativamente para el control de
plagas las cuales pueden ser; cultural, mecánico, físico, biológico, genético y
químico (Zepeda, 2018).
Pese a cada una de las iniciativas, el agricultor sigue eligiendo un limitado
número de alternativas para el control de plagas, basados aun mayormente en la
aplicación de plaguicidas químicos impulsados por la revolución verde, sin ni una
capacitación, monitoreo y organización entre productores, gobiernos y
especialistas, la utilización de plaguicidas tuvo un incremento exponencial en las
últimas décadas, creándose una dependencia casi total en los procedimientos
químicos de defensa (Zepeda y Zepeda, 2018). Resultando así, efectos colaterales
negativos afectando la salud humana en forma de intoxicaciones agudas y crónicas
en las poblaciones, así como también en el medio ambiente, comprometiendo la
sostenibilidad de los sistemas agrícolas (Zepeda y Zepeda, 2018).
9
2.3 Generalidades Plaguicida
Los plaguicidas son sustancias o mezcla de sustancias liberadas en el medio
ambiente de forma intensiva para prevenir, destruir, repelar, atraer o controlar
plagas y enfermedades incluidas las especies no deseadas de plantas o animales.
Estos se pueden aplicar durante la etapa de producción almacenamiento,
transporte, distribución y en el procesamiento de alimentos (FAO y OMS,1997;
Yamada, 2016b). Por otro lado, los plaguicidas incluyen además otras sustancias
como reguladores del crecimiento de las plantas, defoliadores, desecantes, agentes
diluyentes de la fruta, inhibidores de germinación y sustancias aplicadas a los
cultivos antes o después de la cosecha para protegerlos del deterioro durante el
transporte y el almacenamiento (Michlig, 2018).
El uso de estos agroquímicos ha aumentado la productividad agrícola, el
rendimiento y protección de los cultivos, garantizando así los alimentos e incrementa
los ingresos de los agricultores (Antonini y Argilés, 2017). El aumento de la
demanda de alimentos en los últimos años es por la crecente población que se
estima en 8.500 millones de personas para el 2030, por lo que ha intensificado el
uso de los plaguicidas (Clark y Tilman, 2017; Crist et al., 2017).
Para atender la demanda mundial de esas sustancias se estima que se han
desarrollado y registrado más de 6,400 ingredientes activos que, una vez
combinados con otros componentes y aditivos, representan más de 100 mil
formulaciones comerciales. El consumo promedio de insecticidas, herbicidas,
fungicidas y bactericidas entre 1990 a 2010 a nivel mundial fue de 342,000, 566,000
y 353,000 ton, respectivamente (Liu et al., 2015). En 1990 se reportaba un consumo
anual a nivel mundial por 2.29 t de plaguicidas, ya para el año 2017 se reporta 4.11
millones de tonelada (Figura 1 y 2), México es uno de los principales países
consumidores de plaguicidas reportando en ese mismo año 1.77 kg/ha con un
consumo total 47,128 ton (FAO, 2020).
10
Consumo anual total de plaguicidas (1990-2017) a nivel mundial.
Fuente: FAO, 2020.
11
Distribución del consumo anual para 2017 a nivel mundial
representado en toneladas. Fuente: FAO, 2020.
12
El mayor consumidor de plaguicidas es Europa, seguido de China y los
Estados Unidos (EE. UU.). Con lo que respecta a los países en desarrollo la
aplicación de estos agroquímicos representa aproximadamente el 25% del uso
mundial de plaguicidas en la agricultura, con una aplicación excepcionalmente alta
en vegetales (Bernhardt et al., 2017).
Por tanto, la aplicación desmedida de los plaguicidas a través del tiempo se
han acumulado estos en el medio ambiente, los cuales pueden persistir en
diferentes sistemas (Udeigwe et al., 2015). Estos residuos se han encontrado en
cereales, vegetales, frutas y miel, así como sus derivados; como jugos y el vino,
esto dependiendo de las buenas prácticas de los agricultores y procesadores (Heard
et al., 2017). Junto con eso, podemos mencionar la aplicación deficiente afecta a
organismos no objetivos como peces y otras especies acuáticas, polinizadores
naturales (abejas y mariposas), ganado, aves y microorganismos benéficos del
suelo (Buah et al., 2018).
2.4 Clasificación de los Plaguicidas
Los plaguicidas se pueden clasificar según los ingredientes activos, la
estructura química, el modo de acción y la toxicidad (Botitsi et al., 2017). Hay
plaguicidas orgánicos e inorgánicos. Los plaguicidas orgánicos son a base de
carbono, ya sean plaguicidas de materiales naturales o plaguicidas sintéticos a partir
de productos químicos orgánicos (Cantrell et al., 2012). Los plaguicidas inorgánicos
se derivan de compuestos minerales o químicos que se producen como depósitos
en la naturaleza, principalmente compuestos de antimonio, cobre, boro, flúor,
mercurio, selenio, talio, zinc y fósforo y azufre elemental (Patinha et al., 2018).
Además, los plaguicidas se clasifican en función de la toxicidad aguda oral y
dérmica (Tabla 1). Según la Organización Mundial de la Salud (2010), LD 50 es la
estimación estadística del número de miligramos (mg) de tóxico por kilogramo (kg)
de peso corporal requerido para matar al 50% de la población de animales en
estudio. La formulación de plaguicidas puede contener más de un ingrediente, como
un agente humectante de toxicidad significativa, entonces la clasificación debe
corresponder a la toxicidad de los ingredientes mezclados (OMS, 2009).
13
Según los ingredientes activos y las plagas objetivo, los plaguicidas tienen
diferentes modos de acción: interfieren con la síntesis de aminoácidos y proteínas,
sistema nervioso, división celular, producción de energía, respiración, regulación del
crecimiento o desarrollo, fotosíntesis, daño del ácido desoxirribonucleico (ADN) y
metilación, integridad de membrana o multisitio y en algún momento con
especificidad desconocida (Tabla 2).
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas en función de su toxicidad aguda
Clases
DL50 para ratas (mg/kg de peso corporal)
Oral Dérmico
I a Extremadamente peligroso <5 <50
I b Altamente peligroso 5-50 50-200
II Moderadamente peligroso 50-2,000 200-2,000
III Ligeramente peligroso Más de 2,000 Más de 2,000
U Es poco probable que produzca
peligro agudo
Más de 5,000
Fuente: Organización Mundial de la Saludo (2010)
14
Tabla 2. Clasificación por grupo químico y su modo de acción
Grupo químicos Modo de acción y efecto sobre las plagas
Organoclorado Modulador del canal de sodio y disruptor del sistema nervioso, que conduce a convulsiones y parálisis.
Organofosfato Inhibidores de la acetilcolinesterasa, que causan la falla del impulso nervioso a través de las sinapsis y provocan una contracción rápida de los músculos voluntarios, por lo tanto, parálisis y muerte.
Carbamatos Inhibidores de la acetilcolinesterasa, afecta el sistema nervioso y los músculos.
Piretroides Moduladores de canales de sodio; se une a los canales de sodio dependientes de voltaje para despolarizar los nervios. Potentes neurotoxinas y disruptor endocrino que conducen a parálisis.
Neonicotinoides El modulador competitivo del receptor nicotínico de acetilcolina se une a los receptores nicotínicos de acetilcolina que conducen a parálisis
Fenilpirazoles (Fiproles) Bloqueadores de los canales de cloruro activados por Gaba, que afectan los nervios y los músculos.
Compuestos organoestánnicos Efectos de disrupción endocrina. Además, inhibición de la fosforilación oxidativa.
Pirazol Afecta la respiración mitocondrial.
Derivados de triazina Afecta el ciclo de división celular que resulta en la muerte celular.
Compuestos de arsénico Predomina el daño del ADN y el efecto epigenético sobre la metilación del ADN.
Derivados de bipiridilio Afectan la fotosíntesis y el fotosistema.
Compuestos de cobre Actividad multisitio, principalmente daño en el ADN.
Derivados de nitrofenol Respiración que afecta la fosforilación oxidativa.
Buprofezina Inhibidores de la biosíntesis de quitina.
Imazamox Se dirige a la síntesis de ácidos nucleicos, aminoácidos y proteínas.
Propiconazol Desmetilación de C-14 en la biosíntesis de ergosterol, que conduce a la acumulación de metilesteroles C-14.
Avermectinas Modulador alostérico del canal de cloruro activado por glutamato, que afecta los nervios y los músculos causando parálisis.
Triflumezopirim Modulador competitivo del receptor de acetilcolina nicotínico, que actúa sobre los nervios y los músculos como un objetivo.
Diamidas (ciantraniliprol) Modulador del receptor de rianodina; actuando sobre los nervios y músculos como objetivo.
Fuente: (Zikankuba et al., 2019)
15
2.5 Plaguicida, Suelo, Medio Ambiente y Salud
Se han reportado impactos negativos relacionados a la aplicación constate
de ciertos plaguicidas afectando directamente las funciones del suelo. Por ejemplo,
algunos plaguicidas organoclorados (OCP) disminuyendo la fijación simbiótica de
nitrógeno, lo que provoca una disminución en la producción agrícola (Fox et al.,
2007). El informe de la FAO y el ITPS (Panel Técnico Intergubernamental sobre
Suelos), destaca la falta de conocimientos sobre la interacción entre plaguicidas y
suelo, principalmente en lo que se refiere a la contaminación del suelo por estos
(FAO y ITPS, 2017). A pesar de acciones internacionales para evaluar el riesgo
ecotoxicológico de los plaguicidas y controlar su uso y liberación al medio ambiente,
a través de los Convenios de Rotterdam y Estocolmo (PNUMA, 1998, 2001), estas
acuerdos pueden prevenir y controlar la contaminación del suelo, pero es necesario
aún interpretar las interacciones específicas de los plaguicidas con los componentes
del suelo, su movilidad en esta matriz y posible absorción por las plantas, así como
su efecto en la producción agrícola (Arias-Estévez et al., 2008).
Algunos plaguicidas se han encontrado muy estables y persistentes en el
medio ambiente como los organoclorados (OCP) utilizados popularmente durante
años para controlar plagas y enfermedades (Buah et al., 2018). Los plaguicidas
(OCP) aldrin, dieldrin, endosulfan, diclorodifeniltricloroetano (DDT),
hexaclorobenceno (HCB) y hexaclorociclohexano (HCH) pueden persistir en el
medio ambiente durante años después de la aplicación (Debnath y Khan, 2017).
Además, la mayoría de los plaguicidas tienden a ser liposoluble, ya que se han
reportado concentraciones en la leche, sangre y tejidos grasos que se acumulan en
la cadena alimentaria (Du et al., 2017); (Buah et al., 2018). La exposición contaste
a estos residuos pueden ocasionar efectos en la salud humana incluyendo dolor de
cabeza, irritación de la piel, picazón, mareos, inquietud, neurotoxicidad, dificultades
para respirar, pérdida del conocimiento, enfermedades crónicas, cáncer y la muerte
(Guyton et al., 2015; Evangelou et al., 2016).
A pesar de la poca información disponible respecto al uso de plaguicidas, se
sabe que en México están autorizados 183 ingredientes activos (IA) de Plaguicidas
16
Altamente Peligrosos (PAPs), los cuales representan el 33% de los IA publicados
en el Catálogo Oficial de Plaguicidas (CICOPLAFEST, 2016). Dichos IA se pueden
clasificar como extremadamente peligrosos y mortales si son inhalados, así como
carcinógenos, probables carcinógenos, mutagénicos, tóxicos en reproducción,
perturbadores endócrinos, bioacumulables, persistentes en agua, suelo o
sedimento, y tóxicos en organismos acuáticos y abejas. Los estados de Sonora y
Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs, destacando por su alta toxicidad:
paratión metílico, malatión, metamidofos, clorpirifós, monocrotofos, paraquat,
glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb, clorotalonil, dimetoato, carbarilo,
atrazina, 2,4-D, fosfuro de aluminio, imidacloprid, cipermetrina, lambda cialotrina y
endosulfán (Bejarano, 2017; García et al., 2018; Camarena et al., 2019).
Por consiguiente, el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático
(INECC) en 2019, reporta un panorama amplio y actual sobre las investigaciones y
estudios que se han efectuado en el país para detectar la presencia y cuantificar los
niveles de plaguicidas en agua superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios
de México (Figura 3). Estos sitios se localizan en 23 estados de la república, la
mayoría de ellos en los estados con mayor actividad agrícola siendo Sinaloa y
Sonora, mientras que Chiapas es un estado con alta incidencia de enfermedades
transmitidas por vectores. Entre todos los sitios identificados se reporta el Valle de
Culiacán, una zona con intensa actividad agrícola en el Estado de Sinaloa, el mayor
número de plaguicidas detectados, con 31 ingredientes activos y algunos
metabolitos.
17
Localización de los sitios identificados en los que se reporta la
presencia y niveles medidos de plaguicidas. Fuente: (INECC, 2019)
18
2.6 Plaguicidas seleccionados
2.6.1 Glifosato
Los herbicidas son formulaciones químicas ampliamente utilizadas para
controlar de maleza y gramíneas anuales de hoja ancha que compiten con los
cultivos. Sin embargo, en las últimas décadas, los herbicidas también se usan para
el pretratamiento de tierras agrícolas y su aplicación se ha incrementado mediante
el cultivos genéticamente modificados tolerantes a herbicidas que pueden
metabolizar concentraciones elevadas (Powles, 2014).
El glifosato, nombre IUPAC [Ácido 2- (fosfonometilamino) acético] es el
ingrediente activo no selectivo que se usa como el herbicida más popular y de
amplio espectro, en los campos de producción agrícola desde 1974 (Figura 4) (Gill
et al., 2017). Después de 30 años de aplicación, representa el herbicida más exitoso
de la historia. Tiene un enlace carbono-fósforo (C-P) muy estable y una alta
solubilidad en agua (12000 mg/L). A pesar de su estabilidad, una vez dispersado en
el medio ambiente tiene una vida media en el suelo ligeramente degradable de 8-
280 días, dependiendo del tipo de suelo, la técnica de procesamiento, las
condiciones climáticas y otros factores ambientales. Por lo que, puede acumularse
en el suelo y agua, este es toxico para plantas, animales y bacterias, además los
residuos de herbicidas utilizados en cultivos anteriores pueden causar fitotoxicidad
en los cultivos de rotación, amenazando la seguridad de la producción de alimentos
(Duke y Powles, 2008; Zhao et al., 2015).
19
Estructura química glifosato; nombre IUPAC [Ácido 2-
(fosfonometilamino) acético]. Fuente: PubChem
20
2.6.1.1 Impacto por el uso de Glifosato
El uso intensivo de glifosato (GP) ha resultado en un aumento de riesgos
crónicos y remotos para el humano y el medio ambiente (Wang et al., 2016). Las
prácticas de aplicación inadecuadas y la sobrepulverización dan como resultado
una presencia generalizada en ambientes acuáticos y terrestres (Zhan, Feng, et al.,
2018). El glifosato a pesar de que es considerado ligeramente degradable, es
bastante resistente a la degradación debido al enlace C-P en la molécula (Chekan
et al., 2016). Estos se unen a las partículas del suelo y se acumula en la capa
superior causando cambios estructurales en la comunidad microbiana inhibiendo el
crecimiento y facilitar el aumento de hongos fitopatógenos (Van Bruggen et al.,
2018a).
Los herbicidas que contienen glifosato se adsorben a la arcilla y la materia
orgánica, frenando su degradación por microorganismos del suelo y provocando
con el tiempo la acumulación en los suelos (Cassigneul et al., 2016; Okada et al.,
2016). En consecuencia, se puede encontrar en aguas subterráneas, aguas
superficiales y sedimentos (Lupi et al., 2015). Rendon-von y Dzul, (2017) reportan
en México concentraciones de glifosato en muestras de agua subterránea de hasta
1.42 μg/l. Sin embargo, este se descompone en el suelo por en presencia de
microrganismos (Van Bruggen et al., 2018b).
Debido a la aplicación a gran escala y su acumulación en el medio ambiente
y en productos comestibles, en los últimos años estos plaguicidas han generado
efectos secundarios nocivos con respecto a la calidad del suelo y agua, y salud de
plantas, animales y humanos (Zhang et al., 2017). Dado a informes actuales por la
Agencia Internacional de Investigación contra el Cáncer (IARC), la Organización
Mundial de la Salud reclasificó el herbicida glifosato (categoría 2A) como
probablemente cancerígeno en ser humano (IARC, 2015; Bai y Ogbourne, 2016).
2.6.1.2 Degradación de glifosato por microorganismos
El catabolismo microbiano es una vía importante para la disipación de
herbicidas en el medio ambiente. A través del tiempo se han aislado y
21
caracterizados una variedad de microorganismos capaces de degradar una
diversidad de herbicidas. Sobre la base de estos recursos microbianos, se han
descifrado algunas rutas metabólicas y se han caracterizado genes y enzimas
involucradas en el catabolismo de herbicidas (Huang et al., 2017a).
La degradación del glifosato en suelos se debe principalmente al
cometabolismo microbiano, ya que la gran mayoría utilizan a este herbicida como
unida fuente de carbono (Sviridov et al., 2015). Las bacterias se encuentran entre
los microorganismos más comúnmente estudiados por su capacidad de
degradación del glifosato, ya que estudios in vitro han reportado que pueden usarlo
como fuente de sustancias inorgánicas P (Pi) (Kononova y Nesmeyanova, 2002;
Singh y Walker, 2006; Sviridov et al., 2015). El glifosato se metaboliza a través de
una de las dos vías conocidas, la vía C-P liasa y la vía de glifosato oxidorreductasa,
GOR (Huang et al., 2017a). En la ruta C-P liasa, el glifosato se transporta y escinde
por medio de un conjunto de aproximadamente 14 proteínas codificadas en el
operón phn, produciendo una molécula que contiene P (5-fosforibosil 1-difosfato,
PRPP) y N- metilglicina (sarcosina) (Figura 5). Se ha demostrado que varias
especies o cepas microbianas pueden utilizar el glifosato a través de esta vía,
utilizándolo como fuente de fosfato inorgánico. Incluyen Ochrobactrum anthropi
ATCC 49188 y así como también aislado de suelo contaminado con glifosato;
Sinorhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Burkholderia pseudomallei, y
varias especies de cianobacterias, incluyendo Nostobacteria sp. PCC 7120.
La vía GOR produce glioxilato y ácido aminometilfosfónico (AMPA) que aún
retiene el enlace C-P, y debe canalizarse hacia la vía C-P liasa para una
degradación completa (Kononova y Nesmeyanova, 2002; Jochimsen et al., 2011;
Sviridov et al., 2012)
22
Vías metabólicas del glifosato en bacterias
23
Así, la ruta de la C-P liasa es crítica en la mineralización del glifosato como
un paso central y de conexión en ambas rutas metabólicas conocidas descritas para
este compuesto (Huang et al., 2017b). En la vía de la C-P liasa, se requiere la
expresión de 14 polipéptidos, especificados por el operón phnCDEFGHIJKLMNOP,
para la descomposición completa de los fosfonatos. Entre las muchas proteínas
involucradas, el complejo central phnGHIJK parece tener un papel clave en la
división del enlace C-P, actuando específicamente como C-P liasa (Hove et al.,
2014). Una evolución conservadora considerable en las secuencias alineadas de la
proteína phnJ en comparación con otras proteínas Phn, sugiere que esta es la
enzima clave en la vía (Parker et al., 1999; Jochimsen et al., 2011).
Fan et al. (2012) reportaron a Bacillus cerus CB4 con capacidad de degradar
concentraciones hasta 12 g/L (12,000 ppm), como también estudiaron la
metabolización del glifosato indicando ambas vías mediante la actividad de CP liasa
y la actividad de glifosato oxidorreductasa degradando el glifosato a AMPA,
glioxilato, sarcosina, glicina y formaldehído como productos.
La permanencia de GP en el suelo, depende de la tasa de degradación
química, fotodegradación y microbiana. Para los procesos de biorremediación de
suelos, las bacterias y los hongos son los microorganismos mayormente
caracterizados por su capacidad de tolerar y degradar estos compuestos. Los
hongos filamentosos presentan ventajas sobre otros microorganismos como las
bacterias y levaduras, por el crecimiento micelial y enzimas extracelulares. Algunos
de los estudios recientes se han centrado en los procesos y las rutas metabólicas
al identificar los metabolitos intermedios de algunos plaguicidas en relación con los
hongos, se ha reportado que siguen diferentes procesos durante la biodegradación
de diferentes plaguicidas (Maqbool et al., 2016). Por ejemplo, algunas de las cepas
de hongos que pertenecen a los ascomicetos, basidiomicetos y cigomicetos pueden
transformar los plaguicidas a través de hidroxilación y desmetilación polar (Ellegaard
et al., 2013).
Aluffi et al. (2020), valoraron la tolerancia de diferentes géneros de hongos 5,
20, 50 y 100 mM (equivalente a 0,85, 3,4, 8,4 y 16,9 mg / ml ó 850, 3400, 8400,
24
16900 ppm respectivamente) concentraciones de glifosato, encontrando el valor
más alto (>1000 mM) de concentración efectiva de herbicida que causó un 50% de
inhibición del crecimiento (CE50), para los aislados de Trichoderma y Sterilia spp.
con valores de CE50 de 100 mM (16,900 ppm), mientras que Aspergillus spp. y
Mucor presentaron valores de CE50 entre 50 mM (8,400 ppm) y 100 mM (16,900
ppm), rendimiento de crecimiento en los medios suplementados con GP después
de un período de aclimatación variable.
2.6.2 Carbofurán
Carbofurán, nombre IUPAC [2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il
metilcarbamato] (Figura 9). Este plaguicida es usado ampliamente como
insecticida, nematicida y acaricida, pertenece al grupo químico de los carbamatos y
a la categoría IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA). Los
carbamatos tienen como acción principal la inhibición de la enzima
acetilcolinesterasa, tanto la colinesterasa eritrocitica, estos actúan por
carbamilación de la enzima y esa unión es más débil e inestable que la unión
generada por una intoxicación con organofosforados, lo que la hace reversible; lo
anterior causa la perdida de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa
ocasionando un síndrome colinérgico (Öztürk et al., 2016).
En los últimos años se ha prohibido su aplicación en la Unión Europea y
Canadá, debido a su alta toxicidad y alto potencial de lixiviación al agua subterránea,
sin embargo, todavía se usa en países como Kenia, Vietnam y Corea del Sur. En
México la Secretaría de Economía reportó, en el período de 2003 a 2019, los
plaguicidas con mayor cantidad importada son Paraquat, Cloropicrina, el Amitraz,
Carbofurán y Bromuro de metilo (INECC, 2019). En 2018, la Comisión Federal para
la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), con la Industria de Protección
de Cultivos (PROCCYT), asociación a la que pertenece FMC Agroquímica de
México, y la Unión Mexicana de Fabricantes y Formuladores de Agroquímicos
(UMFFACC) acuerdan el retiro voluntario del mercado y la cancelación de los
Registros Sanitarios de todos los productos a base de carbofurán (Furadan ®).
25
Estructura química de carbofurán; nombre IUPAC [2,3-dihidro-2,2-
dimetilbenzofuran-7-il metilcarbamato] Fuente: PubChem
2.6.2.1 Impacto por el uso de Carbofurán
Aunque el carbofurán muestra eficiencia agronómica, este insecticida tiene
restricciones ambientales debido a los riesgos de contaminación. Un problema
frecuentemente asociado al carbofurán, es la muerte de los animales del bosque
como el caso que se notificó en el estado de Virginia observado por (Stinson et al.,
1994). La presencia continua de carbofurán en los canales de agua y ríos puede
causar daños graves, agudos o crónicos a los organismos acuáticos (Crepeau y
Kuivila, 2000). El uso de carbofurán en la agricultura está prohibido en algunos
países, debido a su toxicidad ecológica.
Aunque el carbofurán es químicamente inestable debido a la hidrólisis en el
medio ambiente, sus residuos a menudo se detectan en las aguas subterráneas
debido a su uso generalizado en el suelo y su alta fluidez (Campbell et al., 2004).
Por lo tanto, se ha generado una gran preocupación e interés con respecto al
comportamiento ambiental y los mecanismos de degradación del carbofurán (Yan
et al., 2018).
2.6.2.2 Degradación de carbofurán por microorganismos
El proceso de degradación de la molécula de carbofurán (2,3-dihidro-2,2-
dimetil-7-benzofuranol metilcarbamato) (representada como RX) ocurre cuando
26
reacciona con la molécula de agua originando un nuevo enlace C – N y rompiendo
un C – X enlace en la molécula original. La reacción neta es esencialmente un
desplazamiento directo de X por OH (Mabury y Crosby, 1996).
Existen varias técnicas de descontaminación disponibles para la eliminación
de estos contaminantes, aunque no todas son lo suficientemente eficientes como
para destruir los contaminantes. Los microorganismos juegan un papel importante
en la desintoxicación de compuestos xenobióticos, y pueden degradar estos
contaminantes a productos inocuos (principalmente CO2 y H2O) (Jiang et al.,
2006).(Tejada y Magallona, 1985) y (Rouchaud et al., 1990), han observado que los
principales metabolitos del carbofurán son el 3-cetocarbofurano (2,2-dimetil-3-oxo-
2,3-dihidro-1-benzofuran-6-il metilcarbamato), carbofuran-fenol (2,2- dimetil-2,3-
dihidro-1-benzofuran-7-ol) y 3-cetocarbofuran-fenol (7-hidroxi-2,2-dimetil-1-
benzofuran-3 (2 H ) -ona).
La biodegradación, especialmente la degradación microbiana, es el
mecanismo principal que conduce a la disipación de carbofurán. Hasta la fecha, se
han reportado algunos microorganismos que degradan el carbofurán de los géneros
de Achromobacterium, Flavobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas,
Novosphingobium , Paracoccus y Cupriavidus (Tomasek y Karns, 1989; Yan et al.,
2007; Rousidou et al., 2016; Yan et al., 2018; Gupta et al., 2019). Entre ellos, solo
varias cepas podrían usar carbofurán como fuente de carbono para el crecimiento,
incluida Sphingomonas sp. cepa CF06, Novosphingobium sp. KN65.2 y Cupriavidus
sp. ISTL7 (Feng et al., 1997; Nguyen et al., 2014; Gupta et al., 2019). Por lo que,
solo tres genes han sido clonados e identificados funcionalmente como
responsables de la hidrólisis del carbofurán, incluidos mcd (Tomasek y Karns,
1989), cehA (Hashimoto et al., 2002) y mcbA (Trivedi et al., 2016; Zhu et al., 2018).
Entre estos tres genes, cehA es el gen más antiguo reportado y el más alojado.
Aunque se ha informado que existe cehA en cepas de diferentes géneros, su
mecanismo de hidrólisis aún necesita ser investigado (Jiang et al., 2020).
27
2.6.3 Permetrina
Los piretroides sintéticos son análogos de la piretrina natural que se
encuentra en la planta Chrysanthemum cinerariaefolium de la familia Asteraceae
(Smith y Stratton, 1986). Durante las últimas cuatro décadas, los piretroides se han
utilizado globalmente para el manejo y control de plagas en la agricultura,
silvicultura, áreas sanitarias y hogares. En comparación con las piretrinas naturales,
los piretroides sintéticos son más estables a la luz solar directa y son
significativamente más efectivos contra una amplia gama de insectos. Estas
propiedades los hicieron mucho más adecuados para su uso en la agricultura
(Laskowski, 2002). Hoy en día, los piretroides contribuyen con más del 25% del
mercado mundial de plaguicidas (Chen et al., 2011).
Estos se clasifican como insecticidas de Tipo I y Tipo II; los piretroides tipo I
carecen de un grupo ciano y tienen una gran diversidad estructural (aletrina,
bifentrina, d-fenotrina, permetrina, resmetrina, teflutrina y tetrametrina), la
clasificación tipo II con un grupo α-ciano son más neurotóxicos que los piretroides
tipo I e incluyen ciflutrina, cihalotrina, cipermetrina, deltametrina, fenvalerato,
fenpropatina, flucitrina, flumetrina, fluvalinato y tralometrina (Kaviraj y Gupta, 2014).
Dentro de los piretroides con mayor estabilidad ambiental y actividad
insecticida es permetrina, nombre IUPAC [3- (2,2-dicloroetenil) -2,2-
dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo] (Figura 6). Estos actúan
a nivel contacto, estomacal, no sistémico, con leve efecto repelente, bloquea la
conducción del estímulo nervioso. Es más estable en medios ácidos que en
alcalinos, mayor estabilidad a pH 4; DT50 50 d a pH 9; estable a pH 5 y 7 a 25ºC y
al calor (>2 años a 50ºC). Los residuos de piretroides no son extremadamente
tóxicos para los humanos, pero su exposición a largo plazo puede afectar la calidad
del semen, el ADN espermático y las hormonas reproductivas (Han et al., 2008).
Por lo que, permetrina se clasifica en el grupo IA. Extremadamente peligroso (OMS);
I. Altamente tóxico (EPA).
28
Estructura molecular de permetrina; nombre IUPAC [3- (2,2-
dicloroetenil) -2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-fenoxifenil) metilo].
Fuente: PubChaem.
2.6.3.1 Impacto por el uso de Permetrina
Los piretroides son propiedades altamente hidrófobas y absorbentes,
propiedades que facilitan su entrada directa o indirecta en los ecosistemas naturales
para amenazar la integridad ecológica acuática y terrestre. El uso generalizado y la
aplicación constante de permetrina en los suelos agrícolas, ha generado la
acumulación en diferentes entornos, especialmente en el suelo, debido que se unen
fuertemente a las partículas del suelo y la materia orgánica. Por lo que les permite
filtrarse al agua subterránea y formar residuos de estos compuestos (Antwi y Reddy,
2015).
Cycoń et al. (2014), encontraron la mayor disipación de piretroides en los
suelos que se caracteriza por el mayor contenido de materia orgánica. Estos
resultados mostraron que la materia orgánica y el contenido de arcilla son los
principales factores que controlan la biodisponibilidad de los piretroides para los
microorganismos. Las propiedades lipofílicas de los piretroides resultan en su fuerte
29
tendencia a unirse a varios componentes orgánicos y no orgánicos del suelo y estos
insecticidas pueden persistir en los suelos durante un largo período.
Los insecticidas piretroides son beneficiosos para el manejo de plagas
agrícolas y domésticas, pero su aplicación debe monitorearse cuidadosamente para
evitar impactos tóxicos relacionados con el medio ambiente y la salud. Se deben
explorar y optimizar técnicas eficientes para eliminar los residuos de piretroides y
remediar los ambientes contaminados. Hasta la fecha, se han utilizado diversos
enfoques para descomponer productos químicos persistentes a través de procesos
biológicos, químicos, físicos y fisicoquímicos (Marican y Durán, 2018).
2.6.3.2 Degradación de permetrina por microorganismos
La eficiencia de degradación de los piretroides depende no solo de la
actividad catabólica de los microorganismos del suelo, sino también en gran medida
de las diferentes propiedades del suelo, es decir, la textura del suelo, el contenido
de materia orgánica, la humedad, el pH y la temperatura (Mariusz Cycoń y
Piotrowska-Seget, 2016).
Los piretroides representativos de Tipo I y Tipo II contienen un residuo de
ácido ciclopropano carboxílico conectado al alcohol aromático. Hasta la fecha, se
han estudiado las vías de biodegradación de solo cuatro piretroides tipo I: aletrina,
bifentrina, D-fenotrina y permetrina (Chen et al., 2012; Yang et al., 2018; Zhan et al.,
2018) . Como se muestra en la Figura 7, los piretroides representativos de Tipo I
se degradan a ácido ciclopropano carboxílico y PBAlc, que se transforma en PBAld
para producir más ácido 1,2-bencenedicarboxílico o 1,2-bencenedicarboxílico butil
dacil éster (Yang et al., 2018).
30
Vías de degradación microbiana propuestas para piretroides tipo I
representativos. R1 representa diferentes grupos sustituyentes en los
piretroides tipo I. Fuente:(Zhan et al., 2020)
31
Las enzimas funcionales clave involucradas en la degradación de los
piretroides (Figura 8). PytZ, perteneciente a la familia VI de esterasa, se aisló de
Ochrobactrum antropic YZ-1 (Zhai et al., 2012). Sys410, perteneciente a la familia
de la esterasa V, se aisló de la biblioteca metagenómica de Turban Basin (Fan et al.,
2012). PytH, perteneciente a la carboxilesterasa, se aisló de Sphingobium sp. JZ-1
(Wang et al., 2009). La aminopeptidasa se aisló de Pseudomonas aeruginosa GF31
(Tang et al., 2017). EstP, perteneciente a la esterasa, se aisló de Klebsiella sp.
ZD112 (Wu et al., 2006) Est3385, perteneciente a la familia de esterasa I, fue
aislado de Rhodopseudomonas palustris PSB-S (Luo et al., 2018). EstZ,
perteneciente a la esterasa, se aisló de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (datos no
publicados). Pye3, perteneciente a la familia de esterasa I, se aisló del metagenoma
del suelo vegetal (Li et al., 2008). PytY, perteneciente a la familia VI de esterasa, se
aisló de Ochrobactrum antropic YZ-1 (Ruan et al., 2013). Se aisló CMO,
perteneciente a la monooxigenasa, de Streptomyces sp. (Chen et al., 2013).
Árbol filogenético de enzimas funcionales clave involucradas en la
degradación de los piretroides.
32
Zhan et al. (2018), reportan A. baumannii ZH-14 capaz de utilizar una amplia
gama de permetrina sintéticos (SP) así como fuentes de alimentos, con la capacidad
excepcional de colonizar nichos ecológicos donde los nutrientes son limitados,
valoraron la degradación de SP reportando un 100% (50 mg/L)) dentro de 72 h,
concluyendo que esta cepa en particular degrada una concentración de 800 mg/L.
Por lo que, determinaron que esta cepa (ZH-14) degrada permetrina, a través de
una nueva vía metabólica con la formación de 3-fenoxibencenometanol, 3-
fenoxibenzaldhído y éster bis (2-metilpropil) del ácido 1,2-bencenedicarboxílico
como los principales metabolitos intermedios, que se transformaron aún más sin
persistencia producto acumulativo, lo que indica que la cepa bacteriana puede
albergar una vía metabólica completa para la degradación y el metabolismo de la
permetrina.
2.6.4 Clorporifós
Los organofosforados (OP) son ampliamente utilizados en aplicaciones
agrícolas y domésticas, posicionándose como uno de los principales en el mercado
internacional en el uso de insecticidas. Debido a su mecanismo de acción, el cual
inactiva de forma irreversible a la colinesterasa (Che) y su alta estimulación
colinérgica, durante décadas los OP proporcionan un control amplio y efectivo
contra las plagas, garantizando así el suministro mundial de alimentos y la salud
pública para una población en rápido crecimiento (Liu et al., 2018).
Clorpirifós, nombre IUPAC [dietoxi-sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-
λ 5 -fosfano] (Figura 10), pesticida organofosforado (OP) fue introducido por Dow
Chemical Company en 1965, como un pesticida de follaje para uso generalizado en
cultivos significativos y se ha utilizado comercialmente desde la década de 1960
(Das y Adhya, 2015). La formulación comercial de clorpirifós (CP) se realiza en
diversas formas, incluidos los concentrados emulsionables (EC), el polvo
humectable (WP) y los gránulos (GR). Los CP por su actividad insecticida de amplio
espectro contra plagas de artrópodos, los convierte en uno de los OP con mayor
consumo (Liu et al., 2018).
33
Estructura molecular de clorpirifós; nombre IUPAC [dietoxi-
sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] Fuente: PubChaem.
2.6.4.1 Impacto por el uso de Clorpirifós
Las causas de acumulación, amortiguación, filtración, inactivación y
degradación del suelo por plaguicidas se ven considerablemente influenciadas por
la materia orgánica (Burauel y Baßmann, 2005). El suelo puede actuar como un
medio potencial de transporte de plaguicidas para contaminar el agua, el aire, suelo,
las plantas y los alimentos, impactando diferentes ecosistemas y la salud humana.
El movimiento de los plaguicidas en el suelo se produce por medio del flujo
intermedio, la lixiviación, el desbordamiento de la superficie, el drenaje subterráneo
y la transferencia de nutrientes minerales del suelo a los productos agrícolas
afectado la calidad de los alimentos (Dar et al., 2019a).
El clorpirifós es un pesticida de toxicidad moderada (Clase II) que tiene una
dosis letal mediana en mamíferos (DL 50) de aproximadamente 32–1000 mg/kg
(Organization, 2010). Existen evidencias de la acumulación de los
organofosforados, ya que se han detectado en suelo, agua, alimentos y fluidos a
nivel mundial. Se analizaron 45 muestras de maíz y soja procedentes del norte de
Italia para detectar residuos de plaguicidas, por lo que en 30 muestras se
encontraron hasta 12.4 mg/kg de clorpirifós (Marchis et al., 2012). En este mismo
34
sentido (Salas et al., 2003) realizaron un estudio para medir los residuos de
plaguicidas OP en la leche pasteurizada comercial de México. Se recogieron
muestras de tres marcas comerciales de supermercados y una marca de tiendas
gubernamentales. Los residuos de plaguicidas OP se encontraron en todas las
marcas, y se confirmó que cada marca contiene los residuos de uno o muchos
plaguicidas OP por encima de sus niveles de LMR.
Morales et al. (2017), detectaron diferentes tipos de plaguicidas
relativamente en baja concentración en muestras de agua dulce de México. Las
frecuencias de detección de plaguicidas OP en las muestras fueron, en orden
descendente, clorpirifós (28.5%)> diazinón (25%)> malatión (5.6%)> etion (1.4%)>
carbofenotión (0.7%)> metilparatión (0.7%), reportando concentración máxima de
(CP) de 0.0296 μg/L, 0.0163 μg/L y 0.0157 μg/L para los ríos Tamazula, Humaya y
Culiacán, respectivamente.
El análisis residual del pesticida OP, CP se trazó en las muestras de orina de
residentes urbanos y agricultores. La concentración residual máxima de PC en
muestras de residentes urbanos se detectó como 1.03 μg/g mientras que, en la
muestra de los agricultores, el análisis residual se realizó desde, antes de la
pulverización de plaguicidas hasta el tercer día después de la pulverización, que se
detectaron en los rangos de 2.45–7.66 μg/g (Wang et al., 2016).
Debido a su baja solubilidad en agua y alta sorción del suelo, su movilidad
fuera del sitio (como lixiviación y escorrentía superficial) a través y sobre el perfil del
suelo es limitada (Racke et al., 1996) lo que puede resultar en una alta acumulación
de residuos de clorpirifós por su aplicación intensiva y excesiva en cultivos
agrícolas. En las últimas décadas, la creciente evidencia indicó que la exposición
crónica al clorpirifós puede inducir efectos adversos en organismos no objetivo, lo
que potencialmente amenaza el equilibrio ecológico (Muturi et al., 2017; Zhang
et al., 2017). Además, la asociación entre la exposición al clorpirifós y múltiples
síndromes clínicos ha suscitado una gran preocupación, ya que la exposición aguda
a altos niveles de clorpirifós conduce a una crisis colinérgica en humanos y
35
animales, incluidos signos periféricos, efectos en el sistema nervioso central y
eventualmente convulsiones y muerte (Lu et al., 2015; Christen et al., 2017).
2.6.4.2 Degradación de clorpirifós por microrganismos
En el entorno natural, la degradación de clorpirifós puede ocurrir mediada por
evaporación, hidrólisis, oxidación, fotólisis y metabolismo microbiano después de la
aplicación directa al suelo (Racke et al., 1996; Lester et al., 2017). Lo
organofosforados a pesar de sus características fisicoquímicas, su baja persistencia
y degradación natural, estos son fácilmente solubles en agua pudiendo representar
un impacto al ecosistema y de igual forma causar graves problemas de salud.
Por tanto, la degradación de organofosforados ya sea por métodos biológicos
o fisicoquímicos, se ha investigado ampliamente en todo el mundo. Sin embargo, la
remediación biológica se ha estudiado en mayor proporción por la razón de que los
microorganismos hidrolizan a los OP más rápido que los procesos químicos y aun
diez veces más rápido que la degradación física (Ragnarsdottir, 2000), esto debido
a que los microorganismos en el medio ambiente puede utilizar a los OP como única
fuente de carbono, nitrógeno y fósforo, generalmente la hidrolisis de OP se lleva a
cabo en los enlaces (P-O) alquilo y arilo con ayuda de enzimas hidrolasa,
fosfotriesterasa y fosfatasa (Brajesh y Walker, 2006). Por lo que, podemos concluir
que la capacidad de la población microbiana para degradar estos contaminantes
esta conferida por genes catabólicos para permaneceré en números nichos
ecológicos, adquiriendo la fuerza de tolerancia y capacidad para ser utilizados en
procesos de biorremediación (Dar et al., 2019b).
El primer microorganismo con capacidad de degradación de OP se aisló e
identificado en 1973 como Flavobacterium sp. En consecuencia, seguido del
aislamiento e identificación de varios microbios como hongos, algas y
cianobacterias que pueden descomponer una amplia gama de OP (Dar et al.,
2019b).
La biodegradación de la CP se lleva a cabo tanto aeróbicamente como
anaeróbicamente por los microbios a través de dos vías principales de degradación,
36
es decir, catabolismo y co-metabolismo. El proceso catabólico implica la
descomposición completa de compuestos orgánicos complejos o sus fragmentos,
mientras que el proceso co-metabólico conduce a la degradación parcial de los
compuestos orgánicos, sin beneficio para el organismo (Yadav et al., 2016).
La degradación o descomposición de la CP en un entorno aeróbico, las
bacterias tienden a transformar CP en subproductos altamente electrofílicos, es
decir, CP-Oxon (dietil 3,5,6-tricloropiridin-2-il fosfato) o TCP (3,5,6-tricloro-2-
piridinol) y DETP (Dietil tiofosfato) mediante desulfuración oxidativa o desarilación,
respectivamente, con TCP como el metabolito más común. CP-Oxon se hidroliza
aún más a DEP (dietilfosfato) y TCP (Tiwari y Guha, 2014). Tiwari y Guha (2014)
llevaron a cabo el estudio de biodegradación de la PC en condiciones anaeróbicas
e informaron la producción de TCP y DETP durante la degradación de la PC, lo que
indica que en condiciones anaeróbicas la PC se hidroliza directamente a TCP y
libera DETP (Figura 10).
Las enzimas hidrolíticas esenciales organofosforado hidrolasa (OPH), que
comprende el diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD), la descarboxilasa de
pirofosfato de mevalonato (MPD), la hidroxilasa de metil paratión (MPH) ), etc.
(Zhang et al., 2017). El primer OPH fue aislado del plásmido de Pseudomonas
diminuta por Serdar et al. (1989). Mulbry y Karns, (1989), aislaron OPH que
comprende 1693 pares de bases que tienen un marco abierto de lectura. La cepa
Stenotrophomonas YC-1, con capacidad de degradación completa de CP a
concentraciones de 100 mg/kg. El gen mpd de esta bacteria se clonó con éxito y se
usó para la biorremediación de suelos contaminados (Yang et al., 2006) (Figura 11-
12).
Dar et al. (2019b), realizaron una revisión de literatura reportan diversas
cepas bacterianas pueden tolerar y degradar CP a concentraciones de 10 a 1000
mg/L. Sasikala et al. (2012) aislaron diferentes especies bacteriana generando un
consorcio con capacidad de degradación de CP a CP-oxón y dietilfosforotioato, bajo
las siguientes condiciones pH 7, temperatura 37ºC y concentraciones de 500 mg/L
o 500 ppm.
37
Vía propuesta para la degradación aeróbica de clorpirifós por
bacterias. Fuente: modificado de Singh y Walker, 2006; Reddy et al., 2012.
38
Vía propuesta para la degradación anaeróbica de clorpirifós
(Modificado de Tiwari y Guha, 2014).
39
2.7 Consorcios microbianos ambientales y sintéticos
El microbioma del suelo desempeña un papel principal en el funcionamiento
del ecosistema, participando en los procesos biogeoquímicos necesarios. Cualquier
cambio en el microbioma del suelo conduce a diferencias en las propiedades
fisicoquímicas del suelo, como la salinidad, el pH y el contenido orgánico, lo que
finalmente conduce a la infertilidad del suelo. Las comunidades microbianas del
suelo se consideran bioindicadores sensibles de la contaminación del suelo, ya que
son las primeras señales de cambios fisiológicos y fisioquímicos a largo plazo en el
suelo (Singh et al., 2020).
En la naturaleza, los microorganismos generalmente sobreviven en
comunidades complejas que contienen múltiples poblaciones que pueden
interactuar metabólicamente entre sí. Por lo que, la diferenciación funcional y el
intercambio de metabolitos durante las interacciones ecológicas, particularmente en
las relaciones de cooperación, permiten a las especies coexistentes reciclar los
nutrientes de manera eficiente y obtener una fuerte resistencia a las perturbaciones
ambientales (Kawaguchi et al., 2016). Así podemos definir a un consorcio como
grupos coexistentes de dos o más especies microbianas. Además, el cultivo de
poblaciones mixtas también presenta una mayor capacidad de resistencia a
cambios ambientales.
Esta interacción microbio-microbio, determinan la estabilidad y las funciones
de los consorcios, generando así combinaciones de efectos positivos, negativos y
neutrales entre dos especies, existen seis modos básicos de interacción:
mutualismo, comensalismo, parasitismo o depredación, competencia, amensalismo
y neutralismo (Faust y Raes, 2012). Es más probable que se logre un crecimiento
estable y robusto en consorcios basados en relaciones de cooperación, como
mutualismo y comensalismo.
Al comunicarse mediante el intercambio de metabolitos o señales, los
miembros de un consorcio coordinan sus actividades y se benefician mutuamente
a través de la división del trabajo, que permite a los consorcios microbianos tener la
capacidad de realizar funciones complejas y permite procesos paralelos o
40
secuenciales para la utilización de recursos. La diversidad de reacciones
bioquímicas en los consorcios aumenta la eficiencia general de la utilización de los
recursos y reduce la formación de subproductos (Che y Men, 2019a).
Las interacciones microbianas y las redes metabólicas que poseen los
consorcios microbianos ambientales pueden proporcionar orientación para el diseño
y la optimización de consorcios microbianos sintéticos estables, robustos y
eficientes para una variedad de aplicaciones de ingeniería, como la biosíntesis y la
biodegradación (Che y Men, 2019b). Podemos definir a un consorcio microbiano
sintético como a las comunidades microbianas simples diseñadas regularmente por
2 a 3 especies. Los consorcios microbianos sintéticos exitosos no sólo cumplen las
funciones deseadas, sino que también sostienen el crecimiento celular de manera
estable y robusta (Villaverde et al., 2018). Se forman relaciones más estables entre
los miembros del consorcio cuando dependen en gran medida unos de otros. Las
interacciones microbianas que conducen a la interdependencia y las relaciones
estables incluyen la alimentación cruzada, la desintoxicación y la formación de
biopelículas, que son importantes principios de diseño de los consorcios (Men et al.,
2014; Shahab et al., 2018). Normalmente hay dos estrategias para seleccionar a los
miembros del consorcio: a) de arriba abajo (de complejo a simple): los miembros
del consorcio son los protagonistas clave identificados de una comunidad
microbiana compleja específica (Zuroff Curtis, 2012; Che y Men, 2019b) (Figura
13a), y b) de abajo arriba (de simple a complejo): los miembros del consorcio se
seleccionan de un conjunto inclusivo de microorganismos aislados y/o manipulados,
que pueden poseer los rasgos deseados pero no necesariamente tienen orígenes
ambientales comunes (Kong et al., 2018) (Figura 13b).
41
Estrategias para seleccionar a los miembros del consorcio; (a) de
arriba abajo (de complejo a simple) y (b) de abajo arriba (de simple a complejo).
Kong et al., 2018.
El uso de consorcios microbianos para mejorar la eficiencia de la
biodegradación ha aumentado debido a su capacidad de metabolismo sinérgico. El
intermediario metabólico de un microorganismo puede ser utilizado por otra para
una degradación eficiente, acelerando así la biodegradación y evitando los posibles
efectos tóxicos de los metabolitos formados (Li et al., 2017; Villaverde et al., 2017a).
Ortiz-Hernández y Sánchez-Salinas (2010), aislaron un consorcio bacteriano
formado por Stenotrophomonas malthophilia, Proteus vulgaris, Vibrio metschinkouii,
Serratia ficaria, Serratia spp. y Yersinia enterocoliti cepas puras provenientes de
suelos agrícolas, capaz de degradar tetraclorvinfos (ácido fosfórico, 2-cloro-1-
(2,4,5-triclorofenil) etenil dimetil ester).
Los consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans,
Bacillus aerophilus y Pseudomonas fulva) podrían degradar el forato, y la mayor
eliminación de forato (entre 97.65 y 98.31%) a concentraciones de 100, 200 y 300
mg/kg se encontró en suelos inoculados con cultivos mixtos. (Villaverde et al.,
2017a).
42
2.8 Metagenómica Funcional
Por otra parte, el suelo ha sido utilizado para realizar estudios
metagenómicos debido a su alta diversidad microbiana (Pathak et al., 2009; Voget
et al., 2006). El suelo es uno de los nichos ecológicos de mayor diversidad genética
microbiana, dado a la riqueza de texturas y estructuras, determinadas
principalmente por el contenido de arena, limo, arcilla, materia orgánica, contenido
de agua, y pH (Cortés et al., 2014). Por lo que un gramo de suelo puede contener
más de 4,000 especies, de diferentes microorganismos, principalmente procariotas,
que a su vez poseen miles de enzimas diferentes, constituyendo una reserva
enorme de nuevas moléculas (Curtis et al., 2002; Torsvik et al., 2002; Plassart et al.,
2012; Cortés et al., 2014).
Las enzimas que comúnmente se obtienen de meta genomas de suelos son
lipasas, esterasas y α-glucidasas, estas pueden hidrolizar enlaces C-C y C-O; desde
una perspectiva ecológica, puede contribuir al ciclo del carbono, por lo que sus
genes están ampliamente distribuidos en la comunidad microbiana (Martínez-
Martínez et al., 2013). La metagenómica brinda la oportunidad de aislar nuevas
secuencias de ADN que codifiquen enzimas y proteínas que participen en vías
metabólicas en relación con la biodegradación de plaguicidas, busca ser capaz de
estudiar con mayor profundidad a la comunidad microbiana, tanto a su estructura
como diversidad y entender el sinergismo entre las especies, su relación con los
ciclos biogeoquímicos (Cortés et al., 2014).
Se han caracterizado genes degradantes de plaguicidas de diferentes
microorganismos. La mayoría de los genes catabólicos responsables de la
degradación son extracromosómico, genómico o encontrados en transposones. El
nuevo avance en el campo de la metagenómica y la secuenciación del genoma
completo ha abierto nuevas vías para buscar los nuevos genes degradativos de
contaminantes y sus elementos reguladores de microorganismos tanto cultivables
como no cultivables del medio ambiente. Las enzimas responsables de la
degradación de varios plaguicidas están codificadas por estos plásmidos y
transposones que actúan como un elemento genético móvil (Kumar et al., 2018). El
43
valor de utilizar enfoques metagenómicos holísticos en todo el sistema como
herramienta para predecir la degradación microbiana en el contexto de la ecología
de hábitats contaminados (Jeffries et al., 2018).
Fang et al. (2014), reportaron mediante análisis metagenómico la abundancia
y diversidad de genes lip y mnp, que codifican para la peroxidasa, y el gen carA,
que codifica para la lacasa, detectándose como los genes dominantes para la
degradación de contaminantes orgánicos. Los genes hdt, hdg y atzB, que codifican
hidratasa, deshalogenasa y etilaminohidrolasa, fueron los genes más abundantes
involucrados en la degradación diclorodifeniltricloroetano (DDT),
hexaclorociclohexano (HCH) y atrazina (ATZ) en agua dulce y sedimentos marinos,
los conjuntos de datos se derivaron utilizando Illumina secuenciación de alto
rendimiento y se basaron en BLAST.
El análisis metagenómico extiende las observaciones de aislados cultivados
y proporciona evidencia de que la secuencia IS1071 es un portador de genes
catabólicos en ambientes estresados con xenobiótico y contribuye a la adaptación
a nivel de la comunidad para la biodegradación de plaguicidas (Moore et al., 2016).
Los suelos contienen comunidades microbianas extremadamente diversas
con capacidades metabólicas versátiles. La adquisición de nuevos rasgos se
produce mediante la diversificación del material genético existente del metagenoma
y se habilita aún más mediante la transferencia horizontal de genes (Maheshwari
et al., 2017). Por lo tanto, es posible que surjan nuevas actividades metabólicas y
se refuercen evolutivamente a través de la selección dentro de las comunidades
microbianas del suelo (Fierer, 2017; Kumar y Pannu, 2018).
44
III. JUSTIFICACIÓN
En México en el año 2017, se reportó un volumen de producción de 59 157
ton de plaguicidas, siendo Sinaloa y Sonora de los principales estados agrícolas
consumidores. Estos agroquímicos, son fuentes de contaminación del suelo, ya que
su uso excesivo satura los procesos biológicos de degradación. Dando como
resultado una prolongación de la vida media de los plaguicidas, afectando la
capacidad del suelo, acumulación en el ambiente y graves problemas de salud
pública. La comunidad microbiana en suelos es compleja, actúan como una red
metabólica que colectivamente permiten la degradación catabólica de dichos
contaminantes. Aprovechando la maquinaria metabólica de los microorganismos
nativos para la remediación de suelos, se identifican genes asociados en la
degradación para predecir rutas metabólicas y generar un consorcio microbiano
dirigido a un amplio espectro de plaguicidas, con ayuda de herramientas de
metagenómicas funcionales.
45
IV. HIPÓTESIS
La presencia y variación de genes de los integrantes del consorcio
microbiano aumentará el espectro de tolerancia a diversas familias de plaguicidas.
46
V. OBJETIVOS
Objetivo General
Identificar los genes asociados a la degradación de glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós provenientes de microorganismos aislados de cultivos papa,
maíz y trigo por metagenómica funcional.
Objetivos Específicos
• Valorar la capacidad de tolerancia glifosato, carbofurán, permetrina y
clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz y trigo del
noroeste de México.
• Identificar a los integrantes del consorcio microbiano por
secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).
• Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con mayor
tolerancia a glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.
• Diseño de primer para genoteca metagenómica funcional dirigida a
genes asociados a degradación de glifosato, carbofurán, permetrina y
clorpirifós.
47
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Antecedentes Proyecto (SIP20170193)
Se cuenta con un registro de los sitios (Guasave de cultivos de papa
(Solanum tuberosum L.), Culiacán cultivos de maíz (Zea mays) y Navojoa cultivo de
Trigo (Triticum) (Figura 14), donde se muestreo suelo impactado por la agricultura,
se definen las características fisicoquímicas y las concentraciones de plaguicidas
presentes (Tabla 3 y 4). A partir de los aislados de suelos contaminados de
plaguicidas del proyecto de (SIP20170193), de los que se partió con 86 cepas de
bacterias y hongos no identificado (Figura 15) (Tabla 5) y las pruebas de tolerancia
a diferentes plaguicidas (Tabla 6-7), dichas cepas se encuentran almacenadas a -
20°C en glicerol en el Laboratorio de Inocuidad Agroalimentaria del CIIDIR-IPN,
unidad Sinaloa.
De igual forma, se cuenta en el grupo de trabajo con Metagenómica del sitio
de muestreo correspondientes a los diferentes suelos, identificando la población
microbiana mediante amplicones 16S rRNA, en la (Figura 16) se muestra la
abundancia y diversidad de taxones.
48
Área de estudio: A. Región agrícola del valle del Yaqui y del río Mayo
(Navojoa cuenta con 295,553 habitantes), B. Valle agrícola de Guasave (Guasave
cuenta con 163,650 habitantes), C. Valle agrícola de Culiacán (Culiacán cuenta con
905, 265 habitantes). Elaborado por Montoya-Álvarez, 2017, a partir de datos
obtenidos de: Arellano-Aguilar et al., 2017; Leal Soto et al., 2014; Leyva et al., 2014b
y Hernández y Hansen., 2011.
49
* Milimhos por centímetro (mmhos/cm) * Centimoles por kilogramos (Cmol/Kg) * Partes por millón (ppm)
Tabla 3. Caracterización del suelo de los puntos de muestreo de los
municipios de Guasave, Culiacán y Navojoa con base a la norma NOM-AA-
021-2001
Análisis
Punto de Muestreo Referencia
Guasave Culiacán Navojoa
Potencial Hidrogeno: pH
7.8 6.4 7.8 6.6-7.3
Conductividad Eléctrica: CE (mmhos/cm)
1.99 0.10
1.99 ˂2.0
Materia Orgánica: %MO
0.7 1.20 0.70 ˂1.5
Nitratos: NO3 (ppm)
50 25 50 -
Fosforo: Olsen P (mg/Kg)
5.15 42.90 5.15 ˂10
Potasio: K (Cmol/Kg)
1.6 2.65 1.60 0.9-1.75
Calcio: Ca (Cmol/Kg)
18.6 20.36 18.6 14-20
Magnesio: Mg (Cmol/Kg)
3.98 4.0 3.98 ˃4.0
Sodio: Na (Cmol/Kg)
0.7 0.70 0.70 1.1-1.5
Fierro: Fe (ppm)
8.3 11.47 8.3 ˃9
Cobre: Cu (ppm)
2.3 4.2 2.3 ˃1.3
Zinc: Zn (ppm)
5 6.35 5.0 ˃1.5
Manganeso: Mn (ppm)
8.2 8 8.2 ˃8
Textura % Arena Arcilla Limo
Franco-Arcillosa
46.02 25.62 24.36
Arcillosa 16.02 63.62 20.36
Franco 46.02 25.62 24.36
50
Tabla 4. Patrones usados para identificación de plaguicidas en suelos de Guasave
DT50 suelo Guasave Culiacán Navojoa
15 meses ligeramente degradable
- 0.007590
250 días Muy
ligeramente degradable
- 0.000891
100 a 184 días Ligeramente degradable
0.002244 0.001031 0.000964 - 0.000363
( - ) Muy
ligeramente degradable
- 0.000613 0.001024
60-800 días Ligeramente degradable
- - 0.003108 - 0.002681 -
4 años
Ligeramente/no degradable
- - 0.004290 - 0.003517 -
4 años Ligeramente/no
degradable
- - 0.001060 - 0.000367 -
> 7 año Muy
Ligeramente Degradable
0.000181 0.000248 0.001267 - 0.000435 -
Años Muy
ligeramente degradable
- - 0.000629 - 0.000235 -
4-30 años Muy
Ligeramente Degradable
0.000009 0.000050 0.000749
0.000012 0.000213 -
4-14 años Muy
ligeramente degradable
- - 0.000576 0.000011 0.000351 -
60-800 días Ligeramente degradable
- 0.000121 - - -
120 días - 0.000118 0.000382 - - -
51
Ligeramente degradable 4-14 años
Muy ligeramente degradable
- 0.000615 0.004125 - -
Años (proporcional al
grado de cloración)
Muy ligeramente degradable
0.000066 - - - - -
**Guasave. Valle agrícola de Guasave (Guasave cuenta con 163,650 habitantes), Culiacán. Valle
agrícola de Culiacán (Culiacán cuenta con 905, 265 habitantes) y Navojoa. Región agrícola del valle del Yaqui y del río Mayo (Navojoa cuenta con 295,553 habitantes)
52
Aislados de microorganismo de suelos; de cultivos de papa Solanum
tuberosum L. Aislados de suelos de cultivos maíz (Zea mays). Aislados de suelos
de cultivos Navojoa cultivo de Trigo (Triticum).
53
Tabla 5. Cepas aisladas de los diferentes sitios (Guasave, Culiacán y Navojoa)
GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA
GVE 1 G 1 CLN 1 C1 NAV 1 N 1
GVE 2 G 2 CLN 2 C 2 NAV2 N2
GVE 3 G 3 CLN 3 C 3 NAV 3 N3
GVE 4 G4 CLN 4 NAV 4 N 4
GVE 5 G5 CLN 5 NAV 5 N 5
GVE 6 G6 CLN 6 NAV 6 N 6
GVE 7 (A) G7 CLN 7 NAV 7 N 7
GVE 8 G8 CLN 8 NAV 8 N 8
GVE 9 G9 CLN 9 NAV 9 N 9
GVE 10 G10 CLN 10 NAV 10 N 10
GVE 11 CLN 11 NAV 11
GVE 12 CLN 12
NAV 12 (Consorcio ambiental)
GVE 13 CLN 13 NAV 13 GVE 14 CLN 14 NAV 14 GVE 15 CLN 15 NAV 15 GVE 16 CLN 16 NAV 16 GVE 17 CLN 17 NAV 17 GVE 18 CLN 18 NAV 18 GVE 19
(B) CLN 19 NAV 19 GVE 20
GVE 21 * CLN 20
CLN 21
CLN 22
CLN 23
CLN 24
CLN 25
CLN 26 *GVE (bacterias) *G (hongos) **CLN (bacterias) **C (hongos) ***NAV (bacterias ***N (hongos)
54
Tabla 6. Tolerancia a diferentes plaguicidas
Tabla 7. Muestras positivas de hongos y bacterias a mix de plaguicidas a 200 y 100 µL/L
*Mix [carbofurán, paraquat, paratión y permetrina]
PLAGUICIDA (100 µL/L)
DT50 SUELOS (cálculos FAO)
GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA
Bacteria Hongo Bacteria Hongo Bacteria Hongo
Carbofurán 30-117 días Moderadamente
Degradable
M7 M10
M11 M5 M2 M4 M7
M7 M12
Paraquat 1,000 días Muy
Ligeramente Degradable
M10 M8 M7
M5 M15
M2 M4 M7
Paratión Varias Semanas
Fácilmente Degradable
M7
M11 M2 M4 M7
M7 M13
Permetrina ˂38 días Moderadamente
Degradable
M7 M8 M10
M3 M4
M11 M15
M2
M4 M5 M7
MIX PLAGUICIDA
GUASAVE CULIACÁN NAVOJOA
Bacteria Hongo Bacteria Hongo Bacteria Hongo
200 µL/L
M11 M7
M5 M1 M3
M7 M12
100 µL/L M7 M10
M3 M4
M11 M15
M2 M3
M4 M7
55
Histograma de la abundancia bacteriana de la metagenómica de
los tres sitios muestreados.
56
6.2 Producto Químico
Para el objetico 1, pruebas de tolerancia en medio solido M9 se utilizaron
plaguicidas marcas comerciales Glifosato (FAENA® 35.6%), Carborurán (Furadan®
350L), Permetrina (PERKILL® 34%CE) y Corpirifós Etil (CHLORBAN® 480CE) y el
objetivo 2, curvas de crecimiento se evaluó solo glifosato N - (fosfonometil) glicina
grado analito (96%) marca Sigma-Aldrich.
6.3 Etapa I
6.3.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz
y trigo del noroeste de México.
6.3.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de papa
(Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum)
- Selección y adaptación de cepas aisladas
a. Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de cultivos de
papa (Solanum tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo
(Triticum)
Se tomaron los 86 aislados proyectos (SIP20170193) conservados en glicerol
a -20ºC, para su reactivación y posterior purificación en medio Luria Bertani (LB)
agar y Luria Bertani (LB) caldo, se llevaron a cabo la inoculación de las cajas de
agar LB por medio de asas bacteriológicas por estriado y se pasaron a incubar a 28
°C, durante 24 horas.
b. Preparación de los preinóculos
Los preinóculos se realizaron adicionando dos asadas de la cepa
correspondiente en 50 mL de caldo LB esterilizado a 121 °C y 15 psi. Se incubaron
a 27 ± 2 °C y 150 rpm, por 24 horas.
c. Actividad Hemolítica
57
Se determino la capacidad de producción o ausencia de hemólisis, en agar
sangre al 5% de suero de sangre de bovino (Anexo 1), se llevaron a cabo la
inoculación por estriado y posteriormente se incubo a 28 °C, durante 18 horas
(Haubert et al., 2017).
- Selección de Plaguicidas
Se realizó una base de datos de plaguicidas para determinar los
agroquímicos tomando en cuenta la familia, procesos de degradación y la vida
media DT50, como referencia; TOXNET https://toxnet.nlm.nih.gov; PubChem
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov; DISI https://disi.gob.mx/agroquimicos/ (Anexo I).
6.3.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados.
Para cada tratamiento en esta Etapa I/Fase I, se tomó en cuenta la
valoración de tolerancia (86 cepas), se inocularon en agar medio mínimo mineral
M9 (Na2HPO4·7H2O 48 mM, KH2PO4 22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM, MgSO4
1 mM y CaCl2 0.1 mM: pH 7-7.2 (se ajustó HCL 1 M o NaOH 5 M), este se preparó
de acuerdo a la metodología de (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al., 2018a),
una vez esterilizado el medio y a temperatura de 40°C se agregó 200 ppm 0 200
mg/L patrón de plaguicidas marca comercial (glifosato, carbofurán, permetrina y
clorpirifós) como única fuente de carbono, cada plaguicida se preparó un stock 2
g/L disuelto en agua desionizada estéril y se filtró usando acrodisco 0.22 µm, y por
último se conservó a 4°C para su aplicación. Por medio de asas bacteriológicas por
estriado y posteriormente se incubaron a 28ºC durante 7 días, metodología con
modificaciones (Shabbir, 2018b) .
El ensayo se realizó considerando un blanco y testigo para garantizar la
confiabilidad de los resultados, como medida de control y para obtener datos
estadísticamente significativos por cuatro replicas (Anexo II). Para evaluar el
crecimiento en la caja se determinó una escala ponderada (elaboración propia),
tomando los siguientes criterios: área (valores:0-6) y densidad/biomasa
(observación) (valores:0-4) (Anexo III), dichos resultados se concentraron en una
58
matriz para luego generar la distribución de datos en un mapa de calor (Anexo IV)
para la interpretación de resultados. Se determinó la clasificación de las cepas en
dos grupos considerando la capacidad de tolerancia a 200 ppm (Tabla 8).
Tabla 8. Diseño experimental
Tratamiento Medio de Cultivo
Microorganismo
T (n)
M9 + [300ppm] de plaguicida
Cepa (n) TP (+) / PA (-)
Control
C1
M9 + [300ppm] de plaguicida
-----
C2
M9 Cepa (n) TP (+) / PA (-)
6.3.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.
Una vez realizado el análisis, se seleccionaron aquellas cepas que
presentaron tolerancia a las cuatro moléculas, para su posterior evaluación a
concentración a 5,000 ppm para cada patrón de plaguicida, posteriormente las
cepas que presentaron tolerancia a 5000 ppm se pasaron a 10,000 ppm, bioensayos
Etapa I/Fase II. El aumento de las concentraciones se determinó considerando la
literatura disponible de las concentraciones mínimas o máximas reportadas para
tolerancia y la degradación de los cuatro plaguicidas 10 a 8,000 ppm o mg/L, así
como la dosis que se aplica en campo. Este ensayo se realizó siguiendo la
metodología anterior, pero la interpretación de resultados no se aplicó la escala
ponderada, por lo que aquella cepa que presentara crecimiento positivo (+) y
ausencia de crecimiento (-), todos los tratamientos se llevaron considerando un
control y una réplica.
59
6.4 Etapa II
6.4.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán y
glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).
Estudios moleculares
6.4.1.1 Extracción de ADN
Bacterias
Una vez reactivas y purificadas las cepas, se realizó una resiembra masiva
en caldo de cada cepa para la obtención de biomasa, se pasó a la extracción de
ADN siguiendo los pasos indicados por el kit DNeasy UltraClean Microbial Kit
QIAGEN. Posteriormente, el ADN se observó en geles de agarosa al 1% teñidos
con bromuro de etidio y se visualizaron.
6.4.1.2 Amplificación de ADN mediante PCR
Para la amplificación de las regiones conservadas 16S y 18S se utilizaron los
siguientes cebadores; 515f -1100r (Yang et al., 2016) correspondientes a cada
fragmento de interés (Tabla 9) (Figura 17). La reacción de amplificación: 5 μL de
ADN [20 ng], 0.5 μL de cada oligonucleótido [10 μM], 5 μL de buffer PCR [5X], 2 μL
de MgSO4 [25 mM], 0.5 μL de dNTP‟s [10 mM], 0.2 μL de Taq polimerasa [5 U/μL]
y agua ULTRAPURA para llevar a un volumen final de 25 μL. Las reacciones se
colocaron en un termociclador, bajo las siguientes condiciones descritas en el
(Tabla 10). Por lo que, los productos de PCR se corrieron en una cámara de
electroforesis en un gel de agarosa al 1%, a un voltaje de 90 V durante 35 minutos
(Sabrook y Russell, 2001). Los resultados se observaron bajo luz ultravioleta en un
fotodocumentador. Los productos de PCR se purificaron con el kit PureLink™ PCR
Purification Kit Invitrogen, con las especificaciones descritas por el proveedor.
60
Diagrama de ubicación de cebadores de la región 16S rRNA. Ilustración de diferentes regiones variables. Las regiones rojas (V2, V8) tienen una resolución filogenética deficiente a nivel de phylum. Las regiones verdes (V4, V5, V6) están asociadas con la distancia geodésica más corta, lo que sugiere que pueden ser la mejor opción para los análisis relacionados con la filogenia y el análisis filogenético de nuevos filos bacterianos. La figura se refiere al mapa de cartilla de Lutzonilab (http://lutzonilab.org/16s-ribosomal-dna/). El uso de esta información fue aprobado por los autores originales del sitio web.
Tabla 9. Cuadro descripción de los cebadores para las regiones de 16S rRNA
Cebadores Secuencia (5 'a 3') Tamaño Referencia
515f GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 585 pb Turner et al., 1998 Weisburg et al., 1991
1100r AGGGTTGCGCTCGTTG Yang et al., 2016 16S1 AAGGAGGTGATCCAGCC 16S2 GAGASTITGATCHTGGCTCAG
Tabla 10. Condiciones de amplificación de ambas regiones 16S rRNA
Etapa 16S rRNA
Tiempo (min) Temperatura (ºC)
Desnaturalización inicial 4 95
Desnaturalización 1 95 Alineamiento 1 70
Extensión 2 72 extensión Final 5 75
(Kumar y Shukla, 2005)
(ADN ribosomal 16S | Lutzoni Lab 2019
61
6.4.1.3 Secuenciación
La pureza y la concentración del producto de PCR se midieron utilizando un
espectrofotómetro Nanodrop, aquellos que cumplieron con las especificaciones se
enviaron a la Instituto de Biotecnología de la UNAM por el método de Sanger y a la
empresa MACROGEN, se obtuvieron la generación de los archivos FASTA y su
archivo de calidad con base en el programa CONSED.
6.4.1.4 Análisis filogenético16S rRNA
Las secuencias obtenidas se analizaron mediante BLAST comparando con
anteriores resultados publicadas en el NCBI (por sus siglas en inglés, National
Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Posteriormente,
se llevó a cabo una alineación múltiple empleando el programa MAFFT (Katoh et al.,
2002), así como el filtrado de estos con ayuda de GBlocks (Selección de bloques
conservados de múltiples alineaciones para su uso en el análisis filogenético). Tras
el análisis se identificó el modelo de sustitución empleando el programa Model Test
(Posada, 2006). Para la construcción de árboles filogenéticos se utilizó el programa
Silva (https://www.arb-silva.de/aligner/) RAXML (Máxima Verosimilitud).
62
6.5 Etapa III
6.5.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con
mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas.
6.5.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes concentraciones
de glifosato.
El análisis del estudio anterior, se seleccionaron dos cepas del grupo I, (A)
una con capacidad de tolerancia (CT) mayor y (B) otra con un comportamiento
menor a concentraciones 200 ppm o mg/L, con base a nuestras escales ponderadas
y el análisis previo, para generar un cultivo mixto (consorcio artificial) y valorar curva
de crecimiento bacteriano en medio liquido M9* (Na2HPO4·7H2O 48 mM, KH2PO4
22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM), MgSO4 1 mM y CaCl2 0.1 mM,
suplementado con (3aa+0.2%FC+1vit); pH 7-7.2 (se ajustó HCL 1 M o NaOH 5 M),
a diferentes concentraciones 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10,000 ppm de
glifosato (N - (fosfonometil) glicina grado analito (96%) (marca Sigma-Aldrich
número de catálogo 337757-5G), el ensayo se realizó de forma individual (curva de
crecimiento de cada cepa A y B) y consorcio artificial (cultivo mixto), también se
consideró una cepa control (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al., 2018a).
a. Preparación Consorcio Artificial (cultivo mixto)
Una vez seleccionadas las cepas con base a su capacidad de tolerancia a
glifosato, y a su actividad hemolítica se descartando aquellas que presentaron β-
hemólisis positiva A (>CT) y B (<CT). Debido a que no se tiene datos individuales
sobre la eficacia de cada una de las cepas, se procedió a aplicar la misma cantidad
de inóculo a cada uno de los tratamientos.
Para la combinación de las cepas nativas preseleccionadas, inicialmente se
preparó los preinóculos de cada una de las cepas (dos asadas en 50 mL de caldo
nutritivo LB previamente esterilizado a 121 °C y 15 psi en erlenmeyers de 250 mL),
una vez listos los preinóculos, se realizó el lavado de las células y se ajustaron todas
63
las cepas a una misma OD 600 nm absorbancia de 0.2. Para ajustar la densidad
óptica se realizarán los cálculos correspondientes según la ecuación:
A1 V1 = A2 V2
Donde:
A1: OD 600 nm del cultivo de preinóculo
V1: volumen tomado del cultivo de preinóculo
A2: OD 600 nm absorbancia de 0.2
V2: volumen que se requiere inocular (20 mL)
El volumen V1 se depositó en un tubo falcón estéril de 45 mL y se centrifugo
a 2000 rpm durante 60 min. El sobrenadante fue descartado y el pellet se
resuspendió en el agua destilada estéril hasta completar 20 mL correspondiente a
cada cepa, para realizar la mezcla [A+B] (mismo volumen) y los preinoculos de
forma individual se conservaron para su posterior análisis.
b. Cinética de Crecimiento
Se inocularon los tratamientos con un volumen de preinóculo proveniente del
tratamiento anterior equivalente al 10% del volumen total del medio líquido (20 mL)
OD 600 nm absorbancia igual a 0.2. Una vez inoculado cada tratamiento (Tabla 11)
para cada concentración de glifosato, se pasaron a incubar a 150 rpm, 27± 2 ° C.
Todas las fermentaciones líquidas se llevarán a cabo con un pH inicial de 7-7.2 en
medio M9 suplementado, por duplicado, se tomaron lecturas cada 2 horas a las
cuales se les midió OD 600 nm (Basu et al., 1996).
64
Tabla 11. Diseño Experimental; tratamientos para evaluar M9 3aa+0.2%FC+1vit; 0-10000 ppm Glifosato; Cepas A y B; Consorcio
TRATAMIENTO
M9*+ 0
M9*+ 250ppm
M9*+ 500ppm
M9*+ 1000ppm
M9*+ 2500ppm
M9*+ 5000ppm
M9*+ 10000ppm
A B
MEZCLA (A+B) CONTROL
*blanco + testigo **3aa: triptofano, treonina y fenilalanina; 0.2% FC: porcentaje fuente de carbono (glucosa) mínima;
1vit: tiamina (tratamiento)
6.5.1.2 Comparación de un consorcio nativo (aislado ambiental) contra un
consorcio artificial en diferentes concentraciones de glifosato
El ensayo consistió en comparar ambos consorcios bajo las siguientes
condiciones, se utilizará agar medio mínimo Mineral M9 (Na2HPO4·7H2O 48 mM,
KH2PO4 22 mM, NaCl 8.6 mM, NH4Cl 18.7 mM, MgSO4 1 mM y CaCl2 0.1 mM); pH
7-7.2, para valora la capacidad de tolerancia de ambos consorcios en diferentes
concentraciones de 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10,000 ppm de glifosato (N -
(fosfonometil) glicina grado analito (96%) (marca Sigma-Aldrich número de catálogo
337757-5G). Se preparó el inoculo para ambos consorcios, estos fueron reactivados
(dos asadas en 50 mL de caldo nutritivo LB previamente esterilizado a 121 °C y 15
psi en erlenmeyers de 250 mL), se pasarán a medio agar LB para partir de
consorcios en medio sólido y una vez listos los preinóculos estos serán inoculados
en cada tratamiento, metodología de (Graf y Altenbuchner, 2011; Shabbir et al.,
2018a).
El ensayo se realizó considerando un blanco y testigo para garantizar la
confiabilidad de los resultados, como medida de control y para obtener datos
estadísticamente significativos por cuatro replicas. Para la interpretación de
resultados se utilizó escala ponderada.
65
6.6 Etapa IV
6.6.1 Objetivo 4. Diseño de primer para metagenómica funcional dirigida a
genes asociados a degradación de plaguicidas.
6.6.1.1 Construcción de la base de datos de genes asociados a la degradación de
plaguicidas
La búsqueda de las secuencias que codifican para enzimas asociadas a la
degradación de los diferentes plaguicidas reportados de bacterias se realizó usando
como referencia la base de datos de NCBI, (http://fungene.cme.msu.edu) y
(https://metacyc.org/). Una vez descargados los genomas se construyó una base de
datos con la información de los aislados previamente identificados y los genes
asociados a degradación de glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.
a. Diseño de primers
Para el diseño de primers se utilizó programa bioinformático OLIGO 6 (DBA
Oligo, Inc.; https://www.oligo.net/) y primers BLAST
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi que permite diseñar
cebadores para la región de interés (Araujo et al., 2018).
66
VII. RESULTADOS
En la presente tesis los objetivos se organizaron por etapas, con la finalidad
de llegar al diseño de metagenómica dirigida a un panel de genes asociados a la
degradación de los diferentes plaguicidas, por lo que a continuación se presentan
los resultados correspondientes a cada experimento desarrollado por cada etapa.
7.1 Etapa I
7.1.1 Objetivo 1: Valorar la capacidad de tolerancia a glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados de cultivos de papa, maíz
y trigo del noroeste de México.
7.1.1.1 Reactivación de las cepas aisladas de cultivos de papa (Solanum
tuberosum L.), maíz (Zea mays) y trigo (Triticum)
En la presente Se logró reactivar el total de los aislados 86 cepas no
identificadas de los tres sitos (papas Solanum tuberosum L., maíz (Zea mays) y trigo
(Triticum) se cuenta con morfologías diferentes correspondientes a 64 de bacterias,
21 hongos y un consorcio natural (NAV 12) aislado de Navojoa (Figura 18). Una
vez reactivas se realizó ensayo para medir su activada hemolítica, por lo que, se
reportan (+) a β-Hemólisis 6 cepas (GVE4, GVE8, CLN 7, NAV8, NAV15 y NAV16),
identificándose como probable patógeno estas se trabajaron con las medidas de
protección necesarias (Figura 19) (Tabla 12). El total de las cepas pasaron a
conservarse a temperatura de -20°C al 30% de glicerol.
67
Morfología de cepas aisladas de suelos; Guasave cultivo de papa
(Solanum tuberosum L.), Culiacán cultivos de maíz (Zea mays) y Navojoa cultivos
de trigo (Triticum) contaminado por plaguicidas. **Cepas reactivas en medio LB ;(a
–f) morfología presuntiva de bacterias; (g – i) morfología presuntiva de hongos.
(a) (b)
(g)
(d)
(i) (h)
(f) (e)
(c)
68
Prueba de Hemólisis. *(a) β-Hemólisis; halo de hemólisis completamente claro; (b) α-Hemólisis; lisis parcial de eritrocitos coloración verde alrededor de las colonias (producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina); (c) γ-Hemólisis; ausencia de hemólisis; estrado en medio Sangre Base Agar 5% de sangre de bovino.
Tabla 12. Prueba de hemólisis de bacterias aisladas Guasave, Culiacán y Navojoa
Bacterias por sitio de aislamiento Hemólisis
α β Γ
Guasave (cultivos de papa) 6 2 12
Culiacán (cultivo de maíz) 12 1 13
Navojoa (cultivo de trigo) 3 3 13
α- Hemólisis; lisis parcial de eritrocitos coloración verde alrededor de las colonias (producto de degradación de la hemoglobina llamado biliverdina): β-Hemólisis; halo de hemólisis completamente claro: γ-Hemólisis; ausencia de hemólisis
(a) (c) (b)
69
7.1.1.2 Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados.
Los bioensayos realizados en esta Etapa I/Fase I valoración capacidad de
tolerancia a 200 ppm concentración mínima PP, se determinó a partir de la
distribución de los datos interpretados mapa de calor para cada región
representados en las (Figura 20-24), dependiendo de su capacidad de tolerancia
(CT) a 200 ppm a los diferentes plaguicidas, se agruparon: Grupo I y Grupo II,
integrados por (bacterias y hongos respectivamente), por lo que Grupo I 24.42%
(21/86) cepas presentaron CT a los cuatro plaguicidas, incluyendo en este grupo a
NAV 12 (CN), así como también podemos resaltar aquellas cepas aisladas de
suelos agrícolas de Culiacán en su mayoría presentaron CT al total de los
plaguicidas evaluados, y representado el 75.58% (65/86) cepas CT a igual o menor
a tres plaguicidas evaluados determinando así el Grupo II, dentro de este se ubicó
aquellas cepas que resultaron con CT a glifosato y carbofurán, concentrándose en
la Tabla 13. En este primer ensayo se clasificó aquellas cepas con base a su
capacidad de tolerancia con la finalidad de filtrar y pasar a los siguientes ensayos.
Por último, de la variedad de plaguicidas evaluados en el presente experimento
carbofurán cuenta con la mayor incidencia en todos los aislados.
70
Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Guasave (cultivos de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós
Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores
dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i. Cepas de Guasave; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con
actividad hemolítica (+) ii. Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)
A)
B)
i) ii)
(a
(b
(c
71
Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Culiacán (cultivos de maíz) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós
Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores
dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con
actividad hemolítica (+) ii) Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)
A)
B)
i)
ii)
(a
(b
(c
72
Pruebas de tolerancia de bacterias aisladas de suelos agrícolas de
Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós
Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores
dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); c) Bacterias con
actividad hemolítica (+) ii) Repeticiones x1…x4; Densidad (DEN 0-6); Área (0-4)
A)
B)
i) ii)
(a
(b
(c
73
Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de
Navojoa (cultivos de trigo) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós
Etil; MM9 200 ppm. A) Histograma B) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores
dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Etiqueta cepas; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia); ii) Repeticiones x1…x4; Área (0-4)
A)
B)
(a
(b
i)
ii)
74
Pruebas de tolerancia de hongos aisladas de suelos agrícolas de
Guasave (cultivo de papa) a Glifosato, Carbofurán, Permetrina y Clorpirifós
Etil; MM9 200 ppm. a) Histograma b) Dendograma mapa de calor muestra una matriz en la distribución de datos representado por colores
dando un resumen de las diferencias numéricas en árbol de agrupamiento; i) Cepas de Guasave; a) Grupo I (mayor tolerancia); b) Grupo II (menor tolerancia) ii) Repeticiones x1…x4; Área (0-6)
A)
B)
(a
(b
i) ii)
75
Tabla 13. Cepas del total de los sitios clasificación determinada por las pruebas de tolerancia al total de los plaguicidas.
Grupo I: pasar a ensayos de aumento de concentraciones Grupo II: Se seleccionaron 14 cepas aquellas con capacidad para dos plaguicidas (glifosato) marcadas con (*) para ser identificadas y dos de estas cepas con capacidad de tolerancia a glifosato para conformar un consorcio) (cultivo mixto) (A) y (B) (CN); Consorcio Natural
GRUPO I (cuatro plaguicidas)
GRUPO II (tres ≤ plaguicidas)
GVE 1 CLN 3 NAV 6 GVE 3* CLN 1* NAV 1
GVE 2 CLN 4 NAV 12 (CN) GVE 5* CLN 2 NAV 2
G1 CLN 5 N 5 GVE 6* CLN 9* NAV 3
G2 CLN 6 N 6 GVE 7* (A) CLN 10 NAV 4
G6 CLN 8 GVE 9 CLN 11 NAV5*
G7 CLN 18 GVE 10 CLN 12 NAV 7
G8 CLN 20 GVE 11 CLN 13 NAV 9
CLN 23 GVE 12* CLN 14 NAV 10*
C 2 GVE 13 CLN 15 NAV 13
C 3 GVE 14 CLN 16 NAV 14*
GVE 15 CLN 17 NAV 17
GVE 16 CLN 19 NAV 18*
GVE 17 CLN 21 NAV 19*
GVE 18 CLN 22 N 1
GVE 19* (B) CLN 24 NAV 11 (H)
GVE 20* CLN 25 N 4
G5 CLN 26 N 7
G3 C 1 N 8
G4 N 9
G9 N 10
G10
76
7.1.1.3 Valorar la capacidad de tolerancia a 5000 y 10000 ppm glifosato,
carbofurán, permetrina y clorpirifós de las cepas del grupo I.
Los aislados clasificados en la (Etapa I) dentro del (Grupo I) caracterizados
como aquellos que presentaron CT al total de los plaguicidas (glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós) incluyendo al consorcio natural NAV12, así como también
consorcio artificial aislados GVE7 y GVE19 recordemos que estos pertenecen al
Grupo II. Dichas cepas pasaron a una segunda valoración CT ya que se aumentaron
las concentraciones de 200 ppm a 5000 ppm y una máxima de 10000 ppm, por lo
que se determinaron en esta Etapa I/Fase II, con base a las asociadas a procesos
de degradación y tolerancia de estos cuatro plaguicidas 10 a 8000 ppm o mg/L, así
como la dosis que se aplica en campo. En el ensayo de tolerancia a 5000 ppm se
encontró el 66.66% (16/24) aislados tolerantes a los cuatro plaguicidas y 45.83%
(11/24) cepas tolerantes a sólo tres de los plaguicidas a 10000 ppm, ya que la
mayoría no soportan concentraciones altas a permetrina. Dentro de este ensayo,
podemos destacar que los hongos presentan CT para ambas concentraciones, a
excepción de permetrina a 10000 ppm, así como dentro de estos aislados se cuenta
con un consorcio natural (NAV 12) conformado por dos morfologías diferentes estos
crecen entre, sin presentar antagonismo y dado a sus características de tolerancia
etapa II presentaron crecimiento a 5000 ppm en todos los plaguicidas, como
también en 10000 ppm en glifosato, carbofurán, y clorpirifós, con lo que respecta al
consorcio artificial presenta CT tan solo a concentraciones de 5000 ppm (Tabla 14).
77
Tabla 14. Ensayo aumento de concentraciones de plaguicida a 5000 ppm y 10000 ppm de las cepas que presentaron tolerancia a 200 ppm (Grupo I)
CEPAS Tolerancia a 5,000 ppm Tolerancia a 10,000 ppm
C-01 P-02 G-03 F-04 C-01 P-02 G-03 F-04
GVE 1 - - - -
GVE 2 + + + + + - - +
GVE 7(ICA) + + + + - - - -
GVE19(ICA) + + + + - - - -
GVE 21 + + + + + + - +
CLN 3 - - - -
CLN 4 + + + + + - + +
CLN 5 + + + + - + + +
CLN 6 + + + + - + - +
CLN 8 - - - -
CLN 18 + + + + - + - +
CLN 20 - - - -
CLN 23 + + - - - - - -
C 2 - - - +
C 3 - - - +
NAV 6 + + + + - - - -
NAV 12 (CN) + + + + + + - +
G1 + + + + + - + +
G2 + + + + + - + +
G6 + - + + + - + +
G7 + + + + + - + +
G8 + + + + + - + +
N 5 + + + + + - + +
N 6 + + + + + - + +
*C-01(Clorpirifós); P-02(Permetrina); G03(Glifosato); F-04(Carbofurán) **ICA (Integrante del Consorcio Artificial) ***CN (Consorcio Natural)
78
7.2 Etapa II
7.2.1 Objetivo 2. Identificar cepas con capacidad de tolerancia a carbofurán y
glifosato Grupo II por secuenciación Sanger (marcadores 16S rRNA).
Se determinó por secuenciación de amplicon de 16S rRNA especifico de la
región V1-V4, la identidad del grupo II se incluyen los aislados GVE7 y GVE 19
(integrantes del consorcio artificial). Por lo que, se reporta la predominancia de cinco
aislados identificados como Bacillus subtilis, seguido de Bacillus megaterium
registrando cuatro y el resto una diversidad de Bacillus como; Bacillus sp., Bacillus
cereus, Bacillus albus, Bacillus aryabhattai y Bacillus thuringiensis, es importante
señalar el análisis de sustitución por sitios se observó una distancia nucleotídica
(0.010) (Figura 25). Así como también, se realizó la distribución de datos en función
de los aislados previamente identificados en relación con su capacidad de
tolerancia, pudiendo interpretar que este grupo presenta una baja tolerancia a
clorpirifós y una mayor a carbofurán, como también presentando una CT intermedia
dichas cepas a glifosato y permetrina (Figura 26).
79
Cladograma del alineamiento de secuencias nucleotídicas. Aislados
con capacidad de tolerancia a carbofurán y glifosato Grupo II (por secuenciación
Sanger (marcadores 16S rRNA).
80
Dendograma aislados identificados asociados a su capacidad de tolerancia.
81
7.3 Etapa III
7.3.1 Objetivo 3. Conformar el consorcio microbiano a partir de las cepas con
mayor tolerancia a los diferentes plaguicidas.
7.3.1.1 Consorcio Artificial: valoración de tolerancia a diferentes concentraciones
de glifosato.
Para el diseño de este consorcio se seleccionaron dos cepas (A y B) dentro
del Grupo II aquella que presentaron una tolerancia alta a glifosato cepa (A) GVE7
y otra con una CT menor (B) GVE 19, ambas identificadas como Bacillus
megaterium. Para adecuar un medio con las características de potenciar el
crecimiento de ambas y generar un cultivo mixto, se adecuó un medio liquido medio
Mínimo Mineral M9 con algunos suplementos como aminoácidos (treonina,
triptófano y fenilalanina), 0.2% de glucosa (fuente de carbono mínimo) y vitamina
(tiamina), la intención de adecuar el medio M9 a una concentración baja de glucosa
para valorar a glifosato como fuente alternativa de carbono para el consorcio. Este
ensayo consistió en determinar una curva de crecimiento en medio liquido M9 a
concentraciones 0, 250, 500, 1000, 2500, 5000 y 10000 ppm de glifosato (N -
(fosfonometil) glicina grado analito (96%) de cepas individuales (Figura 27 a y b),
cultivo mixto (Figura 28) y de igual forma se compararon B. Subtilis WT; cepas
individuales; cultivo mixto (Figura 29). La representación gráfica cinética de
crecimiento correspondiente a cada tratamiento, dieron como resultados ambas
cepas Bacillus megaterium (GVE 7 y GVE 19) completa inhibición del crecimiento
microbiano en el tratamiento de máxima concentración a 10000 ppm,
comportamiento bajo concentraciones de 5000 ppm presentaron ambas cepas a las
12 hrs un aumento de biomasa similar alcanzando una OD 600 nm máxima a las 24
hrs, con respecto a la valoración del comportamiento del consorcio artificial (GVE7
+ GVE19 mix) coincide con los resultados individuales de las cepas en el tratamiento
10000 ppm, pero una marcada diferencia en biomasa en la última lectura 24 hrs se
puede observar mientras el crecimiento microbiano (mix) en concentraciones 0-
2500 ppm va disminuyendo, a concentraciones de 5000 ppm la OD 600 nm va
82
incrementando, de modo que podría asociarse a un proceso adaptativo a medida
que el tiempo transcurre. Grafica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales;
cultivo mixto curva de crecimiento a 5000 ppm, se puede observar una mínima
diferencia en relación con el comportamiento del consorcio artificial, ya que se logra
distinguir en la lectura 24 hrs a diferencia GVE7 un pequeño aumento de biomasa
en el mix, y una marca diferencia en relación con la cepa control B. Subtilis WT.
Los experimentos realizados anteriormente en la Etapa I/Fase II, donde se
aumentaron las concentraciones a 5000 y 10000 ppm estos bioensayos se llevaron
en medio mínimo mineral M9 sólido, en dichos experimentos se valoró CT de las
cepas GVE7 y GVE19 (integrantes del consorcio artificial), es importante mencionar
que presentaron CT a 5000 ppm y nulo crecimiento a concentraciones máximas de
10000 ppm (Tabla 15). Podemos entonces, relacionar estos resultados con las
observaciones en la cinética de crecimiento en medio liquido M9 ya que presentaron
este mismo comportamiento (Figura 27 a y b). En tanto, podemos interpretar la
metodología medio solido – liquido M9 un acercamiento a una correlación
presuntiva, ya que se propone llevar a cabo ambos experimentos bajo las mismas
condiciones.
83
(a)
(b)
Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium
GVE7 y GVE 19. (a) GVE7; (b) GVE19; ambos experimentos se llevaron a cabo bajo las mismas
condiciones; temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres
aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) respectivamente a concentraciones variables de patrón de plaguicida 0-
10000 ppm (línea azul 0 ppm; naranja 250 ppm; gris 500 ppm; amarilla 1000 ppm; azul claro 2500 ppm; verde
5000 ppm; azul marino 10000 ppm); representación gráfica de la curva entre densidad óptica OD 600 nm contra
tiempo (hora).
84
Curva de crecimiento tolerancia a glifosato de Bacillus megaterium
cultivo mixto (Consorcio). Experimento consorcio se llevaron a cabo bajo condiciones;
temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres
aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) respectivamente a concentraciones variables de patrón de
plaguicida 0-10000 ppm (línea azul 0 ppm; naranja 250 ppm; gris 500 ppm; amarilla 1000 ppm; azul
claro 2500 ppm; verde 5000 ppm; azul marino 10000 ppm representación gráfica de la curva entre
densidad óptica OD600 contra tiempo (hora).
85
Gráfica comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo
mixto curva de crecimiento a 5000 ppm. Se llevaron a cabo bajo condiciones;
temperatura, tiempo (24hrs) e inoculadas en Medio mínimo mineral M9 (modificado añadiendo tres
aminoácidos, 0.2% glucosa y tiamina) concentraciones del patrón de plaguicida 5000 ppm; línea
representada por color azul GVE7 Bacillus megaterium; naranja GVE19 Bacillus megaterium; gris
mix (consorcio); amarilla B. Subtilis WT; representación gráfica de la curva entre densidad óptica OD
600 nm contra tiempo (hora).
86
7.4 Etapa IV
7.4.1 Objetivo 4. Diseño de primer para genoteca de metagenómica funcional
dirigida a genes asociados a degradación de plaguicidas.
Para esta última etapa con base a los ensayos previos se determinó el panel
de oligos (primers) de cepas identificadas dentro del grupo II incluyendo consorcio
artificial, con el objetivo de proponer posible diseño para la genoteca de
metagenómica funcional dirigido para aquellos genes asociados a rutas centrales a
la degradación en específico a los cuatro plaguicidas, a través de MetaCyc se ha
identificado los siguientes genes para cada de los plaguicidas; glifosato phnJ,
carbofurán mcd, permetrina estP y por ultimo clorpirifós cpd, por lo que, se podrá
encontrar descrita en tanto a la vía de degradación, espacie de la cual han sido
aislados, así como también gen, proteína y numero de acceso en la Tabla 15.
Una vez determinada la base de datos correspondiente a cada vía de
degradación y ubicando el gen central, se realizó el diseño de primers, basándonos
en las 14 cepas correspondientes al grupo II (CLN1 Bacillus thuringiensis; NAV19
Bacillus cereus; NAV 5 Bacillus sp; GVE20 Bacillus albus; GVE6 Bacillus
aryabhattai; GVE7 Bacillus aryabhattai; GVE19 Bacillus aryabhattai; GVE5 Bacillus
aryabhattai; NAV18 Bacillus subtilis; CLN9 Bacillus subtilis; GVE12 Bacillus subtilis;
GVE3 Bacillus subtilis; NAV14 Bacillus subtilis y NAV10 Bacillus subtilis), esto con
la finalidad de generar un panel dirigido a la variedad de especies de Bacillus, por
tanto el diseño está en función de la relación gen-especie (Tabla 16).
87
Tabla 15. Base de datos vías de degradación asociadas a genes de degradación para glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.
TOLERANCIA Vía
Degradación
Especie gen/ Acceso Proteína
GLIFOSATO Vía
C-P Liasa
VIA III
Rhizobium
meliloti
(cepa 1021)
Ensifer
meliloti
Sinorhizobium
meliloti
phnJ
SM_RS24155
Ubicación: plásmido:
pSymB
Secuencia:
NC_003078.1
UniProtKB - Q52987
α- D- ribosa 1-
metilfosfonato
5-fosfato CP-
liasa
CARBOFURÁN Vía
etilmalonil-
CoA
Rhodobacter
sphaeroides
mcd
SMR D3JV03
UniProt D3JV03
(2S) -
metilsuccinil-
CoA
deshidrogenasa
PERMETRINA --------- Klebsiella sp.
ZD112
estP
G-12541 (MetaCyc)
Q52NW7 (UniProt)
Piretroide
Hidrolasa
Esterasa
Hidrolizante de
piretroides
CLORPIRIFÓS Degradación
Clorpirifós
Paracoccus
sp. TRP
cpd
G-80423 (MetaCyc)
SAMN02746000_03607
A0A1X7LL67 (UniProt)
Clorpirifos
Hidrolasa
88
Tabla 16. Diseño de primers para la aplicación metagenómica
AISLADO
Carbofurán Glifosato Permetrina Clorpirifós
posición/tamaño posición/tamaño posición/tamaño posición/tamaño
CLN 1
Bacillus thuringiensis
cepa OCAT32
1 (66-361) --------- --------- ---------
315pb --------- --------- ---------
2 (180-599) --------- --------- ---------
439 pb --------- --------- ---------
3 (420-944) --------- --------- ---------
544 pb --------- --------- ---------
NAV 19
Bacillus cereus cepa
FORT 87
1(67-608) --------- --------- 1(178-313)
561 pb --------- --------- 136pb
2 (608-779) --------- --------- 2 (288-829)
191 pb --------- --------- 542 pb
NAV 5
Bacillus cereus cepa
FORT 87
1(67-608) --------- --------- 1(178-313)
561 pb --------- --------- 136pb
2 (608-779) --------- --------- 2 (288-829)
191 pb --------- --------- 542 pb
GVE 6
Bacillus aryabhattai cepa CN13-
5 Bacillus sp.
cepa HRTK156 Bacillus
megaterium cepa SD15
1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------
114 pb 168 pb 964 pb ---------
2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------
391 pb 453 pb 154 pb ---------
3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------
705 pb 302 pb 738 pb ---------
GVE 7
Bacillus aryabhattai cepa CN13-
5
1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------
114 pb 168 pb 964 pb ---------
2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------
391 pb 453 pb 154 pb ---------
3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------
705 pb 302 pb 738 pb ---------
GVE 19
Bacillus aryabhattai cepa IGND-
13
1 (90-203) --------- --------- ---------
114 pb --------- --------- ---------
2 (185-575) --------- --------- ---------
391 pb --------- --------- ---------
3 (411-1115) --------- --------- ---------
705 pb --------- --------- ---------
GVE 5
Bacillus aryabhattai cepa CN13-
5
1 (90-203) 1 (59-226) 1 (486-1449) ---------
114 pb 168 pb 964 pb ---------
2 (185-575) 2 (117-569) 2 (1423-1557) ---------
391 pb 453 pb 154 pb ---------
3 (411-1115) 3 (444-745) 3 (752-1469) ---------
705 pb 302 pb 738 pb ---------
89
NAV 18
Bacillus subtilis cepa CICC10028
1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) 1 (51-261)
197 462 pb 964 pb 211 pb
2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) 2(289-308)
558 pb 681 pb 154 pb 359 pb
--------- --------- 3 (752-1469) 3 (629-846)
--------- --------- 738 pb 218 pb
CLN 9
Bacillus subtilis cepa
D9 16S
1 (225-421) --------- --------- ---------
197 --------- --------- ---------
2 (402-959) --------- --------- ---------
558 pb --------- --------- ---------
GVE 12
Bacillus subtilis cepa
D9 16S
1 (225-421) --------- 1 (486-1449) ---------
197 --------- 964 pb ---------
2 (402-959) --------- 2 (1423-1557) ---------
558 pb --------- 154 pb ---------
--------- --------- 3 (752-1469) ---------
--------- --------- 738 pb ---------
GVE 3
Bacillus subtilis cepa IAM 12118
1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) ---------
197 462 pb 964 pb ---------
2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) ---------
558 pb 681 pb 154 pb ---------
--------- --------- 3 (752-1469) ---------
--------- --------- 738 pb ---------
NAV 14
Bacillus sp. cepa BAB-
5924 Bacillus
subtilis cepa sdau08-96
Bacillus velezensis cepa B6-2
1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) ---------
197 pb 462 pb 964 pb ---------
2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) ---------
558 pb 681 pb 154 pb ---------
--------- --------- 3 (752-1469) ---------
--------- --------- 738 pb ---------
NAV 10
Bacillus sp. cepa BAB-
5924
1 (225-421) 1 (55-516) 1 (486-1449) 1 (32-233)
197 pb 462 pb 964 pb 202 pb
2 (402-959) 2 (59-724) 2 (1423-1557) 2 (149-899)
558 pb 681 pb 154 pb 751 pb
--------- --------- 3 (752-1469) ---------
--------- --------- 738 pb ---------
GVE 20
Bacillus albus cepa
FA77 Bacillus sp. (alternativa)
1 (66-380) --------- --------- ---------
315 pb --------- --------- ---------
2 (366-958) --------- --------- ---------
593 pb --------- --------- ---------
90
VIII. DISCUSIÓN
En los últimos años, el aumento en la demanda de alimentos a causa del
incremento en el número de población que se estima en 8.500 millones de personas
para el 2030, por lo que se ha intensificado el uso de los plaguicidas (Clark y Tilman,
2017; Crist et al., 2017). Los organofosforados (OP) posicionados como uno de los
principales en el mercado internacional como insecticidas y herbicidas (Liu et al.,
2018); Glifosato [Ácido 2- (fosfonometilamino) acético], herbicida más popular y de
amplio espectro, en los campos de producción agrícola desde 1974 (Gill et al.,
2017). Dado a informes actuales por la Agencia Internacional de Investigación
contra el Cáncer (IARC), la Organización Mundial de la Salud reclasificó a glifosato
en la categoría 2A (IARC, 2015; Bai y Ogbourne, 2016); Clorpirifós, [dietoxi-
sulfaniliden- (3,5,6-tricloropiridin-2-il) oxi-λ 5 -fosfano] toxicidad moderada (Clase II),
por su actividad insecticida de amplio espectro contra plagas de artrópodos, los
convierte en uno de los OP de mayor consumo (Liu et al., 2018).
Otros plaguicidas como carbofurán, [2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-il
metilcarbamato] (insecticida, nematicida y acaricida), pertenece al grupo químico de
los carbamatos y a la categoría IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico
(EPA), a pesar de ser químicamente inestable debido a la hidrólisis en el medio
ambiente, sus residuos a menudo se detectan en las aguas subterráneas debido a
su uso generalizado en el suelo y su alta fluctuación (Campbell et al., 2004). Dentro
de los piretroides con mayor estabilidad ambiental y actividad insecticida es
permetrina [3- (2,2-dicloroetenil) -2,2-dimetilciclopropano-1-carboxilato de (3-
fenoxifenil) metilo] el uso generalizado y la aplicación constante en los suelos
agrícolas, ha generado la acumulación en diferentes entornos, especialmente en el
suelo, debido que se unen fuertemente a las partículas y la materia orgánica de éste
(Antwi y Reddy, 2015). Permetrina se clasifica en el grupo IA. Extremadamente
peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA).
El movimiento de los plaguicidas en el suelo se produce por medio del flujo
intermedio, la lixiviación, el desbordamiento de la superficie, el drenaje subterráneo
y la transferencia de nutrientes minerales del suelo a los productos agrícolas (Dar
91
et al., 2019a). Por lo que, éste puede actuar como un medio potencial de transporte
de plaguicidas para contaminar el agua, el aire, suelo, las plantas y los alimentos,
impactando diferentes ecosistemas, así como también la salud humana. En la
presente investigación, se determinó la capacidad de tolerancia (CT) mediante el
crecimiento en medio sólido M9 como única fuente de carbono (patrón de
plaguicida) a diferentes concentraciones partiendo con 200 ppm hasta 10000 ppm
de glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós de cepas aislados de suelos
agrícolas de tres sitios diferentes (Culiacán, Guasave y Navojoa) y consorcios
natural como artificiales, se determinó el diseño para la conformación de consorcios
artificial, así como curva de crecimiento a concentraciones diferentes a un máximo
de 10000 ppm de glifosato, los aislados caracterizados como tolerantes se
identificaron por 16S rRNA y se diseñó un panel de oligos para genes asociados a
rutas metabólicas de degradación de éstos cuatro plaguicidas.
En la Etapa I/Fase I, se clasificaron el total de los 86 aislados (hongos,
bacteria y consorcio natural) en Grupo I (21/86) 24.42% CT cuatro plaguicidas,
incluyendo en este grupo a NAV 12 (CN) y Grupo II 75.58% (65/86) CT tres ≤
plaguicidas. Una vez agrupadas las cepas en función de su CT, se valoró grupo I
concentraciones máximas Etapa I/Fase II; por lo que, aislados que presentaron
crecimiento para el total de plaguicidas en tratamientos a 5000 ppm (GVE2, GVE7*,
GVE19*, GVE21, CLN4, CLN5, CLN6, CLN18, NAV6, NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8,
N5, N6), y para 10000 ppm (GVE21, CLN4, CLN5, NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8,
N5, N6) estos presentaron CT (3/4) plaguicidas (permetrina). En este experimento
se incluyeron GVE7 y GVE19 (consorcio artificial) presentado CT a 5000 ppm,
presentando un comportamiento diferente NAV12 (consorcio natural) ya que
presentó CT a 10000 ppm (carbofurán, permetrina y clorpirifós). Podemos
mencionar que dichas cepas se aislaron de suelos agrícolas del estado de Sinaloa
y Sonora. En el año 2019, el Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático
(INECC) presentó un panorama amplio y actual sobre las investigaciones y estudios
que se han efectuado en el país para detectar la presencia y cuantificar los niveles
de plaguicidas en agua superficial, agua subterránea y suelo en 125 sitios de
México, representando ambas entidades mayor actividad agrícola y del total de los
92
sitios identificados, se reporta el Valle de Culiacán, una zona con intensa actividad
agrícola y así como también el mayor número de plaguicidas detectados, con 31
ingredientes activos y algunos metabolitos. La acumulación de estos plaguicidas en
el ambiente, por diversos procesos, puede afectar la capacidad del suelo para
realizar sus funciones de producción biológica, protección ambiental y sustento de
la salud humana (Leyva-Morales et al., 2014b; Martínez-Valenzuela et al., 2017).
Sonora y Sinaloa utilizan entre un 40 y 50% de PAPs, destacando por su alta
toxicidad: paratión metílico, malatión, metamidofos, clorpirifós, monocrotofos,
paraquat, glifosato, carbofurán, metomilo, mancozeb, clorotalonil, dimetoato,
carbarilo, atrazina, 2,4-D, fosfuro de aluminio, imidacloprid, cipermetrina, lambda
cialotrina y endosulfán (Bejarano, 2017; García et al., 2018; Camarena et al., 2019).
Estos se han detectado en muestras de agua, sedimento, suelo agrícola,
organismos acuáticos, roedores entre otros (Arellano-Aguilar y Von Osten, 2016;
Hernández et al., 2018). Por lo que, dichos suelos han sido impactados a través de
los años por estos plaguicidas, indicando que un mayor tiempo de exposición al
plaguicida para estos suelos podría ser la causa de un aumento en la población
microbiana con capacidad de tolerancia a estos.
Por tanto, dado que los microorganismos persisten a compuestos
recalcitrantes, estos se han asociado y caracterizado por llevar a cabo funciones
importantes en relación con la degradación de xenobióticos, así como también influir
en los procesos físicos o químicos durante la degradación (Chakrabarty, 2017). Un
estudio reciente por Rosado-Flores et al., (2020), en este sentido caracterizaron
capacidad de tolerancia a 2, 4- diclorofenoxiacético (2,4-D) y malatión e identificaron
por 16S rRNA y región ITS, de una diversidad microbiana de suelos agrícolas de
diferentes localidades de Guanajuato, en el presente ensayo reportan la medición
de la capacidad de tolerancia en relación a la concentración celular por variantes de
densidad óptica (OD) a una longitud de 625 nm en medio mínimo (MM) líquido, por
lo que reportan cepas de Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas pavanii y
Acinetobacter lactucae crecimiento a una concentración > 2.0 g/L (2000 ppm) de
2,4-D y > 1.0 g/L (1000 ppm) de malatión. Así como, Fusarium sp., a 2.0 g/L (2000
ppm) de malatión y 0.9 g/L (900 ppm) de 2,4-D y Talaromyces variabilis a 3.1 g/L
93
(3100 ppm) de malatión. Menciono que, en otro estudio reportan de un total de seis
aislados de suelos agrícolas de Tailandia, una cepa con una capacidad de tolerancia
a clorpirifós a una concentración máxima de 2000 ppm en comparación de las
concentraciones reportadas en el medio ambiente (50-100 ppm), dicho ensayo es
importante destacar que para la medición de la capacidad de tolerancia que se llevó
bajo las siguientes condiciones; valoración crecimiento microbiano (turbidez) en
medio mínimo mineral M9 líquido a diferentes concentraciones de plaguicida
(clorpirifós), e identificada por 16S rRNA como Pseudomonas stutzeri CHL3, dicha
cepa presenta potencial para ser utilizada para biorremediación no sólo para
clorpirifós sino también para otros insecticidas organofosforados (Phumkhachorn,
2020).
En el presente estudio, respecto a la valoración capacidad de tolerancia (CT),
se empleó medio mínimo mineral M9 sólido aplicado en la metodología Etapa I, esto
debido a la composición del medio de cultivo (no complejo) siendo un parámetro
importante en los ensayos permitiendo un medio selectivo en presencia de
plaguicida. Por lo que, los medios complejos pueden incluir protectores, como
antioxidantes o agentes quelantes. Así mismo, estos ensayos tolerancia al estrés
químico, es necesario la presencia de energía para las bombas de eflujo molecular,
la actividad de chaperona , los cambios en la composición de la membrana y las
funciones de reparación (Nicolaou et al., 2010). En otro estudio, en el cual evaluaron
la capacidad de tolerancia a cinco plaguicidas (sales dimetilaminas, tri-
isopropanolaminas y de glifosato, atrazina y carbofurán) a concentraciones de 0.05,
1, 5 y 10% v/v (500, 10000, 50000 y 100000 ppm), utilizando dos medios de cultivo:
TY (Triptona / Extracto de Levadura) y Bushnell Haas (FLUKA) (Ortiz et al., 2019).
Debido a la diversidad de trabajos, enfocado en la capacidad de tolerancia y
degradación de plaguicidas se tiene una variación de expresión de unidades para
la concentración de patrón de plaguicidas, en el presente trabajo se manejó las
unidades (ppm) siendo la de mayor frecuencia. Así como, se definió el medio M9,
ya que nos permitió medir crecimiento microbiano sin fuente de carbono,
indicándonos su capacidad para tolerar y posiblemente utilizar los plaguicidas como
única fuente, en función de su crecimiento en medio sólido, como también reducir
94
tiempo y costo, debido que se trabajó en la primera etapa con un total de 86
aislados.
Los aislados, una vez valorada su capacidad de tolerancia a los diferentes
plaguicidas, en una segunda etapa los aislados seleccionados del Grupo II (GVE3,
GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*, GVE20, GVE12, CLN1, CLN9, NAV5, NAV10,
NAV14, NAV18, NAV19) (predominante glifosato y carbofurán), con el objetivo de
un análisis molecular (secuenciación 16S rRNA) identificados como Bacillus subtilis,
Bacillus megaterium Bacillus sp., Bacillus cereus, Bacillus albus, Bacillus
aryabhattai y Bacillus thuringiensis. Narsing Rao et al. (2019) evaluaron y proponen
reclasificar Bacillus aryabhattai como sinónimo heterotípico posterior de Bacillus
megaterium de Bary 1884 (Listas aprobadas 1980). Por lo que, las cepas
identificadas como Bacillus aryabhattai (GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*) podrán
renombrarse como Bacillus megaterium (Figura 26). Microorganismos
caracterizados como biorremediadores de plaguicidas son Pseudomonas sp.,
Bacillus sp., Klebsiella sp., Pandoraea sp., Phanerochaete chrysosporium y
Mycobacterium sp. (Odukkathil y Vasudevan, 2013).
En particular, se reporta crecimiento de Baciillus subtilis Bs-15 en
concentraciones altas de glifosato como fuente de carbono y fosfato, presentando
una capacidad de tolerancia máximas de 40000 ppm en medio mínimo mineral MS1
líquido midiendo CT a OD a una longitud de 600 nm (crecimiento bacteriano), así
como también reportan condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano y la
degradación del glifosato menos de 10000 ppm de glifosato, temperatura de 35°C y
un pH de 8.0; medido en suelos estéril y no estéril (Yu et al., 2015). Este reporte,
coincide con los aislados (NAV18, NAV14, NAV10, GVE12, GVE3, CLN19)
identificados como Baciillus subtilis con una CT 200 ppm a glifosato, por lo que, es
necesario continuar aumentando la concentración ya que pueden presentar una
mayor capacidad de tolerancia y ser un candidato para las próximas combinaciones
de consorcios pudiendo presentar similitud con el aislado Bs-15. En relación con los
resultados presentados en la valoración de medio líquido de las cepas para la
conformación de consorcios (GVE7* y GVE19*) Bacillus megaterium los cuales
95
presentaron CT a glifosato a 5000 ppm, se podría continuar adecuando el medio de
cultivo como única fuente de fosfato, ya que solo evaluamos fuente carbono, de
igual forma trabajar con el diseño del medio MS1 que podría ser una posible
alternativa para el mejoramiento de condiciones óptimas para el crecimiento de
estas dos cepas. Así también la cepa NAV 12 (CN) CT 10000 ppm a glifosato será
necesario aumentar concentraciones, con las diferentes variables (M9 y MS1), y
fuente (carbono y fosfato).
Por otra parte, es necesario mencionar que para determinar las
concentraciones de los diferentes plaguicidas que nos permitió identificar aquellas
cepas con CT, se requiere una revisión en función de concentraciones asociadas a
la degradación. En este sentido, se reporta Bacillus cereus CBMAI2067, aislada de
la sabana brasileña para la biodegradación de esfenvalerato (piretroide) 100 mg/L
o ppm (67 ± 3% de biodegradación), estos resultados nos permiten contrastar tanto
el emplear medio sólido M9 y las concentraciones determinadas iniciando una
primera etapa determinando capacidad de tolerancia CT a 200 ppm (concentración
media; glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós), en esta etapa encontramos
dos cepas (NAV5/NA19) identificadas como Bacillus cereus, capacidad de
tolerancia a 200 ppm para permetrina siendo un piretroide, de modo que nos permite
comparar nuestro resultados con la capacidad de degradación de la cepa Bacillus
cereus CBMAI2067, teniendo en cuenta que empleamos medio sólido permitiendo
así valorar crecimiento microbiano y no concentración del plaguicida, por lo que,
podemos concluir que a concentraciones mayores de 100 ppm podemos asociar
capacidad de tolerancia con degradación, debido a que estas bacterias crecen bajo
un estrés químico.
El género de Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae que comprende 293
especies/subespecies. Estos comparten características similares, son bacterias
grampositivo, aeróbicas o anaeróbicas facultativas, formadoras de esporas (Patel y
Gupta, 2020). Especies de Bacillus se han aislado de una variedad de fuentes, al
ser ubicuos. Por lo que, bacilos constituyen un grupo versátil de bacterias, con
aplicaciones en el campo salud, medio ambiente y agricultura. Producen varios
96
metabolitos secundarios que incluyen antibióticos y biosurfactantes (Caulier et al.,
2019). Además, son fuentes potenciales de enzimas industriales que incluyen
lipasas, proteasas, alfa-amilasa y la enzima de restricción BamH1 (Latorre et al.,
2016). Asimismo, en la biodegradación de varios xenobióticos entre ellos incluidos
los plaguicidas. Debido a que, Bacillus, puede degradar los compuestos tóxicos por
medio de dos procesos; (i) Mineralización completa, (ii) Co-metabolismo (Arora,
2020). Onunga et al. (2015) identificaron Bacillus sp. pudiendo considerarse Bacillus
cereus o Bacillus thuringiensis, reportan como cepa nativa con capacidad de
biodegradación ya que, mineraliza el 98% de 100 μg/mL o ppm de carbofurán en 10
días. Esto coincide con nuestro trabajo, aislado Bacillus cereus (NAV19) y Bacillus
thuringiensis (CLN1) ambas cepas presentaron CT 200 ppm a carbofurán,
mencionemos que ambos experimentos se realizaron bajo determinadas
condiciones y objetivos diferentes, nuestro ensayo es solo valoración de capacidad
de tolerancia en medio sólido, por lo que, estas dos cepas podrían considerarse
para cuantificación de plaguicida por cromatografía de gases (GC) y cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC).
En esta segunda etapa, se elaboró dendograma aislados identificados
asociados a su capacidad de tolerancia, para determinar correlación entre especie
y CT, facilitando su clasificación (Figura 28). Las cepas con capacidad de tolerancia
a glifosato 200 ppm son; Bacillus cereus (NAV19), Bacillus aryabhattai (GVE7;
GVE5), Bacillus subtilis (NAV18; NAV14; NAV10) resultados representados en el
dendograma. Estos resultados concuerdan con el primer informe de la cepa CB4
Bacillus cereus con capacidad de degradar glifosato (Fan et al., 2012). Además, se
reporta B. megaterium asociado biorremediación de sitios contaminados con
glifosato, debido a que utiliza glifosato como fuente de carbono y fósforo (Mousa et
al., 2019). Por consiguiente, el hecho de encontrar en nuestros aislados diversas
especies de Bacillus, confiere a este grupo II un potencial para futuros trabajo
derivados de estas evidencias, teniendo en cuenta que este grupo no se llevó a
máximas concentraciones (5000 y 10000 ppm), además mencionar que podrían ser
posibles candidatos para la combinación de más consorcios, considerando que en
97
esta etapa de investigación solo se logró desarrollar un consorcio artificial y obtener
de los aislados un consorcio natural.
El uso de consorcios microbianos para mejorar la eficiencia de la
biodegradación ha aumentado debido a su capacidad de metabolismo sinérgico. El
intermediario metabólico de un microorganismo puede ser utilizado por otra para
una degradación eficiente, acelerando así la biodegradación y evitando los posibles
efectos tóxicos de los metabolitos formados (Li et al., 2017; Villaverde et al., 2017a).
Los consorcios de tres microorganismos (Brevibacterium frigoritolerans, Bacillus
aerophilus y Pseudomonas fulva) degradan forato (entre 97.65 y 98.31%) a
concentraciones de 100, 200 y 300 mg/kg o ppm en suelos inoculados con cultivos
mixtos (Villaverde et al., 2017b). Por lo contrario, reportan un consorcio bacteriano
(Lysinibacillus xylanilyticus CBMAI2085, Bacillus cereus CBMAI2067, Lysinibacillus
sp. CBMAI2051 y Bacillus sp. CBMAI2052) aislados de la sabana brasileña para la
biodegradación de 100 mg/L o ppm de esfenvalerato (piretroide) como única fuente
de carbono en medio de cultivo líquido en un tiempo de 12 días en un 90%, también
compararon el consorcio bacteriano (52 ± 5% de biodegradación) en relación al
promedio de las mismas cepas individuales (40 ± 7% de biodegradación) reportando
mayor eficiencia el consorcio, lo que demuestra que el uso de consorcios es un
enfoque interesante. Sin embargo, la cepa Bacillus cereus CBMAI2067 (67 ± 3% de
biodegradación) fue más eficiente que el consorcio bacteriano, mostrando su
potencial como fuente de carboxilesterasas y demostrando que, en este caso, el
uso de una cepa eficiente única es más adecuado (Anjos et al., 2020).
Se ha conformado un consorcio microbiano artificial a partir de las cepas
grupo II (GVE7 y GVE19) B. megaterium identificadas por 16S rRNA y previamente
caracterizadas dado que cumplen con capacidad de tolerancia carbofurán, glifosato,
clorpirifós y permetrina a concentraciones hasta 5000 ppm M9 sólido valorado
durante 7 días de incubación y curva de crecimiento M9 líquido concentraciones 0-
10000 ppm de glifosato valorada durante 24 hrs, así como también un consorcio
natural NAV12 el cual ha sido caracterizado con un potencial de tolerancia a
concentraciones máximas de 10000 ppm en medio sólido M9 durante 7 días. En el
98
contexto del panorama de valoración en medio líquido, podemos referenciar el
trabajo de Uniyal et al., (2021) ya que evaluaron crecimiento bacteriano y
biodegradación a una concentración inicial de 50 mg/L o ppm de clorpirifós como
única fuente de carbono en medio líquido MSM; tanto de consorcios como de
cultivos axénicos, dichos aislados de muestras de suelos de huertos de manzana,
en tanto reportan capacidad de degradación de CP de cepas bacterianas y el
consorcio presentando una disminución en la concentración de CP con degradación
completa durante los 8 y 6 días de incubación, respectivamente. Por lo que reportan
de acuerdo con el orden: consorcio ECO-M> Cepa ECO2 de Cellulosimicrobium
funkei > Cepa ECO1 de Agrobacterium tumefaciens > Cepa ECO3 de Shinella
zoogloeoides > Cepa ECO4 de Bacillus aryabhattai, dado que concluyen que el
consorcio ECO-M formado por la cepa ECO1 de Agrobacterium tumefaciens, la
cepa ECO2 de Cellulosimicrobium funkei, la cepa ECO3 de Shinella zoogloeoides
y la cepa Bacillus aryabhattai ECO4, establece un enfoque más eficaz para la
biodegradación de CP en comparación con los cultivos axénicos. En contraste con
nuestros resultados en los ensayos valoración capacidad de tolerancia a glifosato
como única fuente de carbono a concentraciones 0-10000 ppm en medio líquido M9
para cepas individuales y cultivo mixto (consorcio), en nuestro diseño se utilizaron
concentraciones iniciales máximas, a diferencia de concentraciones bajas (50 mg/L
o ppm) de clorpirifós empleadas por Uniyal et al., (2021) ya que reportan capacidad
de degradación y no capacidad de tolerancia, así como también cuantificación del
plaguicida por cromatografía. Por lo que, se demostró así en la (Figura 26) gráfica
comparativa B. Subtilis WT; cepas individuales; cultivo mixto curva de crecimiento
a 5000 ppm, en la cual no se logró observar diferencia significativa en el
comportamiento entre consorcio y cultivos axénicos, debido que solo se valoró
capacidad de tolerancia bajo un diseño de concentración nula hasta máximas
valoradas durante 24 hrs, por lo que es necesario diseñar ensayos a
concentraciones 5000 ppm y evaluar a un mayor tiempo (días) y cuantificar
concentraciones inicial y final del plaguicida, como lo sugiere dicho reporte. Otro
punto que es pertinente mencionar, es que en ambos ensayos tanto el de Uniyal et
al., (2021) y nuestros ensayos, se evaluaron organofosforados diferentes clorpirifós
99
y glifosato, por lo que, coinciden en la identificación de Bacillus aryabhattai ECO4
(degradación completa 50 mg/L o ppm CP) con las cepas del presente trabajo
reportadas como Bacillus aryabhattai (GVE5, GVE6, GVE7*, GVE19*)
caracterizadas en función de su capacidad de tolerancia en medio sólido M9 a 200
ppm de glifosato presentando crecimiento positivo el total de las cepas, y en
relación al crecimiento en medio líquido M9 a concentraciones 250, 500, 1000, 2500,
5000 ppm mismo patrón de plaguicida positivas (GVE7 y GVE19). Estos resultados,
coinciden con el reporte de Elarabi et al. (2020), aislaron una cepa con capacidad
de tolerancia a 50, 100, 150, 200 y 250 mg/mL (50000, 100000, 150000, 20000 y
250000 ppm) concentraciones máximas de glifosato valorado en líquido medio de
sales minerales (MSM) cuantificando UFC durante 7 días, dicha cepa identificada
como Bacillus aryabhattai FACU3 por 16S rRNA. Podemos destacar que en tal
estudio se emplearon concentraciones para aislar y caracterizar CT a glifosato
mayores a las reportadas en nuestros aislados, dado al tiempo, debido que
valoramos durante 24 horas. Pailan et al. (2015) reportan una nueva cepa de
Bacillus aryabhattai SanPS1 aislada del suelo de un campo agrícola en India,
identificación por 16S rRNA, reportan CT a hasta 500 µg/mL o ppm para clorpirifós
y paratión, y una degradación de paratión (200 µg/mL o ppm) aproximadamente del
56% en medio mineral líquido (MM) durante las primeras 24 hrs. Por consiguiente,
se puede concluir que la especie de Bacillus aryabhattai presenta un amplio
espectro a diferentes organofosforados.
El diseño de consorcios microbianos aislados de suelos contaminados podría
asegurar una biorremediación más efectiva. Con relación a los resultados de la
presente tesis el consorcio artificial (B. megaterium) CT 5000 ppm, nos permite
formar consorcio de los cuales se pueden modificar, mejorar condiciones de
supervivencia, siendo que estas características son de alto interés en el desarrollo
de este tipo de consorcios, por tanto, se dejan los principios para futuras
combinaciones del resto de los aislados tanto del Grupo I y II. Asimismo, con lo que
respecta el consorcio natural NAV12 caracterizado CT 10000 ppm medio sólido M9,
se sugiere continuar con una identificación molecular, siendo un candidato para
evaluación en medio líquido (curva de crecimiento). Ambos consorcios, son buenos
100
candidatos para cinética de degradación, para dar seguimiento de la presente
investigación.
Aun cuando, se ha reportado diversos microorganismos caracterizados por
su capacidad de tolerar, degradar xenobióticos como los plaguicidas, así como
también se han descrito numerosas rutas metabólicas y aislamiento de enzima
centrales. Para confirmar nuestra hipótesis la presencia y variación de genes de los
integrantes del consorcio microbiano aumentará el espectro de tolerancia a diversas
familias de plaguicidas. En la última etapa, se trabajó no solo con el consorcio
artificial sino con el total de las cepas previamente identificadas variedad de especie
del género Bacillus (Grupo II), por lo que nuestro diseño de metagenómica funcional
está dirigida a un panel de cuatro genes glifosato phnJ, carbofurán mcd, permetrina
estP, y clorpirifós cpd (Tabla 16). Este es, hasta donde sabemos, el primer reporte
de cebadores diseñados para apuntar más de un gen asociados a la degradación
para varias familias de plaguicidas en particular para especies del género de
Bacillus, con aplicación tanto para cultivos puros o metagenómica funcional para
diferentes fuentes ambientales. Además, se propone desarrollar un diseño de
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para futuros ensayos,
pudiendo ser un sustituto rentable para determinar el potencial de degradación para
carbofurán, glifosato, clorpirifós y permetrina en diferentes ambientes, por medio de
la cuantificación directa de mcd, phnJ, cpd y estP. En este sentido, reportan el primer
diseño de cebadores degenerados dirigidos al gen phnJ en bacterias, phnJF1 y
phnJR2 amplifican un fragmento de tamaño apropiado para ensayo de qPCR
(Morales et al., 2020).
101
IX. CONCLUSIÓN
1. El cribado de 86 cepas aisladas de suelos agrícolas, mediante el
crecimiento en medio sólido M9 patrón de plaguicida 200 ppm, el cual
permite valorar crecimiento microbiano sin fuente de carbono,
indicándonos su capacidad para tolerar y posiblemente utilizar los
plaguicidas como única fuente; Grupo I (21/86) 24.42% CT cuatro
plaguicidas, incluyendo en este grupo a NAV 12 (CN) y Grupo II 75.58%
(65/86) CT tres ≤ plaguicidas.
2. Aumento de las concentraciones 5000 y 10000 ppm, nos permitió una
clasificación dentro del grupo I y caracterizar aquellas cepas que soportan
más de 200 ppm, siendo las concentraciones máximas un indicativo de
tolerancia asociado a un potencial de degradación; 5000 ppm (GVE2,
GVE7*, GVE19*, GVE21, CLN4, CLN5, CLN6, CLN18, NAV6, NAV12*,
G1, G2, G6, G7, G8, N5, N6), y para 10000 ppm (GVE21, CLN4, CLN5,
NAV12*, G1, G2, G6, G7, G8, N5, N6) estos presentaron CT (3/4)
plaguicidas.
3. Conformación de un consorcio artificial con capacidad de tolerancia a
5000 ppm y caracterización de un consorcio natural con capacidad de
tolerar una concentración máxima 10000 ppm, son candidatos para
productos de biodegradación de estos plaguicidas.
4. Análisis molecular Grupo II (secuenciación 16S rRNA) identificados como
Bacillus subtilis, Bacillus megaterium Bacillus sp., Bacillus cereus,
Bacillus albus, Bacillus aryabhattai y Bacillus thuringiensis. Esto coincide
con lo reportado en trabajos previos ya que, el género de Bacillus es una
de las principales bacterias asociadas a los procesos de biodegradación.
5. Este es, hasta donde sabemos, el primer reporte de cebadores diseñados
para apuntar más de un gen asociados a la degradación para varias
familias de plaguicidas en particular para especies del género de Bacillus,
con aplicación tanto para cultivos puros o metagenómica funcional para
diferentes fuentes ambientales.
102
X. PERSPECTIVAS
• Realizar la metagenómica funcional para un consorcio microbiano
tolerantes a carbofurán, glifosato, clorpirifós y permetrina o para
diferentes ambientes impactados por estos plaguicidas.
103
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125
XII. ANEXOS
Anexo I. Base de datos plaguicidas en estudio
PLAGUICIDAD DT50 (en suelos) TOXICIDAD REGISTROS
CARBOFURÁN (Insecticida, Acaricida,
Nematicida)
30-117 Días Moderadamente degradable
IB. Altamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA)
8
CLORPIRIFÓS ETIL (Insecticida)
3 mese - 1 año Muy ligeramente degradable
II. Moderadamente peligroso (OMS);
II. Moderadamente tóxico (EPA) 165
FAENA (GLIFOSATO)
(Herbicida)
8-280 días Ligeramente degradable
IARC calificó a glifosato como “probablemente carcinógeno en
humanos” (categoría 2A) 85
PERMETRINA (Insecticida)
mayor estabilidad a pH 4; DT50 50 d a pH 9; estable a pH 5 y 7 a 25 ºC y al calor (>2 años a 50 ºC) ˂38 Días Moderadamente
Degradable
IA. Extremadamente peligroso (OMS); I. Altamente tóxico (EPA).
139
126
Anexo II. Valorar la capacidad de tolerancia a 200 ppm glifosato, carbofurán,
permetrina y clorpirifós de las cepas aislados
127
Anexo III. Escala ponderada para evaluar el crecimiento microbiano en medio
solido-ensayo de tolerancia a glifosato, carbofurán, permetrina y clorpirifós.
(a
(a)
a) Densidad; valores (0-6) b) Área; valores (0-4)
*bacterias: densidad y área **hongos: área
(b
(a)
128
Anexo IV. Script en R para generar un mapa de calor con la distribución de datos.