SONIA RODRÍGUEZ
ANALISYC-II
CSIC-AI
5 Abril 2011
DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGÍAS DE EXTRACCIÓN, ENRIQUECIMIENTO Y ANÁLISIS
DE COMPUESTOS BIOACTIVOS A PARTIR DE PRODUCTOS VEGETALES
OBJETIVO 3. Nuevas metodologías analíticas para la determinación
de componentes naturales y/o ingredientes autorizados de los
alimentos, incluyendo cultivos de leguminosas y cereales o sus
derivados, frutos, aceites vegetales, fórmulas alimenticias, alimentos
enriquecidos y extractos alimentarios.
OBJETIVO 5. Desarrollo y optimización de metodologías de
preparación y fraccionamiento de muestras; avances en optimización
y validación de datos analíticos; integración de técnicas instrumentales
mediante la creación de una plataforma instrumental común
HITO 8. Metodologías analíticas basadas en GC-MS para la
determinación de carbohidratos bioactivos en extractos
vegetales de uso alimentario y en alimentos enriquecidos.
MATERIALES
VEGETALES
EXTRACCIÓN
ENRIQUECIMIENTO
ACTIVIDAD
IN VITRO
TOXICIDAD
ESTABILIDAD ENSAYOS
IN VIVO
CLINICOS
INGREDIENTE INDUSTRIA ALIMENTARIA
ANÁLISIS
CARACTERIZACIÓN
MATERIALES
VEGETALES
EXTRACCIÓN
ENRIQUECIMIENTO
ACTIVIDAD
IN VITRO
TOXICIDAD
ESTABILIDAD ENSAYOS
IN VIVO
CLINICOS
INGREDIENTE INDUSTRIA ALIMENTARIA
ANÁLISIS
CARACTERIZACIÓN
*IMINOAZÚCARES
DESOXINOJIRIMICINA (DNJ)
FAGOMINA
PROPIEDADES: Inhibición de glicosidasas (control de la glicemia,
anticancerígenos, antivirales, etc)
PINITOL
*INOSITOLES Y DERIVADOS
PROPIEDADES: Control de la glicemia
CARBOHIDRATOS BIOACTIVOS
*PREBIÓTICOS: carbohidratos no digeribles que
estimulan selectivamente el crecimiento de bacterias
beneficiosas de la microflora intestinal
Chiro-INOSITOL
BIOSEARCH S.A.
MORERA
TRIGO SARRACENO
FRUTOS SECOS
SOJA
LEGUMBRES
HOJAS DE ALCACHOFA
LECHUGA…
CHUFA …
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
Desarrollo de un método de extracción,
enriquecimiento y análisis de iminoazúcares a
partir de hojas de morera (Morus sp.)
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
Morus sp. IMINOAZÚCARES (DNJ, fagomina)
HPLC
GC-MS
OPTIMIZAR DERIVATIZACION
DERIVADOS
PERACETILADOS TMS DERIVADOS ALDONONITRILOS PERACETILADOS (PAAN) TMS-OXIMAS
6.00 12.00 18.00 24.00 30.00
600000
1200000
1800000
2400000
3000000
3600000
4200000
4800000
min
Abundance
TMS-OX
min 6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00
2000000
6000000
10000000
14000000
18000000
Abundance TMS
Ribosa +
fagomina
ribosa
6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
Abundance PAAN
min
fagomina
6.00 10.00 14.00 18.00 6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00
2000000
6000000
10000000
6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00
400000
800000
1200000
1600000
2000000
2400000
2800000
3200000
3600000
400000
800000
1200000
1600000
2000000
2400000
2800000
3200000
3600000
min
Abundance ACETILADOS fagomina
+ fructosa
DNJ
I.S.
Myo-inositol
fructosa
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
Myo-inositol
I.S.
DNJ
fructosa
fructosa
DNJ
Myo-inositol
I.S.
fagomina
DNJ
Myo-inositol
I.S.
MSTFA
BSTFA
HMDS
SILILACIÓN
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
* Rampa de temperaturas del horno
Columna capilar de metilsilicona
(30 m x 0.25 mm i.d.x 0.25 μm df)
100 ºC
0 min
200 ºC
300 ºC
50 min
15 min
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
7.50 8.50 9.50 10.50 11.50
200 ºC
300 ºC
7.50 8.50 9.50 10.50 11.50
* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)
10.00 14.00 18.00 22.00 26.00 30.00
200000
600000
1000000
1400000
1800000
2200000
Tiempo
AbundanceMORERA 240 ºC
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
28.50 29.00 29.50 30.00 30.50 31.00 31.50 32.00
240 ºC
28.50 29.00 29.50 30.00 30.50 31.00 31.50 32.00
200 ºC
* Temperatura del inyector (200 ºC, 220 ºC, 240 ºC, 260ºC, 300 ºC)
8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00 32.00
200000
500000
800000
1100000
1400000
1700000
2000000
Tiempo
AbundanciaMORERA 240 ºC
1. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS. CARACTERIZACIÓN
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
EXTRACCIÓN CONVENCIONAL
EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)
A. EXTRACCIÓN
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
* DISOLVENTE
EXTRACCIÓN CONVENCIONAL
A. EXTRACCIÓN
* CICLOS 3er ciclo ( 17% en compuestos de interés)
mg / g de MUESTRA
Disolvente FAGOMINA DNJ MYO-INOSITOL GLICOSIL-INOSITOLES
H2O 0,33 (0,04) 1,25 (0,01) 2,64 (0,13) 0,32 (0,05)
H2O AC 0,34 (0,01) 1,35 (0,02) 3,45 (0,03) 0,28 (0,02)
H2O-MEOH 50% 0,23 (0,04) 1,26 (0,06) 2,33 (0,29) 0,05 (0,01)
MEOH 0,10 (0,01) 0,59 (0,01) 1,35 (0,03) 0,01 (0,00)
H2O-ETOH 50% 0,13 (0,01) 0,80 (0,02) 1,84 (0,01) 0,03 (0,00)
ETOH tr tr 0,11 (0,01) tr
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
válvula
Celda de
extracción
Gas de secado
Vial colector
Bomba
Horno
Disolvent
válvula
e
Disolventes a altas presiones y temperaturas
A. EXTRACCIÓN
EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
Temperatura (50 ºC, 100 ºC y 150 ºC )
Tiempo (2, 5,15 y 30 min)
Cantidad (0,05 y 0,1 g)
Condiciones óptimas
50 ºC, 5 min, 0,05 g
1 ciclo
A. EXTRACCIÓN
EXTRACCION CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS (PLE)
Ciclos (1 y 2)
MUESTRA
MORERAFAGOMINA DNJ
MYO-
INOSITOL
GLICOSIL-
INOSITOLES
1-3 CICLOS
CONVENCIONAL0,47 (0,01) 2,44 (0,04) 7,88 (0,15) 0,72 (0,07)
50 ºC 5min 0,05 g
PLE (1 CICLO)0,48 (0,15) 2,52 (0,89) 8,90 (1,88) 0,35 (0,06)
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
A. EXTRACCIÓN
VENTAJAS DEL PLE: rapidez, manejo de muestra, escalado industrial
INTERCAMBIO CATIÓNICO
Extracto original
4.00 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 28.00
1000000
3000000
5000000
7000000
9000000
1.1e+07
Tiempo (min)
TIC
fagomina
DNJ
myo-inositol
P.I.
sacarosa
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
B. ENRIQUECIMIENTO
Lavado 1: agua
Lavado 2: 2M NH4OH
6.00 10.00 14.00 18.00 22.00 26.00
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
Tiempo (min)
TIC
fagomina
DNJ
P.I. sacarosa
Incubación 37 ºC 5h
2. DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA EXTRACCIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
B. ENRIQUECIMIENTO
Saccharomyces cerevisiae
Control 0 h 5 h 8 h
Fructosa Glucosa Galactosa Sacarosa Trehalosa
CARBOHIDRATOS
Control 0 h 5 h 8 h
Fagomina DNJ
IMINOAZÚCARES E INOSITOLES
Tiempo (horas)
Fagomina Gliceril-inositoles
Tiempo (horas)
CANTIDADES (mg/ g Muestra)
MUESTRA FAGOMINA DNJ MYO-
INOSITOL
GLICERIL-
INOSITOLES FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA
CONTROL 0,47 2,44 7,88 0,72 43,89 48,10 4,36
RESINAS LAVADO 2
0,48 2,24 0 0 0 0 0,93
LEVADURAS 5 H
0,41 2,27 8,06 0,6 0 0 0
CANTIDADES (mg/ g peso seco del extracto)
MUESTRA FAGOMINA DNJ MYO-
INOSITOL
GLICERIL-
INOSITOLES FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA
CONTROL 2,55 13,8 46,08 4,25 279,69 308,16 28,13
RESINAS LAVADO 2
10,53 49,62 0 0 0 0 20,63
LEVADURAS 5 H
2,58 14,28 50,42 3,69 0 0 0
PLE
Apropiado para la extracción de carbohidratos bioactivos en hojas de morera
rápida, limpia y de fácil escalado
Aplicación a OTRAS MUESTRAS
RESINAS DE INTERCAMBIO CATIÓNICO
LEVADURAS
3. ACTIVIDAD
* PLE acoplado con resinas
1. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN
* Antiamilasa y antiglucosidasa
4. ESTUDIO COMO INGREDIENTE
toxicidad, estabilidad…
2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS
* HILIC
* Columnas Líquidos Iónicos