"Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY
contra Vitelogenina (Vtg), como
biomarcador esteroidogénico en
Oreochromis niloticus”
Jairo Caza Barcia
V Congreso Internacional de Acuicultura en Aguas Continentales
Sangolquí del 17 al 19 de mayo del 2016
(Carrillo, 2009)
Control hormonal y vitelogénesis
Biomarcadores
• Bioquímicos y moleculares
• Celulares
• Histológicos
• Individuales
• Poblacionales
• Comunidades
• Biomarcadores de exposición
• Biomarcadores de efecto
• Biomarcadores de
susceptibilidad
Maduración asincrónica
Falta de estacionalidad en la
producción de ovocitos y afectación
de la esteroidógenesis
Evaluación de productos
esteroidógenico ofrecen
información sobre el proceso
reproductivo
Compuestos químicos pueden
actuar como disruptores
endócrinos en cuerpos de agua
Diclorodifenil-tricloroetano y
tamoxifeno, inductores e
inhibidores de la vitelogenesis
Vitelogenina (Vtg)
Biomarcador
esteroidogénico
Biomarcador
ambiental
Ventajas del uso IgY
(Schade y col, 1991)
IgG IgY
Muestreo Invasivo No invasiva
Rendimiento 200 mg IgG por
sangramiento (40 ml)
50-100 mg IgY por
huevo
(5 a 6 por semana)
Rendimiento por mes 200 mg Aprox. 1600 mg
Rendimiento específico/proceso Aprox. 5% 2% a 10%
Interferencia con el factor
reumatoide
Si No
Activación de complemento Si No
OBJETIVO GENERAL
Producir anticuerpos policlonales (IgY) de
gallinas contra la proteína precursora,
vitelogenina (Vtg), como posible biomarcador
esteroidogénico en hembras adultas de
Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Inducir la producción y purifica de Vtg con 17-ß
estradiol en machos adultos de tilapia (Oreochromis
niloticus)
Inmunizar gallinas Isa Brown, para inducir la
producción y purificación de inmunoglobulinas IgY
contra Vtg
Determinar la avidez y especificidad de
anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia, mediante
técnicas de inmuno detección
Metodología
Producción de IgY
(Born, 2015)
Resultados
Purificación de Vtg
Shi, y col. (2002) fueron capaces de separar
mediante cromatografía de intercambio aniónico
vitelogenina del pez dojo (Misgurnus
anguillicaudatus) y en el pez carpa (Cyprinus
carpio)
La elución en la que Vtg fue identificada y
validada en gradiente de 0,37 M
Se empleó el método fluorométrico
Qubit® Protein Assay (Invitrogen,
USA), que arrojó un resultado de Vtg
total de 1,127 mg vtg/ml
Shi y col. (2002), aislaron 1,067 mg/ml
a través del mismo método.
Ortiz y col., (2016) recuperó Vtg a una
concentración de 1,8 ± 0,4 mg Vtg/ml
Concentración Cuantificación
Identificación (SDS-PAGE)
Ortiz y col., (2016) en tilapia del
Nilo (Oreochromis niloticus) a una
altura de 210 KDa
Fukada y col., (2003) purificaron
Vtg de 150 KDa en carpa
(Cyprinus carpio)
Shimizu y col., (2002) halló Vtg en
medaka común (Oryzias latipes) a
220 KDa
Alícuotas de 800 µl de anticuerpos a una
concentración de máxima de 5,2 mg/ml
Shimizu y col., (1988) aislaron
anticuerpos IgY a partir de cromatografía
de intercambio iónico en matrices de
DEAE celulosa
Hwee y col., (2012) utilizaron doble
precipitación con sulfato de amonio al 30
y 20 % con un rendimiento de IgY de 5
mg/ml.
Purificación de IgY
•Nunes y col., (2014)
caracterizaron una cadena
pesada en los 68 KDa, y una
cadena liviana en los 27 Kda
•Oyarzún (2011) han reportado
utilizando SDS-PAGE al 12%
estructuras de IgY con cadena
pesada de 67 KDa y cadena
liviana de 25 KDa
Identificación de IgY por SDS-PAGE
Deslow (1999) propuso
dosis de concentración de
100 µg/ml y 50 µg/ml como
dosis de refuerzo
Moreno (2010) propuso
dosis similares de
inmunización
Wen y col., (2012)
utilizaron dosis de
antígeno a 1 mg/ml
Curva de inmunización de gallinas
en función de IgY purificadas
Sotiropoulou y col., (2012)
comprobaron la unión
antígeno-anticuerpo a una
concentración de 1 µg/ml
Tada y col., (2004)
utilizaron IgG anti
vitelogenina a una
concentración de 40 µg/mL
ELISA indirecto
Muestras pre-purificadas de plasma de O. niloticus. 1: plasma inducido día 10.
2: plasma inducido día 15. 3: plasma inducido día 20. 4: plasma inducido día 25.
- : plasma macho normal.
Western Blot IgY contra Vtg
Conclusiones
Se inoculó 17-ß estradiol en individuos
machos de Oreochromis niloticus, lo cual
indujo la producción Vtg, obteniéndose 1,127
mg /ml
Se obtuvieron inmunoglobulinas IgY
contra Vtg en huevos de gallinas Isa Brown,
inmunizadas a partir de 19 semanas de
nacidas. Los anticuerpos fueron purificados
mediante métodos bioquímicos.
Se determinó la especificidad de
anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia,
mediante el uso de ensayos inmunométricos,
tales como ELISA y WB.
Dr. Juan Ortiz Tirado, Director del Grupo de Investigaciones de Recursos
Bioacuáticos y Acuicultura de la ESPE (RAAE)
Dra. Marbel Torres del Laboratorio Inmunología-Virología-ESPE
Dr. Rodolfo Fernández-Gómez investigador-docente del Programa
Prometeo SENESCYT, de Biophysic Solurions, C.A., Caracas, Venezuela
Al personal científico-docente, técnico y administrativo de la Universidad
de las Fuerzas Armadas-ESPE, y en especial, del IASA I
Agradecimientos
Anticuerpos IgY
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