Download - Curs IHC 01
-
8/8/2019 Curs IHC 01
1/30
Antigene si anticorpi
Principiulmetodei IHC
Panelul minim de
anticorpiDr. Mihai Ceausu
Nu este Salvador DaliNu este Salvador Dali
-
8/8/2019 Curs IHC 01
2/30
Istoric
1941 - Coons et al. - tehnica imunofluorescentei 1970 - L. Sternberger - metoda PAP (a complexelor
imune circulante)
1974 - Taylor & Mason - tehnica imunoenzimatica 1981-1983 - Hsu et al. - metoda ABC, modificata
de Bussolati & Gugliotta
1996 - DAKOEn VisionTM
Systems - metodadextranului
2000 - metoda amplificarii cu tiramina (Sigma) -
dupa Kerstens et al. (1995)
-
8/8/2019 Curs IHC 01
3/30
-
8/8/2019 Curs IHC 01
4/30
Antigenul
Ag este orice substanta de origine exo- sau endogena, capabila sa declanseze unraspuns imun care, consta din stimularea si proliferarea celulelor antigen specifice si
sinteza unor molecule de recunoastere (anticorpi sau receptori) ce au capacitatea de
a se combina specific cu antigenul inductor.
-
8/8/2019 Curs IHC 01
5/30
Proprietatile antigenelor
Imunogenitate =capacitatea Ag de a
declansa raspunsul
imun
Specificitate =
capacitatea Ag de a
reactiona strict cu
produsele sistemului
imun (Ac) sau Ac
preformati
Dubla reactie IHC pentru lanturi k si P
intr-un folicul limfatic reactiv (secventiere
HRP / APAP)
-
8/8/2019 Curs IHC 01
6/30
PanCK (KL1 vs MNF116)
HMFG vs EMA
KL1
HMFG - CDI
EMA - TD
MNF116 MTS
-
8/8/2019 Curs IHC 01
7/30
Anticorpul in imunohistochimie Este o molecula ce se
combina specific cu un Ag
pe baza unei recunoasteri3-D a epitopului antigenic
(mecanism cheie -
broasca)
Fiecare Ag nativ are mai
multi epitopi recunoscuti
de Ac diferiti
Dubla coloratie Cromo / PgR in CDI
cu diferentiere neuroendocrina
-
8/8/2019 Curs IHC 01
8/30
Structura generala a anticorpilor
Planul structural unic al oricarei
molecule de Ig este unitatea tetra-
catenara, formata din 4 lanturi : 2
grele (H = heavy chains) si 2
usoare (L = light chains), soli-
darizate prin punti disulfurice
Fc = fragment crystalisable;
rol in specificitatea
antigenica si activarea
complementului
Fab = fragment antigen
binding; rol in recunoasterea
si legarea Ag la nivelul
situsului combinativ
-
8/8/2019 Curs IHC 01
9/30
Ac monoclonali versus Ac policlonali
Acm este un Ac idiotipic specific pentru un singur
epitop produs de o clona de plasmocite hibride
Acp este un antiser ce contine specii diferite de Ac
cu afinitati variabile, in cursul unei imunizari
Acm HPV
Acp BPV
-
8/8/2019 Curs IHC 01
10/30
Acm versus Acp
Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali
peci icitate (+) ensibilitate (+)
eactie de ond (-) eactie de ond (+)
u coloreaza celulesuplimentare
oloreaza celulesuplimentare
arkeaza putine structurihistologice asemanatoare
arkeaza mai multestructuri histologice
asemanatoare
-
8/8/2019 Curs IHC 01
11/30
Proprietatile Ac
Specificitatea
Afinitatea si aviditatea
Echivalenta
-
8/8/2019 Curs IHC 01
12/30
Specificitatea si reactia incrucisata
Este o reactie de cuplare a Ag cu Ac printr-un
mecanism de tip cheie-broasca, pe bazacomplementaritatii epitop-paratop, ale caror
suprafete se adapteaza reciproc
-
8/8/2019 Curs IHC 01
13/30
Afinitatea
Afinitatea evalueaza o
reactie de tip epitop-
paratop sau intre Fab
si haptena
Afinitatea mare
implica o adaptare
mare a suprafetelorFab - epitop
Atractie inalta Repulsie inalta
(adaptare mare) (adaptare mica)
Afinitatea =Afinitatea = 77Fa + FrFa + Fr; Fa - forta
de atractie, Fr -forta de respingere
epitop
paratop
-
8/8/2019 Curs IHC 01
14/30
Aviditatea
Aviditatea evalueaza oreactie de tip Ag - Ac
Aviditatea implica o serie
de forte de interactiune
moleculare non-covalente
Se supune legii actiunii
maselor
Ag Ac npAgAc
Legea actiunii maselor :
][
]][[
AgAc
AcAgK !
K = constanta de echilibruK = constanta de echilibru
-
8/8/2019 Curs IHC 01
15/30
Echivalenta
Cand intr-un sistem este
introdusa o cantitate
suplimentara fie de Ag,
fie de Ac, echilibrul va
fi deplasat in sensul
cresterii cantitatii de
complexe Ag-Ac
Recunoasterea unei molecule antigenice purtatoare a mai multorDRecunoasterea unei molecule antigenice purtatoare a mai multorD--Ag diferitiAg diferiti
este cu mult mai specifica prin interactiunea cu un serpoliclonal sau uneste cu mult mai specifica prin interactiunea cu un serpoliclonal sau un
amestec proportionat de Acm diferiti, decit interactiunea cu un singurAcm !amestec proportionat de Acm diferiti, decit interactiunea cu un singurAcm !
Retele Ag-Ac
cu precipitare
Curba de reci itare i reactiaCurba de reci itare i reactia
gg -- c (Heidelberger, 1930)c (Heidelberger, 1930)
-
8/8/2019 Curs IHC 01
16/30
Imunohistochimia (IHC)
Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte :
imunologia si histochimia, avind ca scop
evidentierea proprietatilor antigenice ale
unor substante intr-un tesut utilizind Acm
sau seruri polireactive.
Vizualizarea substantelor antigenice sepoate face atit la nivel tisular, cit si la nivel
celular si subcelular, pe preparate la gheata
sau parafina.
-
8/8/2019 Curs IHC 01
17/30
Tehnica IHC - principiul metodei Se lucreaza cu Acm, de care sunt legate una sau mai multe
molecule enzimatice, ce catalizeaza transformarea unui
substrat incolor intr-un produs de reactie colorat. Enzima
este cuplata covalent cu portiunea Fc a Ac; pe ea se
plaseaza substratul cromogenic.
Enzimele utilizate sunt : - peroxidaza
- fosfataza alcalina
Substratele folosite sunt : - DABpentru peroxidaza (brun)
- fast red si fast bluepentru fosfataza alcalina
-
8/8/2019 Curs IHC 01
18/30
Metoda ABC (dupa Hsu et al., 1981,
modificata de G. Bussolatti, 1983)
-
8/8/2019 Curs IHC 01
19/30
CDI - EGFR (ABC)
-
8/8/2019 Curs IHC 01
20/30
Panelul minim de Ac necesar
Citokeratina Vimentina
Desmina / actina
Neurofilamente Gliofibrile (GFAP)
CLA - L26 / UCHL1
S-100 F VIII
TB-01
Ki-67 / PCNA
-
8/8/2019 Curs IHC 01
21/30
Citokeratina - filament intermediar ; CK
1p 20 (catalogul Moll); Pan CK : KL1 /
MNF116
ADK colon
-
8/8/2019 Curs IHC 01
22/30
Vimentina
Melanom Sarcom
-
8/8/2019 Curs IHC 01
23/30
Desmina / actina
PAS
-
8/8/2019 Curs IHC 01
24/30
NFT = neurofilamente totale
GFAP = proteina gliofibrilara acida
NFT - tesut nervos normal GFAP in astrocitom
-
8/8/2019 Curs IHC 01
25/30
CLA = CD45; L26 p CD20; UCHL1 p
CD45RO
L26 UCHL1
CLA
-
8/8/2019 Curs IHC 01
26/30
S-100
S-100 in histiocite
S-100 in melanom
-
8/8/2019 Curs IHC 01
27/30
Markeri vasculari : F VIII, CD31, CD34
FVIII vase peritumorale CD31
CD34 ADK gastric
CD34 tesut granulatie
-
8/8/2019 Curs IHC 01
28/30
TB-01 / Leu 7 (CD57)
Hiperplazie neuroendocrina
Celule NK
-
8/8/2019 Curs IHC 01
29/30
PCNA / Ki-67 (MIB 1)PCNA - CDI
p53
Ki-67
-
8/8/2019 Curs IHC 01
30/30
Nu orice micrograf este un histolog i nu orice
histolog este un histopatolog; histopatologul este
totodat histolog i medic [] Histodiagnosticul
este un act medical. El este o CONSULTATIE
MEDICALA n care responsabilitateahistopatologului este grav angajat, cu att mai
mult, cu ct expertiza sa este cerut n ultim
instan i comand terapeutic
Medicul histopatolog ar trebui pltit n raport cu
serviciile pe care le face.
(Masson, Histopatologie)