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Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela.
Mark J. van Raaij Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular, facultade de Farmacia
Unidade de Diffracción de Raios X, RIAIDTUniversidade de Santiago de Compostela
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- por que determinar estructuras de proteínas?
- cristalización y cristalografía de macromoléculas
- proteómica / genómica estructural
- biología estructural de proteínas virales
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por que determinar estructuras de proteínas?
todavía no es posible predecir estructuras de proteínas
la estructura de una proteína / macromolécula da pistas sobre su función, efecto de mutantes, etc.
amino ácidos lejos en la secuencia primaria pueden estar muy cerca en 3D
para descubrir nuevos plegamientos, mejorar la predicción de estructuras
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como determinar estructuras de proteínas?
crio-microscopía electrónica .cristales 2D: in membrano, proteínas de membrana.partículas simples- a resolución relativamente baja, apto para complejos grandes
espectroscopía NMR- en solución- alta resolución- proteínas no muy grandes (< 30 kD)
difracción de fibras- p. ej. proteínas del músculo
cristalografía de rayos X (neutrones)
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cristalografía de rayos X- alta resolución, con datos (y fases) a ~ 3 Å de resolución o mejor se pueden construir modelos atómicos- apto desde moléculas pequeñas (NaCl) hasta muy grandes (ribosomas)- proporcionan una imagen estática de la estructura, aunque reaccionesenzimáticas han sido estudiadas en cristales
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pasos en la determinación de una estructura de una macromolécula
• obtención de la macromolécula en escala de mg- expresión y purificación• cristalización- difusión de vapor, “micro-batch” • recogida de datos- ánodo rotante con detector, sincrotrón• determinación de fases- MR, MIR, SIRAS, MAD, SAD• análisis de la estructura• (verificación bioquímica de las conclusiones)
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cristalización
muestra- múltiples preparaciones de varios mg cada una a alta concentración (al menos 5 mg/ml, mejor 10-20 mg/ml o más)- alta pureza, tanto “química” como “conformacional”
estrategias de cristalización- en primera instancia probar ~100 condiciones muy diferentes- barrido de precipitantes vs pH (4-10) y temperatura (5 ºC y 20 ºC) - optimización de las condiciones más prometedoras (ajuste fino, aditivos)
métodos de cristalización- difusión de vapor, “micro-batch”, otros
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métodos de cristalizacióndifusión de vapor: gotas colgantes, sentadas o “sandwich”
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métodos de cristalización“micro-batch”: placas Terazaki, “gotas flotantes”
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métodos de cristalizaciónmicro-diálise: “botones”
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cristalografía de macromoléculas
datos “nativos”: hasta varios cientos de imágenes como esta
si se conoce una estructura relacionada (> 30% de identidad en secuencia), resolución de la estructura por “Molecular Replacement” (reemplazamiento molecular) puede ser posible (MR)
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si no se conoce una estructura homóloga:MIR: Multiple Isomorphous Replacement, utilizando varios
“derivados” de átomos pesados - importancia del isomorfismo, encontrar derivados útiles puede ser complicado
SIR: MIR pero con un solo derivado, normalmente aprovechando la señal anómala (Anomalous Signal, SIRAS)
MAD: Multi-wavelength Anomalous Dispersion, utilizando un derivado o una proteína modificada con Se-Met (ácido nucleíco con Br)
SAD: Single-wavelength Anomalous Dispersion
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cuellos de botella típicos
- la proteína no expresa- la proteína se expresa de forma insoluble- la proteína es difícil de purificar- la proteína no cristaliza- los cristales obtenidos no difractan rayos X- no se encuentran derivados útiles
duración típica de un proyecto: 3 meses - 3 años (o infinito)
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proteómica / genómica estructural
determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis)
a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación deestructuras de proteínas antes de saber su función
clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala
- tasa de éxito individual limitado: 10-20%
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proteómica / genómica estructural
determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis)
a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación deestructuras de proteínas antes de saber su función
clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala
- tasa de éxito individual limitado: 10-20%
spin-off: tecnología como vectores de expresión, automatización,etc.
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expresión, purificación
cristalización recogida de datos
resolución estructura
año
fibra corta del bacteriofago T4
EMBL Grenoble, FR
Leiden University, NL
Leiden University, NL
USC 2003
proteína de fusión fibritin / “foldon”
IBS, Grenoble, FR
IBS, Grenoble, FR
USC USC 2004
“tailspike” del
bacteriofago Det7
Profos, Regensburg, DE
USC USC USC 2004
proteína sigmaC del reovirus aviar
USC USC USC USC 2005
cabeza fibra larga adenovirus aviar
USC USC USC USC 2006
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adenovirus reovirus aviar
estructuras de fibras virales
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morfología
- dominio central proporciona “alcance”- en general triméricas:
- coiled coil - estructura beta
proteínas estables (SDS, urea, temperatura, proteasas)
dominio de unión al receptor
dominio de unión al virus
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adenovirus
- icosaédrico- caras : hexon, proteína trimérica- vertices: penton, base pentamérica, en el cual una fibra trimérica estáinsertada- cabeza de la fibra une receptor, en humanos CAR (Coxsackievirus and Adenovirus Receptor)
![Page 21: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/21.jpg)
adenovirus aviar (CELO, FAV1) - no es un patógeno importante, pero uso potencial como vacuna- dos fibras en cada base del penton:. fibra larga, no-esencial, receptor CAR?. fibra corta, esencial para infección in vitro, receptor desconocido
![Page 22: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/22.jpg)
estructura de la cabeza de la fibra largaresuelta por SIRAS con derivado de cloruro de metilmercurio y refinadocon datos nativos a 1.6 Å de resolución
en colaboración con Patrick Langlois, Ploufragan, Francia
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cabeza de la fibra larga
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alineamiento de las secuencias de las cabezas de la fibra del adenovirus humano tipo 2 (AD2) y la fibra larga del adenovirus aviar basados en la estructura identifica pocos aminoácidos implicados en unión a CAR conservados
![Page 25: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/25.jpg)
rojo: cabeza de la fibra larga del adenovirus aviaramarillo: cabeza de la fibra del adenovirus humano tipo 12azul: dominio 1 de CAR
la fibra larga del adenovirus aviar probablemente no une CARo lo hace de manera diferente que adenovirus humano
![Page 26: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/26.jpg)
reovirus aviar- patógeno importante- genoma: 10 dsRNAs- 8 proteínas estructurales y 4 no-estructurales- cubierta interna: A, A, C- cubierta externa: C (fibra) - receptor desconocido
en colaboración con Javier Benavente, USC
A
C
C A
![Page 27: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/27.jpg)
estructura del dominio C-terminal de sigmaC, el dominio de unión al receptor de la fibra del reovirus aviar
- resuelto por MAD con derivado de cloruro de metilmercurio y refinadocon datos nativos a 2.1 Å de resolución
- lamina beta circular DABC-HEFG con bucle DE largo
- dos repeticiones de espiral beta triple
![Page 28: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/28.jpg)
aminoácidos conservados en todas las cepas del reovirus aviar en la superficie del trímero
![Page 29: Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij](https://reader036.vdocuments.co/reader036/viewer/2022062421/56812b07550346895d8ee96e/html5/thumbnails/29.jpg)
futuroinvestigación• cristalografía de proteínas
(no solo virales)• proyecto EU Artizymes
“desarrollo de metalo-enzimas artificiales que contienen metales de transición”
• proyecto EU BeNatural “nano-materiales biotecnológicos para investigación y aplicaciones”
recursos• cristalización de
macromoléculas
- robot de cristalización• plataforma de expresión y
purificación de proteínas para estudios estructurales
- bacterias- (baculovirus, levadura,
células de mamífero)• clonaje en vectores de
expresión paralelo
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agradécese a colaboración de:• Lois Hermo, Pablo Guardado, Patricia Ferraces, Antonio
Llamas • grupo de Javier Benavente e José Martinez-Costas• Gavin Fox, ESRF Spanish beamline BM16• unidade de difracción de raios X (RIAIDT)• financiamento:
EU: proxectos Artizymes e BeNatural
MEC: BFU2005-02974, BFU2005-24982-E (ESF: proxecto FolProCom, EuroSCOPE), HG2005-0012 (acción integrada Grecia)
Xunta de Galicia: incentivo Artizymes, infraestructura (FPLC)