Cortes con enzimas de restricción
Yudy Alvear CarvajalNatalia Carolina CastiblancoNéstor Julián Zarate Herrán
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción, tuvieron su primera aparición en 1950 principalmente en organismos bacteriófagos, estas enzimas adoptaron el nombre a partir del hecho de q que prevenían la invasión de ADN foráneo tal como el ADN viral, cortándolo, adicionalmente, las enzimas cortaban preferencialmente en sitios internos del ADN foraneo, por esta razón recibieron el nombre de endonucleasas.Se observó en experimentos de laboratorio, que ciertas cepas de bacterias eran capaces de restringir el crecimiento de virus crecidos previamente en estas cepas. Este efecto fue atribuido a enzimas de restricción.
El término endonucleasa de restricción fue adoptado por Cohen y Boyer y fue asignado a las enzimas que producían restricción.En los años sesenta Swewaert Linn y Wernwr Arber, fueron quienes descubrieron las endonucleasas de restricción en Escherichia coli.Lin y Arber esperaban que las enzimas que descubrieron pudieran cortar el ADN en sitios específicos y así producir Tajadas” de ADN, aunque no fue lo que observaron. Posteriormente, Hamilton Smith descubrió una enzima aislada de Haemoplitus influenzae aislada de la cepa R, que cortaba el ADN en un especifico. A esta enzima se le denominó Hind II.
• Las enzimas de restricción tiene como ventaja principal su habilidad al cortar cadenas de ADN de una manera reproducible en los mismos sitios.
• Las dos cadenas de ADN que cortan en forma de “escalera” denominados así por la forma que deja en las cadenas, que hace que los extremos puedan encontrar complementariedad entre si mismo o/y con otros extremos; por lo que se denominan extremos adhesivos. Propiedad que tiene numerosas aplicaciones en técnicas moleculares, como en la Clonación.
1. Cohen y Boyer aprovecharon los extremos adhesivos y empezaron a crear experimentos de clonación.
2. Implementación de 2 plásmidos que conferían resistencia a antibióticos.
3. Utilización de la endonucleasa EcoRI.
Acción de la DNA ligasa.
Formación de un plásmido que incluye
mas resistencia.
Reglas generales de nomenclatura en las enzimas
de restricción
Primera • E. de restricción y endonucleasa de
restricción son sinónimos; se abrevia Reasa- Enasa.
Segunda• Las metiltransferasas (metilasas), tienen
por abreviación MTasa.
Tercera • las tres primeras letras que
corresponden al nombre científico del microrganismo (en cursiva).
• La cuarta letra a la cepa o estirpe si la hubiese
Cuarta• En números romanos, se distingue la
presencia de más de una endonucleasa aislada de esa misma especie.
Quinta • El prefijo M, R o RM indica la función de
la enzima Ej. RM. Eco571.
Sexta
Cuando genes codificantes para REasas o MTasas están asociados en un solo
sistema R-M, deben ser referidos con el segundo carácter del prefijo y utilizar
numero arábicos.Ej los productos de dos genes M de HphI de un sistema R-M va a ser M1 HphI y M2
HphI
Septima Los isosquizomeros difieren de los
neoesquizomeros.
Tipos de enzimas de restricción
Tipo I Tipo II Tipo III
Tipo IV
Tipo I
Formado por Proteínas de
múltiples subunidades 2-R;
2M y 1S
Cuando actúan sobre sustratos
no metilados funcionan como
REasas
Cuando se encuentra un sustrato
hemimetilado, el complejo actua como
MTasa. Usa S-adenosilmetionina.
La localización de los sitios de escisión se da
por la colisión y dilatación de dos
complejos durante la translocación.
Endonucleasas de
restricción Tipo II
La nomenclatura que toman se
relaciona con la secuencia que
corta o la estructura que
tiene
Reconocen secuencias de
ADN especificas.
Necesitan Mg como cofactor.
Actuan de manera independiente de las
MTasasLa MTapas transfieren un grupo metil a partir
del S-adenosil-L-metionina.
Reconocen secuencias palindrómicas y realizar
cortan de manera
simétrica
Se encuentran las enzimas que
reconocen secuencias simétricas
Cortan sitios fijos simétricos en la molécula o adyacentes
Tipo IIP
5’ G A A T T C 3’ 3’ C T T A A G 5’
Se encuentran todas las
enzimas de tipo II que reconocen
secuencias asimetricas.
Tienen un gen codificante para una REasa y dos
MTasa
Tipo IIA
Enzimas tipo II B• Corte doble de la secuencia
de reconocimiento.• Ej:• BcgI ( 10/12)S.C ; (12/10)
Escisión
Enzimas tipo IIC • Enzimas hibridas con ambos dominios de
escisión, modificando una sola proteína.• Contienes las IIB,II G Y IIH.
Enzimas tipo IIE y IIT• Interacción con 2 copias de reconocimiento.• Regiones blanco ( escisión/ efecto alexitérico
( Mg++)• Ej: EcoRII• IIT: subunidades heterodimericas
Enzimas Tipo IIF y IIG• IIF: coordinada con 2 secuencias de
reconocimiento.• IIG: 1 solo poli péptido fusionado.( R-M)• AdoMet ( donador del grupo metilo)• Secuencias de reconocimiento variadas.
Enzimas Tipo IIH, IIM y IIS
• IIH: características similares a tipo I y bioquímicamente iguales a tipo II.
• IIM: Secuencias metiladas, Sitio fijo de corte • IIS: Sub categoria de IIA que corta al menos 1 de
las cadenas de DNA fuera de la S.R.
Nicking Enzimas• Reasas de corte incompleto (N 1 chain)• ej: Bpu10I ( inactivación de 1 de las
subunidades).• M5c-Mtasas ( mismatch de apareamiento erróneo
de G/T)
Proteínas de control• Genes adicionales• Codificación de enzimas que regulan la expresión
de Gen R.• Ej: Pvu II Y C.BamHI genes c(ACTIVADORES
TRANSCRIPCIONALES) - acumulación protegiendo REasa.
Endonucleasas Tipo III• Sistemas (Mod/res) SITIO DE reconocimiento• DUO + ATP• DNA no palíndromo y secuencias de forma
inversa,• Corte en secuencia especifica de una de las
copias de secuencia de reconocimiento.• M6A - Hemimetilacion.• EJ: EcoP 1I
Endonucleasas Tipo IV• Solo DNA modificado( metilado, hidroximetilado,
y glucosil/metilado)• EcoKMcrBC: • Reconocimiento de 2 dinucleotidos de la forma
RmC.• 30 bases lejos de reconocimiento
Enzimas Hipotéticas• Similitud o inferencia en secuencias especificas
en un plásmido o DNA bacteriano METILADO.
•P… comprobación P
Sistemas R/M : Formas Mínimas de Vida
• Mantenido en bacterias como defensa a infecciones como: DNA viral, plásmido etc.
• « HIPOTESIS DE DEFENSA CELULAR»
• Muerte celular si hay perdida de sistema o arreglos genómicos para supervivencia. «HIPOTESIS DEL GEN EGOISTA»
• Variación genómica Diagnostico de enfermedades genéticas con cambios en secuencia de DNA ( mutaciones, delecciones o inserciones) o Enf. Infecciosas.