Download - Control Mc Parte 1
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LA HABANA, CUBA 2011
PhD Claudio Rodrguez Martnez,Centro Nacional de Biopreparados
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Actualizar a los especialistas en las recomendaciones, guas y normas para el control de la calidad de medios de cultivo y reactivos como herramientafundamental para prevenir y/o corregir los fallos en los anlisismicrobiolgicos.
Brindar recomendacionesprcticas para la seleccin de los parmetros y mtodos de control de la calidad de mc y reactivos.
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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PRIMER DA Generalidades del Control de la Calidad (CC) de
los medios Funcionalidad-desempeo-control
microbiolgico (mtodos cuantitativos, semi-cuantitativos y cualitativos Indicadores especficos (productividad) paramedios slidos y lquidos
PhD Claudio Rodrguez Martnez
SEGUNDO DA Indicadores especficos (selectividad para
medios slidos y lquidos; especificidad; contaminacin microbiana)
Parmetros fsico-qumicos para el CC de los medios de cultivo pH, cantidad dispensada, propiedades del gel,
otros parmetros Estudios de estabilidad Control de la calidad de los reactivos
Agua, ingredientes, suplementos, tintes, discos antibiticos, antisueros
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SEGN LA ISO 11133-1: formulacin de sustancias, en formalquida, semi-slida o slida, que contiene constituyentesnaturales y/o sintticos destinados a apoyar la multiplicacin,o a preservar la viabilidad de los microorganismos.
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-1:2000
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Deben almacenarse siempre: en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la
humedad y la luz
La exposicin a la luz
puede conducir a la degradacin de los componentes (nutrientes)
Son higroscpicos
alteraciones en los constituyentes
Condiciones de almacenamiento
Medios de cultivo deshidratados Medios completos y Medios suplementados
La mayora de los medios preparados se
guardan en refrigeracin
CARACTERSTCAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLGICOS QUE LOS HACEN VULNERABLES AL DETERIORO
cambios en el color del medio
variaciones del pH
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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ANLISIS MICROBIOLGICO FIABLE
Aceptabilidad de cada lote de medio, reactivos y juegos diagnstico
Adecuacin del diganosticador al objetivo
Constancia en el desempeo: fiabilidad, exactitud, robustez, rudeza
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Proceso para detectar y corregir los defectos estableciendo lmites aceptables de desempeo
CONTROL DE LA CALIDAD (CC) EN MICROBIOLOGA
Khajornsak Tragoolpua. Department of Clinical MicrobiologyFaculty of Associated Medical Sciences. Chiang Mai UniversityDecember 30, 2004
CC
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Seguir los Procedimientos Normalizativos de Operacin (PNO), polticas y protocolos para el CC
Emplear utensilios y procedimientos aspticos u otros procedimientosespecficos durante el CC
Utilizar equipamiento relevante de manera correcta y segura
Seleccionar mtodos de ensayo de CC apropiados, enmarcndose en suexperiencia prctica personal
Interpretar los resultados del CC con respecto a los resultados esperados
Completar todos los registros relevantes con cuidado y segn los protocolos
CHS189 Perform Quality Control of culture media and solutions. Performance criteria, 2007
REQUISITOS DE BUENAS PRCTICAS DE LABORATORIO (BPL) PARA EJECUTAR EL CC DE LOS MEDIOS DE CULTIVO (MC)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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CC DURANTE LA RECEPCIN DE LOS MEDIOS EN EL LABORATORIO
Nombre del medioIngredientesSuplementos y sus cdigosCdigo o nmero de lotepH del medio antes o despus de prepararInformacin de la conservacin y fecha de vencimiento Evaluaciones de desempeo, m.o. ensayados y procedencia (eficacia,
criterios de aceptabilidad para m.o. diana, no diana y los que deben ser inhibidos)
Hoja tcnica del producto Especificaciones de calidad y fecha de emisin Certificado de calidad con la confirmacin del cumplimiento de las
especificaciones Datos sobre seguridad y/o toxicidad Para los Medios Listos Para el Uso (MLPU) el control de esterilidad Plan de muestreo Informacin sobre modificaciones a las especificaciones del producto
Exigir del fabricante las siguientes informaciones:
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Norma ISO/TS 11133-1:2000
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CC del Medio Deshidratado
ColorApariencia (homogeneidad, fluidez)Presencia de grumos o partculas extraas
Caractersticas organolpticas (evaluacin visual)
PRDIDA POR DESECACIN
Mtodo gravimtrico hasta masa constante
SOLUBILIDAD Se debe disolver una cantidad de medio en 100 mLde agua destilada o desionizada que correspondacon las recomendaciones del fabricante y bajo lascondiciones para su preparacin
DENSIDAD APARENTE Determinacin de la masa de un volumen determinado
TAMAO DE PARTCULASPor tamizaje con determinado mesh(debe pasar no menosdel 95 % de la muestra)
PhD Claudio Rodrguez MartnezRodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Mediosde Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011
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CC DEL MEDIO RESTITUIDO Y DEL PREPARADO
Mtodo: evaluacin visual
Color Transparencia BrillantezPresencia
de precipitados
Medio restituido y/o preparado
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-1:2000
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CC del Medio Listo para el Uso
Los laboratorios pueden adoptar esquemas de CC ms sencillos
el proveedor de los MLPU posee un Sistema de Calidad(SC) acorde a lasISO 9001 un similar
y
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provee certificadosde calidad de susproductos
Norma ISO/TS 11133-1:2000
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FUNCIONALIDAD DESEMPEO -CONTROL MICROBIOLGICO
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EVALUACIN MICROBIOLGICA DEL MEDIO LISTO PARA EL USO
Caractersticas morfolgicas de los m.o. objetoTamaoColor SuperficieOtras
Esterilidad
Inhibicin del crecimiento/Selectividad
Promocin del crecimiento/Productividad
Reacciones tpicas de los m.o. objeto y no objetoBioqumicasSerolgicasSensibilidad/ResistenciaOtras
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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EVALUACIN DEL DESEMPEO DEL MLPU
Mtodos cuantitativosMtodos semi-cuantitativos Mtodos cualitativos
Empleocompulsorio de medio de referencia
Empleo recomendado de
medio de referencia
Medio de referencia:
Reaccin positivaCalidad probadaLotes recientemente liberados/de otroproveedor reconocido (calificado)/MLPU
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MEDIOS PREPARADOS A PARTIR DE FORMULACIONES DESHIDRATADAS DISPONIBLES COMERCIALMENTE
EXIGENCIAS MNIMAS PARA CADA LOTE
EXMENES CUALITATIVOS
MEDIOS SIN INDICADORES MEDIOS SELECTIVOS Y/O CON INDICADORES
Una cepa control +Una cepa control total- o parcialmenteinhibida(selectividad)
Una cepa control +
MEDIOS SELECTIVOS COMPLEJOS CON SUPLEMENTOS
Una cepa control +al suplemento
EXMENES CUANTITATIVO
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
MAYORES EXIGENCIAS
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EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MEDIOS PREPARADOS A PARTIR DE COMPONENTES BSICOS INDIVIDUALES
MILES Y MISRA
EXMENES CUANTITATIVOS ADICIONALESPARA EVALUAR PRODUCTIVIDAD
PLACA EN ESPIRAL (SPIRAL PLATE)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Garcia-Armesto MR y col. Modern microbiological methods for foods: Colony count and direct count methods. A review. Microbiologa.Volumen 9. No. 1. 1993.
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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PhD Claudio Rodrguez Martnez
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PREPARACIN DEL INCULO Y LAS SUSPENSIONES
INOCULACIN DEL M.O. EN CALDO TRIPTONA SOYA (u otro caldo)
INCUBACIN POR 4-6 h HASTA DENSIDAD COMPARABLE CON ESTNDAR DE LA ESCALA DE McFarland* (0,5 comnmente)
107 108 ufc/ml (0,08 1 de absorbancia a 625 nm en espectrofotmetro)
PREPARACIN DE DILUCIONES DECIMALES (u otras) EN SOLUCIN SALINA FISIOLGICA (o en otro medio lquido)
INOCULACIN EN LOS MEDIOS(para medios slidos 15 ml de medio/placa)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Mediosde Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011
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ENSAYOS CUANTITATIVOS EN MEDIOS SLIDOS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Definicin: Rendimiento, recuperacin, crecimientode un microorganismo que se espera que se desarrolleen el medio de cultivo
Para evaluar la productividad de los mediosde cultivo preparados, los mismos debenser inoculados con una cepa de referenciaapropiada (OBJETO)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Ns recuento total promedio, o en al menos en una placa delmedio a ensayar;
donde:
No recuento total promedio, o en al menos una placa del medio de referencia (n 100 ufc)
PR = Ns / No
Inculo = 102 ufcRazn de Productividad
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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para m.o.objeto en medio de propsito general PR 0,7
para m.o. objeto en medio selectivo
PR 0,1
lmite mnimo
definido de la productividad
PhD Claudio Rodrguez Martnez
La norma ISO/TS 11133-2:2000 especifica:
Los microorganismosTiempo y temperatura de incubacinCriterios de aceptacinMedios de referencia
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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Ejemplo de clculo de la productividad de un medio de propsito general
Recuento promedio del m.o. objeto en el medio de propsito general a ensayar: 80 ufc/placa
Recuento promedio del m.o. objeto en el medio de propsito general de referencia: 100 ufc/placa
PR = Ns/No = 80/100 = 0,8 > 0,7
El lote de medio evaluado resulta conforme
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Ejemplo de clculo de la productividad de un medio selectivo
Recuento promedio del m.o. objeto en el medio selectivoa ensayar: 20 ufc/placa
Recuento promedio del m.o. objeto en el medio de propsito general de referencia: 100 ufc/placa
PR = Ns/No = 20/100 = 0,2 > 0,1
El medio evaluado resulta conforme
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Herramientas para analizar datos distribuidossegn Poisson.
Otro enfoque (el ms propagado) es latransformacin de datos hasta lograr ladistribucin normal (log10 (n+1) u otra).
Comparacin de los recuentos segn pruebade Student u otra herramienta estadstica.
TRATAMIENTO ESTADSTICO PARA LA COMPARACIN DE LOS RECUENTOS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Se deben emplear ensayos cuantitativos para evaluar nuevos proveedores o nuevos medios de cultivo
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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donde:N poblacin microbianaa - la sumatoria de ufc en todas las placasV volumen del inculon1 nmero de placas en la primera dilucin n2 nmero de placas en la segunda dilucin d factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin
Clculo de N (poblacin microbiana): basado en el volumen distribuido en la superficie de la placa y el factor de dilucin
POBLACIN MICROBIANA
PhD Claudio Rodrguez MartnezISO 4833: 1993
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Ejemplo simplificado:
Dilucin Recuento10-2 60 y 70 colonias
10-3 5 y 7 colonias
60 + 70 + 5 + 7 142N = ---------------------------------- = ------------------ = 64 545,5 = 6,5 x 104
0,1 *(2 + (0,1 * 2)) * 10-2 0,1 * 2,2 * 0,01
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Prueba de Student, basada en determinar:
ACCREDITATION SCHEME FOR LABORATORIES. A Guide on Measurement Uncertainty in Chemical & Microbiological Analysis. Technical Guide 2, Second Edition, March 2008. The SAC Accreditation Programme. SPRING. Singapore PhD Claudio Rodrguez Martnez
donde:S2p- cuadrado de la desviacin estndar de la poblacin1 LOG de los recuentos/lote de referencia2 LOG de los recuentos/lote de ensayon1, n2 nmero de muestras de cada lotet - estadgrafo t de Student
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Ejemplo de Prueba de Student
COMPARACIN DEL CRECIMIENTO DE NUEVO LOTE DEL MEDIO CromoCen CC (102011) CONTRA EL LOTE DE REFERENCIA (102010)
Lote 102011 (A) LOG A LOG A - Media (LOG A - Media)2 Lote 102010 (B) LOG B LOG B - Media (LOG B - Media)2
100 2,000000 0,009955 0,000099 89 1,949390 -0,035427 0,00125599 1,995635 0,005590 0,000031 100 2,000000 0,015183 0,000231
101 2,004321 0,014277 0,000204 106 2,025306 0,040489 0,00163998 1,991226 0,001181 0,000001 89 1,949390 -0,035427 0,00125591 1,959041 -0,031003 0,000961 100 2,000000 0,015183 0,000231
Media=1,990045 Media=1,984817Suma= 0,001297 Suma= 0,004611DSA2=suma/n-1 = 0,000324 DSB2=suma/n-1 = 0,001153
Sp2=(4 X 0,000324) + (4 x 0,0001153) / (5 + 5 - 2)= 0,000738Sp= 0,027173803
Sp x (1/nA + 1/nB)= 0,017186
t=(1,990045 - 1,984817)/(Sp x 0,2 + 0,2) 0,30417572F=DSA2/DSB2 0,281265554
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Se compara el valor de la t calculada delestadgrafo con el valor crtico para 95 % = 2,306para (n1 + n2) 2 grados de libertad
Como el valor calculado (0,304) es < que el valor crtico (2,306)
pues no hay diferencias significativas entre lacapacidad promotora del crecimiento de loslotes
Prueba de Student
PhD Claudio Rodrguez Martnez
El lote no se rechaza
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RECUENTO PARA EL MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA
donde:
Vtot volumen total de la muestra original inoculada y filtrada en las placas enumeradas;
n1, n2, ..., ni - nmero de placas o membranas contadas para las diluciones d1, d2, ..., di;
V1, V2, ..., Vi volumen de muestra empleado para las diluciones d1, d2, ..., di;
d1, d2, ..., di dilucin empleada para ensayar los volmenes V1, V2, ..., Vi (d = 1 en la muestra sin diluir, d = 0,1 para la dilucin decimal, etc.).
ISO 8199. Second edition. 2005-06-15PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Cs estimado de ufc en el volumen de referencia Vs de la muestra;
Z suma de colonias contadas en las placas o membranas a partir de lasdiluciones d1, d2, ..., di, derivadas de volmenes separados de la porcin de ensayo (muestra o la dilucin);
Vs volumen de referencia seleccionado para expresar la concentracinde los m.o. en la muestra de ensayo;
Vtot volumen total calculado de la muestra original que comprende lasplacas o membranas enumeradas.
RECUENTO PARA EL MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA
PhD Claudio Rodrguez Martnez
IC - intervalo de confianza
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Ejemplo:
Dilucin Recuento10-2 60 y 70 colonias
10-3 5 y 7 coloniasSi Vi = 100 ml
Z = 60 + 70 + 5 + 7 = 142
Vtot = (2 x 100 x 0,01) + (2 X 100 X 0,001) = 2 + 0,2 = 2,2
Vs = 1 ml
Cs = (142/2,2) x 1 ml = 64,54 = 65 ufc/ml
RECUENTO PARA EL MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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m.o. objeto
NMP ensayo + IC ens NMP ref IC ref
Medio de ensayo Medio de referencia
Incubar Incubar
CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS PARA LA TCNICA DE NMP
3, 5 10 tubos
Criterio de aceptacin:
Scott Sutton, Quality Control of MicrobiologicalCulture Media. PMF Newsletter. January, 2006
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Inocular 1 ml (20-100 ufc/ml)m.o. ensayo
Aguas potables, naturales, minerales, ros, potables envasadas, fuentes privadas, hielo (fundido), aguas de mataderos y de equipos de clima
Placa vertida15-20 ml de medio
Incubar a 37 C 1 C Incubar a 22 C 1 C Incubar a 37 C 1 C Incubar a 22 C 1 C
Ejecutar los clculos de productividad y comparacin de recuentos
CONTROL DE LA CALIDAD DE MEDIOS PARA ANLISIS DE AGUASPLACAS VERTIDAS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Hpa standard method. Aerobic colony count by the pour plate method w 4.Centre for Infections. Issue no: 4.2 Issue date: 08.08.08 Issued by Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory in conjunction with the Regional Food, Water and Environmental. Coordinators Forum Page no: 1 of 14. W 4i4.2. National Public Health Service for Wales
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Inocular 1 ml (20-100 ufc/ml)m.o. de ensayo
Lote de ensayo Lote de referencia
Placa vertida15-20 ml de medio
Incubar a 37 C 1 C Incubar a 37 C 1 C
CONTROL DE LA CALIDAD DE MEDIOS PARA ANLISIS DE AGUASPLACAS VERTIDAS
Aguas de piscinas
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Hpa standard method. Aerobic colony count by the pour plate method w 4. Centre forInfections. Issue no: 4.2 Issue date: 08.08.08 Issued by Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory in conjunction with the Regional Food, Water and Environmental. Coordinators Forum Page no: 1 of 14. W 4i4.2. National PublicHealth Service for Wales
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Ashraf M and Ashraf H, Pak J Med Sci . 2007; 23(3): 415-9
Pueden ser utilizados los mtodos:
Miles-Misra
Siembra en espiral
Otros mtodos de recuento
Mossel DA y col. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at standardization at the international level. J Appl Bacteriol. 1983; Jun; 54(3):313-27
PhD Claudio Rodrguez MartnezMiles AA & Misra SS. J Hyg (London).1938; 38:732
Garcia-Armesto MR y col. Modern microbiological methods for foods: Colony count and direct count methods. A review. Microbiologa.Volumen 9. No. 1. 1993.
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Mtodo suplementario para medios slidos
Necesidad de secar la superficie de manerareproducible
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Diluciones del m.o. de ensayo (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6)Placas con los medios de referencia y del lote a ensayar, divididas encuadrantesCada cuadrante rotulado con la dilucin que se aplicarSe adicionan 0,01 ml (10 l) de cada dilucin sobre cada cuadrante,dejndola caer desde una altura de 2,5 cm con ayuda de unamicropipeta automtica correctamente calibradaCada gota se dispersa por un rea de aproximadamente 1,5 a 2,0 cm dedimetroLas placas se incuban a la temperatura y tiempo indicados en la normaSe ejecuta el recuento en los sectores donde sea posibleSe pueden ensayar ms de dos placas por muestra, en ese caso, sepromedian los recuentos
MTODO DE MILES-MISRAMODIFICADO
Grupo colaborador GEGMIC. Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiologa ClnicaCCI-SEIMC-00. 16-05-04 Versin: 1
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PRODUCTIVIDAD MTODO DE MILES-MISRA MODIFICADO
No. de colonias en el medio exper. x factor de dilucin P = -----------------------------------------------------------------------------
No. de colonias en el medio control x factor de dilucin Ejemplo: Medio experimental: 20 colonias a la dilucin 10-3 Medio control: 25 colonias a la dilucin 10-4 20 x 3 60 P = --------------- = --------- = 0,6 x 100 % = 60 % 25 x 4 100
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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ENSAYOS CUANTITATIVOS EN MEDIOS LQUIDOS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Prueba de dilucin cuantitativa en medios lquidos Tubos con un volumen de 10 ml del medio a evaluar y el de referencia
m.o. objeto
Inocular una dilucin alta
(10-100 ufc)
m.o. no objeto
Inocular una dilucin baja(> 1000 ufc)
Mezcla de m.o. objetoy no objeto:
caldos selectivos
Incubar segn norma y despus de la incubacin
del caldo
Tomar un volumen (alcuota, ej., 10 l) y si esnecesario se recomienda preparar diluciones
Sembrar en un medio agarizado no inhibitorio eincubar por 6 12 h
Evaluar productividadPara la evaluacin de las mezclas de cultivo se recomienda utilizar un medioagarizado no selectivo el cual permita la diferenciacin de las especies contenidasen la mezclaEjemplo: PCA con MUG (diferencia E. coli y Salmonella)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
m.o. objeto (10-100 ufc)m.o. no objeto (> 1000 ufc)
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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Para la mayora de los medios el PR de los m.o.objeto no debe ser < 0,1, sea, la diferencia encrecimiento no debe exceder un orden de magnitud
PR = Ns / No
Prueba de dilucin cuantitativa en medios lquidos (continuacin)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
En determinados medios los m.o. objetodeben alcanzar entre 106 ufc/ml y 108 ufc/ml y los no objeto en medios selectivosno > 104 ufc/ml
Para otros casos:
Para las mezclas de m.o. los diana deben prevalecer sobre los no diana
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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Prueba de dilucin cuantitativa de diluyentesIdem a los medios, pero se incuban a temperatura ambiente por 45 min
Se transfiere a placas, se incuba y se procede al clculo
El perodo de incubacin en placas es reducido(entre 6 y 10 h)
El nmero de m.o. despus de incubar debeencontrarse en 50 % del recuento inicial (para esto se inoculan placas a partir de los tubos sin incubar a t ambiente)
No se requieren nmeros reducidos o elevados de m.o. objeto y no objeto
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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Prueba de dilucin cuantitativa de medios de transporte
Idem a los medios, pero se incuban a la temperatura y por el perodo de tiempo acostumbrados a su uso comn
Se transfiere a placas, se incuba y se procede al clculo
El perodo de incubacin en placas es reducido(entre 6 y 10-12 h)
El nmero de m.o. despus de incubar debeencontrarse en 50 % del recuento inicial (para esto seinoculan placas a partir de los tubos sin incubar a tambiente)
No se requieren nmeros reducidos o elevados dem.o. objeto y no objeto
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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ENSAYOS SEMI-CUANTITATIVOS EN MEDIOS SLIDOS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Mtodo ecomtrico
Inculo de 103 104 ufc
Superficie de los medios secas por igual
Utilizando un asa de 1 l, se trazan 4 lneas paralelasa intervalos de 0,5 cm (sector A)
El rayado es repetido para el sector B y C
Se concluye en el sector D con una simple lnea acompaada de un estriado
Puede usarse una plantilla bajo la placa para facilitar el rayado exacto
.
PRUEBAS SEMI-CUANTITATIVAS
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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Slo la vuelta (asa), no el alambre que sostiene el asa debe sumergirse en el cultivo y llenarse completamente.
El lquido en exceso debe ser eliminado apretando la parte ms ancha del asa tres veces contra el borde del recipiente (placa).
Al rayar las placas el ngulo entre la vuelta y la superficie del agar debe ser 20 a 30 .
La presin del asa sobre la superficie del agar y la rapidez de rayar debe ser consistente.
Nunca se debe quemar el asa para pasar a lassiguientes estras.
Como excepcin, en algunos casos, se permite cambiar el asa o esterilizarla para pasar de la seccin A a la B.
PRUEBAS SEMI-CUANTITATIVASMtodo ecomtrico (continuacin 1)
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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PhD Claudio Rodrguez Martnez
Las cuentas se suman para obtener el G1
Luego de la incubacin de las placas de acuerdo con los requisitos del mediode cultivo, se evala la apariencia y tamao de las colonias y se calcula elndice de crecimiento (G1)
Cada lnea que muestre crecimiento se evala con un score (puntuacin) de 1
El mximo score obtenido por placa es 16
Si el estriado no muestra crecimiento hasta la mitad de su longitud se evalacon un score de 0,5
Si el estriado no muestra crecimiento o manifiesta un crecimiento escaso(menos de la mitad la longitud) se evala con un score de 0
Interpretacin: Para un m.o. objeto el G1 debe ser al menos 6 para concluir que el medio es aceptable. Para medios de cultivo no selectivos G1 es normalmente > 6.
PRUEBAS SEMI-CUANTITATIVASMtodo ecomtrico (continuacin 2)
Norma ISO/TS 11133-2:2000
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Medios slidos: Por el mtodo ecomtrico
Medios fluidos: Por el mtodo de control de la calidad de los medios fluidos
EVALUACIN MICROBIOLGICA
NDICE ABSOLUTO DE CRECIMIENTO NDICE RELATIVO DE CRECIMIENTO
IACvalor absoluto obtenido de acuerdo al mtodo
IRCrelacin entre el valorabsoluto obtenido en elmedio evaluado y elmedio de referencia
IRC= IACexp/IACref
OTRAS PRUEBAS SEMI-CUANTITATIVAS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Mossel DAA. Microbiologa de los alimentos, 2 edicin, Acribia, Zaragoza, Espaa, 2003; 703.
Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. CursoMaestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011
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ESQUEMA DE INOCULACIN SEGN EL MTODO ECOMTRICO (variante anterior) A1 = 5 B1 = 10 C1 = 15 D1 = 20
A2 = 25 B2 = 30 C2 = 35 D2 = 40
A3 = 45 B3 = 50 C3 = 55 D3 = 60
A4 = 65 B4 = 70 C4 = 75 D4 = 80
A5 = 85 B5 = 90 C5 = 95 D5 = 100
IAC exp. 75IRC =------------ x 100 = ----- x 100 = 88,24 %
IAC ref. 85
Ejemplo:Medio referencia: Crec.- ltimo punto A5, IAC=85Medio experimental: Crec.- ltimo punto C4, IAC=75
Mtodoecomtricode Mossel(1983)
Estriado en 5 zonas
MTODO ECOMTRICO
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Barbara M. Lund and oth,The microbiological safety and quality of food, Volumen 2. 2000
MOSSEL, D.A. and oth. Quality assurance of selective culturemedia for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal Applied Bacteriology, 1983, 54(3), 313-27.
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Recuperabilidad y reproducibilidad
Cada estra tiene un valor de 0.2 y la estra central de 1.0
ndice Relativo de Crecimiento (IRC) 1
ndice Absoluto de Crecimiento (IAC) 2.5 3 para m.o. objeto
Alfonso Cabeza HE. Manual Prctico de Microbiologa de Alimentos. 2006
Mtodo Ecomtrico(versin de la USP)
Crecimiento IAC
Todas las estras 5,0
Todas menos la central 4,0
Todas en los cuadrantes 1, 2 y 3, la mitad en el cuadrante 4 y ningn crecimiento en la central
3,5
Todas en los cuadrantes 1, 2 y 3, ninguna en el cuadrante 4 en la central
3,0
Los crecimientos registrados en la mitad de los cuadrantes se recogen como 2,5; 2,0; 1,5 y as sucesivamente
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Scott Sutton, Quality Control of Microbiological Culture Media, PFM newsletter. Volume 12, Number 1 January, 2006
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ENSAYOS SEMI-CUANTITATIVOS EN MEDIOS LQUIDOS
PhD Claudio Rodrguez Martnez
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Prueba semi-cuantitativa (medios lquidos) Mtodo de tubo simple con MEZCLA DE M.O.
Tubos con un volumen de 10 ml del medio exp. y el de ref.
m.o. objeto
Inocular una dilucin alta (10-100 ufc)
m.o. no objeto
Inocular una dilucin baja (> 1000 ufc)
Medio selectivo especfico Medio no selectivo (ATS)
Interpretacin: La PR es satisfactoria si al menos 10 colonias del m.o. objeto crecen en el medio selectivo
Estriar un asa de 10 l en
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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Preparar diluciones hasta 10-12 de los m.o. a evaluar
Adicionar 1 ml de cada dilucin a 9 ml de los medios de cultivo (exp. y ref.)
Examinar los caldos y anotar la mxima dilucin en la cual se observ el crecimiento por la turbiedad del caldo
Incubar por 18 h a 37 C
Ejemplo: Medio exp. se observ crecimiento
a la dilucin 10-7: IACexp=7
Medio ref. se observ crecimiento a la dilucin 10-8: IACref=8
IRC= 7/8 = 0,875 = 87,5 %
MTODO DE CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS FLUIDOS
Calcular el IAC y el IRC
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011
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MTODO DE PUNTO FINAL (USP)m.o. objeto
Inocular una dilucin alta (< 5 ufc) del m.o. ensayo en los dos medios a comparar
Hasta 100 tubos del lote de ensayo
100 tubos del lote de referencia
Incubar
Contar el nmero de tubos con crecimiento en cada lote de medio
Comparacin estadstica (2 o Fisher)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Scott Sutton, Quality Control of Microbiological CultureMedia, PFM newsletter. Volume 12, Number 1 January, 2006
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ENSAYOS CUALITATIVOS EN MEDIOS SLIDOS
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Pruebas cualitativas
El inculo de trabajo: 103 104 ufcUtilizando un asa de 1 l, se realizan estriados en lneas sobre la superficie del medio (preferiblemente lneas paralelas)Se pueden estriar ms de 1 m.o.
Mtodo de estriado por agotamiento
Interpretacin: Se llevar a cabo visualmente asignando un score de crecimiento:
0 no hubo crecimiento1 crecimiento dbil2 buen crecimiento
Los m.o. objeto deben presentar su apariencia tpica, tamao y morfologa colonial(score de 2)
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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Pruebas cualitativas
El inculo de trabajo: 103 104 ufc
Mtodo por inundacin de la superficie
Interpretacin: Visualmente asignando un score de crecimiento:
0 no hubo crecimiento1 crecimiento dbil2 buen crecimiento
Los m.o. objeto deben presentar su apariencia tpica, tamao y morfologa colonial(score de 2)
1 L
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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ENSAYOS CUALITATIVOS EN MEDIOS LQUIDOS
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Prueba cualitativa Mtodo de tubo simple
Los resultados son slo indicativos
El m.o. de trabajo se inocula directamente utilizando un asa microbiolgica de 1 L
Interpretacin: Se llevar a cabo visualmente asignando un score de crecimiento:
0 no tiene turbiedad1 turbiedad dbil2 turbiedad fuerte
Otras caractersticas pueden ser evaluadas: precipitados, agregacin celular, gas, hidrlisis, etc.
PhD Claudio Rodrguez MartnezNorma ISO/TS 11133-2:2000
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Crecimiento copiosom.o. se ionocula a un nivel muy bajo (< 100 ufc/unidad)Se incuba por perodo descrito (3 das 5 das)Se compara el nuevo lote con el de referenciaSe considera un ensayo de punto final con n=1
Mtodo de tubo simple (USP)Los resultados son slo indicativos
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Scott Sutton, Quality Control of MicrobiologicalCulture Media, PFM newsletter. Volume 12, Number 1 January, 2006
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OTROS ENSAYOS PARA MEDIOS ESPECIALES
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PARA MEDIOS ESPECIALES, CONDICIONES ESPECIALES
Medios de cultivo para anlisis de sangre (hemocultivos)
PhD Claudio Rodrguez Martnez
Agar de Mueller-Hinton para ensayos de susceptibilidad
EFECTIVIDAD DE LOS MEDIOS LQUIDOS
BIOSCREEN (LabSystems)Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso
Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011
CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLGICOSASPECTOS GENERALES, PRODUCTIVIDADNmero de diapositiva 2Nmero de diapositiva 3Nmero de diapositiva 4Nmero de diapositiva 5Nmero de diapositiva 6Nmero de diapositiva 7Nmero de diapositiva 8Nmero de diapositiva 9Nmero de diapositiva 10Nmero de diapositiva 11Nmero de diapositiva 12Nmero de diapositiva 13Nmero de diapositiva 14Nmero de diapositiva 15Nmero de diapositiva 16Nmero de diapositiva 17INDICADORES ESPECFICOS DEL DESEMPEONmero de diapositiva 19Nmero de diapositiva 20Nmero de diapositiva 21Nmero de diapositiva 22Nmero de diapositiva 23Nmero de diapositiva 24Nmero de diapositiva 25Nmero de diapositiva 26Nmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31Nmero de diapositiva 32Nmero de diapositiva 33Nmero de diapositiva 34Nmero de diapositiva 35Nmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Nmero de diapositiva 38Nmero de diapositiva 39Nmero de diapositiva 40Nmero de diapositiva 41Nmero de diapositiva 42Nmero de diapositiva 43Nmero de diapositiva 44Nmero de diapositiva 45Nmero de diapositiva 46Nmero de diapositiva 47Nmero de diapositiva 48Nmero de diapositiva 49Nmero de diapositiva 50Nmero de diapositiva 51Nmero de diapositiva 52Nmero de diapositiva 53Nmero de diapositiva 54Nmero de diapositiva 55Nmero de diapositiva 56Nmero de diapositiva 57Nmero de diapositiva 58Nmero de diapositiva 59Nmero de diapositiva 60Nmero de diapositiva 61Nmero de diapositiva 62Nmero de diapositiva 63