CLASE GENERAL DE PROBLEMAS II: PCR APLICADA AL CLONADO
Docente: Cecilia L. Balaban
APLICACIONES DE LA PCR Y SUS VARIANTES: • DIAGNÓSTICO/FORENSE: IDENTIFICACIÓN, PRESENCIA O AUSENCIA DE UNA
SECUENCIA DE ADN BLANCO.
• GENERACIÓN DE SONDAS/ NIVELES DE EXPRESIÓN: TRANSCRIPCIÓN REVERSA→PCR.
• CLONADOS MOLECULARES
DISEÑO DE OLIGOS CON SITIOS DE RESTRICCIÓN: • Secuencia inicial : 3-6 nt extra en el extremo 5’ para apoyo de la ER. (NNN)
• Sitio de restricción:
No existe otro en el inserto. Se encuentra sólo una vez en el vector.
• Secuencia de hibridación: 18-21 nt. Clonado en fase para expresión de un ORF. Se agregan 0/1/2 nt. Antes del ATG. Inclusión codón START(ATG)/ STOP(TAA,TGA, TAG)
¿clonando un ORF?
¿clonando con fusión
N/C-Terminal?
TEMPERATURA ANILLADO PROTOCOLO DE PCR PARA INSERTO: ADN molde: plasmídico/genómico/ biblioteca cADN Temperatura de anillado (Ta): Se calcula teniendo en cuenta sólo los nt del oligo que hibridan con el molde. Se puede aumentar la Ta en ciclos avanzados para aumentar la especificidad de la reacción. Ej.:
5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'
Ta=Tm-4°C= (2x(A+T) + 4x(G+C)) -4°C= (2x(6+6)+4x(5+4)) - 4°C = (24 + 36) -4°C= 56 °C
Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a continuación (se subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción). HindIII 5’GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG -582 nt- ACA TAA AAG CTT ATC TTC
AGC TGC ATT 3’
La proteína que codifica se debe obtener con todos los aminoácidos y se la quiere purificar introduciendo un tag de histidina amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en el vector pET28. En el laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI, las cuales no se encontraron en la secuencia codificante. a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares. b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla. c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?
PROBLEMA DE PCR PARA CLONADO MOLECULAR
a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares.
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582
nt – ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’
Hind III
Enzimas en el laboratorio:
BamHI: G GATCC
EcoRI: G AATTC
HindIII: A AGCTT
Posibles combinaciones:
• D: BamHI - R: EcoRI
• D:BamHI - R: HindIII (A)
• D: EcoRI - R: HindIII (B)
BamHI: G GATCC
EcoRI: G AATTC
HindIII: A AGCTT
OLIGO REVERSO: 5’ GCTGAAGATAAGCTTTTATG 3’
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA AAG
CTT ATC TTC AGC TGC 3’
Hind III
Ta= Tm – 4°C= ((4x7)+(2x13)) – 4°C= 50°C; 20 nt.
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA
AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’
OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando
missmatches
BamHI: G GATCC
A T
OLIGO DIRECTO: 5’ NNNGGATCCAAGCGAATGTTCGG 3’
GATCCAAGCGAATG….
Ta= (Tm – 4°C x missmatch) – 4°C=
((4x11)+(2x9)) – (2 x 4°C) – 4°C= 50°C; 23 nt.
BamHI
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA
AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’
OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de
restricción entero.
EcoRI: G AATTC
OLIGO DIRECTO: 5’ NNNGAATTCATGTTCGGTCAGGAACTG 3’
Ta= (Tm – 4°C) = ((4x9)+(2x9)) – 4°C= 50°C; 27 nt.
AATTCATG….
EcoRI
b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla.
Para expresar la proteína recombinante se transformará una cepa de
Escherichia coli como la BL21(DE3) la cual posee el gen que codifica para la
T7 ARN polimerasa. Esta enzima reconoce el promotor del bacteriófago T7
que dirige la expresión del gen de interés en el vector derivado de la serie
pET28. La expresión será inducida mediante el agregado de IPTG (isopropil-β-
D-tiogalactósido) el cual se une al represor LacI y libera el sitio de unión para
la RNA polimerasa en el promotor.
La proteína de fusión tendrá 237 aminoácidos en ambas opciones de clonado.
La secuencia de polihistidinas amino terminal de la proteína recombinante
permitirá purificarla selectivamente mediante una columna cromatográfica
con resina de Ni-NTA. La proteína se eluye con imidazol.
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA
AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’
OPCIÓN A: oligo directo con sitio para BamHI incorporando
missmatches
194 aa + 1 aa 10 aa + …
+ 29 aa
+ 3 aa
10 +195+29+3= 237 aa
5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG – 582 nt – ACA TAA
AAG CTT ATC TTC AGC TGC 3’
194 aa + 1 aa 8 aa + …
+ 29 aa
+ 5 aa
8 +195+29+5= 237 aa
OPCIÓN B: oligo directo con sitio para EcoRI incorporando el sitio de
restricción entero.
c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?
El hexámero de histidinas amino terminal se puede eliminar de la proteína
purificada mediante un tratamiento de proteólisis con trombina.