Download - Apuntes bioensayo
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 1/71
Apuntes de Bioensayos.
1.- INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS GENERALES.
Características generales del curso
1.1.1. Propósito y entrega de temario y calendario de prácticas de
laboratorio.
1.2. Conceptos Básicos.
Que es un Bioensayo??
Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de
prueba para la presencia o concentración de un compuesto químico o
un efecto ambiental.
1.2.1. Diseño Experimental.
Un experimento es una investigación planeada para descubrir
nuevos hechos o para confirmar o negar los resultados de
investigaciones previas. En un experimento se manipulan
deliberadamente una o más variables independientes (supuestas
causas) para analizar las consecuencias que la manipulación tiene
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 2/71
b á bl d d ( f ) d d
1. Simplicidad. La selección de los tratamientos y la disposición
experimental deberá hacerse de la forma más simple posible.
2. Grado de precisión. El experimento deberá tener la
capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de
precisión que desee el investigador. Para cumplir con este propósito se
deberá partir de un diseño y un número de repeticiones adecuados.
3. Ausencia de error sistemático. Se debe planear un
experimento con el propósito de asegurar que las unidadesexperimentales que reciban un tratamiento no difieran
sistemáticamente de aquellas que reciben otro tratamiento,
procurando de esta manera obtener una estimación insesgada del
efecto de tratamientos.
4. Rango de validez de las conclusiones. Este deberá ser tanamplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a
aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos
replicados y los experimentos con estructuras factoriales.
5. Cálculo del grado de incertidumbre. En todo experimento
existe algún grado de incertidumbre en cuanto a la validación de las
conclusiones. El experimento deberá ser concebido de modo que sea
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 3/71
canario moría, por ser mas sensible, ellos tenían la oportunidad de
salir y no correr la misma suerte. Otros ejemplos de organismos de
prueba son, el uso de cerdos para detectar y colectar trufas, perros
para detectar explosivos y drogas, gametos de erizo de mar paradetectar eco toxicidad en agua de mar, Euglena gracilis para detectar
niveles de vitamina B12.
Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de una
población expuesta a cierto agente tóxico se deba al efecto de éste y
no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de
fallas operacionales en la aplicación del método.
Los Organismos de prueba pueden ser:
• Organismos criados en Laboratorio
• Organismos colectados en campo.
En general, es preferible utilizar organismos criados en el laboratorio
en vez de los recolectados en el campo porque los exámenes
estandarizados requieren de un abastecimiento siempre disponible de
organismos en buena salud provenientes de cultivos de condicionesconocidas y constantes. Los bioensayos hechos en el laboratorio
usando organismos recolectados en el campo han sido menos
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 4/71
1.2.3. Material de Prueba.
Cualquier objeto orgánico o inorgánico donde se van a aplicar los
diseños experimentales con el fin de observar una respuesta,
Compuestos químicos, extractos, fuente de compuestos o materia que
pueden generar una respuesta biológica en los organismos de un
ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino,
pesticidas, materia orgánica
1.2.3. Aplicación del análisis Estadístico.
En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o
variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que
la respuesta que se va a medir realmente provee información útil
acerca de la investigación.
Cada respuesta medible, está representada matemáticamente en
un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las
observaciones generalmente denotadas por , en términos de “efectos'' que contribuyen a . Esos efectos se pueden clasificar en
tres categorías: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseño y Efectos
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 5/71
Error Experimental. Una característica de todo material
experimental es la variación. Asociada con la unidad experimental está
el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son
iguales. También podemos decir que es una medida de la variaciónexistente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar.
Contribuyendo al error experimental están:
a) El error de tratamiento, el cual resulta de cualquier falta de
uniformidad en la realización física del experimento o en la replicación
de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de
cierta sustancia, administramos 19 ó 21 ppm.
b) El error de estado.o variabilidad inherente al material al cual
se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios
en el estado físico de una UE. Por ejemplo, en un experimento denutrición con camarones como material experimental, los individuos
tendrán constitución genética diferente, ésta es una variabilidad
inherente al material experimental o error de estado. Las camarones
se colocarán en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros
factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realizaciónfísica del experimento o error de tratamiento.
Al h i f i dí i i l d fi
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 6/71
Manejar el material experimental de tal manera que se logre
reducir los efectos debido a la variabilidad inherente.
Refinar la técnica experimental. Es responsabilidad del
experimentador que se haga todo lo posible para asegurar una técnica
cuidadosa porque ningún tipo de análisis estadístico puede mejorar los
datos obtenidos de experimentos mal efectuados. La técnica
defectuosa puede aumentar el error experimental de dos maneras:
i) Puede introducir fluctuaciones adicionales de una naturalezamás o menos aleatoria y, posiblemente, sujetas a las leyes del azar.
Tales fluctuaciones, si son grandes, deberán revelarse por sí mismas
en la estimación del error experimental, posiblemente mediante la
observación del coeficiente de variación. Este es una medida de
variación relativa y es utilizado para comparar la precisión de dosexperimentos o de dos medidas.
ii) Mediante errores no aleatorios. Éstos no están sujetos a las
leyes del azar y no siempre pueden detectarse mediante la
observación de las medidas individuales. Se dispone de pruebas
estadísticas para detectarlo.
La técnica defectuosa también puede producir medidas
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 7/71
El error experimental no puede detectar sesgos; estima la
precisión o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud.
Error Observacional. Se considera como parte del error
observacional el error de medida, es decir, el error debido a la
imprecisión de la medida o procedimiento de detección (aparatos) y el
error de muestreo debido a la selección de las UE para la
investigación.
1.3. Panorámica de la Aplicación del Bioensayo en problemas
relacionados con la bioprospección en el medio marino.
La evaluación de sustancias bioactivas o de condiciones
ecotóxicas requiere de la medición de una multiplicidad de parámetros
que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que
permitan extraer conclusiones a través de un análisis estadístico
correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que
representa casi el 75% del total de especies del planeta, el número de
sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan
considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede
deber a que el medio marino es mucho mas homogéneo que el
ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposición de
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 8/71
et al ., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de
origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay
muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para
inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiacollamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido
corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias
coliformes, experimentación exploratoria en este mismo curso de
Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido
como “Vaquita” Aplysia californica inhibe significativamente elcrecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina
que es un antibiótico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos
de mar es un bloqueador nervioso. Además de los organismos
marinos, en general el agua de mar es un suero biológico que además
de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de
materia orgánica entre esta materia se encuentran disueltas
hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace
del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones
bioquímicas.
2. BIOÉTICA
S ú l E l di f Bi hi (N Y k 1978 l I
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 9/71
la calidad de vida humana. Esta disciplina esta conformada por la
interacción de varias ciencias por lo que se fundamenta en la
experimentación con seres vivos. Se puede decir que en si, esta
ciencia trata de justificar la investigación en animales. Existen distintasagrupaciones humanas que rechazan la idea de experimentar en
animales, ya que estos últimos tienen el mismo derecho a la vida que
un ser humano; pero también hay algunos movimientos humanos que
la apoyan y mantienen de esta manera a los laboratorios.
2.1. Utilidad del uso de los bioensayos en la investigación
biomédica y ambiental pros y contras.
PROS
La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un
método de detección relativamente simple y que se puede emplear
para el monitoreo de causas y sus efectos de tipo ambiental y en
farmacología. En un organismo, especial, la respuesta biológica
(efecto) se puede generar a concentraciones menores a los límites de
detección de los principales métodos analíticos y aunque, un método
analítico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o
concentración de compuesto o causa de daño, sus datos no nos
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 10/71
• Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parámetros
estatales y federales de calidad ambiental.
Estas acciones se pueden aplicar en:
• Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías
biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de
nuevos productos.
• Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o
procesos.
• Obtener permisos de descarga.
• Evaluación de riesgo ambiental.
• Elementos de cargo o descargo en litigios.
• Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger
organismos de futuras afectaciones.
CONTRAS.
La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados,
difícilmente, generan información específica de un compuesto, causa ocondición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los
organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 11/71
necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le
provea lo necesario.
2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la
investigación Biomédica. Y El Derecho del hombre a utilizar
organismos para experimentación.
La Asociación Médica Mundial afirma que el uso de animales en
la investigación biomédica es esencial para el progreso médico, y a
pesar que se dice que en la experimentación con animales deben decumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales,
esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al
organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir
alguna lesión es un proceso traumático aunque se utilicen anestésicos
ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados enla disminución de peso. Así mismo, el impacto de estrés sobre los
mecanismos fisiológicos se ha estado analizando al igual que el miedo,
que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo,
una posible solución sería tener un mayor acercamiento a los
organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana.
Se conoce que la bioética tiene por objeto material los actos
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 12/71
2.4. Otras alternativas al uso de animales en experimentación
biomédica y en la enseñanza en la carrera de oceanología.
La creciente sensibilidad respecto a la experimentación en
animales en investigación biomédica y la enseñanza de las ciencias
naturales, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos
de la misma son parte de un debate actual y, probablemente,
necesario.
La utilización de animales de experimentación en investigación
Biomédica y en la enseñanza de las prácticas de diferentes
asignaturas de las Ciencias naturales y en especial en nuestra
Facultad en las prácticas de Fisiología, Bioquímica, Zoología, Química
Orgánica, Aprovechamiento de Productos Marinos, Acuacultura y por
supuesto en BIOENSAYOS ha venido siendo la metodología másempleada por todos los profesores de estas disciplinas. Gracias a la
utilización de estos animales, los estudiantes han podido ver de cerca
los diferentes fenómenos que se les habían explicado anteriormente en
la clase de teoría. En la mayoría de los casos, excepto en
BIOENSAYOS, son prácticas cruentas donde varios animales sonsacrificados y además en la mayoría el fin didáctico no se cumple y el
estudiante se convierte en un simple espectador Es obvio que éste
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 13/71
25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales
Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se
especifica:
"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o
de entrenamiento … se deben restringir a los absolutamente
necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y
se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos
por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente
efectivos".
En las legislaciones relacionadas con la protección de los
animales de todos los países se considera fundamental aplicar el
principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este
principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales deexperimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el
nuevo método nos aporte el mismo grado de información.
En el caso de la docencia e investigación se plantea el reemplazo
de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los
métodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniquíes ysimuladores mecánicos; b) películas y vídeos; c) simulaciones de
d i d lid d i l d) i ió
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 14/71
bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide
el paso de substancias hidrosolubles.
Las proteínas de la membrana están suspendidas en formaindividual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los
canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva, ciertas
substancias.
La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula
controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes
entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 15/71
molécula "señal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la
superficie celular.
En la membrana se localizan unas glicoproteínas que identifican
a otras células como integrantes de un individuo o como extrañas
(inmunoreacción). Las interacciones entre las células que conforman
un tejido están basadas en las proteínas de las membranas.
Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los
lípidos y las funciones dependen de las proteínas.
3.2. Procesos de entrada de sustancias a través de membranas
Absorción
La absorción de un Xenobiótico se define como el proceso por
medio del cual éste atraviesa membranas y capas de células hastallegar al torrente sanguíneo. El mecanismo de ingreso del xenobiótico
al organismo usa los mismos mecanismos de transporte diseñados
para movilizar compuestos de estructura similar.
Los principales mecanismos de transporte son los siguientes:
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 16/71
acuosos o canales de pequeño tamaño pueden pasar de modo pasivo
los compuestos hidrófilos, iones y electrólitos (PM menor 100)
La difusión simple es el mecanismo de transporte más
importante en la absorción de los Xenobióticos. La velocidad de
difusión pasiva se basa en la ley de Fick
d
CiCf DmAKmw
dt
dX )( −=
Donde:
• Dm: Coeficiente de difusión del Xenobiótico en la membrana(cm2 /min)
• A: Superficie de la membrana (cm2)
• Kmw: Coeficiente de partición del Xenobiótico en la interfase agua-membrana.
• Cf: Concentración del xenobiótico fuera de la membrana• Ci: Concentración del xenobiótico en el interior de la membrana
• d: Grosor de la membrana en cm.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 17/71
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 18/71
Transporte activo.- El transporte activo, la endocitosis o la
difusión mediada por un transportador son los mecanismos por los
cuales se difunden los compuestos de peso molecular grande (sean
polares o liposolubles) y los que se transportan en contra del gradientede concentración. Requieren de un transportador y se consume
energia (ATP).
Cinética
Extracelular Memb Intracelular
P X X P P X v
V
V
+ → + ⇔ '3
1
2
El Xenobiótico fuera de lamembrana se absorbe y enlaza alportador “P”a una velocidad V1
para formar el complejo XP, lavelocidad V2 es la velocidad dedesorción a la cual el xenobióticose separa de P y permanece fuerade la célula.
[ ][ ] [ ][ ]XKV X 11 P P V =→1α
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 19/71
[ ] [ ] [ ]
[ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ][ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ][ ]
[ ][ ]
enzimáticanaturalezadees Portador El
Menten-Michaelisdeecuaciónlaesigu
activotrasnportedecinéticala
revelanosecuación Esta X Kt
X V V
X Kt
X
Vmax
V
Pt
XP
X Kt
X
(3)enos sustituim Pt
XP
Vmax
V
Pt K
XP K
Vmax
V
Vmax
V divide sesi Pt K Vmax la entonces Pt [MP] cuando
o xenobióticel conenlazadosestan portadoreslostodoscuandodá semáximotrasnporte El
XP K V
2de
Pt
XP
X Kt
X
X Kt XP XPt
XPX KtXP XPt KtXP XPt-XPX
Kt MP
XPt-XPX Kt
XP
XP Pt X 1de XP Pt P entoces
XP P Pt Si
33
33
3
+
=⇒
+
=⇒=
+
=⇒=
==
=
=
+
∴
+=
+=∴=
=∴=−
⇒−=
+=
max
3
)(
3
3
3
33
La Endocitosis
Existen dos formas la
Fagocitosis y la
Pinocitosis, se trata de un
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 20/71
3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en
el efecto farmacológico.
Las propiedades fisicoquímicas de los Xenobioticos
Pequeño radio atómico o molecular
Grado de ionización
Coeficiente de partición
Pka
• Se realiza a favor de un
gradiente de concentración
• Necesita un portador
• No consume energia
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 21/71
la velocidad de absorción y del tiempo de residencia del agente en la
superficie de transporte.
3.4. Factores inherentes a los organismos que influyen en el
efecto farmacológico.
Cuando el tóxico se ingiere, entra al Tracto Gastro Intestinal
(TGI), la mayor cantidad se absorbe en el estómago y en los intestinos
aunque también puede haber absorción en cualquier lugar del TGI,
incluyendo las absorciones sublingual y rectal.El sitio de absorción depende en parte del estado de ionización
del compuesto. Los ácidos débiles es más probable que se absorban en
el estómago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases débiles,
que están menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el
intestino donde existen estas condiciones.
La gran área de absorción del intestino y los largos tiempos de
residencia, dependiendo de la movilidad intestinal, permiten que se
tengan absorciones considerables aunque el flux, cantidad
transportada por unidad de área y de tiempo, sea pequeño.
La absorción de los xenobióticos usa los mismos mecanismos
que tiene el TGI para absorber los nutrimentos Por ejemplo el plomo
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 22/71
La absortividad del tóxico ingerido depende de sus propiedades
físicoquímicas. Como se mencionó antes, los compuestos liposolubles
de bajo peso molecular y los compuestos no ionizados se absorben
mejor.
Los xenobióticos se pueden ligar reversiblemente a las proteínas
plasmáticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones
hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. La
molécula de proteína tiene un número limitado de sitios donde se
pueden ligar, tanto los xenobióticos, como los compuestos endógenos.
Así que, un agente determinado tiene que competir con los demás
compuestos (xenobióticos y/o endógenos) por los sitios de unión
disponibles. La unión reversible del compuesto a las proteínas impide
la difusión simple pero no limita su transporte activo.
3.5. Modelos que explican la absorción, distribución,
biotransformación y excrecion de sustancias por los
organismos.
3.5.1. ADBE.
Adsorbción.
ó
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 23/71
Los modelos ADBE y ADME representan la cinética de
transferencia de xenobióticos en un organismo y su efecto
farmacológico, a traves del estudio de estos modelos se generan las
terapias correspondientes para eliminar su efecto.
La interacción dinámica de todos los procesos que constituyen el
ADME, determina el tiempo que permanecerá un agente dentro del
organismo después de que éste ha sido expuesto a una dosis
determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la
concentración de las especies tóxicas dentro del organismo se
le conoce como toxicocinética.
Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se
pueden modelar matemáticamente e integrarlas en un modelo que
represente la dinámica global del tóxico dentro del organismo.Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad
química, se puede representar por una ecuación diferencial en la que
la derivada de la concentración con respecto al tiempo en un sitio
determinado, se expresa como una función de la concentración en ese
lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidadespecífica y normalmente se representa por la letra "k".
(h // f d h i d / b/ 2 3 5 h l)
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 24/71
dC/dt = - kelC
dondeC = concentración plasmática
kel = constante de velocidad de eliminación de
primer orden
t = tiempo al que se muestreó la sangre.
Este modelo indica que la velocidad global a la que procede el
ADME de un compuesto es directamente proporcional a la
concentración y que la velocidad no varía linealmente con la dosis,
sino que su variación es exponencial. La velocidad de eliminación es
alta cuando la dosis es alta, pero disminuye fuertemente a medida quela concentración del tóxico disminuye.
Vida media es el tiempo que tarda el organismo en reducir a la
mitad la concentración del tóxico.
Si un compuesto tiene una vida media de 24 horas y su
concentración en un momento dado es 40 mg/L, en un día se bajará la
concentración a 20 mg/L, pero bajar esta concentración otros 20 mg/L
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 25/71
y su eliminación mostrará una cinética de orden cero aparente, aunque
a concentraciones no saturantes presente una cinética de primer
orden. Por el contrario, los compuestos que normalmente se eliminan
siguiendo una cinética de orden cero, cuando las concentraciones sonmuy bajas, su eliminación sigue una cinética de primer orden
aparente. El modelo que representa la cinética de orden cero es:
dC/dt = Ko
Donde: ko es la constante de velocidad de
orden cero,
C y t tienen el mismo significado que en la
ecuación anterior
Cuando se tienen dosis repetidas el nivel del tóxico se aproxima
a la concentración de estado estacionario porque las velocidades de
eliminación y de absorción son iguales. Se necesitan aproximadamente
5 vidas medias para alcanzar el estado estacionario, así que los
compuestos que se eliminan muy lentamente tardan mucho enalcanzarlo.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 26/71
Ts es el tiempo de residencia en el organismo y
t es el intervalo entre dosis.
3.6. Biotransformación.
Biotransformación Fase I
(http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-4-1.html)
La Fase I es un conjunto de reacciones de oxidación que
preparan a los tóxicos para que puedan transformarse por las
reacciones de la Fase II. Esto lo logran transformando los grupos
funcionales del xenobiótico en sitios que pueden llevar a cabo
reacciones de la Fase II, o bien introducen grupos nuevos que le dan
esta característica. Para hacer este trabajo las células cuentan con dos
sistemas de enzimas, que tienen la función de introducir en el
substrato un átomo de oxígeno proveniente del oxígeno molecular
(oxigenasas de función mixta). Estos dos sistemas son las amino-
oxigenasas y los Citocromos P-450. Ambos sistemas se encuentran
localizados en el retículo endoplásmico. Las amino-monoxigenasas
oxidan aminas y compuestos sulfurados.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 27/71
reduciédolo del nivel (III) a (II), de férrico a ferroso, (C) la reducción
abre el sitio activo del O2, (D) el O2 entra a su sitio activo y oxida al
xenobiótico que está en la superficie de la enzima transfiriéndole uno
de los átomos de oxígeno.
Existen varios Citocromos P-450 que se diferencian en su
especificidad, por ejemplo, el P-450 IIE oxida al etanol y el P-450 IA
oxida al alfa-benzo-pireno.
Si la concentración de oxígeno en la célula es muy baja,
entonces la reacción catalizada por el Citocromo P-450 es una
reducción en la que el NADPH actúa como donador de iones hidruro.
Las reacciones de reducción más comunes son la transformación
de nitroderivados aromáticos a aminas, la azoreducción de aminas
primarias y la deshalogenación reductiva. La reducción puede dar lugara la formación de un radical libre más tóxico que el xenobiótico
original, capaz de producir daños en el ADN. Esta biotransformación es
entonces una bioactivación. Por ejemplo; el tetracloruro de carbono
sufre la deshalogenación reductiva produciendo el radical libre
triclorometilo.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 28/71
Reacciones de Reducción Catalizada por Citocromo P-450.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 29/71
endógenos, permitiendo, al mismo tiempo, que la célula oxide al
xenobiótico y se deshaga de estos compuestos endógenos altamente
tóxicos. El producto de esta reacción es un alcohol que puede ser
destoxificado por una alcohol deshidrogenasa.
Biotransformación Fase II
La Biotransformación Fase II, tal como se mencionó
anteriormente, consiste en reacciones de conjugación, catalizadas por
un conjunto de enzimas, la mayoría de ellas localizadas en el citosol.Las reacciones consisten en agregar un grupo polar de tamaño
relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I o a
los xenobióticos originales que contienen los grupos funcionales
apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugación. Los
donadores de los grupos polares tienen que ser compuestos de altaenergía, ya que las reacciones de conjugación no son
termodinámicamente favorables.
El resultado que se logra con estas reacciones es un gran
incremento de la solubilidad en agua del xenobiótico.
Glucuronidación.- La reacción consiste en agregar un grupo
glucuronil en un grupo hidroxilo amino o sulfhidrilo del tóxico La
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 30/71
sulfotransferasas, enzimas solubles localizadas en el citosol. El
producto de la reacción es un sulfato orgánico ionizado, muy soluble
en agua que se excreta en la orina.
Aminoacidación.- La reacción consiste en la formación de una
unión peptídica entre el grupo amino de un aminoácido, normalmente
glicina, y un carboxilo en el xenobiótico. Obviamente para que esta
reacción se pueda dar es indispensable que el xenobiótico tenga un
grupo carboxilo. Estos conjugados son eliminados en la orina debido a
que el sistema de transporte del riñón reconoce al aminoácido.
Glutationización.- La glutationización consiste en la adición de
glutatión (GSH), a través de su grupo sulfhidrilo (nucleofílico), con un
carbón electrofílico del xenobiótico. La reacción es catalizada por la
glutatión-S-transferasa y el glutatión mismo es el cofactor de alta
energía. El glutatión es un tripéptido, Glu-Gli-Cis. El compuesto que se
forma se rompe en el riñón produciendo el Cis-derivado, que se acetila
para producir un conjugado del ácido mercaptúrico, el cual se excreta
en la orina. Esta reacción es importante en la destoxificación de
epóxidos y peróxidos. La glutatión-S-transferasa se encuentra encélulas de muy diversos tejidos. Si esta reacción disminuye
significativamente el nivel celular de glutatión el organismo puede
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 31/71
compuestos endógenos y forma parte en la biosíntesis de varios
aminoácidos y esteroides, así como en la metilación del ADN.
Las reacciones de la Fase I activan grupos funcionales, la
metilación los enmascara impidiendo que participen en reacciones de
la fase II, por lo tanto, si se metilan los xenobióticos se disminuye la
tasa de eliminación del compuesto.
Como se puede ver, varias de las reacciones de la Fase II
requieren de los mismos grupos funcionales, así que los compuestos
que pueden ser modificados por más de una enzima entran en
reacciones que son mutuamente competitivas.
Qué tanto tiene lugar una reacción determinada depende, de la
capacidad del tejido para llevar a cabo la reacción y de la afinidad de
la enzima por el substrato. La capacidad está definida por la cantidadde cofactor presente en el tejido cuando éste es expuesto al
xenobiótico.
Capacidades y Afinidades de las Reacciones de Conjugación
REACCIÓN CAPACIDAD AFINIDADGlucuronidación Alta Baja
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 32/71
se incrementará la concentración del sulfoester y posteriormente
aparecerá el derivado glucuronidado. Esto significa que el fenol tiene
mayor afinidad por la sulfotransferasa, esta reacción procederá hasta
que se agote la disponibilidad de PAPS. Cuando se agota el PAPS seempieza a utilizar el UDPglucuronato. En el caso de la N-acetilación,
las afinidades y capacidades pueden cambiar debido al polimorfismo
de esta enzima (acetiladores lentos contra los acetiladores rápidos).
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 33/71
En los moluscos esta biotransformación es muy lenta y los PAHs
tienden a acumularse en estos organismos.
Bioactivación
La bioactivación es el conjunto de reacciones metabólicas que
incrementan la toxicidad de los xenobióticos, o sea que los metabolitos
resultantes de la biotransformación de la sustancia absorbida son más
tóxicos que el compuesto original. Por ejemplo las toxinas de las
mareas rojas incrementan su toxicidad cuando son metabolizadas enel hígado de los peces.
La mayoría de las bioactivaciones son producidas por las enzimas
de la Fase I, aunque algunas de las enzimas de la Fase II también
pueden bioactivar algunos xenobióticos. Este efecto lateral indeseable
de la biotransformación ocurre cuando se producen especies químicasmuy reactivas, normalmente compuestos electrofílicos con gran
afinidad por los nucleófilos. El ADN, las proteínas y los lípidos son
nucleófilos.
La mayoría de las reacciones en los que se generan productos de
aducción de ADN y proteínas se deben a la interacción de estas
macromoléculas con los productos de las reacciones de bioactivación.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 34/71
• Inducción de Enzimas. Un xenobiótico puede inducir una enzima
que bioactiva a otro xenobiótico. Por ejemplo el etanol induce la
síntesis del Citocromo P-450 que bioactiva al tetracloruro de
carbono. Esta interacción hace que el tetracloruro de carbonosea más tóxico cuando se administra junto con alcohol
• Inhibición de enzimas. La inhibición también puede incrementar
la bioactivación. Por ejemplo, una substancia que bloquee la
síntesis de los Citocromos P-450 hará que el organismo se
vuelva más susceptible a los tóxicos que son destoxificados porlos P-450. Las substancias que inhiben la síntesis de Citocromo
P-450 también pudieran servir de antídoto si la especie tóxica es
producto de la bioactivación del xenobiótico por el Citocromo P-
450
Las rutas de Bioactivación son las siguientes:
1. El tejido blanco contiene las enzimas para bioactivar el
xenobiótico y es el sitio activo para la especie tóxica. El ejemplo
clásico de esta ruta es la bioactivación del tetracloruro de
carbono vía la deshalogenación por el P-450 del hígado,
produciendo el radical libre triclorometilo, el cual reacciona con
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 35/71
cruzadas en los neurofilamentos causando daño en nervios
periféricos.
Ejemplos de Reacciones de Bioactivación
En resumen:
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 36/71
en la Fase I, que dan productos mucho más solubles en agua
que los compuestos absorbidos y los productos de la Fase I
• Algunas reacciones de la Fase II producen compuestos menos
solubles en agua• La capacidad de los tejidos para hacer transformaciones Fase II
depende de la cantidad disponible de cofactores en las
condiciones fisiológicas en las que se encuentra el organismo
Normalmente el organismo tiene las defensas adecuadas para manejar la
agresión química para lo cual cuenta con lo siguiente:
• las enzimas de las dos fases de la biotransformación
• la presencia de antioxidantes que eliminan radicales libres y
reducen especies tóxicas
• las proteínas plasmáticas que ligan los tóxicos en el plasma
sanguíneo impidiendo su difusión hacia los tejidos
La toxicidad ocurre cuando todas las defensas han sido vencidas.
Por ejemplo el fenol, como vimos anteriormente, se destoxifica
primero por sulfatación y después por glucuronidación. Cuando seagotan los dos cofactores para estas reacciones, el fenol se empieza a
l d di t ib ió h i iti ti l éd l
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 37/71
O H eOH
O H OH eO H
O H eO
OeO
H
H
H
2.
2.
22
222
2
22
→ +
+ → +
→ +
→ +
+
+
+−
−
−
−
−
−
Reacción Neta O H eO H 2
42 4 → + +−
En esta secuencia se producen radicales como el O2-
(superóxido), H2O2 (peróxido de Hidrógeno) y OH-, que son muy
reactivos y perjudiciales a los sistemas biológicos. El O2-, y el OH- son
radicales libres del oxígeno. El agua oxigenada; H2O2, aunque no es un
radical libre es también muy reactiva y junto con el O2- es un precursor
del OH-:
2.
222 OOH OH O H O ++ → +−−
Esta reacción es muy lenta sin embargo metales como el Fe y Cu
catalizan la reacción y facilitan la producción de .OH.:
Quelato FeOH OH O H Quelato Fe
Quelato FeOQuelato FeO
−+−+ → +−
−+ → −+
++
++−
322
2
22
32
.
Reacción Neta: 2.
222 OOH OH O H O ++ → +−−
Compuestos que generan radicales libres:
Quinonas, Herbicidas, Nitro-Aromáticos, Hidroxi-Aminas
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 38/71
Vitamina C Vitamina A (β -caroteno)XantofilasSuperOxidasaDismutasa (SOD)Catalasa
2222
2222
22
22
OO H CAT
O H
OO H SOD
H O
+
+ → +
→
+
La célula no está indefensa contra estas especies reactivas, tiene
dos líneas principales de defensa para protegerse.
• La primera es la presencia de antioxidantes los cuales donan o
aceptan un electrón para formar intermediarios estables.
Ejemplos de ellos son el alfa-tocoferol, ascorbato y GSH.
• Probablemente de mayor importancia, particularmente en la
destoxificación de radicales oxigenados y del peróxido dehidrógeno, son los sistemas de enzimas protectoras. Éstas
incluyen la peróxido dismutasa, la cual convierte el superóxido en
peróxido de hidrógeno, la GHS peroxidasa y la catalasa
convierten al peróxido de hidrógeno en agua.
Si el radical libre no es inactivado causará daños a la célula y
puede hacerlo vía la unión a un blanco o capturando un hidrógeno del
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 39/71
El daño por radicales libres está implicado en las lesiones
causadas por agentes químicos, por radiación, inflamación,
envejecimiento y reperfusión/isquemia.
Metabolismo de Metales y Toxicidad.
Se pueden clasificar en dos tipos
Metales esenciales : Cu, Mn, Zn
Metales no esenciales: Cd, Pb, Hg
La exposición a concentraciones elevadas de ambos tipos de
metales es tóxica, los metales generan enlaces no específicos a
biomoléculas. El metabolismo y biotransformación de un metal y su
enlaces dentro de las células, generan quelatos que bien pueden ser
almacenados en compartimientos intracelulares o pueden eliminarse.
Los mecanismos de biotransformación en macro y microalgas pueden
implicar diferentes procesos como la unión con Metalotioeninas,
síntesis de fitoquelatos o la formación de complejos con polifenoles o
Taninos.
Las Metalotieneinas son proteínas de bajo peso molécular ricasen cysteina que compleja iones metálicos en anillos Tiol. La función de
í
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 40/71
dibásica del potasio de 2,3,-dibromo-5-hydroxyl-1’,4-disulfato son
muy efectivos en secuestrar iones metálicos.
Estos mecanismos de biotransformación actuan como
reguladores de metales esenciales y no esenciales y modulan subiodisponibilidad para las macromoléculas.
Se conoce que algas pardas como el Fucus vesiculosus tienen la
capacidad de asimilar grandes cantidades de metales sin sufrir daño en
su metabolismo.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 41/71
CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE ORGANISMOS DE PRUEBA.
Principios de Weil.
Semejanza Metabólica
Para generar la dosis de referencia (DRf) de un medicamento
para su aplicación en Humanos se debe de considerar que existe un
factor de incertidumbre (Uf) que se presenta cuando se usan animalesde prueba como modelos de toxicidad para humanos. La magnitud de
esta incertidumbre de puede determinar por evaluación de las
variaciones Inter-químicas que existen entre las proporciones de dosis
asociadas con efectos toxicológicos similares en animales de
laboratorio y humanos:
Uf= NOAEL crónico en Animales/ NOAEL crónico en Humanos
NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) es el nivel de exposición
experimental que representa el máximo nivel probado al cual no se
observan efectos tóxicos. Para el propósito de evaluación de riesgoséste es el dato clave que se obtiene de los estudios de Dosis-
Respuesta Si las exposiciones experimentales fueron intermitentes se
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 42/71
• Mientras mas información se tenga sobre una droga en
diferentes especies, abulones, camarones, almejas y monos,
la dosis de referencia, DRf, que se obtiene permite reducir el
factor de incertidumbre, Uf.• Los datos de comparación entre especies sugieren que las
proporciones pueden variar según la dosis empleada en el
ensayo.
Además de las consideraciones anteriores para la evaluación del
Uf, se debe de tener en cuenta la variabilidad interhumana, porque
cuando se tienen datos suficientes sobre el efecto de una droga en
Humanos, su dosis se puede estimar sin la necesidad de aplicar el
factor de incertidumbre Uf. Pero, cuando no existen datos suficientes
sobre seres humanos sensibles, al Uf se agrega otro factor de
incertidumbre que expresa la variabilidad en respuestas entre
individuos y se trata con un factor de 10 veces.
Este factor de incertidumbre asume que existe variabilidad de
respuesta entre humanos y que esta variabilidad no se puede obtener
categóricamente debido al tamaño de la muestra que se puede usar esmuy reducido. Este factor también implica que existen sub-poblaciones
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 43/71
DRf= NOAEL/ Uf n
4.1.2. Vias de entrada.
Consideraciones sobre la vía de exposición. La filosofía
detrás del cálculo de la DRf es la misma, independientemente de cual
sea la vía de exposición, sin embargo, la forma de calcularla es
diferente.
Si en los estudios experimentales la exposición fue intermitente,
la DRf se calcula ajustando los valores observados de tal manera quereflejen exposiciones continuas.
El procedimiento de cálculo de las dosis de referencia orales es el
descrito anteriormente.
Los valores tabulados de las DRf están expresados en mg de
substancia por Kg de masa corporal por día.
Cuando la vía de exposición es el aparato respiratorio, la
extrapolación de datos obtenidos con animales debe de considerar
• Las diferencias anatómicas entre el animal de estudio y el hombre.
Estas diferencias pueden afectar el patrón de deposición, salida y
redistribución de los contaminantes. Consecuentemente, las diferentes
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 44/71
Los valores de DRf tabulados se expresan en función de la
concentración del tóxico en el aire en mg por metro cúbico para una
exposición continua de 24 horas por día.
Otros índices. Además de las DRf se han calculado y publicadootros índices de toxicidad que se denominan HA1 y HA10 para
exposiciones de corta duración. Son concentraciones de contaminantes
en agua potable, a las cuales no se presentan efectos adversos si la
exposición es de una duración especificada, un día o 10 días
respectivamente. Estos índices de toxicidad no-cancerígena se
obtienen dividiendo el NOAEL por los Uf y UFM adecuados. Se basan
en que un niño de 10 Kg. ingiere 1 litro de agua por día y se incluye un
margen de seguridad para proteger a los miembros más sensibles de
la población. Los HAs no incluyen ningún riesgo cancerígeno aún si la
substancia es un cancerígeno potencial.
4.2. Criterios para la selección de organismos de prueba.
Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo
o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la
potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad
se desconoce (FAO, 1981).
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 45/71
controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las
fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente
oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a
cabo (Rodríguez et al., 1995).Selección de Especies
Para obtener la máxima información de los bioensayos es
necesario escoger los organismos más apropiados. Se debe tener en
cuenta que requieren diferentes períodos de aclimatación en el
laboratorio, según las especies, y es sumamente importante que los
organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daños, se
encuentren sanos y sean de edad o tamaño uniformes (FAO, 1981);
Según Henry (1988) la selección de organismos para bioensayos debe
basarse en:
• Los objetivos del programa toxicológico
• La información disponible sobre los posibles organismos
• Las características de las especies
• Las instalaciones y equipos de laboratorio
• El nivel de capacitación de los técnicos
C it i l d l ió
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 46/71
bioensayos.
Organismos para
bioensayos
Adaptabilidad del organismo Comúnmente
utilizado comoun organismos
para
bioensayos
Cultivo de
laboratorio
Recolección
de campo
1. Algas Excelente Disponoble Si
2. Protozoos Excelente
Muy difícil de
recolectar
cultivo puro
Muy limitado
3. Invertebrados
a. Planctónicos
1. Rotíferos Bueno
Muy difícil de
recolectar
cultivo puro
Limitado
Alta tasa de
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 47/71
b. Bénticos
1. Anélidos Mediano Mediano Limitado
2. Insectos Bajo Mediano Si
3. Moluscos Bueno Mediano Si
4. Crustáceos Bajo Mediano
4. Peces Excelente Alta tasa de
mortandad
después de la
recolección de
campo
Si
(Henry, 1988)
¿Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y
diseños? (Henry, 1988).
El diseño de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente
considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría
de los protocolos de bioensayos agudos y crónicos requieren
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 48/71
Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias
tóxicas para el agua superficial o para los organismos bénticos que
viven en los sedimentos. Las sustancias tóxicas que se mueven desde
los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinadospreparando lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden
ser de preocupación las sustancias tóxicas que están estrechamente
ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en
organismos bentónicos, particularmente cuando éstos son un
componente importante de una cadena alimenticia que resulta en laexposición humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar
toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en
mejor forma con organismos planctónicos o de libre natación. Aún
cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad
puede ser evaluada exponiendo los organismos planctónicos a unlixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial
(Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas
firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los
organismos bentónicos en contacto directo con los sedimentos. Estas
pruebas revelarán cualquier toxicidad de los sedimentos y también elpotencial de bioacumulación de las sustancias tóxicas y su
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 49/71
• De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de
organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud
de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma
importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puedevariar significativamente durante su desarrollo (Esclapés,
1999).
• Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con
sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de los
escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta
protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999).
El uso de más de una especie permitirá una determinación más
cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuáticos varían en su
respuesta a las sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden ser
más sensibles que los invertebrados a una sustancia química, mientras
que puede suceder lo contrario con otra sustancia química (Henry,
1988).
Organismos criados en el laboratorio para bioensayos. Ventajas:
Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados,saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry,
é
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 50/71
laboratorio y de alimentación asegurará que todos los organismos de
prueba responderán a las sustancias tóxicas en forma similar con el
paso del tiempo. Es una característica importante cuando se comparan
los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas:Muchos organismos con ciclo complejo de vida o información
insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio.
Por lo tanto, la variedad de organismos está limitada cuando se usan
los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de
cultivo para organismos acuáticos varían sustancialmente, aún entreespecies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento
óptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener
cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas,
invertebrados y especies de peces se han usado como organismos
para bioensayos, sólo existe información disponible sobre algunasespecies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry,
1988).
Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la
comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos
estándares criados en el laboratorio es que ellos no son
necesariamente representativos de la comunidad acuática o de las
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 51/71
• ¿Puede recolectarse el organismo directamente del campo?
¿Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecíficas?
• ¿Están los organismos disponibles durante todo el año o sólo
durante ciertas estaciones?
• ¿Es el organismo sensible al manejo durante su recolección y
transporte al laboratorio?
• ¿Se adaptará el organismo al agua del laboratorio o se
necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desdeel campo?
Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el
efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una
comunidad específica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos
conteniendo muchas especies pueden prepararse fácilmente. Sepueden desarrollar exámenes con varias especies en la misma cámara
de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles,
almeja, peces y plantas acuáticas pueden incluirse en la misma
cámara de prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos
múltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio
utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 52/71
durante todo el año o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry,
1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son
desconocidas. No existe manera de obtener organismos
"estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad esdesconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho
más diverso que las algas o los peces, con diferencias dramáticas en
su forma física, sus características históricas de vida y sus requisitos de
cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los
bioensayos debido a su pequeño tamaño y porque con ellos es posiblerealizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy
corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los
estudios de bioacumulación, puesto que se ubican en el nivel más bajo
de la pirámide trófica (FAO, 1981).
5 ESTRATEGIAS PARA LA VALORACIÓN DE SUSTANCIAS
BIOACTIVAS.
5.1. Bioprospección.
La bioprospección es la búsqueda de elementos útiles de la
naturaleza generalmente para fines comerciales o medicinales
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 53/71
ellas?? Con respecto a la relación de actividad de acuerdo al phyla,
ambiente marino, temperatura, profundidad, localidad geográfica.
Con respecto al phyla se ha observado que la actividad es una
propiedad general, pero hay actividades específicas que se concentranen cientos phylas, por ejemplo la actividad antifungal se observa
principalmente en los Holothuridos (Echinodermata). Durante la
campaña AHCE 1978 (Alpha Helix Caribbean Expedition) se evaluaron
unas 650 especies en actividades antibacteriales, antifungales y
antivirales, además de citotóxicas.
Actividades, antimicrobianas, antivirales y citotóxicas en
diferentes pilas. Bioprospección Alpha Helix Caribbean. 1978.
% de Especies activas
Phylum Especiesevaluadas
E.c B.s. S.c. P.a. HSV-1 CV-1
Porifera 187 14 41 19 11(138) 14 62
Cnidaria 70 4 26 7 2 (66) 17 56
Ectoprocta 1 100 100 0 0 0 0
Mollusca 20 5 15 0 0 (17) 0 33
Annelida 3 33 0 0 0 0 0
Arthropoda 6 0 0 0 0 0 0
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 54/71
actividades respecto a la profundidad e indican que a pesar de ser
localidades diferentes, las actividades son similares en las dos
localidadas. La actividad presenta patrones parecidos en organismos
bentónicos de profundidades de 600 a 762m. La principal limitante enla colecta de organismos a profundidades superiores es por supuesto
el costo.
Son pocas las variaciones con la profundidad las actividades
antibacteriales y antifungales se reducen generalmente en organismos
colectados en aguas profundas. Este fenómeno probable estarelacionado con las temperaturas del agua, ya que la incidencia de
actividades antibacteriales y antifungales en organismos colectados en
la costa oeste de España asi como en Maine y Nueva Escocia son muy
bajas mientras que las actividades citotóxicas y antivirales se
presentan en intervalos normales. Las actividades con respecto a la
temperatura del agua indican que los organismos de zonas trópicales
exhiben mayores actividades que aquellos de aguas templadas. Esto
se refleja principalmente en la presencia de Icthiotoxinas de esponjas
y holoturidos. Las aguas frias de las costas Nororientales de Estados
Unidos, orientales de Canada, Oeste de España y Nueva Zelanda son
zonas ricas de aprovisionamiento de sustancias con actividades
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 55/71
i). El experimentador debe liberarse de toda simpatía personal
hacia determinado tratamiento que pudiera sesgar los resultados.
ii). Todas las observaciones que se tomen deben ser anotadas
cuidadosamente en un registro apropiado, no dejando nada a lamemoria. Los datos deben anotarse en forma ordenada, de tal forma
que puedan ser utilizados por otro experimentador si fuese necesario
en una fecha más o menos lejana, quien debe poder entender todas
las anotaciones.
iii) Se recomienda que el experimentador tome las
observaciones (aleatoriamente) olvidándose cuáles son los
tratamientos de las parcelas a fín de no dejarse influir por prejuicios
sobre determinados tratamientos.
iv). En algunos experimentos no es práctico tomarobservaciones en toda la unidad experimental, tal es el caso de
determinaciones químicas. En estos casos es recomendable muestrear
la unidad experimental para obtener subunidades. Generalmente hay
mas variabilidad entre las unidades que entre las subunidades
experimentales. Es por esto que no debe haber mucho interés enmuchas determinaciones químicas en cada unidad experimental, ya
l b id d l i i l UE l i
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 56/71
organismos internacionales, como EPS (1990), indican que se debe
ejecutar un número mínimo de veinte (20) bioensayos de toxicidad
consecutivos con el tóxico de referencia antes que se pueda realizar
una calibración intralaboratorio. El Laboratorio de Bioensayos hatrabajado estrechamente bajo la guía de la US EPA, Los bioensayos,
como toda herramienta de medición, deben tener cierta precisión y
exactitud en sus resultados.
Organizaciones internacionales (ASTM, 1996; OECD 1993;ISO,
1996;EC, 1992 y USEPA, 1994) han estandarizado metodologías parala realización de estos bioensayos con distintos organismos, en donde
además se describen métodos de cultivo, condiciones de los
experimentos, aplicabilidades y restricciones.
Una vez estandarizadas las metodologías experimentales, los
laboratorios que ejecuten el bioensayo deben realizar una calibración
de su método. La calibración es un proceso relacionado con los
conceptos que rigen el control de calidad, y cuyo objetivo es
determinar la precisión y exactitud que puede y debe alcanzarse en los
resultados generados por un determinado bioensayo. Lo anterior es
útil para asegurarse que la respuesta de la población expuesta a cierto
agente tóxico se deba al efecto de éste y no a variaciones tanto de la
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 57/71
Us Epa. 1990. Methods for measuring the acute toxicity of
effluents and receiving waters to freshwater and marine organism.
Fourth Edition. Report 600/4-90/027F.
Pruebas de hipotesis
Si queremos decidir entre dos hipótesis que afectan a un cierto
parámetro de la población, a partir de la información de la muestra
usaremos el contraste de hipótesis, cuando optemos por una de
estas dos hipótesis, hemos de conocer una medida del error cometido,
es decir, cuantas veces de cada cien nos equivocamos.
En primer lugar, veremos cómo se escribirían las hipótesis
que queremos contrastar:
H0 se llama hipótesis nula y es lo contrario de lo que
sospechamos que va a ocurrir (suele llevar los signos igual, mayor o
igual y menor o igual)
H1 se llama hipótesis alternativa y es lo que sospechamos que
va a ser cierto (suele llevar los signos distinto, mayor y menor)
Los contrastes de hipótesis pueden ser de dos tipos:
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 58/71
• alfa: Es la probabilidad de cometer un error de tipo I.
• beta: Es la probabilidad de cometer un error de tipo II.
De los dos, el más importante es alfa que llamaremos nivel de significación y
nos informa de la probabilidad que tenemos de estar equivocados si
aceptamos la hipótesis alternativa.
Debido a que los dos errores anteriores a la vez son imposibles de controlar,
vamos a fijarnos solamente en el nivel de significación, este es el que nos
interesa ya que la hipótesis alternativa que estamos interesados en probar y
no queremos aceptarla si en realidad no es cierta, es decir, si aceptamos la
hipótesis alternativa queremos equivocarnos con un margen de error muy
pequeño.
El nivel de significación lo marcamos nosotros. Si es grande es más fácil
aceptar la hipótesis alternativa cuando en realidad es falsa. El valor del nivel
de significación suele ser un 5%, lo que significa que 5 de cada 100 veces
aceptamos la hipótesis alternativa cuando la cierta es la nula.
Solamente vamos a estudiar el contraste bilateral para la media.
CONTRASTE DE HIPÓTESIS BILATERAL PARA LA MEDIA
Si se cumple una de las siguientes hipótesis:
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 59/71
• , valor teórico y es el valor que en la distribución N(0,1) deja a su
derecha un área de alfa/2 para un nivel de significación alfa. Es el
valor z que definíamos ala principio del tema.
La regla de decisión fijado el nivel de significación, alfa, es la siguiente:
• Si se acepta la hipótesis alternativa, llegamos a la
conclusión de que la hipótesis es cierta.
• Si se acepta la hipótesis nula, en realidad no podemos
afirmar que sea cierta, sino que la hipótesis alternativa no es cierta,
ya que el margen de error con el que se acepta la hipótesis nula es
muy grande.
Actividad 21. Un equipo de psicólogos han comprobado que en cierta
población infantil, el tiempo (en minutos) empleado en realizar determinada
actividad manual, sigue un modelo Normal de probabilidad. Un grupo de 36
niños, seleccionados aleatoriamente en dicha población, realizaron esa
actividad manual en un tiempo medio de 6,5 minutos con una desviación
típica muestral de 1,5 minutos. A partir de esta información, para un nivel de
significación del 1% (alfa=0,01) ¿podíamos rechazar la hipótesis de que el
tiempo medio en la población es de 7 minutos? Utiliza la escena siguiente.
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 60/71
en el 2001 de 36,5 horas. Sabiendo que:
donde representa el número de horas perdidas por el i-ésimo trabajador.
a) ¿Podríamos rechazar, con un nivel de significación del 1% la hipótesis de
que el número medio de horas perdidas a causa de accidentes laborales en
esa empresa durante el año 2001 fue de 35 horas?
b) ¿Y para un nivel de significación del 5%?
Adaptación de María Vicenta Cabalgante Perera
de la unidad:
http://descartes.cnice.mecd.es/Bach_HCS_2/inferencia_estadistica/index_inferencia.htm
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 61/71
Weil, C.S. (1972). Statistics vs safety factors and scientific
judgment in the evaluation of safety for man. Toxicol. Appl.
Pharmacol . 21, 454-463.
Weil, C.S., and McCollister, D.D. (1963). Relationship between
short- and long-term feeding studies in designing an effective toxicity
test. Agric. Food Chem. 11, 486-491.
Factores de Incertidumbre en dosis de medicamentos entre
Humanos y pruebas con animales
Variabilidad De Interhuman
Siempre que sea posible, los datos sobre seres humanos se
utilicen para conducir el gravamen de riesgo del noncancer, de tal
modo evitando los problemas inherentes con la extrapolación de los
interspecies. Si existen los suficientes datos sobre individuos sensibles,
la dosis subliminal se puede estimar directamente, es decir, sin la
necesidad de un factor de la incertidumbre. Si no existen los datos
adecuados sobre seres humanos sensibles, se encuentra una
incertidumbre que se debe tratar -ma's a menudo con un factor 10-
fold. Este factor de la incertidumbre asume que ocurre la variabilidad
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 62/71
variabilidad interhuman fue apoyado indirectamente, pero que puesto que
los animales de experimento son generalmente menos heterogéneos
cuando están comparados a los seres humanos, el factor de diez veces no
era necesariamente conservador. Calabrese (1985) encontró diferencias
considerables entre temas humanos en su capacidad de metabolizar
sustancias extranjeras, y concluyó que un factor de diez veces
proporcionó la protección para cerca de 80-95% de la población. Esta
conclusión, sin embargo, fue basada en la suposición que el factor de diez
veces era explicar la gama total de la variabilidad humana. Hattis et el al.
(1987) analizaban 101 modems de los parámetros toxicokinetic individuales
para 49 sustancias específicas (sobre todo drogas) en los grupos de
adultos cinco o más sanos. Estos datos sugirieron que un factor de diez
veces de la incertidumbre considerara el cerca de 96% de la variación en
estos parámetros toxicokinetic. Sin embargo, estos datos también midió la
gama total de la variabilidad humana en este experimento, y no el puntomedio a la variabilidad humana sensible. Sheeman y Gaylor (1990)
compararon los cocientes del LD 50 del adulto a los mamíferos recién nacidos
para 238 productos químicos como medida de variabilidad de los
intraspecies. El cociente mediano era 2,6 (adulto a recién nacido). Los
cerca de 86% por de los valores eran menos que un cociente de diez veces,similar a las observaciones Dourson y Stara (1983).
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 63/71
assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in
experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and
toxicodynamic differences exist among species, and that humans are
more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m
3
concentration. A number of authors have tried to quantify this area of
uncertainty by investigating the ratios between animals and humans,
and between different animal species for a number of parameters.
For example, Brown and Fabro (1983) identified the lowest effective dose to
cause teratogenicity in animals and humans for eight chemicals. Ratios(animal-to-human) vary from 1.8 to 50, with a geometric mean of 7. For the
chemicals examines, these authors state that humans appear to be more
sensitive, although the difference is generally less than an order of
magnitude. Dourson and Stara (1983) showed an interspecies adjustment
factor calculated as the cubed root of the ratio between the assumedaverage human body weight (70 kg) and animal weight. Assuming that
such an adjustment could account for all of the differences in animal to
human extrapolation, then a 10-fold factor accounts for many of the
experimental animal to human differences. Ford (1990) suggests that
kinetic and metabolic data, when available, should be used in the
assessment of the likely human health hazard of reproductive toxicants
from animal toxicity data Calabrese et al (1992) and Hoel et al (1975) have
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 64/71
assessment. The use of PBPK models for this purpose is likely to grow
(Jarabek 1995a,b). Agencies such as Health Canada, IPCS, and EPA have
positions reflecting the use of reduced interspecies UF when dosimetric
adjustments, toxicity data or comparative toxicokinetics are available.
Less-than-Chronic Studies to Chronic
The subchronic-to-chronic UF is based on the assumption that an effect
seen at shorter durations will also be seen after a lifetime of exposure, but
at lower doses. This factor also assumes that effects may only be seen
after an experimental group is exposed chronically. In fact, severalinvestigators have examined subchronic-to-chronic ratios of NOAELs and
LOAELs, and the average differences between subchronic and chronic
values are only 2 to 3, while some small percentage of chemicals have
ratios that exceed 10-fold (McNamara, 1976; Dourson and Stara 1983;
Woutersen et al., 1984; Aida et al. 1992; Kadry et al., 1995). Lewis (1993)showed an analysis of subchronic-to-chronic NOAEL ratios based on peer-
reviewed literature or information from the U.S. National Toxicology
Program. Criteria for inclusion in their analysis were rigorous. Of 54
chemicals considered, only 18 chemicals were analyzed. Of these, 78% had
ratios of 3.5 or less. All but one of these ratios (17/18, or 94%) had ratios of
10-fold or less. Unpublished work in EPA (Swartout, 1995) encompasses
more chemicals than described above, but the criteria for inclusion are not
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 65/71
LOAEL to NOAEL
If a LOAEL exists on which to base the estimation of a subthreshold dose,
the uncertainty in the NOAEL must be addressed. Analysis of several data
bases suggest that a factor of 10 or lower is adequate and that use of datadoes support a lower factor with certain chemicals. For example, Dourson
and Stara (1983) describe ratios of LOAELs to NOAELs of either
subchronic or chronic exposures based on data from Weil and McCollister
(1963). Ninety-six percent of these ratios had values of 5-fold or less. Kadry
et al. (1995) also evaluated the uncertainty factor for LOAEL to NOAEL
extrapolation for several chlorinated compounds. Ratios were 1.4 to 8.9 for
methylene chloride, 2 to 5 for pentachlorophenol, 2 or 4.2 for
monochlorobenzene, 3.3 or 10 for chlorpyrifos, and 1.6 or 2.2 for 1,1-
dichlorethane. The authors conclude that 91% of these ratios were 6-fold or
less; all of them were 10-fold or less.
The results of the research on LOAEL to NOAEL extrapolation are not
extensive, nor unexpected. Experiments are seldom designed with doses in
excess of 10-fold apart, leading to the common statement that these ratios
depend more on dose spacing than inherent toxicity. The choice of dose
spacing, however, often reflects the judgment on the likely steepness of
the dose-response slope, with steeper slopes resulting in tighter dose
spacing. The data indicate that when faced with a LOAEL and not a NOAEL,
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 66/71
que varían en forma continua y tienen un valor único para cada dosis
(dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen
bioensayos).
La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas losEfectos (E) causados en el organismo expuesto a una substancia química
y en las absisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la experimentación
se hizo con el tejido blanco aislado expuesto directamente a la substancia,
la respuesta observada normalmente es una función hiperbólica de la
dosis de una forma similar a la ecuación Michaelis-Menten para expresar la
velocidad inicial de una reacción enzimática. La curva pasa por el origen
del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente máxima se presenta
en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante
un rango amplio de la dosis (cinética de primer orden), después la
pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve cero (cinética de
orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A este valor máximo
se le denomina efecto máximo (Emax) y es una medida de la eficacia del
tóxico.
En algunas ocasiones, la relación dosis-efecto no es tan definida y dentro
de una población se observa una distribución de respuestas para cada
dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, se mide el
porcentaje de la población en estudio que presenta una determinada
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 67/71
Figura 2.5.1.A.- Curva Dosis-Respuesta.0 a 1.-Región NOAEL; 2.-LOAEL; 3.-Región Lineal; y 4.-Respuesta Máxima.
La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero)
y a valores muy bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del
efecto igual a cero (la curva va sobre el eje de las dosis). La respuesta
empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega al nivellímite. De allí en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta
que se llega a una pendiente máxima. Esta pendiente se mantiene por un
amplio rango de dosis en el que la respuesta es directamente proporcional
a la dosis (línea recta). A dosis mayores la pendiente empieza a decrecer
hasta que la curva se vuelve asintótica a un valor máximo de la respuesta(Emax).
i C d ú á l d i l f
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 68/71
crecientes. Cuando se aumenta aún más la dosis se presentan los efectos
letales crecientes que también se relacionan con la dosis en la misma
forma que los efectos anteriores. Las dos curvas son paralelas (Figura
2.5.1.B).
Figura 2.5.1.B. Curva Dosis-Respuesta. Compuesto que presenta las doscurvas.
1= curva de dosis-efectos tóxicos; y 2= curva de dosis-efectos letales.
2.5.1.1 Potencia vs. Eficacia
Potencia se refiere al rango de dosis dentro del cual una substancia
produce respuestas crecientes. La curva del tóxico (o droga) más potente
aparece más cercana al origen.
L t i d d tá i fl i d f t t l l
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 69/71
La potencia de un droga está influenciada por factores tales como la
absorción, el metabolismo, etc. La eficacia está relacionada a una acción
más fundamental de la droga, es una medida de la capacidad intrínseca de
la droga para producir un efecto. Este valor se estima midiendo la altura
máxima de la curva dosis-respuesta (cuando la curva se vuelve asintótica a
las absisas) y, como ya vimos anteriormente, se le denomina Emax.
Dos drogas que son cualitativamente iguales en producir un efecto
particular pueden diferir en su eficacia, en su potencia, o en ambas (Figura
2.5.1.C). El compuesto 1 es más potente que el compuesto 2, y el
compuesto 2 es más potente que el compuesto 3; los compuestos 1 y 2
tienen igual eficacia, pero el compuesto 3 es menos eficaz que 1 y 2 .
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 70/71
5/12/2018 Apuntes bioensayo - slidepdf.com
http://slidepdf.com/reader/full/apuntes-bioensayo 71/71