A N Á LI S E D E A M O S T R A S F O R E N S E S P O R
E S P E C T R O M E T R I A D E M A S S A D E A L T A R E S O LU Ç Ã O :
I D E N T I F I C A Ç Ã O D E P E S T I C I D A S U S A D O S P A R A A M O R T E
I N T E N C I O N A L / A C I D E N T A L D E A N I M A I S D O M É S T I C O S E S E L V A G E N S
AN A PAT R ÍC IA M AT OS A BR E U
D I S S E R T A Ç Ã O P A R A A O B T E N Ç Ã O D E G R A U D E M E S T R E E M
ENGENHARIA QUÍMICA
ORIENTADORES: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes
Dr. Andrea Alexandre
JÚRI
PRESIDENTE: Professora Doutora Conceição Oliveira
ORIENTADOR: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes
VOGAL: Professora Doutora Maria Joana Neiva Correia
OUTUBRO 2019
II
I
A N Á L I S E D E A M O S T R A S F O R E N S E S P O R E S P E C T R O M E T R I A D E
M A S S A D E A L T A R E S O L U Ç Ã O
RESUMO
Matar animais por envenenamento, incluindo espécies protegidas, é infelizmente um
comportamento criminoso frequente. No entanto, a maioria desses crimes não são convenientemente
penalizados devido, em grande parte, à indisponibilidade de metodologias analíticas adequadas para
a identificação dos agentes químicos suspeitos de terem causado a intoxicação.
Este trabalho foi realizado no âmbito de um protocolo estabelecido entre o Centro Química
Estrutural CQE-IST e o Laboratório de Polícia Científica da Polícia Judiciária (LPC / PJ), com o objetivo
final de desenvolver protocolos analíticos para a identificação de potenciais compostos tóxicos em iscos
envenenados, encontrados em locais públicos, ou em amostras obtidas após necropsia animal.
Utilizando a técnica de cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa de alta
resolução com ionização de electrospray, foi otimizado um protocolo analítico para a identificação de
diversos pesticidas. Este protocolo foi inicialmente utilizado para a preparação de uma base de dados,
por análise de pesticidas padrão. Posteriormente, foram analisadas amostras cedidas pelo LPC/PJ de
casos onde havia suspeita da utilização de pesticidas para a morte intencional/acidental de animais
domésticos ou selvagens.
Aplicando a metodologia analítica desenvolvida, e por comparação com a base de dados, foi
possível identificar pesticidas em 13 das 20 amostras analisadas, atestando a viabilidade da
metodologia desenvolvida para a identificação de pesticidas em amostras forenses.
Palavras chave: espectrometria de massa de alta resolução, amostras forenses, pesticidas,
envenenamento animal.
II
III
A N A L Y S I S O F F O R E N S I C S A M P L E S B Y H I G H R E S O L U T I O N M A S S
S P E C T R O M E T R Y
ABSTRACT
Unfortunately, killing animals by poisoning, including protected species, is a frequent criminal behavior.
However, most of these crimes are not conveniently penalized, due mainly to the unavailability of
suitable standard methodologies to identify the chemical agents suspected of having caused
intoxication.
This work was carried out under the scope of the protocol established between the Centro de Química
Estrutural CQE-IST and the Laboratório de Polícia Científica da Polícia Judiciária (LP /PJ), with the
ultimate goal of developing analytical protocols for the identification of potential toxic compounds in
poisoned baits found in public places or in samples obtained following animal necropsy.
An analytical methodology, based on liquid chromatography coupled with high resolution mass
spectrometry with electrospray ionization, was developed for the identification of multiple pesticides.
This methodology was initially used for the preparation of a data-base, using pesticides standards, and
was subsequently used for the analysis of forensic samples that were provided by LPC/PJ. These
samples were obtained from real cases, where the use of pesticides was suspected for the
intentional/accidental death of domestic or wild animals.
Pesticides were identified in 13 of the 20 samples analyzed, thereby attesting the viability of the
analytical methodology developed for the identification of pesticides in forensic samples.
Key-words: high resolution mass spectrometry, forensic samples, pesticides, animal intoxication.
IV
V
AGRADECIMENTOS
À Professora Doutora Alexandra Antunes pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por
todo o apoio e atenção que me deu durante a realização do trabalho experimental e durante a
elaboração desta tese.
À Doutora Andrea Alexandre pela maneira como me recebeu e me ajudou no Laboratório da
Polícia Judiciária.
À Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, através dos
projetos UID/QUI/00100/2019 e PTDC/QUI-QAN/32242/2017 e do contrato como Investigador Principal
CEECIND/02001/2017 ( A. M. M. Antunes) .Agradeço também ao financiamento conjunto da FCT com
o Programa COMPETE pelo acesso à Rede de Massa (RNEM-LISBOA-01-0145-FEDER-022125).
A todos as pessoas que me ajudaram em tudo o que precisei durante esta viagem e me deram
apoio e motivação diariamente trabalhando ao meu lado.
Às minhas “migas” que, ao longo destes 5 anos, me acompanharam nesta vida de estudante
do IST, na firme convicção de que nos tornaríamos excelentes engenheiras. Em especial à Bia por ter
lavado a loiça nos dias em que fiquei a trabalhar até mais tarde.
À minha família que apesar de não perceberem muito sobre o tema, sempre me disseram as
palavras certas.
Por último, um profundo e sincero agradecimento, ao que é a base de tudo na minha vida, os
meus pais, pelo carinho, compreensão e apoio sem os quais nada teria sido possível.
VI
VII
ÍNDICE 1. Introdução ....................................................................................................................................3
1.1. Enquadramento do Tema ....................................................................................................3
1.2. Pesticidas no contexto criminal de morte de animais ............................................................5
1.2.1. Europa .........................................................................................................................5
1.2.2. Espanha ......................................................................................................................5
1.2.3. Portugal .......................................................................................................................6
1.3. Identificação de pesticidas ...................................................................................................7
1.3.1. Caracterização dos pesticidas a serem incluídos no estudo .........................................7
1.3.2. Métodos de identificação de pesticidas por espetrometria de massa .......................... 10
1.4. Princípios gerais da espetrometria de massa de alta resolução ............................................... 14
2. Objetivo ..................................................................................................................................... 17
3. Parte experimental ..................................................................................................................... 19
3.1. Reagentes ......................................................................................................................... 19
3.2. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS) 19
3.3. Preparação dos Padrões ................................................................................................... 20
3.4. Extração da Amostra ......................................................................................................... 20
4. Resultados e discussão ............................................................................................................. 23
4.1. Análise dos pesticidas padrão - preparação base de dados .................................................... 23
4.2. Análise de amostras forenses ............................................................................................ 26
4.2.1. Caso estudo 1: Isco encontrado num galinheiro ......................................................... 26
4.2.2. Caso estudo 2: Carne encontrada num prato de comida para cão .............................. 29
4.2.3. Caso estudo 3: Uma ave de rapina com suspeita de envenenamento ........................ 30
4.2.4. Caso estudo 4: Comida de cão com suspeita de envenenamento .............................. 32
4.3. Resultados das análises - Amostras forenses .................................................................... 33
5. Conclusões ................................................................................................................................ 34
6. Bibliografia ................................................................................................................................. 35
7. Anexos ...................................................................................................................................... 39
Anexo A: Base de dados ............................................................................................................... 40
Anexo B: Identificação dos pesticidas nas em amostras forenses .................................................. 50
Anexo C: Poster ............................................................................................................................ 53
VIII
IX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema das principais partes de um espectrómetro de massa [adaptado [31]] ................... 14
Figura 2. Ionização por Electrospray - [adaptado[31] ] ......................................................................... 15
Figura 3. Fotografia da amostra 13: diferentes partes de um milhafre real. ........................................ 22
Figura 4. Fotografia da amostra 8 (garras; glote; músculo) pertencentes ao mesmo animal . ............. 22
Figura 5. Fotografia da amostra 12: partes de uma águia imperial. .................................................... 22
Figura 6. Fotografia da amostra 14A e 14B diferentes partes de um milhafre real. ............................. 22
Figura 7. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 307,0965, obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de varfarina; (B) Espetro de massa da varfarina e sua estrutura; (C)
Espectro de MS/MS da varfarina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao
fragmento maioritário. ....................................................................................................................... 25
Figura 8. A) Isco comercial de bromadiolona B) Isco comercial de Ratax .......................................... 27
Figura 9. I) Proposta de fragmentação para o brodifacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2
respetivamente; II) Proposta de fragmentação para o difenacume, erro associado da amostra 10 A1 e
10 A2 respetivamente ....................................................................................................................... 27
Figura 10. I)Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 443,1642 (difenacume-D) e m/z
521,0747 (brodifacume-B) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão
de Ratax e das amostras 10A1 e 10A2; II) Comparação do espetro de MS/MS do Ratax com as
amostras 10 A1 e 10A2 quando extraído os iões de brodifacume e difenacume. ............................... 28
Figura 11. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0595, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua
estrutura (C) Espectro de MS/MS do Imidacloropride, sendo apresentado a estrutura proposta dos iões
fragmentados. ................................................................................................................................... 29
Figura 12. Fotografia da amostra 2-A (garras e bico) e 2-B (conteúdo estomacal) pertencentes a uma
ave de rapina. ................................................................................................................................... 30
Figura 13. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 541,1621 obtido por ionização
de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2A; II) Espetro de
MS/MS do padrão de flocumafeno; III) Espectro de MS/MS da amostra 2A; IV) fragmentação proposta
do ião maioritário. ............................................................................................................................. 31
Figura 14. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 543,1778 obtido por ionização
de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2 A e 2B; II)
Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno e das amostras 2 A e 2B ; III) Proposta
de fragmentação para os iões fragmentados maioritários da flocumafeno. ........................................ 31
Figura 15. Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 292,0403 (paratião-P) e m/z
262,0661 (aminoparatião-A) obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão
de E-605 forte com a amostra 1 ; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de paratião e do
seu metabolito aminoparatião com os da amostra 1 ; III) Proposta de fragmentação para o ião
fragmentado maioritário do paratião; IV) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário
do aminoparatião .............................................................................................................................. 32
X
Figura 16. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 461,1555, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de terramicina; (B) Espetro de massa da terramicina e sua estrutura
(C) Espectro de MS/MS da terramicina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao
fragmento maioritário. ....................................................................................................................... 40
Figura 17. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 292,0403 ,obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de paratião; (B) Espetro de massa do paratião e sua estrutura (C)
Espectro de MS/MS do paratião, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento
maioritário. ........................................................................................................................................ 40
Figura 18.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0596, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua
estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 41
Figura 19.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 254,0439, obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua
estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura do seu fragmento
maioritário. ........................................................................................................................................ 41
Figura 20. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 223,0745, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa da acetamiprida e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS da acetamiprida, sendo apresentado a estrutura plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 42
Figura 21.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 222,1125, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de carbofurão; (B) Espetro de massa do carbofurão e sua estrutura;
(C) Espectro de MS/MS do carbofurão, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente a um
fragmento. ........................................................................................................................................ 42
Figura 22. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 373,0626 ,obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de clorofacinona; (B) Espetro de massa de clorofacinona e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS da clorofacinona, sendo apresentado a estrutura plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 43
Figura 23. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 525,0695, obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de bromodiolona; (B) Espetro de massa de bromodiolona e sua
estrutura (C) Espectro de MS/MS da bromodiolona, sendo apresentado a estrutura plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 43
Figura 24. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 335,1754, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de estricnina; (B) Espetro de massa da estricnina e sua estrutura; (C)
Espectro de MS/MS da estricnina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao
fragmento maioritário. ....................................................................................................................... 44
Figura 25. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 170,0213 obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de glifosato; (B) Espetro de massa do glifosato e sua estrutura. ... 44
Figura 26. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 293,1172,obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de cumatetril; (B) Espetro de massa da cumatetril e sua estrutura;
XI
(C) Espectro de MS/MS do cumatetril, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao
fragmento maioritário. ....................................................................................................................... 45
Figura 27. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 543,1777, obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa do flocumafeno e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a fragmentação plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 45
Figura 28. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 541,1621,obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa da flocumafeno e sua
estrutura (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a estrutura plausível
correspondente ao fragmento maioritário. ......................................................................................... 46
Figura 29. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 521,0796 ,obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de Ratax-brodifacume; (B) Espetro de massa do brodifacume e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS do brodifacume, sendo apresentado a proposta de fragmentação.
......................................................................................................................................................... 46
Figura 30. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 191,0849 ,obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de aldicarbe; (B) Espetro de massa do aldicarbe, sua estrutura e iões
aductos observados. ......................................................................................................................... 47
Figura 31. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 318,0130,obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de azinfos metilo ; (B) Espetro de massa do azinfos metilo e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS do azinfos metilo, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.
......................................................................................................................................................... 47
Figura 32. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 346,0443 ,obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de azinfos etilo; (B) Espetro de massa do azinfos de etilo, sua
estrutura e iões aductos observados. ................................................................................................ 48
Figura 33. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 503,9804 obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de deltamitrina; (B) Espetro de massa da deltamitrina e sua estrutura;
(C) Espectro de MS/MS da deltamitrina, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado............. 48
Figura 34. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 443,1642 obtido por ionização de electrospray no
modo negativo da amostra padrão de RATAX ; (B) Espetro de massa do difenacume e sua estrutura.
Figura 35. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 262,0661 obtido por ionização de electrospray no
modo positivo da amostra padrão de E-605 forte; (B) Espetro de massa do aminoparatião e sua
estrutura; (C) Espectro de MS/MS do aminoparatião, sendo apresentado a proposta de fragmentação.
......................................................................................................................................................... 49
Figura 36. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 525,0695 (bromadiolona) obtido
por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromadiolona e das amostras:
4, 5, 6, 17 e 18; II) Eespetro de MS/MS do padrão de bromadiolona; III) Full scan da amostra 4,
distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal
isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0688; IV) Espetro de MS/MS
do ião extraído da bromadiolona da amostra 5; V) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona
da amostra 6; VI) Full scan da amostra 17, distribuição isotópica característica de uma molécula
XII
contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do
monoisotópico a m/z 527,0714; VII) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra
18; VIII) Estrutura da molécula bromadiolona; IX) Estrutura do ião fragmento maioritário................... 50
Figura 37. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 307, (varfarina) obtido por
ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina e das amostras: 14-A e
14-B; II) Espetro de MS/MS do padrão de varfarina; III) Espetro de MS/MS da amotra 14-A ; IV) Espetro
de MS/MS da amostra 14-B; V) Proposta de fragmentação para a varfarina, e erro associada ao
fragmento maioritário para ambas as amostras. ................................................................................ 51
Figura 38. Poster apresentado no CQE meeting ............................................................................... 53
1
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Pesticidas selecionados para este estudo. ...........................................................................8
Tabela 2. Compilação das condições experimentais reportadas na literatura para a identificação dos
pesticidas selecionados para este estudo, por LC-MS/MS ................................................................. 10
Tabela 3. Condições cromatográficas utilizadas para a análise de pesticidas. ................................... 20
Tabela 4. Identificação das amostras forenses .................................................................................. 22
Tabela 5. Parâmetros cromatográficos inseridos na base de dados................................................... 24
Tabela 6. Resultados das análises de todas as amostras forenses analisadas neste estudo:
identificação do pesticida .................................................................................................................. 33
Tabela 7. Erros associados aos valores de m/z identificados, para o ião precurssor de bromadiolona e
para o seu fragmento maioritário, em cada uma das amostras analisadas......................................... 51
2
ABREVIATURAS E SIGLAS
AR- Rodenticida anticoagulante
ESI- Ionização por electrospray
ESI (-)- Ionização por electrospray no modo negativo
ESI (+)- Ionização por electrospray no modo positivo
EU- União Europeia
FE- Fase estacionaria
FM- Fase móvel
GC- Cromatografia gasosa
GC-MS- Cromatografia gasosa acoplada à espetrometria de massa
HPLC- Cromatografia líquida de alta eficiência
HRMS- Espetrometria de massa de alta resolução
LC- Cromatografia líquida
LC-ESI(-)-HRMS- Cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa de alta
resolução com ionização por electrospray no modo negativo
LC-ESI(+)-HRMS- Cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa de alta
resolução com ionização por electrospray no modo positivo
LC-MS/MS- Cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa tandem
LD50- Dose letal 50
LPC-PJ- Laboratório da Polícia Científica- Polícia Judiciaria
MS- Espetrometria de massa
MS/MS- Espetrometria de massa tandem
ONGs- Organizações
OP- Organafosforados
PJ- Polícia Judiciária
Tr- Tempo de retenção
3
1. INTRODUÇÃO
1.1. ENQUADRAMENTO DO TEMA
A morte intencional de animais por envenenamento, incluindo espécies protegidas, é
infelizmente um comportamento criminoso frequente.
A toxicologia forense é uma área da toxicologia, multidisciplinar, de características
essencialmente analíticas e que tem como objetivo auxiliar no esclarecimento de questões judiciarias
e judiciais que possam estar relacionadas com intoxicações e suas potenciais consequências, fatais ou
não, no âmbito dos diversos domínios do Direito.[1]
O primeiro grande toxicologista foi, sem dúvida, Philippus Bombastus Von Hohenheim (1493-
1541) mais conhecido pelo seu pseudónimo Paracelso. Efetivamente, foi Paracelso quem definiu pela
primeira vez o conceito de “veneno”, afirmando que “todas as substâncias são venenos; não há
nenhuma que não seja veneno. A dose distingue o veneno do remédio”. Na verdade, a lei de Paracelso
é muito mais complexa, uma vez que a dose tóxica e a exposição global dependem de uma grande
variedade de fatores como a idade, género, espécie, entre outros. Um dos conceitos toxicológicos
subjacentes a esta lei é o conceito de dose letal 50 (LD50)[1] .Em toxicologia a DL50 é a dose necessária
de uma dada substância para matar 50% de uma população.
Uma intoxicação ou envenenamento ocorre quando se ultrapassa a dose máxima de segurança
de uma determinada substância [1]. Estima-se que os pesticidas são usados ilegalmente em até 68%
de todos os casos suspeitos de intoxicação animal [2]. De acordo com a Food and Agiculture
Organizaton (FAO), pesticida é qualquer agente (ou mistura) físico, químico ou biológico com
capacidade, para prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer peste. Os agrotóxicos não são uma
invenção moderna. Os Sumérios antigos (ano 3300 a.c.) usavam o enxofre elementar para proteger as
plantações dos insetos, e fazendeiros e cientistas medievais experimentavam substâncias químicas
como arsénico [3]. No entanto, as primeiras intoxicações por pesticidas como conhecemos na
atualidade, na vida selvagem e doméstica, foram documentadas no início dos anos 50 [4], [5].
A análise toxicológica das amostras colhidas após a morte do animal permite determinar a
presença ou a ausência de substâncias tóxicas e dos seus metabolitos e avaliar se contribuíram para
a morte deste, ou seja, verificar se existe uma relação causa efeito entre o agente tóxico no organismo
e as alterações detetadas [6]. Existem várias razões para a utilização destes compostos como venenos
na vida animal. Estas práticas são levadas a cabo por caçadores e gestores de zonas de caça, ou por
criadores de gado. As espécies-alvo são principalmente cães selvagens, lobos e mamíferos de
pequeno e médio porte. A existência de conflitos entre caçadores, ou entre estes e as populações
locais, são a razão de inúmeros casos de envenenamento, assim como o controlo de roedores e aves
silvestres consideradas prejudiciais às atividades agrícolas[7], [8]. A crença de que para obter um
rendimento máximo de explorações de caça é necessária a eliminação dos predadores, leva também
à utilização de iscos envenenados, principalmente nas Zonas de Caça [9]. A escolha do veneno depende
de vários fatores, como o tipo de agricultura da região, o conhecimento popular da toxicidade de um
4
produto específico e a sua disponibilidade no mercado local [4]. As organizações governamentais
incentivam a utilização de pesticidas e financiam a compra desses produtos para agricultores e
pecuaristas. Esta situação leva a um uso extensivo desses artigos por pessoal não qualificado, sendo
muitas vezes utilizados de maneira incorreta [4].
Considerando que um Veneno é uma substância tóxica aplicada com a clara intenção de matar
um organismo, podemos classificar os envenenamentos de fauna em: Envenenamento primário e
Envenenamento secundário. No primeiro caso podemos ter dois padrões: o intencional, quando o
propósito é matar um determinado animal, e o acidental, quando há o objetivo de matar um animal e
outro por engano consome o veneno, acabando por morrer. No caso do Envenenamento Secundário,
há um objetivo claro de abater um animal, que posteriormente é consumido por outro. Desta forma, há
transferência de resíduos de um ser para outro, havendo assim envenenamento de forma secundária
[10]. Deste modo a utilização de venenos é um método não seletivo que pode provocar a morte de vários
animais [8].
Os pesticidas podem ser classificados de acordo com a praga a ser combatida. Sendo os mais
conhecidos: Inseticidas, Rodenticidas, Herbicidas e Fungicidas. Muitos dos produtos encontram-se no
mercado durante um período limitado de tempo, pois passam a ser proibidos devido à elevada
toxicidade ou ao elevado tempo de semivida, conjugado com o fenómeno da bioacumulação nos
tecidos gordos dos organismos, que os tornam bastante mais tóxicos[11].
Tanto as leis europeias como as leis nacionais proíbem o uso de venenos como forma de
extermínio. De acordo com o artigo 212-1º do Código Penal Português de 1995, o envenenamento de
um animal está previsto como crime de dano e como tal é punido por lei.
O uso ilegal de agrotóxicos é uma das maiores ameaças sob a qual se encontra a conservação
de algumas das espécies protegidas mais importantes da Península Ibérica. Como forma de contrariar
esta situação, e com o objetivo de avaliar os efeitos do uso do veneno sobre as populações de animais
selvagens em Portugal e estabelecer medidas de controlo para a minimização deste problema, foi
formado recentemente o Programa Antídoto Portugal. Este consiste numa plataforma de cooperação
entre várias organizações (ONGs) (onde se incluem as principais ONGs nacionais) e instituições
nacionais inseridas no âmbito de um programa internacional que se encontra em curso noutros países
europeus [9].
5
1.2. PESTICIDAS NO CONTEXTO CRIMINAL DE MORTE DE ANIMAIS
A classe de pesticidas mais frequentemente utilizada para a morte de animais selvagens varia
de continente para continente e, mais especificamente, entre países.
Nos países onde existe um programa de vigilância de envenenamento da fauna silvestre, os
dados são compilados e permanecem disponíveis na literatura científica. Noutros países, os relatos de
casos são publicados apenas de forma incidental, faltando visões gerais anuais, sendo por isso difícil
a análise de dados em termos estatísticos. Como no âmbito deste trabalho serão analisadas recolhidas
em Portugal, é importante fazer uma revisão bibliográfica dos pesticidas mais utilizados na Europa, e
depois devido a localização geográfica especificar a Espanha e, finalmente, Portugal.
1.2.1. EUROPA
Berny e colaboradores concluíram que na Europa, os inseticidas, organofosforados (OP) e
carbamatos (inibidores de colinesterase), seguida de rodenticidas anticoagulantes (AR) [2] constituem
as classes de pesticidas mais utilizadas para a morte de animais selvagens. Num estudo posterior, foi
especificado que os compostos mais utilizados da classe dos carbamatos foram o carbofurão e
aldicarbe, enquanto que, da classe dos AR, o mais frequente encontrado foi a estricnina [12].
1.2.2. ESPANHA
Foi comprovado que não existe relação entre as classes mais consumidas de Pesticidas na
Espanha (herbicidas e fungicidas) e a mais empregue para matar animais (inseticidas) [4]. No entanto,
foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a frequência de envenenamento com a
dose letal de formulações específicas. Curiosamente, o uso ilegal intencional de alguns pesticidas como
venenos não foi afetado pela restrição comercial de suas formulações. Efetivamente, durante o período
de 1990 a 2006, o aldicarbe, o carbofurão e a estricnina foram encontrados em 98% dos casos
resultantes de incidentes de envenenamento de abutres Cinereous (Aegypius monachus) por pesticida
[13].
No período de 2010 a 2013, foi nas Ilhas das Canárias onde ocorreu o maior número de
mortes de animais por pesticidas da União Europeia[14]. Os agrotóxicos carbofurão, bromadiolona,
brodifacume e aldicarbe foram os mais detetados. As espécies ameaçadas são frequentemente
afetadas em incidentes de intoxicação. Os produtos químicos proibidos na União Europeia (EU);
carbofurão e aldicarbe, foram identificados em cerca de 75% dos casos e em quase 100% dos iscos, o
que sugere que esses pesticidas ainda estão disponíveis para a população.
Entre 2005 e 2010, foram registados os níveis de rodenticida anticoagulante no fígado de
animais selvagens e domésticos encontrados mortos em Espanha [15]. Tendo-se concluído que os mais
utilizados foram a clorofacinona (19,7% do total analisado), seguido da bromadiolona (11,0%) e
6
brodifacume (6,7%). Este estudo permitiu concluir que o aumento do envenenamento por AR
encontrado na Espanha em 2007 foi associado ao uso em larga escala de bromadiolona e clorofacinona
na região de Castela e Leão contra uma praga de ratos (argânia comum) em terras aráveis.
Um estudo conduzido por Ruiz et al. [16] teve como objetivo avaliar a exposição a rodenticidas
anticoagulantes de primeira e segunda geração (ARs) em seis espécies de aves rapina das Ilhas
Canárias, através de amostras de fígado. Não foram detetados ARs de primeira geração (ex: arfarin,
estricnina) nas amostras analisadas. No entanto a bromadiolona foi a razão da maior parte das mortes.
Este estudo permitiu concluir que o controle das populações de roedores por ARs sugere que esses
compostos entrarão na cadeia alimentar e, portanto, ameaçarão outras espécies mais vulneráveis.
1.2.3. PORTUGAL
Em 2004 foi criado o Programa Antídoto-Portugal em que uma das primeiras ações foi a
recompilação de dados sobre envenenamento de fauna que estavam dispersos por várias entidades[17].
Foram então reunidas informações anteriores ao início dos trabalhos, entre os anos 1992 a
2003. Apesar de não haver muita informação sobre os venenos utilizados nessa época, sabe-se que
em 2002 uma águia Real foi envenenada com estricnina [18].
Já em 2004, e com a intervenção do Programa Antidoto, realizou se um mapa com as zonas
mais criticas: Beira Baixa (Distrito de Castelo Branco), Alto Alentejo (Distrito de Portalegre), Alto Minho
(Distrito de Viana do Castelo) e Trás-os-Montes (Distritos de Bragança e Vila Real), tendo sido as áreas
que os efeitos dos venenos se fizessem notar com mais intensidade. No mesmo ano, foi reportado um
caso em Portalegre onde se utilizou diclorvos como veneno para matar raposas e cães[19].
Durante o ano de 2005 nos casos de envenenamento de fauna em que foi possível comprovar
laboratorialmente o envenenamento, a estricnina foi o agente tóxico detetado em mais de 60% dos
casos [20].
Em Portugal, são ainda frequentes os envenenamentos com organofosforados altamente
tóxicos já proibidos, e que supostamente não deveriam ser acessíveis, como o paratião (E-605 Forte)
ou como outros que incompreensivelmente ainda são legalizados [21].No que toca a herbicidas temos
como exemplo: o paraquato, um produto altamente tóxico, que se destaca pela elevada mortalidade
de fauna e pessoas que provoca, e que foi comercializado e aplicado sem qualquer tipo de controlo
sério e eficaz [22].
7
1.3. IDENTIFICAÇÃO DE PESTICIDAS
Existem vários métodos analíticos para a determinação de pesticidas. A escolha do melhor
método varia de acordo com a matriz onde se encontram e com as propriedades químicas e físicas do
composto analisado. Existem pesticidas acídicos, neutros ou básicos. Alguns compostos contêm
halogénios, outros fósforo, enxofre ou azoto. Estes heteroátomos podem ter relevância para a
deteção[23]. Essa diversidade causa sérios problemas no desenvolvimento de um método analítico
"universal".
Para detetar agrotóxicos nas amostras que possuem uma mistura de vários componentes numa
matriz complexa, é frequentemente utilizada a cromatografia gasosa ou a cromatografia líquida [24]. A
cromatografia Gasosa acoplada com a espetrometria de massa (GC-MS) e a cromatografia líquida
acoplada à espetrometria de massa tandem (LC-MS/MS) são as técnicas mais adequadas quando
falamos de análise de resíduos de pesticidas [23]. No entanto, o facto da maioria dos agrotóxicos ser
polar e termolábel faz com que atualmente a maioria das análises destes compostos sejam efetuadas
recorrendo a LC-MS/MS, em detrimento de GC/MS [25]. Efetivamente, estes dois métodos foram
comparados para a análise de cerca 500 pesticidas, tendo-se obtido melhores resultados qundo se
utilizou a técnica LC-MS/MS [23].
No presente trabalho vai recorrer-se à cromatografia líquida acoplada à espetrometria de
massa de alta resolução (LC-HRMS) para a determinação de pesticidas em diferentes amostras reco-
lhidas de casos onde havia suspeitado uso de pesticidas no envenenamento de animais. Nesta técnica
alia-se o poder da separação de misturas das técnicas cromatográficas com a sensibilidade, o poder
analítico e de identificação da espetrometria de massa de alta resolução (HRMS).
1.3.1. CARACTERIZAÇÃO DOS PESTICIDAS SELECIONADOS PARA ESTE
ESTUDO
Para identificar os pesticidas que têm mais probabilidade de serem encontrados em amostras
forenses de casos onde há suspeita de morte intencional/acidental por envenenamento, fez-se uma
recolha de dados no que toca aos pesticidas mais utilizados na Europa, Espanha e Portugal,
apresentados na secção 1.2. Foi também efetuado um levantamento junto da Polícia Judiciária sobre
quais os pesticidas que são mais frequentemente utilizados neste contexto criminal. Deste modo, na
Tabela 1 são apresentadas as propriedades físicas e químicas dos pesticidas que foram escolhidos
para a criação de uma base de dados neste trabalho.
8
Tabela 1. Pesticidas selecionados para este estudo.
Classe Nome Com-posto
Grupo Químico
Fórmula Molecular Estrutura Química Ref.
Rodenticida Clorfacinona Indano C23H15ClO3
I
Rodenticida Cumatetralil Cumarínico C19H16O3
II
Rodenticida Flocumafena Cumarínico C33H25F3O4
III
Rodenticida Estricinina Alcalóide C21H22N2O2
IV
Inseticida Carbofurão Carbamato C12H15NO3
V
Inseticida Aldicarbe Carbamato C7H14N2O2S
VI
rodenticida Bromadilona Cumarínico C30H23BrO4
VII
Inseticida Imidacloro-pride
Neonico-tinóide
C9H10ClN5O2
VIII
Inseticida Deltametrina Piretróide C22H19Br2NO3
IX
Inseticida Paratião Organofos-forado
C10H14NO5PS
X
Rodenticida Varfarina Cumarínico C19H16O4
XI
Herbicida Glifosato Glicina substituída
C3H8NO5P
XII
9
Inseticida Azinfos Metilo Organofos-forado
C10H12N3O3PS2
XIV
Inseticida Azinfos Etilo Organofos-forado
C12H16N3O3PS2
XV
Rodenticida Difena-cume/RATAX
Cumarínico C31H24O3
XVI
Inseticida Metomil Carbamato C5H10N2O2S
XVII
Inseticida Aldicarbe Sul-fona
Carbama-tos
C7H14N2O4S
XVIII
Herbicida Paraquat Bipiridílio C12H14Cl2N2
XX
Antibiótico Terrami-cina/oxitetraci-
clina
Tetracicli-nas
C22H24N2O9
XX
Rodenticida Brodifacume / RATAX
Cumarínico C31H23BrO3 XXI
10
1.3.2. MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE PESTICIDAS POR ESPETROMETRIA
DE MASSA
Uma vez escolhidos os compostos a incluir na base de dados, o próximo passo foi fazer o
levantamento bibliográfico de quais as condições experimentais mais adequadas à análise destes
compostos por LC-MS. Desta forma, a Tabela 2 resume os diferentes estudos realizados sobre a
análise destes agrotóxicos por LC-MS. A fonte de ionização utilizada em todos os casos foi o ESI.
Tabela 2. Compilação das condições experimentais reportadas na literatura para a identificação dos pesticidas selecionados para este estudo por LC-MS/MS
REFERENCIA TÍTULO COLUNA FASE MÓVEL MODO DE IONIZAÇÃO
ESI
PESTICIDA
ANALISADO
[14] Análise de 117 pesticidas -
envenenamentos vida selvagem
Analytic Accucore, C18 (2,6 µm,
150x3 mm)
A: Água e B: Metanol negativo I, II,
VII, XI
[14] Análise de 117 pesticidas -
envenenamentos vida selvagem
Analytic Synergy, C18 Hydro-RP
(4,0µm, 150x4,6mm)
A: 7,5mM formato amónio
em água e B:Metanol
C: 2% acido fórmico em
água
positivo V, VI,
VIII,
[37] Análise de 52 pesticidas Purospher STARRP-18e (2 μm, 150×
2,1mm)
A: 10% acetonitrilo em
água e B: Acetonitrilo
positivo VIII,
XIV, XV
[38] Determinação pesticidas em
comida
ACQUITY UltraPerformance UPLC
BEH C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm
A: 0,1% ácido acético em
água e B: 0,1% ácido
acético em metanol
positivo VI, VIII,
XIV
[39] Análise 7 anticoagulantes
rodenticidas
Inertsil ODS-4, C18 (100 x1,5 mm; 3
μm)
A: 10 mM acetato de
amónio em água e
B: 10mM de acetato de
amónio em metanol
negativo I, VII,
XI, XXI
[40] Determinação de rodenticidas
anticoagulantes
Nucleodur C18 (2x125mm, 3μm) A: 5mM formato de
amónio (pH=9) em água
B: formato de amónio em
Metanol (3:7)
negativo II, III, VII, XI,
XVI, XXI
[40] Determinação de rodenticidas
anticoagulantes
UPLC BEH C18 (1,0 x 50mm,
1,7μm)
A: hidróxido de amónio
em água
B: hidróxido de amónio
em metanol
negativo I, III, VII, XI,
XVI, XXI
[40] Determinação de rodenticidas
anticoagulantes
XDB C18 (2,1x100mm, 3,5μm) A: 10 mM acetato de
amónio em água
B:Metanol
negativo II, VII,
XI, XVI, XXI
[41] Análise de Estricnina e seus
metabolitos
Waters X-terra MS-C8 reversed-
phase (100 x 2,1 mm, 3,5 μm)
A: 10 mM acetato de
amónio (pH 4,0) em água
B: Acetonitrilo
positivo IV,
[42] Análise Carbosulfan e seus
metabolitos
Zorbax Bonus-RP C18 (5 μm,
150×2,1 mm,)
A: 1 mM acetato de
amónio em água
B: 1 mM acetato de
amónio em metanol
positivo V,
[43] Análise abrangente de inseticidas KINETEX XB C18 (1,7 μm, 2,1 × 50
mm)
A: 0,2% ácido fórmico ou
5 mM formato de amónio
em água
B: 0,2% de ácido fórmico
ou 5 mM de formato de
amónio em metanol
positivo VIII,
IX,
[44] Análise de pesticidas Synergi Fusion RP 80A C18 (4 μm,
50 x 2,0 mm)
A: água: acetonitrilo
(80:20) com 5mM formato
de amónio
positivo V,
VI,
XVII, XVIII
B: 5mM formato de
amónio em metanol
[45] Análise de Glifosato, e Glifusinato Atlantic C18 (2,6 μm, 150 × 2,1 mm) A: acetonitrilo
B: 0,05 mM acetato de
amónia em água (pH=5)
positivo XII,
[46] Análise Quinolonas e tetraciclinas Zorbax Eclipse XDB C18 (5.0 µm
150×4.6 mm,)
A: 0,1% ácido
heptafluorobutírico em
água e B: acetonitrilo
positivo XIII,
[47] Determinação dos herbicidas:
Paraquat, Diquat, Chlormequat e
Mepiquat
Obelisc R (5 μm 150 × 2.1 mm) A: 20 mM formato de
amónia em água (pH=3) e
B: acetonitrilo
positivo XIX
[48] Análise de inseticidas KINETEX XB C18 (1,7 µm,
2.1×50mm).
A: 0,2% de ácido fórmico
ou 5 mM de formato de
amónio em água
B: 0,2% de ácido fórmico
e 5 mM de formato de
amónia em água
positivo V,
VIII,
X,
XVII
[15] Envenenamento primário e
secundário por rodenticidas
anticoagulantes
C6H5 (150×2.1 mm, 3 μm) A: 10 mM acetato de
amónio (pH: 6.8) em água
B: metanol
negativo I, II, III,
XI, XVI
14
1.4. PRINCÍPIOS GERAIS DA ESPETROMETRIA DE MASSA DE ALTA RESOLUÇÃO
O espectrómetro de massa é um instrumento destinado a separar os iões em fase gasosa
atendendo à sua razão massa carga (m/z). O analisador é a peça principal deste aparelho que utiliza
os campos elétrico, magnético ou uma combinação de ambos para separar os iões de acordo com o
seu valor de m/z [25].
A Figura 1. ilustra um esquema genérico e simplificado de um espectrómetro de massa (MS).
Uma vez introduzida a amostra na fonte de ionização do MS, são gerados iões que vão ser
posteriormente separados no analisador de acordo com o seu valor de m/z e posteriormente
encaminhados para deteção. Um software apropriado instalado num computador efetua os cálculos,
gera os espectros de massa a serem impressos e comanda as funções do espectrómetro [31].
Nos anos mais recentes tornou-se cada vez mais comum o acoplamento de dois ou mais
analisadores em conjunto, permitindo efetuar espetrometria de massas tandem (LC-MS/MS) [32]. O
padrão de fragmentação, obtido no espectro de MS/MS, é bastante informativo quanto à estrutura do
analito. Quando a espectrometria de massa de tandem é associada ao uso de analisadores de alta
resolução torna-se uma combinação poderosa. De facto, nestas condições, os valores de m/z, tanto
dos iões precursores como dos fragmentos podem ser determinados com uma resolução até à quarta
casa decimal. [25][29]
A IONIZAÇÃO POR ELECTROSRAY-ESI
O modo de ionização mais utilizada nas análises por LC-MS é a ionização por electrospray
(ESI; “Electrospray Ionization”) (Figura 2). Há essencialmente três particularidades que caracterizam a
ESI. A primeira destas particularidades é a capacidade para produzir iões multiplamente carregados,
reduzindo assim a razão m/z, de tal modo que é possível analisar compostos de elevada massa
molecular. A segunda característica é que as amostras a serem analisadas devem ser introduzidas em
solução, o que faz com que seja possível o acoplamento com muitas técnicas de separação. Por último,
SISTEMA DE VÁCUO
Entrada da Amostra
Fonte de
Ionização
Analisador
Detetor Sistema de Dados
ATMOSFERA
Figura 1. Esquema das principais partes de um Espectrómetro de massa [adaptado [31]]
15
ESI é uma técnica de ionização suave, provocando pouca (ou nenhuma) fragmentação dos analitos
estudados.
A ionização por este processo permite a criação de iões à pressão atmosférica. Neste processo
a amostra é dissolvida num solvente, e pressurizada num tubo capilar, ao qual é aplicado uma
voltagem. Como resultado, o líquido emerge do capilar à pressão atmosférica, na forma de aerossol.
As gotículas formadas perdem sucessivamente o solvente (são dessolvatadas) e os iões fluem para o
espetrómetro de massas induzidos pelos efeitos da atração electroestática e pelo vácuo. É importante
salientar que só o processo de ionização ocorre à pressão atmosférica; a partir deste ponto, o
espectrómetro de massas encontra-se sob “vácuo” [31]. Recorrendo a ionização por ESI as moléculas
são protonadas no modo de ionização positivo e desprotonadas no modo de ionização negativo,
podendo ocorrer a formação de iões adutos que vão surgir no espectro de massa. A utilização em
simultâneo dos modos de ionização positivo e negativo pode também facilitar a identificação de
compostos em estudo. Na grande maioria dos casos, a ionização no modo negativo resulta produz
moléculas desprotonadas [M- H]-, e no modo positivo, são criadas moléculas protonadas [M+ H]+. No
entanto, podem surgir outros tipos de adutos, como a molécula sodiada, [M+Na]+, ou o aduto formado
com amónio [M+NH4]+, dependendo das características da amostra e do solvente. [25].
Figura 2- Ionização por Electrospray - [adaptado[31] ]
ANALISADOR DE MASSA Q-TOF
Após serem gerados na fonte de ionização, os iões são transferidos para uma região do
equipamento, conhecida como analisador, onde são separados de acordo com o seu valor de m/z. Os
instrumentos Q-TOF oferecem uma ampla gama de recursos devido à combinação de alta
sensibilidade, alta resolução e alta precisão de m/z para iões precursores e dos seus fragmentos[33].
Os analisadores Quadrupolo-Tof conjugam o quadrupolo (célula de colisão) com um analisador
de tempo de voo, permitindo a análise de alta resolução e alta precisão de m/z de todos os iões
16
simultaneamente. O Quadrupolo não é utilizado como analisador, mas atua no modo MS/MS, como um
filtro iónico seletivo, focalizando o feixe de iões para o TOF. O princípio de operação do TOF baseia-se
na medida do “tempo de voo” de um ião dentro do espectrómetro de massa. Uma vez que as dimensões
do tubo e a energia cinética dos iões são bem conhecidas, o cálculo da razão m/z torna-se simples. Os
iões mais leves aceleram mais rápido no tubo de voo até o detetor. Os sistemas Q-TOF MS/MS
possuem uma capacidade de medir a fórmula elementar de um analito desconhecido com um erro até
5 ppm[34]. Esse tipo de resolução permite a medição do valor de m/z do ião com um elevado grau de
exatidão e, assim, uma identificação inequívoca de sua composição elementar[35].
17
2. OBJETIVO
Este trabalho realizou-se no âmbito de um protocolo estabelecido entre o CQE-IST e o LPC/PJ,
com o objetivo final de desenvolver protocolos analíticos para identificação de potenciais compostos
tóxicos em amostras recolhidas de casos onde tenha havido a suspeita de envenenamento de animais
domésticos ou selvagens.
Usando a técnica de em espectrometria de massa de alta resolução acoplado à cromatografia
líquida (LC-HRMS), este trabalho teve três objetivos principais:
1. Preparação de uma base de dados de HRMS e cromatográficos dos pesticidas mais frequentemente
utilizados para o envenenamento de animais.
2. Desenvolvimento de protocolos para preparação de amostras.
3- Identificação da substância utilizada para o envenenamento de animais em amostras reais obtidas
através do LPC/PJ.
18
19
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. REAGENTES
Os solventes utilizados foram: acetonitrilo (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical),
metanol (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical ), ácido fórmico (OPTIMA® LC/MS GRADE,
Fisher Chemical), acetato de amónio (OPTIMA® LC/MS GRADE, Fisher Chemical). Foi utilizada a
água ultrapura (OPTIMA® LC/MS, Fisher Chemical) para a cromatografia.
Os padrões de pesticidas foram disponibilizados pelo LPC/PJ exceto o carbofurão que foi
adquirido da Aldrich (Espanha).
3.2. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA
DE ALTA RESOLUÇÃO (LC-HRMS)
Para as análises por LC-HRMS utilizou-se um analisador híbrido de quadrupolo-tempo de voo
(QTOF) IMPACT II (Bruker Daltoniks, Bremen, Alemanha) com uma fonte de ionização por electrospray
(Bruker Daltoniks, Bremen, Alemanha) acoplado a um sistema de UPLC Elute (Bruker, Bremen,
Alemanha). A coluna e o autosampler foram mantidos a 45ºC e a 8ºC, respetivamente. O volume de
injeção foi de 5-10 μL. As amostras foram separadas numa coluna UPLC Kinetex (Phenomenex) Polar
C18 100A, 100x2.1mm. Foi utilizado um fluxo para a fase móvel de 400 μL/min, utilizando-se o seguinte
gradiente: Iniciando com 100% de ácido fórmico em água (0,1%), ou acetato de amónio 5mM (pH 6.5)
(eluente A) que foi mantido durante 1 min, seguido de um gradiente linear de 4 min de gradiente linear
até 80% de acetonitrilo (eluente B), seguindo de um gradiente de 5 min até 100% de B, mantendo estas
condições por 2 min, gradiente de 1 min até 100% de B seguido de 3 min de eluição isocrática nestas
condições. Resumidamente as condições cromatográficas encontram-se representadas na tabela 4.
.
20
Tabela 3. Condições cromatográficas utilizadas para a análise de pesticidas.
Os espectros de MS foram adquiridos nos modos positivo e negativo com os seguintes
parâmetros: voltagem do capilar, ± 4,5 kV; gás nebulizador, 2,9 psi; fluxo do gás de secagem, 8 L/min,
temperatura do gás de secagem, 200 ºC. A calibração interna foi efetuada com formato de sódio
introduzido na fonte de ionização via um loop de 20 µL no início de cada análise, usando a divert valve.
A calibração foi feita usando o modo high-precision calibration (HPC). As aquisições foram efetuadas
numa janela a m/z 50-1000 com uma taxa de aquisição de 3 Hz usando um método dinâmico com um
tempo de ciclo fixo de 3s em modo data-dependent (DDA) ou broadband CID (BBCID).
3.3. PREPARAÇÃO DOS PADRÕES
Numa fase inicial do trabalho experimental foram preparadas soluções padrão de cada um dos
pesticidas em acetonitrilo com uma concentração de 1 × 10−3𝑚𝑜𝑙𝑑𝑚−3. Cada uma destas soluções foi
depois diluída de forma a se otimizar o sinal obtido para cada um dos pesticidas.
3.4. EXTRAÇÃO DA AMOSTRA
Foram utilizadas duas metodologias diferentes para a extração das distintas amostras. Uma
realizada no LPC/PJ, extração com metanol, e outra efetuada para as amostras em que havia suspeita
de envenenamento por rodenticidas anticoagulantes, tendo-se executado uma extração adicional com
PARÂMETRO DESCRIÇÃO
Coluna UPLC Kinetex (Phenomenex) Polar C18
Fase móvel A 0,1% ácido fórmico
Ou acetato de amónio 5mM (pH 6.5)
Fase móvel B Acetonitrilo
Volume de injeção 5 µl
Fluxo 400 µl/min
Temperatura da coluna 45º
Gradiente
Tempo (min) %Fase
móvel A
%Fase
móvel B
0 100 0
1 100 0
5 80 20
10 0 100
12 0 100
13 100 0
16 100 0
21
água/acetona e diclorometano[49] . Esta extração foi feita para as amostras número 10 A1, 10 A2 e 18
pois havia suspeita que nestas se encontrasse rodenticidas, assim como para o padrão de brodifacume
(Ratax). Para tal, a amostra de rodenticida foi pulverizada num almofariz, colocada num tubo de ensaio
e dissolvida com 1 ml de água desionizada. Seguidamente, juntou-se uma solução de 2ml (1:1, v/v) de
acetona e diclorometano. A mistura foi colocada num banho de utrasons e foi posteriormente
centrifugada durante 3 min, tendo-se obtido 3 fases distintas (aquosa, orgânica e solida). Por fim
separou-se a fase orgânica das restantes e analisou-se a mesma no LC-HRMS.
Na tabela 4, encontra-se a identificação das amostras cedidas pelo LPC/PJ, importante referir
que cada número corresponde a um animal diferente.
22
Tabela 4.Identificação das amostras forenses
Identificação Proveniência
1 Comida no quintal
2-A Garras e bico
2-B Conteúdo estomacal
4 Veneno em via publica
5 Isco carne casa particular
6 Rodenticida no quintal
7 Águia Imperial
8 Garras; glote; musculo
9 Vomitado canídeo em terreno par-ticular
10-A1 Isco em quintal
10-A2 Isco em quintal
11 Poço- líquido azul
12 Águia Imperial
13 Milhafre Real
14-A Milhafre Real
14-B Milhafre Real
16 Milhafre Real
17 Cadáver de ovídeo
18 Isco quintal
19 Comida de cão
Figura 4. Fotografia da amostra 8 (garras; glote; músculo) pertencentes ao mesmo animal .
Figura 3. Fotografia da amostra 13: diferentes partes de um milhafre real.
Figura 5. Fotografia da amostra 12: partes de uma águia imperial.
Figura 6. Fotografia da amostra 14A e 14B diferentes partes de um milhafre real.
23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O procedimento da análise de resultados implicou dois passos importantes: o primeiro foi a
análise inicial dos pesticidas padrão por LC-HRMS/MS, nas condições estipuladas para este trabalho.
Com esta informação foi possível criar uma base de dados. O segundo passo teve como objetivo a
identificação de pesticidas em diferentes amostras forenses por comparação com o a base de dados
dos padrões.
4.1. ANÁLISE DOS PADRÕES-PREPARAÇÃO BASE DE DADOS
Para a preparação da base de dados foram analisadas, nas condições experimentais
estipuladas para este trabalho, as soluções padrão de cada um dos pesticidas selecionados (Tabela
1). Cada amostra padrão foi analisada por LC-HRMS/MS por ESI (+) e ESI (-), tendo-se utilizado como
eluente aquoso uma solução de ácido fórmico (0,1%) ou de acetato de amónio 5mM pH 6,5. Foi utilizada
uma coluna Kinetex (Phenomenex) Polar C18, uma vez que este tipo de fase estacionária garante a
eluição de compostos muito polares, que em colunas C18 standard não são retidos, oferecendo assim
possibilidade de analisar com uma só coluna um maior número de compostos de polaridade muito
distinta.
Depois de cada um dos padrões ter sido analisado nas condições anteriormente descrito foi
construída uma base de dados contendo a seguinte informação (Tabela 5): Valores de m/z teóricos da
molécula protonada ou desprotonada, tempo de retenção (Tr), modo de ionização preferencial - ESI(+)
ou ESI (-) - e valores de m/z experimentais para os fragmentos mais abundantes (obtidos no espetro
de HRMS/MS).
A identificação dos compostos foi possível devido a um dos principais atributos dos
instrumentos Q-TOF, que é a alta resolução, dando a composição elementar do ião precursor e dos
seus fragmentos. A identificação estrutural é valiosa (fragmentação característica de cada pesticida),
tornando possível a obtenção dos valores de m/z com grande exatidão (com erros inferiores a 5 ppm)
tanto dos iões precursores como dos fragmentos, permitindo chegar à sua composição elementar.
Assim, o risco de relatar resultados falso-positivos é extremamente baixo.
24
Tabela 5. Parâmetros inseridos na base de dados
Composto m/z [M+H]
teórico
m/z [M-H]
teórico
Modo de
Ionização
Tr
(min)
Ião precursor
m/z
experimental
Fragmento 1
m/z
experimental
fragmento 2
m/z
experimental
Varfarina
309,1121
307,0965 negativo
positivo
6,1
6,1
307,097
309,1128
250,0627
251,0704
117,0395
163,0392
Terramicina 461,1555 459,1398 positivo 3,3 461,1562 426,124 201,0573
Brodifacoum 523,0903 521,0747 negativo 7,6 521,0766 135,044 187,037
Difenacoum 445,1798 443,1642 negativo 7,2 443,1644 293,1309 135,0458
Paratião 292,0403 290,0247 positivo 6,7 292,0401 235,9769 189,9836
Amino-paratião 262,0661 260,0505 positivo 5,9 262,0654 187,9923 172,0153
Imidacloropride 256,0596
254,0439
positivo
negativo
4,2
4,5
256,0601
254,0451
209,0586
207,0435
175,0970
179,9947
Acetamipride 223,0745 221,0589 positivo 4,4 223,0733 126,0129 144,0225
Glifosato 170,0213 168,0056 positivo 0,7 170,0204 87,1327 135,1247
Flocumafena
543,1778
541,1621
positivo
negativo
7,5
7,6
543,1764
541,1638
355,1314
382,1210
159,0417
289,0872
Estricnina 335,1754 333,1598 positivo 3,7 335,1762 184,0756 264,102
Deltamitrina 503,9804 501,9648 positivo 7,8 503,9803 280,8991 171,9864
Cumatetril 293,1172 291,1016 positivo 6,2 293,1164 175,04 121,0318
Clorofacinona 375,0782 373,0626 negativo 7,4 373,065 201,047 145,0284
Carbofurano 222,1125 220,0968 positivo 5,2 222,1134 123,0452 77,0395
Azinfos metilo 318,0130 315,9974 positivo 1,4 318,0138 162,0581 134,0511
Aldicarbe 191,0849 189,0692 positivo 4,7 *191.0851
*O aldicarbe é o composto que não tem MS/MS. Mas contem o ião m/z 213,0671 com maior intensidade que corresponde ao ião
aducto [M+Na], e contem também o ião [M+NH4 ] com m/z 208,1112, com uma intensidade inferior mas ainda maior que a do
próprio ião m/z 191,0851.
negrito: modo de ionização preferencial
25
A título ilustrativo, de seguida será explicado como foram recolhidas as informações para a construção
da base de dados, no caso do rodenticida bromodiolona.
Todos os cromatogramas foram analisados no programa Data Analysis. No cromatograma
iónico extraído a m/z 307,0965, por análise de ESI (-) do padrão da varfarina (Figura 7 A), foi possível
identificar um sinal a 6,1 min que apresenta no espectro de full scan (B), um ião a m/z 307,0970 ± 1,67
ppm correspondente à molécula desprotonada de varfarina. Os sinais observados no espectro de
MS/MS (C), vieram completar a informação, sendo observado o pico base deste espectro a m/z
250,0627 ± 1,02 ppm, que corresponde à saída do grupo acetilo, a partir da molécula desprotonada.
De modo análogo, foram recolhidas manualmente todas a informações necessárias dos diferentes
padrões para a realização da base de dados. O modo de ionização preferencial, ESI(+) ou ESI(-),
depende das características estruturais de cada composto. No anexo A encontram-se representado
todos os cromatogramas iónicos obtidos para os pesticidas padrão assim como os espectros de HRMS
de full scan e de MS/MS.
Figura 7. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 307,0965, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina; (B) Espetro de massa da varfarina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da varfarina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
311.2184
307.0970
WARFARINA NEG AA_49_01_16548.d: -MS, 6.1min #432
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
6x10
Intens.
250 300 350 400 450 500 m/z
m/z 307,097 ± 1,67ppm
117.0395
161.0273
206.0733
250.0627
-MS2(307.0970), 6.1min #434
0
2
4
6
4x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 250,0627 ± 1,02ppm
Tempo de retenção= 6,1 min
Varfarina
Fragmento 1
A
B
C
26
4.2. ANÁLISE DAS AMOSTRAS FORENSES
Foram analisadas 20 amostras cedidas pelo LPC-PJ e será seguidamente explicado, com
maior detalhe, o processo de identificação dos pesticidas presentes em quatro destas amostras.
De modo a garantir que as amostras forenses eram analisadas nas condições favoráveis à
identificação do maior número possível de pesticidas, foram todas analisadas tanto no modo de
ionização de ESI (+) como por ESI (-), utilizando como fase móvel aquosa tanto uma solução de ácido
fórmico como uma solução de acetato de amónio.
Todos os cromatogramas inspecionados manualmente utilizando o programa Data Analysis.
Em cada um dos modos de ionização – ESI (+) ou ESI (-) - procurou-se extrair os diferentes iões que
correspondiam ao valor de m/z da molécula protonada, [M+H]+, ou desprotonada, [M-H]-, de cada um
dos pesticidas. A identificação teve como base a existência de sinais com o mesmo tempo de retenção,
m/z e padrão de fragmentação similar aos observados para as amostras padrão. Houve um caso em
que, embora não se tivesse o padrão do pesticida, a identificação foi possível tendo em conta os baixos
valores de erros associados à identificação tanto da molécula protonada como dos iões fragmento (no
espectro de MS/MS) assim como o perfil isotópico dos sinais referentes ao ião precursor e aos
fragmentos.
4.2.1. CASO ESTUDO 1: ISCO ENCONTRADO NUM GALINHEIRO
Este caso é um exemplo ilustrativo do fato do método de extração poder ter efeitos dramáticos
na identificação. As amostras 10-A1 e 10-A2, foram identificadas como possíveis iscos envenenados,
que foram encontradas no mesmo galinheiro. Havia a hipótese inicial de se poder tratar de uma amostra
contendo bromadiolona, uma vez que as amostras recolhidas tinham um aspeto muito similar aos iscos
de bromadiolona comerciais (Figura 8 A).
Inicialmente estas amostras foram extraídas no LPC/PJ utilizando como solvente o metanol.
Uma vez que a análise de LC-HRMS deste extrato não permitiu a identificação de qualquer pesticida
foi testado um método de extração alternativo. Tendo em conta o aspeto das provas recolhidas, havia
a suspeita de se tratar de um isco de rodenticida adaptou-se o método que está descrito na literatura
para a extração deste tipo de pesticidas, utilizando-se uma mistura de água/acetona e diclorometano[49].
Quando este novo extrato foi analisado por LC-ESI(-)-HRMS, usando como fase móvel o
acetato de amónio pH=5,6, continuou-se a não ter evidencias da presença de bromadiolona, mas foi
possível identificar os dois pesticidas que estão na composição do isco comercial RATAX: o Brodifcoum
(B) e Difenacume (D). Este fato foi provado quando uma amostra padrão de RATAX comercial foi
extraído e analisado exatamente nas mesmas condições utilizadas para a amostra forense.
Efetivamente, os iscos comerciais de RATAX e bromadiolona (Figura 8) têm aspetos muito similares,
mas o resultado da análise foi indiscutível tratando-se de um isco de RATAX.
27
Da análise efetuada, conclui-se que a amostra 10-A1 e 10-A2 contêm os mesmos compostos
identificados no isco RATAX. Na Figura 10 estão representados os cromatogramas comparados com
o padrão Ratax, e o espetro de MS/MS para cada uma das amostras. Efetivamente, quando analisadas
por LC-ESI(-)-HRMS tanto as amostras forenses A1 e A2 como RATAX, foi possível identificar o
Brodifacume, que elui a Tr= 7,7 min nas condições cromatográficas utilizadas, e apresenta no espectro
de full scan o ião correspondente à molécula desprotonada a m/z 521,0766 ± (3,64-2,30) ppm. Este
sinal apresenta uma distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de
bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico. A molécula
desprotonada do difenacume elui com um Tr=7,3 min e foi identificada a m/z 443,1663 ± (4,73-4,51)
ppm. Os espectros MS/MS destes dois pesticidas têm os mesmos iões fragmentos a m/z 135,0430 e
187,0393 identificados em todas as amostras com um erro inferior a 5 ppm. Na figura 9, está
representado o esquema de fragmentação tanto para o brodifacume como para o difenacume com o
respetivo erro associado para ambas as amostras.
M-H
m/z 187,0393 ± (2,83-1,76) ppm
m/z 187,0395 ± (2,29-1,76) ppm
M-H
I II
Figura 9. I) Proposta de fragmentação para o brodifacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2 respetivamente; II) Proposta de fragmentação para o difenacume, erro associado da amostra 10 A1 e 10 A2 respetivamente
A B
Figura 8. A) Isco comercial de bromadiolona B) Isco comercial de Ratax
28
135.0490
187.0416
219.0821523.0770
-MS2(523.0764), 7.7min #554
0
2
4
4x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
187.0386219.0799
245.0944
293.1311
319.1478 399.1649
443.1573
-MS2(443.1593), 7.2min #523
0
1000
2000
3000
Intens.
200 250 300 350 400 m/z
135.0428
187.0395
523.0741
-MS2(521.0773), 7.6min #548
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
187.0367 219.0795
281.2454
399.1691
444.1625
-MS2(443.1598), 7.4min #527
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
200 250 300 350 400 m/z
135.0449
187.0374
219.0779
263.0682
523.0775
-MS2(521.0796), 7.6min #548
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
187.0382219.0789
293.1310
399.1737
443.1641-MS2(443.1641), 7.3min #520
0
1
2
3
4
55x10
Intens.
200 250 300 350 400 m/z
[Grab your
reader’s
attention
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quote from
the
document
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emphasize
a key point.
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Amostra 10-A1-B
Amostra 10-A2-B
Amostra 10-A2-D
Amostra 10-A1-D
Amostra 10-A2
Amostra 10-A2
Amostra 10-A1
Amostra 10-A1
Ratax-Padrão
Ratax-Padrão Difencume-D
D
D
Brodifacume-B
B
B
Ratax-Padrão-B
Ratax-Padrão-D
I
II
Figura 10. I)Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 443,1642 (difenacume-D) e m/z 521,0747 (brodifacume-B) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de Ratax e das amostras 10A1 e 10A2; II) Comparação do espetro de MS/MS do Ratax com as amostras 10 A1 e 10A2 quando extraído os iões de brodifacume e difenacume.
29
4.2.2. CASO ESTUDO 2: CARNE ENCONTRADA NUM PRATO DE COMIDA
PARA CÃO
Este caso corresponde a uma amostra obtida por extração com metanol de carne encontrada
no prato de um cão, com suspeita de envenenamento.
No cromatograma iónico extraído a m/z 256,0595, por análise de ESI (+) da amostra (Figura
11), foi possível identificar um sinal a 4,2 min que apresenta no espectro de full scan um ião a m/z
256,0601 ± 2,34 ppm correspondente à molécula protonada do imidacloropride. Efectivamente este
sinal tem a distribuição isotópica compatível com uma molécula contendo cloro. Os fragmentos obtidos
no espetro de MS/MS foram então analisados para a confirmação da identificação, tendo-se obtido os
seguintes fragmentos a m/z 209,0576 ± 3,82 ppm e 175,0969 ± 5,13 ppm. De facto o padrão de
fragmentação obtido para a molécula protonada do imidaclorpride é compatível com o padrão de
fragmentação referido na literatura [50]. O primeiro fragmento corresponde à perda do grupo NO2, e ao
segundo onde a perda de água é acompanhada também pela perda do cloro.
A identificação do inseticida imidacloropride foi assim possível tendo em conta não só o grau
de exatidão obtido para os valores de m/z obtidos para a molécula protonada e os iões fragmentos
511.1094
256.0589
210.0654
IMICLORPRIDE auto AA_26_01_16617.d: +MS, 4.2min #305
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 m/z
175.0969
209.0576
+MS2(256.0589), 35.0eV, 4.2min #306
0
2
4
6
85x10
Intens.
170 180 190 200 210 220 230 m/z
m/z 209,0576± 3,82ppm m/z 175,0969± 5,13ppm
m/z 256,0589 ±2,34ppm
Figura 11. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0595, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do Imidacloropride, sendo apresentado a estrutura proposta dos iões fragmentados.
A
B
C
30
obtidos no HRMS full scan e no espectro MS/MS, respetivamente, mas também a distribuição isotópica
dos picos referentes ao ião precursor e aos fragmentos.
4.2.3. CASO ESTUDO 3: UMA AVE DE RAPINA ENCONTRADA MORTA
COM SUSPEITA DE ENVENENAMENTO
Este é um caso de uma ave de rapina encontrada morta com suspeita de envenenamento. A
amostra 2 A foi obtida pela lavagem das garras e bico com metanol e a 2B foi através da extração do
conteúdo estomacal com o mesmo solvente (Figura 12).
O rodenticida flocumafeno foi identificado em ambas as amostras, tanto na análise de LC-ESI
(+)-HRMS como por LC-ESI (-)-HRMS, usando como fase móvel o acetato de amónio pH=5,6. O
composto foi então reconhecido por comparação com o padrão analisado nas mesmas condições.
Ambas as amostras forenses deram origem aos mesmos resultados, tendo sido identificado o
ião correspondente à molécula desprotonada do flocumafeno com o mesmo tempo de retenção
apresentado para o padrão deste rodenticida. Embora o erro associado à determinação do valor de m/z
da molécula desprotonada nas amostras forenses seja superior ao admissível por HRMS, na amostra
2A (garras e bico) foi também possível identificar o espectro de MS/MS deste ião, que por ser
sobreponível ao exibido pelo padrão, dá mais segurança à atribuição efetuada.
Figura 12. Fotografia da amostra 2-A (garras e bico) e 2-B (conteúdo estomacal) pertencentes a uma ave de rapina.
31
No entanto, na análise por LC-ESI (+)-HRMS os erros associados à determinação do m/z da
molécula protonada do flocumafeno não deixaram qualquer dúvida. Efetivamente, no espetro de full
scan observou-se um ião m/z 543,1764 ± 2,52 ppm para a amostra 2A, e um ião 543,1792 ± 2,63 ppm
para a amostra 2B. Os fragmentos obtidos nos espetros de MS/MS para cada uma das amostras são
sobreponíveis. A figura 14 apresenta a comparação dos espetros de MS/MS obtidos por ESI (+) para
amostras e para o padrão, assim como a estrutura dos dois fragmentos maioritários. É importante
reparar que o tempo de retenção é o mesmo (Tr=7,6 min) no padrão e para cada uma das amostras.
161.0243219.0814
289.0872
382.1212
541.1637
-MS2(541.1644), 7.6min #541
0.0
0.5
1.0
6x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
Figura 13. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 541,1621 obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2A; II) Espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno; III) Espectro de MS/MS da amostra 2A; IV) fragmentação proposta do ião maioritário.
m/z 161,0252 ± 14,78ppm
m/z 541,1654 ± 6,06ppm
161.0252
219.0830
289.0861382.1231
-MS2(541.1636), 7.4min #538
0
1000
2000
3000
4000
5000
Intens.
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
Amostra 2 A Amostra 2 A
Padrão Flocumafeno
ESI (-)
[M-H]-
Padrão Flocumafeno
159.0420 291.1011
355.1301+MS2(543.1772), 36.3eV, 7.6min #556
0.0
0.5
1.0
1.5
4x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
159.0413 291.1023
355.1310
409.1238 503.1656
+MS2(543.1781), 36.3eV, 7.7min #473
0
1
2
3
46x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
159.0421 291.1027
355.1316
383.2696 429.1306
546.4888
+MS2(543.1779), 36.3eV, 7.7min #473
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z
ESI (+) Padrão-Flocumafeno
m/z 355,1313 ± 3,90 ppm [M+H]
+
m/z 543,1764 ±2,52ppm
Amostra 2A
m/z 159,0417 ± 2,89ppm [M+H]
+
m/z 543,1792 ±2,63ppm
Amostra 2A
Amostra 2B
Amostra 2B
Padrão Flocumafeno
Figura 14. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 543,1778 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno com a amostra 2 A e 2B; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de flocumafeno e das amostras 2 A e 2B ; III) Proposta de fragmentação para os iões fragmentados maioritários da flocumafeno.
I
II III
32
4.2.4. CASO ESTUDO 4: COMIDA DE CÃO
Este caso diz respeito a uma suspeita de envenenamento dum cão. A comida descoberta na
taça do cão foi extraída com metanol e depois analisada no laboratório por LC-ESI(+)-HRMS, tendo-se
utilizado como fase móvel ácido fórmico (0,1%). Foi possível a identificação do paratião, um potente
inseticida e acaricida pertencente ao grupo dos organofosforados.
Tanto o paratião (P) como o seu metabolito aminoparatião (A) foram identificados aquando a
comparação com um padrão de E-605 Forte (Figura 15). O primeiro (P) elui a Tr=6,7 min e apresenta
no espectro de full scan o ião correspondente à molécula protonada a m/z 292,0403 ± 2,42 ppm. Já o
aminoparatião, nas mesmas condições cromatográficas elui a um Tr=5,9 min e apresenta no espetro
de full scan o ião a m/z 262,0654 ± 1,42 ppm. Os espetros de MS/MS, assim como a estrutura dos
fragmentos maioritários encontra-se na Figura 15.
Conclui-se assim queesta amostra forense continha o paratião e o seu metabolito
aminoparatião. Muito embora este composto seja de venda proibida no nosso país, infelizmente são.
124.0283 156.0220
172.0156
187.9930
206.0035
+MS2(262.0665), 35.0eV, 6.1min #380
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Intens.
100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z
140.0349171.9761
189.9852
235.9777
261.0631 292.9053
+MS2(292.0403), 35.0eV, 6.7min #540
0
100
200
300
400
500
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z
124.0248156.0210
172.0148
187.9916+MS2(262.0653), 35.0eV, 5.8min #441
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Intens.
100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z
123.0346
140.0352
155.9975
171.9734
189.9836 217.9659
235.9769
253.9878
+MS2(292.0391), 35.0eV, 6.8min #514
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 m/z
Padrão-Paratião
Amostra 1
Amostra 1
Padrão-Paratião A
A
P
P
m/z 292,0396 ± 2,42 ppm
MH+
m/z 235,9782 ± 2,09ppm
m/z 262,0654 ± 1,42ppm
MH+
m/z 187,9931 ± 1,06ppm
Padrão-P
Padrão-A
Amostra 1-P
Amostra 1-A
Figura 15. Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 292,0403 (paratião-P) e m/z 262,0661 (aminoparatião-A) obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de E-605 forte com a amostra 1 ; II) Comparação dos espetro de MS/MS do padrão de paratião e do seu metabolito aminoparatião com os da amostra 1 ; III) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário do paratião; IV) Proposta de fragmentação para o ião fragmentado maioritário do aminoparatião
33
4.3. RESULTADOS DAS ANÁLISES- AMOSTRAS FORENSES
As restantes 16 amostras de casos em que houve suspeita de envenenamento de animais
foram analisadas de modo análogo. Na Tabela 6 são identificados os pesticidas detetados em todas as
amostras avaliadas neste estudo. Das 20 amostras mistério analisadas foi possível fazer a identificação
de pesticidas em 13. No anexo B encontram-se todos os cromatogramas iónicos, espectros de full scan
e de MS/MS que serviram de base para a identificação dos pesticidas nas restantes amostras.
É de salientar que os agrotóxicos mais frequentemente detetados pertencem ao grupo dos
rodenticidas anticoagulantes: bromadiolona, brodifacume, difenacume varfarina e flocumafeno.
Tabela 6. Resultados das análises de todas as amostras forenses analisadas neste estudo: identificação do pesticida
Identificação Proveniência Pesticida encontrado
1 Comida num quintal Paratião/ Aminoparatião
2-A Garras e bico Flocumafeno
2-B Conteúdo estomacal Flocumafeno
4 Veneno em via pública Bromadiolona
5 Isco de carne (particular) Bromadiolona
6 Rodenticida no quintal Bromadiolona
7 Águia imperial ?
8 Garras, glote músculo ?
9 Vomitado em terreno particular ?
10-A1 Isco num quintal Brodifacume/Difenacume
10-A2 Isco num quintal Brodifacume/Difenacume
11 Líquido azul ?
12 Águia Imperial ?
13 Milhafre Real ?
14-A Milhafre Real Varfarina
14-B Milhafre Real Varfarina
16 Milhafre Real ?
17 Cadáver ovideo Bromadiolona
18 Isco quintal Bromadiolona
19 Comida de cão Imidacloropride/ Acetamiprida
34
5. CONCLUSÕES
O uso de pesticidas pode resultar no envenenamento de animais selvagens e domésticos. Isso
pode ser devido ao uso indevido do produto, ou por falha descuidada, acidental ou intencional.
Deliberadamente e ilegalmente, muitos pesticidas são empregues para o envenenamento animal. A
colocação ilegítima de iscos contaminados no campo continua a ser um problema persistente e sério.
A natureza dessas ações leva a que que outros animais selvagens e pessoas também estejam
potencialmente em risco. Em alguns casos, pesticidas podem ser encontrados em tecidos de animais,
garras e bicos, mas a origem da substância não é clara e a causa da morte será desconhecida ou não
especificadaO LC-HRMS/MS foi o método analítico escolhido para a deteção e caracterização de
pesticidas em matrizes biológicas complexas, tendo-se revelado muito adequado para este fim.
Existem vários fatores a ter em conta quando se inicia um processo de análise analítica, tais
como a escolha das condições cromatográficas, de que se destacam a coluna cromatográfica e as
fases móveis. Neste trabalho, a utilização de uma coluna Kinetex C18 polar permitiu aliar as condições
de separação de fase reversa com as interações hidrofilicas, permitindo reter até os compostos mais
polares. Constatou-se também que a grande maioria dos pesticidas foi mais facilmente detetado
quando se utilizou como fase aquosa uma solução de acetato de amónio 5mM pH 6,5.
Foram então analisadas nas condições experimentais estipuladas para este trabalho soluções
padrão de cada um dos compostos pertencentes à lista anteriormente estabelecida. Cada amostra
padrão foi analisada por LC-HRMS/MS por ESI (+) e ESI (-), sendo a identificação da espécie proposta
realizada através de vários fatores: massa precisa da molécula protonada ou desprotonada, modo de
ionização preferencial, tempo de retenção e o valor de m/z experimental dos fragmentos característicos
- esta opção é possível devido ao facto de a utilização de um analisador de Q-TOF-MS alcançar um
elevado grau de exactidão nos valores de m/z medidos (inferior a 5 ppm).
O método desenvolvido foi aplicado com sucesso à análise de amostras reais. Das 20 amostras
mistério analisadas foi possível a identificação de pesticidas em 13. Foram encontrados 5 rodenticidas
diferentes: flocumafeno, bromadiolona, brodifacume, difenacume, varfarina e 3 inseticidas: paratião,
imidacloropride e acetamiprida. Infelizmente comprovou-se que existe uma facilidade de acesso a
produtos químicos proibidos, como o paratião.
Como trabalho futuro sugere-se um estudo de quais as melhores condições de extração para
as diferentes classes de pesticidas e para as diferentes matrizes biológicas em que estes são
encontrados para posterior análise por LC-HRMS.
35
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39
7. ANEXOS
40
ANEXO A: BASE DE DADOS
• Terramicina
• Paratião
235.1813
461.1562
443.1455
TERRAMICINA auto novo_27_01_16400.d: +MS, 3.3min #334
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
154.0523
201.0573
226.0743
267.0685
283.0635
307.0640
337.0749
365.0701
381.0659
408.1133
426.1240
444.1348
+MS2(461.1562), 35.0eV, 3.4min #335
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
m/z 426,1240 ± 13 ppm
m/z 461,1562 ± 1,61ppm
A
B
C
Figura 16 (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 461,1555, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de terramicina; (B) Espetro de massa da terramicina e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da terramicina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
189.9836217.9662
235.9768
+MS2(292.0396), 35.0eV, 6.0min #451
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Intens.
200 250 300 350 400 450 500 m/z
m/z 235,9768 ± 3,83 ppm
235.9763
264.0081 292.0396
PARATIAO auto novo AA_50_01_16618.d: +MS, 5.9min #449
0
1
2
3
5x10
Intens.
200 250 300 350 400 450 500 m/z
m/z 292,0396 ± 2,42 ppm m/z 264,0081 ± 3,43 ppm
A
B
C
Figura 17. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 292,0403 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de paratião; (B) Espetro de massa do paratião e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do paratião, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
41
• Imidacloropride(+)
• Imidacloropride(-)
256.0601
511.1125209.0592175.0965 363.0965274.0716280.0386 515.1068
IMICLORPRIDE ato_26_01_16397.d: +MS, 4.2min #261
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
200 250 300 350 400 450 500 m/z
m/z 256,0601 ± 2,03ppm [2M+H]
175.0970
209.0586
+MS2(256.0601), 35.0eV, 4.2min #262
0
500
1000
1500
2000
2500
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
m/z 209,0586 ± 1,20ppm
A
B
C
Figura 18.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 256,0596, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
254.0418
290.0180 509.0950354.2003 531.0772312.0015215.0082
PJImidoclorpride auto neg_26_01_11071.d: -MS, 4.5min #285
0.0
0.5
1.0
1.5
6x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
77.2602
117.0483
153.0220 179.9937
207.0412
254.0394
299.0021
-MS2(254.0418), 4.5min #286
0
250
500
750
1000
1250
Intens.
100 150 200 250 300 m/z
m/z 254,0418 ± 8,26 ppm
m/z 207,0412 ± 9,65 ppm
A
B
C
Figura 19.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 254,0439, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa do imidacloropride e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS do imidacloropride, sendo apresentado a estrutura do seu fragmento maioritário.
42
• Acetamiprida
• Carbofurão
238.0732
256.0595
223.0751
IMICLORPRIDE auto novo_26_01_16398.d: +MS, 4.3min #364
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4x10
Intens.
220 230 240 250 260 m/z
126.0105
+MS2(223.0751), 35.0eV, 4.3min #365
0
50
100
150
200
250
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 m/z
m/z 223,0751 ± 5,37ppm
m/z 126,0105 ± 0,02 ppm
A
B
C
Figura 20. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 223,0745, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra forense de imidacloropride; (B) Espetro de massa da acetamiprida e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da acetamiprida, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
1+
1+
1+
123.04501+
165.09241+
222.11341+
CARBOFURAN_24_01_16392.d: +MS, 5.2min #2103
0.0
0.5
1.0
4x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 222,1134 ± 4,18ppm
55.05541+
77.03951+
91.05531+
105.03491+
123.04521+
165.09171+
+MS2(222.1134), 17.5-52.5eV, 5.2min #2106
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
5x10
Intens.
0 50 100 150 200 250 m/z
m/z 165,0917 ± 4,20ppm
C
B
A
Figura 21.(A) Cromatograma iónico extraído a m/z 222,1125, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de carbofurão; (B) Espetro de massa do carbofurão e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do carbofurão, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente a um fragmento.
43
• Clorofacinona
• Bromadiolona
373.0650
769.1177
CLOROFACINONA NEG_40_01_16530.d: -MS, 7.4min #531
0
1
2
3
4
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 373,0650 ± 6,43ppm
145.0284
201.0470
373.0638
-MS2(373.0650), 7.5min #532
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 201,0470 ± 1,98 ppm
A
B
C
Figura 22. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 373,0626 ,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de clorofacinona; (B) Espetro de massa de clorofacinona e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da clorofacinona, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
Figura 23. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 525,0695, obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromodiolona; (B) Espetro de massa de bromodiolona e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da bromodiolona, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
526.0749
527.0699
528.0732
529.0768
525.0717
BROMADIOLONA AUTO NEG_47_01_16497.d: -MS, 6.9min #492
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5x10
Intens.
515 520 525 530 535 540 m/z
m/z 525,0717± 4,00ppm
250.0641
525.0718
-MS2(525.0717), 7.0min #494
0
1
2
3
4
5
5x10
Intens.
0 200 400 600 800 1000 m/z
m/z 250,0641± 4,ppm
A
B
C
44
• Estricnina
• Glifosato
336.1791
337.1815
335.1762
estricnine auto pos_15_01_17082.d: +MS, 3.7min #267
0
2
4
6
6x10
Intens.
322.5 325.0 327.5 330.0 332.5 335.0 337.5 340.0 342.5 345.0 m/z
m/z 335,1762 ± 2,37ppm
184.0756 264.1020
335.1761 +MS2(335.1762), 35.0eV, 3.8min #269
0.0
0.5
1.0
1.5
7x10
Intens.
200 300 400 500 600 700 m/z
m/z 264,1020 ± 1,71ppm
A
B
C
Figura 24. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 335,1754, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de estricnina; (B) Espetro de massa da estricnina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da estricnina, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
Figura 25. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 170,0213 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de glifosato; (B) Espetro de massa do glifosato e sua estrutura.
170.0211
184.0362
PJ glifosato auto pos_24_01_11147.d: +MS, 0.9min #54
0
1
2
3
4x10
Intens.
120 140 160 180 200 220 m/z
m/z 170,0211 ± 1,88ppm
A
B
45
• Cumatetril
• Flocumafeno (+)
163.0403 291.1008
543.1764
355.1317
fLUOCUMAFEN auto novo_38_01_16426.d: +MS, 7.5min #551
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 543,1764 ± 2,52ppm
159.0417
291.1019
327.1357
355.1314
+MS2(543.1764), 36.3eV, 7.5min #552
0
1
2
3
4
4x10
Intens.
200 300 400 500 600 700 m/z
m/z 355,1314 ± 5,63 ppm
A
B
C
Figura 27. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 543,1777, obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa do flocumafeno e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a fragmentação plausível correspondente ao fragmento maioritário.
Figura 26. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 293,1172,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de cumatetril; (B) Espetro de massa da cumatetril e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do cumatetril, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
293.1164
315.0987
CUMATETRIL auto novo_34_01_16418.d: +MS, 6.2min #453
0.0
0.5
1.0
6x10
Intens.
270 280 290 300 310 320 330 340 350 m/z
m/z 293,1164 ± 2,80ppm
121.0318
175.0400
+MS2(293.1164), 35.0eV, 6.2min #454
0
2
4
6
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 m/z
m/z 175,0400 ± 6,28ppm
A
B
C
46
• Flocumafeno (-)
• Brodifacume
311.1688
541.1637FLUOROMAFEN NEG_38_01_16524.d: -MS, 7.5min #534
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
161.0243
289.0874
382.1212
541.1637
-MS2(541.1637), 7.5min #536
0.0
0.5
1.0
1.5
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 541,1637± 2,92ppm
A
B
C
Figura 28. A) Cromatograma iónico extraído a m/z 541,1621,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de flocumafeno; (B) Espetro de massa da flocumafeno e sua estrutura (C) Espectro de MS/MS da flocumafeno, sendo apresentado a estrutura plausível correspondente ao fragmento maioritário.
m/z 161,0243 ±4,78ppm
[M-H]
135.0449
187.0374
219.0779
263.0682
523.0775
-MS2(521.0796), 7.6min #548
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 m/z
522.0833
523.0782
524.0817
525.0843
521.0796
PJ 201802102A1 nova ext AA autoMS NEG_14_01_18639.d: -MS, 7.5min #546
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4x10
Intens.
515.0 517.5 520.0 522.5 525.0 527.5 530.0 532.5 535.0 m/z
m/z 521,0796 ±5,43 ppm
m/z 187,0395 ± 2,83ppm
Figura 29. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 521,0796 ,obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de Ratax-brodifacume; (B) Espetro de massa do brodifacume e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do brodifacume, sendo apresentado a proposta de fragmentação.
A
B
C
47
• Aldicarbe
• Azinfos Metilo
B
191.0851
229.0398
213.0671
208.1112
ALDICARB AA auto_23_01_16613.d: +MS, 4.7min #454
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4x10
Intens.
120 140 160 180 200 220 240 260 m/z
m/z 213,0671± 1,31ppm
m/z 191,0851± 1,17ppm
[M+Na] [M+NH4]
Figura 30. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 191,0849 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de aldicarbe; (B) Espetro de massa do aldicarbe, sua estrutura e iões aductos observados.
A
B
230.1127
318.0132
162.0582
PJ azinfos metilo AA pos auto_29_01_18726.d: +MS, 1.4min #96
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 318,0129 ± 0,45ppm
134.0511
162.0581
+MS2(318.0132), 35.0eV, 1.4min #97
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 m/z
m/z 318,0132 ± 0,48ppm
m/z 162,0581 ± 5,25ppm
A
B
C
Figura 31. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 318,0130,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de azinfos metilo ; (B) Espetro de massa do azinfos metilo e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do azinfos metilo, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.
48
• Azinfos Etilo
• Deltamitrina
132.0470
160.0502
170.9691199.0005
232.9480
318.0380
346.0437
368.0259
289.0109
260.9796
AZINFOS ETILO auto novo_33_01_16416.d: +MS, 6.4min #471
0
2
4
6
4x10
Intens.
150 200 250 300 350 400 450 500 m/z
m/z 346,0437± 1,86ppm [M+Na] m/z 368,259± 1,06ppm
Figura 32. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 346,0443 ,obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de azinfos etilo; (B) Espetro de massa do azinfos de etilo, sua estrutura e iões aductos observados.
A
B
A
B
C
503.9803
504.9827
506.9815
507.9756
508.9807
505.9775
DELTAMITRINA auto AA_35_01_16616.d: +MS, 7.8min #579
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
4x10
Intens.
504 506 508 510 512 514 516 m/z
m/z 503,9803 ± 0,28ppm
74.8879
171.9864
280.8991
670.1458
+MS2(505.9781), 35.2eV, 7.9min #584
0
200
400
600
800
1000
Intens.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
m/z 280,8991±1,06ppm
Figura 33. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 503,9804 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de deltamitrina; (B) Espetro de massa da deltamitrina e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS da deltamitrina, sendo apresentado a estrutura do ião fragmentado.
A
B
C
49
• Difenacume
• Amino paratiao
206.0021
262.0648
234.0335
PJ201701459 AUTO NOVO AA_25_01_16607.d: +MS, 5.8min #760
0.0
0.5
1.0
1.5
5x10
Intens.
160 180 200 220 240 260 280 m/z
124.0243 156.0204
172.0150
187.9920
206.0016
+MS2(262.0648), 35.0eV, 5.9min #761
0
1
2
3
4x10
Intens.
120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z
m/z 262,0648±4,96ppm
m/z 187,9920 ±4,78ppm
Figura 35. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 262,0661 obtido por ionização de electrospray no modo positivo da amostra padrão de E-605 forte; (B) Espetro de massa do aminoparatião e sua estrutura; (C) Espectro de MS/MS do aminoparatião, sendo apresentado a proposta de fragmentação.
B
A
C
Figura 34. (A) Cromatograma iónico extraído a m/z 443,1642 obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de RATAX ; (B) Espetro de massa do difenacume e sua estrutura.
A
B
50
ANEXO B: IDENTIFICAÇÃO DOS PESTICIDAS NAS AMOSTRAS FORENSES
• Identificação das amostras: 4; 5; 6; 17 e 18 – pesticida identificado: bromadiolona
+
525.0702
526.0745
527.0688
528.0728 530.9924 532.9937 534.9998
537.3435
538.3462
539.3509540.9931
PJ 201806801 AUTO NEG_42_01_16482.d: -MS, 6.9min #495
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4x10
Intens.
524 526 528 530 532 534 536 538 540 m/z
250.0637
527.0692
-MS2(525.0718), 7.0min #499
0
1
2
3
4
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Amostra 5
250.0637
378.9807
525.0712
-MS2(525.0712), 7.0min #496
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
250.0611
527.0689
-MS2(525.0712), 6.9min #490
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
6x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Amostra 18
523.3509
525.0725
526.0760
527.0714
528.0734
531.0126 535.3551
PJ 2018112554 AA autoMS NEG_6_01_18541.d: -MS, 6.9min #492
0
1
2
3
4x10
Intens.
524 526 528 530 532 534 536 538 540 m/z
Amostra 6
Amostra 17
Amostra 4
Padrão bromadiolona
Amostra 4
Amostra 6
Amostra 17
Amostra 18
Amostra 5
250.0641
525.0718
-MS2(525.0717), 7.0min #494
0
1
2
3
4
5
5x10
Intens.
0 200 400 600 800 1000 m/z
Padrão-bromadiolona
I
II
III
IV
V
VI
VII
Figura 36. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 525,0695 (bromadiolona) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de bromadiolona e das amostras: 4, 5, 6, 17 e 18; II) Eespetro de MS/MS do padrão de bromadiolona; III) Full scan da amostra 4, distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0688; IV) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 5; V) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 6; VI) Full scan da amostra 17, distribuição isotópica característica de uma molécula contendo um átomo de bromo, exibindo o sinal isotópico [M-H+2]- de igual abundância ao do monoisotópico a m/z 527,0714; VII) Espetro de MS/MS do ião extraído da bromadiolona da amostra 18; VIII) Estrutura da molécula bromadiolona; IX) Estrutura do ião fragmento maioritário.
Ião precussor: Bromadiolona
Fragmento 1
VIII
IX
51
Tabela 7. Erros associados aos valores de m/z identificados para o ião precurssor de bromadiolona e para o seu fragmento maioritário em cada uma das amostras analisadas.
• Identificação das amostras: 14-A e 14-B: pesticida identificado: varfarina
amostras
m/z exp. m/z teorico erro (ppm)
padrão ião precursor 525,0717 525,0695 4,00
fragmento 1 250,0641 250,0630 4,39
4 ião precursor 525,0701 525,0695 0,95
5 ião precursor 525,0718 525,0695 4,19
fragmento 1 250,0637 250,0630 2,79 6 ião precursor 525,0712 525,0695 3,05
fragmento 1 250,0637 250,0630 2,79 17 ião precursor 525,0725 525,0695 5,52
18 ião precursor 525,0712 525,0695 3,05
fragmento 1 250,0611 250,0630 7,59
I II
III
IV
V
Figura 37. I) Comparação dos cromatogramas iónicos extraídos a m/z 307, (varfarina) obtido por ionização de electrospray no modo negativo da amostra padrão de varfarina e das amostras: 14-A e 14-B; II) Eespetro de MS/MS do padrão de varfarina; III) Espetro de MS/MS da amotra 14-A ; IV) Espetro de MS/MS da amostra 14-B; V) Proposta de fragmentação para a varfarina, e erro associada ao fragmento maioritário para ambas as amostras.
52
53
ANEXO C: POSTER
Figura 38.Poster apresentado CQE meeting
54