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ANEXO I: PROTOCOLO EXTRACCIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS
A cada muestra tras la homogenización se le añadieron 500µl de Trizol en una
campana de extracción de gases. Para que las muestras se disolvieran bien nos
ayudamos de un vortex, finalmente se incubaron en un bloque seco a 60°C durante
15min para completar la disolución de los ácidos nucleicos.
-Separación de fases
A continuación, también en la campana de
extracción de gases, se añadieron a cada
muestra 100µl de cloroformo y se mezclaron
hasta conseguir una solución homogénea. Tras
incubar las muestras 3min a temperatura
ambiente se centrifugaron durante 15min a 4°C
y 12.000rpm para conseguir la separación de
fases. La fase acuosa superior que contiene los
ácidos nucleícos (Figura 7) se transfirió a
nuevos tubos Eppendorf.
-Precipitación de los ácidos nucleícos
A los muestras se les añadieron 250µl de propanol y se mezclaron por inversión, tras
lo cual se incubaron 8min en hielo antes de centrifugarlas durante 10min a 4°C y
12.000rpm para conseguir la precipitación de los ácidos nucleicos.
-Lavado
Se retiró el sobrenadante y se añadieron 500µl de etanol al 75% en agua DEPC. Se
lavó el precipitado mezclando con el vortex. A continuación se volvieron a centrifugar
durante 6min a 4°C y 7.500rpm. Se retiró el sobrena dante y se dejaron secar las
muestras a temperatura ambiente durante 5min para eliminar los restos de etanol.
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-Redisolución
Finalmente cada muestra se redisolvió en 100µl de agua DEPC, y se incubaron
durante 10min a 60°C en un bloque seco, para la com pleta disolución.
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ANEXO II: PROTOCOLO LIMPIEZA DEL RNA
-Unión del RNA a la membrana de sílice
A cada dilución de RNA se le añadieron 350µl de buffer
RLT y 250µl de etanol absoluto obteniendo un volumen final
de 700µl. A continuación se traspasó este volumen a las
columnas proporcionadas en el kit que contienen una
membrana de sílice que retiene el RNA. Las columnas se
introdujeron en un tubo colector de 2ml y se centrifugaron a
10.000rpm durante 15s.
-Limpieza
Cada columna se traspasó a un nuevo tubo colector, se le
añadieron 500µl de buffer RPE y se centrifugó a 10.000rpm
durante 15s. Tras esto se le añadieron a cada columna 500µl
de etanol al 80% en H2O DEPC y se centrifugó a 10.000rpm
durante 2min.
A continuación se transfirió de nuevo el tubo colector y se
centrifugaron a 13.000rpm durante 5min para eliminar el
etanol residual.
-Elución
Para la redisolución del RNA ya limpio, cada columna se
transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5ml y se le añadieron 10µl
de agua libre de RNAsas. Las muestras se centrifugaron a
13.000rpm durante 1min de modo que los 10µl con el RNA
disuelto son recogidos en el tubo Eppendorf. Este paso se
repitió obteniendo de este modo 20µl de volumen final.�
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ANEXO III: PROTOCOLO SÍNTESIS DEL cDNA
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H2O DEPC 16,7µl x Nº de reacciones = µl H2O DEPC
Buffer RT 10µl x Nº de reacciones = µl buffer RT
dNTPs (20mM) 1,8µl x Nº de reacciones = µl dNTPs
Inhibidor de RNAsa 0,5µl x Nº de reacciones = µl inhibidor de
RNAsa
RT (transcriptasa reversa) (200u/µl) 1 µl x Nº de reacciones = µl RT
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ANEXO IV: PROTOCOLO DE PCR SEMICUANTITATIVA
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Las reacciones de amplificación se realizaron en una cabina de flujo vertical utilizando
material estéril para evitar contaminaciones.
Para realizar cada amplificación se utilizaron 2µl de muestra más 18µl de mix de
reacción para un volumen final de 20µl. Se utilizó el kit DNA polimerasa de Biotools
compuesto por:
• Buffer Taq (10x)
• MgCl2 50mM
• Taq polimerasa (5u/µl)
Las mezclas de reacción se realizaron siguiendo el siguiente esquema:
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H2O DEPC 13,66µl x Nº de reacciones = µl H2O DEPC
Buffer 2µl x Nº de reacciones = µl buffer
MgCl2 (50mM) 0,34µl x Nº de reacciones = µl MgCl2
dNTPs (20mM) 0,2µl x Nº de reacciones = µl dNTPs
De cada Cebador 0,8µl x Nº de reacciones = µl cada Cebador
TAQ (5u/µl) 0,2µl x Nº de reacciones = µl TAQ
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Para cada muestra, los 18µl de mix se mezclaron con 2µl de cDNA depositados
previamente en uno de los tubos de una tira de 8 tubos de 0,2ml. A continuación se
agregó una gota de aceite (Mineral Oil de Sigma).
Una vez preparadas las reacciones se realizó la amplificación en un termociclador
siguiendo el siguiente programa:
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Fase 1 1 ciclo 94ºC 2 min
94ºC 1 min
Fase 2 33 ciclos xºC 1 min
72ºC 1 min
Fase 3 1 ciclo 72ºC 10 min
Fase 4 1 ciclo 4ºC ------
- Fase 1: Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 2 min para la separación de las
hebras de DNA.
- Fase 2: La reacción en cadena de la DNA-Polimerasa se realiza en tres etapas que
constituyen un ciclo de amplificación que se repite 33 veces consecutivas. El ciclo consta:
• Desnaturalización del DNA a 94ºC durante 1min.
• Hibridación de las hebras simples de DNA de interés, con los cebadores durante
1min, a una temperatura que va a depender de la composición de bases, tamaño
de los cebadores.
• Etapa de elongación a 72ºC durante 1min, donde la DNA polimerasa sintetiza las
nuevas cadenas empleando como sustrato los dNTPs.
- Fase 3: Elongación de las hebras sintetizadas a 72ºC durante 10min.
- Fase 4: Mantenimiento de las muestras a 4ºC.
La visualización de los resultados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa
al 1,5% en tampón TBE 0,5x. Para la tinción de DNA se añadió el producto SYBR® DNA
gel stain al 0,1% (Invitrogen). La mezcla de las muestras (17µl) y el tampón de muestra
(3µl SB, glycerol (50%), bromophenol blue (0,25%) y Xylene cyanol (0,25%)) se realizó en
un papel Parafilm. Como marcador de peso molecular se utilizó el “100pb DNA Ladder”
de Invitrogen. Las condiciones de la electroforesis fueron 80V durante 1h y 40min. Para la
visualización del producto de amplificación se utilizó el GELDOC de BioRad y el
programa Quantity One 4.6.7.�
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ANEXO V: CEBADORES
-Colección Ax-Alb
Primers Código Secuencias Temperatura
AX-1-2 HV_CEb0002J23r2_s_at AACCCTTAAACTCCGGCAACGA
ACGAGGCCAAATCCTGCTGTT 58,7-59,2
AX-3-4 Contig2742_at ACCCTCGTCCTCAAATGCAA
ACCGCAACATGGAAACACCA 56,5-57,5
AX-5-6 Contig7944_at AAGGACATCTTCACGGCGAT
AAGAAGAAGGTGAGCGCGTA 56,2-56
AX-7-8 Contig12692_s_at ACATGGTGATGGACTACTGCGA
TACTACCATTGCTACGCCTACACG 57,8-58
AX-9-10 Contig10615_at CGCCATCCTCTTCGAGCACATA
TTCATCTCACTGTCGTGGCTTGT 58,8-58,3
AX-11-12 Contig9813_at TTCGGCAACGGCTTCTTCCA
AGTAACAACGCCACCGCAACTA 59,5-58,8
AX-13-14 Contig1800_at ACTTGACCCACAAGCTGAAGCA
TTGCCACGAGAAACGTCGATGA 59,0-58,7
AX-15-16 Contig4811_s_at TCAAGGAGGTTGGCGACATT
GTTGAACATTTCGGCGGTGA 55,9-56,5
AX-17-18 Contig2721_at ACAAGCTGAGCAAGCTGGAAGA
ACGACATGACACGGAAGCAGAA 58,8-58,6
AX-19-20 Contig418_at AAGACTGCGGCAAAGGCAAA
CCTCACCAAACTTGACGCCATT 57,8-58,0
AX-21-22 Contig5059_s_at ACAAGCTGGAGCCAATCGAGAA
TGGTTCACCGCCCATTTGATGT 58,6-59,4
AX-23-24 Contig14378_at TGTGGGAAAGGATGGACGAGTT
ACGTTGCTGTGCCTGTTGTT 57,8-58,1
AX-25-26 HV09F14u_at CCTGTGATACTTTCATGCCATCCG
CAACAAATCGGCTCAGTTGGGT 57,6-57,8
AX-27-28 Contig3221_at ACCTCGCCAAGCAGAAGAAA
TGTTTGCGTGCTGGATGTGA 57,4-56,7
AX-29-30 Contig828_s_at TCAAAGCATCCTCGCCATCT
TTGTTGACAGGGTCGGCAAT 57,0-56,3
AX-31-32 Contig19438_at AGCTCATCCGTCTGTGACAAGT
ACCAGGCGTACACGTTGAAG 58,0-57,3
AX-33-34 Contig13481_at CATTGCCACGCTGATGATGTTC
TCAATGGTGTAATGCCCTCTGC 56,7-57,3
AX-35-36 Contig2992_s_at ACGGCCATTTGGTTCTGGAT
AAGTTTCGCTGGGTGTAGCA 56,9-56,6
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AX-37-38 Contig9152_at GTCCAGGATGCCACGGACAA
GCAGGTTCAATGTTCAGACGGCAA 59,6-59,9
AX-39-40 Contig12724_at ATGTCCATTGCCTCGTTCCT
TGAACCTGACGAGTGGCTTA 55,5-56,3
-Colección QTL-Alb
Primers Código Secuencias Temperatura
QTL-1-2 Contig4499_s_at TCCAACCTCGGCAATCATGT
TGTGCATTAGGCTCCACCTT 56,6-56,3
QTL-3-4 Contig2515_at ACATTGCATCTGCGTCCAAGTG
ATTCATCCCTTCATCTCCGCCT 58-57,9
QTL-5-6 Contig7192_at TTGCACTCTGTAGCGGCAGTTT
ACTTTGGCGGCAGAATCCAGAA 59,1-59,1
QTL-7-8 Contig7090_s_at TTGGAAATGCCGCCAAGGTTGT
TGTTGCATTCAGCGCGTCTTCA 60,1-59,7
QTL-9-10 Contig2278_at TTAAGGGCATGGAGAAGGGCAT
TTGATGATCGCGGTGCTACACA 58,4-58,6
QTL-11-12 Contig6276_s_at AAAGCGACTGCCTCGTGAAA
AACTCCAGGGCTTGTTGCAT 57,0-51,1
QTL-13-14 Contig12110_s_at TGGGCATGTCTATGCGTGTT
ACCCGAAGCAGCAATTCACT 56,8-57,0
QTL-15-16 Contig4021_at TGTCTGCGACCAATGCTATCCA
TTCCTTTCGGTTACTGGGCCTT 58,3-58,4
QTL-17-18 Contig9559_at ATTAGCTGAGCGGTTGGGTT
AGCAGTTGCCTTGCTGAAGA 56,6-57,0
QTL-19-20 Contig4586_at ATGCTGGGCACTACATTCCT
AGGCAGCAAGGCAAGATACA 56,2-56,6
QTL-21-22 Contig4470_s_at TTAGGATTCGGGAGCTGGGTTT
AAACTGATGCCAACGCCCAT 58 -57,7
QTL-23-24 Contig6695_at TTCTCCAGGTGCCAACAACA
TCCTTCCATGCGTTCCTTCT 56,0-56,7
QTL-25-26 Contig11071_at ACGATGTCCAAGTCGTGCAA
GTGACAATTCGGCTGCAAGT 56,8-55,9
QTL-27-28 Contig8361_at TGGCAAAGGCAGTTGGCTACA
AGGCTGGCAGTTGCTTCACTT 59,5-59,5
QTL-29-30 SNP 6170-304 TTTGTTTGAGCGGGAGGCAT
ACGCCGTTGAACTTGACCTT 57,1-57,3
QTL-31-32 Contig6598_at TGATCTCACGGGCTTCATCA
TGTCGTAGTTGCCAAACCCA 56,6-55,7
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QTL-33-34 Contig9219_at ACGGCAGGCTTTGATTTGACGA
TCGTCTGTTTCCGCTAACTGGACT 59.4-59,6
-Colección Cl:
Primers Código Secuencias Temperatura
CL-1-2 Contig11738_at GATCACGGCGAGACAGATAGAA
TTTACTGGCCGCTATGGAGA 55,9-55,5
CL-3-4 Contig1314_s_at AAGTCCGACATCGTCATCGAG
ACACCTCAGCCATCAGGATT 56,3-55,9
CL-5-6 Contig13277_at ACGGTTGAAGCATCTGCGTGAT
AGTGGTGGCATCGTCTCTTTGA 59,2-58,2
CL-7-8 Contig14691_at TTGACACGGAGACGAGCAAT
ATCATCTTCGGCATCGTCCT 56,3-55,8
CL9-10 Contig14780_at TCGTGCAGACCAATCACCAA
TTAGGGTCGAACAGCGACTT 56,6-55,8
CL-11-12 Contig16148_at ACACACATACTGCCCACTCA
TTGGCATCAGGAGGAAGCAA 55,9-56,6
CL-13-14 Contig16389_at ACAGAAGAGCTGATGGCTGT
TTCATTGAGCTTGTCGCCCT 56,0-56,7
CL-15-16 Contig16595_at AGCTCGATGAAACCACGCTAGT
TCGGAGTTCAGGTTCTCTTGGA 58,2-57,3
CL-17-18 Contig17155_at TCACCGGCAACACAGTTGAGAA
TTGCCCAGGATCAGTTTCGGTT 58,8-58,9
Cl-19-20 Contig17319_at AAACATGATGCGGGCAGACGAT
AACGCAACCCAAGGCTGCTAAT 59,3-59,6
CL-21-22 Contig19088_at ATCCGCAAGACCAGCTACAAGA
AGCCGCTACTCAACAATCTCCA 58,1-58,1
CL-23-24 Contig2243_s_at ATCGGCAGCCATGAAGAGCA
TGAAGCCCTGAAGCGATCAGT 59,2-58,4
CL-25-26 Contig23344_at TGCAGCCAAACAAATCGGGAAC
AGCACACGGTGACTAGACTGAA 58,5-57,6
CL-27-28 Contig23926_at TTCTGAGGACGAGGGATGCAAT
TCTGTGTCAAATCCTCCGGCAA 57,9-58,5
CL-29-30 Contig24791_at AACGGAGAAATCGTCCAGCGATCA
TACAATGCAGCAAAGACGCCGA 60,1-59,3
CL-31-32 Contig24914_at CCCACCACAGAAGCAGATGAAT
AAGACCTCGACTGGTTTGGGTA 57,1-57,6
CL-33-34 Contig25153_at AGATCAAGCAGATCCGTGGTGA
AACGATGACGAACAGCGCAT 57,9-57,3
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CL-35-36 Contig26034_at GCAGTCGAACCTGAGACCATAA
ACAAGGGCATGTCGCAAAGA 56,4-57,2
CL-37-38 Contig4380_s_at TCCATGATGTGCTCCTACTCCT
GCTGCTTCTTGGTCTTGTGGTT 57,0-57,8
CL-39-40 Contig5004_at ATACGAGTCACTGTCCCACCAT
AACCTTGCTCAGCTCCTGTT 57,4-56,5
CL-41-42 Contig5708_at GCCTCCAAGGAAGGATCAGTTT
AGCCAACATAGGTGCCAGTT 56,8-56,6
CL-43-44 Contig6640_at AAACCGCCATTGAGGACAGTGA
TCTTCTAGCCGGTCCCTTTATGGT 58,8-59,1
CL-45-46 Contig6817_at TCAGCCATGTTTCTCGTGCCAA
TCATGTGCCGGTCAGACGTT 59,2-58,9
CL-47-48 Contig7509_at TGCCTTCAGCACAACCACTT
TGTTGTTTCGGTCTCCTGCT 57,2-56,3
CL-49-50 Contig8790_at AGATGGCTGACCCAATGCTT
AATGATGGTTTGGCGAGCGT 56,7-57,5
CL-51-52 Contig9121_at TATGCGTGAAAGCGGCCATT
TGCAGCCTTTGCCTTTGGTT 57,6-58,1
CL-53-54 Contig938_s_at TGGATCATCTCCGGCTTCTGCTAT
TTCGAGGCAGATTGGGCAAACA 59,4-59,3
CL-55-56 Contig9412_s_at ACCTGGGAATTGGGAAGATGGT
ACTGCCGTGTTCTTCAGCGA 58,2-59,1
CL-57-58 HVSMEb0007O01f_at TAAATTCCGTGGGTGGCGTA
AGGAATGAATGGCTCGGCTA 56,2-55,9
CL-59-60 HVSMEm0013I03r2_at TCCTCGTTCCTGAGCTTCGACAT
AACGCCAAGTTTGTGGACGTGA 59,7-59,4
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ANEXO VI: HOMOLOGÍAS Y ACRÓNIMOS
-Colección Ax-Alb
Acrónimo Primer Código Gen
PCL AX-1-2 HV_CEb0002J23r2_s_at Blue copper binding protein
TOM20 AX-3-4 Contig2742_at
Mitochondrial import receptor subunit
TOM20
PHT6 AX-5-6 Contig7944_at Phosphate transporter 6
GH16 AX-7-8 Contig12692_s_at
Xyloglucan
endotransglucosylase/hydrolase
Hv-ALB6 AX-9-10 Contig10615_at Predicted protein
EXO AX-11-12 Contig9813_at Phosphate-induced protein 1
PAL AX-13-14 Contig1800_at Phenylalanine ammonia-lyase
DYR AX-15-16 Contig4811_s_at Dehydration response related protein
PPIA AX-17-18 Contig2721_at Peptidyl-prolyl isomerase
WCAB-1 AX-19-20 Contig418_at Chlorophyll A-B binding protein
RNS AX-21-22 Contig5059_s_at Ribonuclease T2
RCC AX-23-24 Contig14378_at
Regulator of chromosome
condensation
JRL AX-25-26 HV09F14u_at
Jacalin-like lectin domain containing
protein
PSAN AX-27-28 Contig3221_at
Photosystem I reaction center subunit
N
WCAB-2 AX-29-30 Contig828_s_at Clorophyll A-B binding protein
FRO AX-31-32 Contig19438_at Ferric-Chelate reductase
Hv-ALB7 AX-33-34 Contig13481_at Phosphatidic acid phosphatase-related
CHIT AX-35-36 Contig2992_s_at Chitinase II
COR14b AX-37-38 Contig9152_at Cor14b protein
FLS AX-39-40 Contig12724_at
Flavonol synthase/flavanone 3-
hydroxylase
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-Colección QTL-Alb:
Acrónimo Primer Código Gen
TPR QTL-1-2 Contig4499_s_at Ubiquitin- ubiquitin ligase activity
HPR QTL-3-4 Contig2515_at
Erythronate-4-phosphate
dehydrogenase domain containing
protein, expressed
UPL QTL-5-6 Contig7192_at
Subfamily HECT-domain domain
containing protein
CPN60 QTL-7-8 Contig7090_s_at
RuBisCO large subunit-binding protein
subunit beta
FNR QTL-9-10 Contig2278_at Ferredoxin-NADP+ reductase
ABA7 QTL-11-12 Contig6276_s_at ABA-induced protein
ZOS3-23 QTL-13-14 Contig12110_s_at Zinc ion binding
ZIM QTL-15-16 Contig4021_at Zinc-finger protein
CAX QTL-17-18 Contig9559_at Sodium/calcium exchanger protein
SCP39 QTL-19-20 Contig4586_at Carboxypeptidase
INV QTL-21-22 Contig4470_s_at Beta-fructofuranosidase invertasa
MBL QTL-23-24 Contig6695_at Metallo-beta- lactamase
Hv-ALB5 QTL-25-26 Contig11071_at Expressed Protein
DDX QTL-27-28 Contig8361_at ATP-dependent RNA helicase activity
BAG QTL-29-30 SNP 6170-304 BAG domain-containing protein
NC QTL-31-32 Contig6598_at NC domain-containing protein
SCP46 QTL-33-34 Contig9219_at Serine carboxypeptidase 1 precursor
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-Colección Cl:
Acrónimo Primer Código Gen
RPS8 CL-1-2 Contig11738_at 50S ribosomal protein L16
Fd CL-3-4 Contig1314_s_at Ferrous iron binding (ferredoxina)
PTAC6 CL-5-6 Contig13277_at Plastid transcriptionally active 6
CRS1 CL-7-8 Contig14691_at
Chloroplastic group IIA intron splicing
facilitator CRS1
Hv-ALB2 CL9-10 Contig14780_at Photosystem II 11 kDa protein-related
ARC5 CL-11-12 Contig16148_at Dynamin family protein ARC5
SBE CL-13-14 Contig16389_at Starch Branching Enzyme
TAB CL-15-16 Contig16595_at psaB translation factor
EF-P CL-17-18 Contig17155_at Elongation factor P
CAF2 Cl-19-20 Contig17319_at
CRS2-associated factor 1, chloroplast
precursor
Hv-ALB3 CL-21-22 Contig19088_at
UDP-N- acetylglucosamine
diphosphorylase activity
BBI CL-23-24 Contig2243_s_at
BBTI11 - Bowman-Birk type bran
trypsin inhibitor precursor
PDE324 CL-25-26 Contig23344_at Plastid transcriptionally active 3
CHUP CL-27-28 Contig23926_at Motor activity, ATPase activity
DAL CL-29-30 Contig24791_at Differentiation and greening-like 1
NOS1 CL-31-32 Contig24914_at Nitric oxide synthase 1
RF CL-33-34 Contig25153_at Translation release factor
SRS CL-35-36
Contig26034_at Serine-tRNA ligase activity, ATP
binding
RPL28 CL-37-38 Contig4380_s_at Ribosomal protein L28 protein
RRF CL-39-40 Contig5004_at Ribosome recycling factor
PSRP4 CL-41-42 Contig5708_at 30S ribosomal protein S31
CRM CL-43-44 Contig6640_at
Chloroplastic group IIA intron splicing
facilitator CRS1
PSRP5 CL-45-46 Contig6817_at Plastid-specific 50S ribosomal protein 5
DAG CL-47-48 Contig7509_at DAG protein, chloroplast precursor
PK1B CL-49-50 Contig8790_at Protein kinase APK1B
PPT CL-51-52
Contig9121_at Pyrimidine nucleotide sugar
transmembrane transporter activity
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RHB1A CL-53-54 Contig938_s_at
RING, subfamily zinc finger (C3HC4-
type RING finger) family protein
RLUB CL-55-56 Contig9412_s_at Pseudouridine synthase family protein
PSBC CL-57-58 HVSMEb0007O01f_at
Photosystem II reaction center protein
C
SIG CL-59-60 HVSMEm0013I03r2_at RNA polymerase sigma factor
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ANEXO VII: RESULTADOS PCR SEMICUANTITATIVA
-Colección Ax-Alb
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-Colección QTL-Alb
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-Colección Cl:
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