AGUA DE COCO (Cocus nucifera), SUERO FETAL BOVINO, ALOE VERA Y
SUS COMBINACIONES PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO
POR:
I.A.P.P. WENCESLAO COSME REYES
Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de
Maestro en Ciencias
Área Mayor: Reproducción y Genética Animal
Universidad Autónoma de Chihuahua
Facultad de Zootecnia
Secretaría de Investigación y Posgrado
Chihuahua, Chih., México Junio de 2005
Agua de coco (Cocus nucifera), suero fetal bovino, aloe vera y sus combinaciones para la criopreservación de semen ovino. Tesis presentada por I.A.P.P. Wenceslao Cosme Reyes como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias, ha sido aprobada y aceptada por:
M.A. Javier Martínez Nevárez Director de la Facultad de Zootecnia Ph.D. Felipe Alonso Rodríguez Almeida Secretario de Investigación y Posgrado Ing. Francisco Javier Camarillo Acosta Coordinador Académico de Investigación y Posgrado Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete Presidente Fecha
Comité:
Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete M.C. Manuel Pérez Durán Ph.D. Jorge Alfonso Jiménez Castro M.C. Oscar Alejandro Viramontes Olivas
ii
AGRADECIMIENTOS
A Dios todopoderoso, por haberme permitido alcanzar una meta más en mi
vida.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por haberme
otorgado la beca para realizar estudios de posgrado.
A la Facultad de Zootecnia y a sus profesores por ser parte en mi formación
profesional.
A mi asesor el Ph.D. Jaime Gutiérrez Alderete, por su amistad, sus consejos y
asesoramiento para la realización de esta tesis.
En especial al M.C. Manuel Pérez Durán, quién me capacitó para poder realizar
el trabajo de laboratorio y además fue un gran apoyo para fortalecer mi
formación como profesionista.
A mi estadístico el Ph.D. Jorge Jiménez Castro y a M.C. Oscar A. Viramontes
Olivas, por las sugerencias y tiempo ofrecido en este proyecto.
A la empresa “Productos Biológicos del Pacífico” y “PAA Laboratorios, Inc.
División México,” por haber colaborado con la donación de suero fetal bovino
para la realización de esta investigación.
A mis amigos de Sonora (Carlos, Gil, Manuel, Rodolfo, Jahzeel), y paisanos
(Emmanuel, Alberto, Abad y Gamboa). A mis compañeros de la casa: Juan
Carlos Cortés, J. C. Galicia, Martín, Lety, Araceli y el charolito. Finalmente a:
Monika, Conchy, F. Serrano, Ramón, Dalia, Muro, Adriana, Elena, Coralia,
Everardo, Alfonso, José Manuel, Melchor, Tere, Nacho, Berta, Griss, Melissa y
Raquel, por haber compartido conmigo esta inolvidable aventura.
DEDICATORIAS
A mi mamá Leticia, por ser alguien muy importante en mi vida, que sin su
apoyo, no hubiera llegado a ser un profesionista.
A mi papá Carlos, por sus consejos y enseñanzas, además de ser ejemplo a
seguir.
A mis hermanos: Guadalupe, Carlos y Astrid, por ser parte de esta gran familia;
por su incondicional apoyo y por el cariño que me han mostrado.
A mis abuelitos Wenceslao y Guadalupe que aunque ya no estén conmigo, se
que siempre están pendientes de mi.
A mis abuelitos Primo y María Elena, por quererme mucho y estar pendientes
en mi formación.
A todos mis tíos, especialmente a mi tía Laura y Mary, por todo su apoyo desde
el momento que estuve fuera de la casa, a mis primos y sobrinos por sus
consejos y apoyo en el momento que más lo he necesitado.
A dos grandes profesores de la licenciatura, Lic. Andrés D. Rubio López y M.C.
José Luis Espino Martínez, por seguir siendo mis grandes amigos y por todos
sus consejos.
A MI MUNICIPIO ZONGOLICA, VERACRUZ.
CURRÍCULUM VITAE
El autor de este trabajo nació el 26 de noviembre de 1977 en la ciudad de
Orizaba, Veracruz.
1998 - 2003 Estudios en el Tecnológico Agropecuario No.
18 de Ursulo Galván, obteniendo el título de
Ingeniero Agrónomo en Producción
Pecuaria.
2003 - 2005 Estudiante graduado de la Secretaría de
Investigación y Posgrado de la Facultad de
Zootecnia, de la Universidad Autónoma de
Chihuahua.
RESUMEN
AGUA DE COCO (Cocus nucifera), SUERO FETAL BOVINO, ALOE VERA Y
SUS COMBINACIONES PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO
Por:
I.A.P.P. WENCESLAO COSME REYES
Maestría en Ciencias
Secretaría de Investigación y Posgrado
Facultad de Zootecnia
Universidad Autónoma de Chihuahua
Presidente: Ph. D. Jaime Gutiérrez Alderete
La crioprerservación de células espermáticas permite conservar y disponer de
material genético por largos periodos de tiempo. El objetivo fue evaluar agua de
coco y su combinación con un diluyente no convencional: suero fetal bovino o
aloe vera (Aloe barbadensis, Miller), para la criopreservación de semen ovino a
largo plazo. El estudio se realizó durante los meses de octubre y noviembre de
2004 con un ovino raza Blackbelly y un total de ocho eyaculados, los cuales
fueron divididos para trabajar dos diluyentes por sesión. Se empleó 50 % de
agua de coco (AC) y 50 % de citrato de sodio al 2.9 % en combinación con
suero fetal bovino (SFB) o aloe vera (AV). Dichos diluyentes tenían
concentraciones y combinaciones desde 10 a 70 %. En total se probaron 14
diluyentes y un testigo (80-0). Se evaluó motilidad progresiva (MP) y
espermatozoides vivos (EV) en cinco periodos: al diluir el semen a 35 ºC,
finalizado el tiempo de equilibramiento, concluido el proceso de congelamiento,
48 h y 90 d poscongelamiento. El análisis de las variables MP y EV se realizó
con un modelo de regresión múltiple con intercepto igual a cero. La mayoría de
las combinaciones estuvieron dentro de los rangos aceptables, obteniendo
valores iguales o superiores al tratamiento testigo de 40 % MP, sin embargo los
diluyentes 10-70 SFB y 40-40 AV fueron mejores a los 90 d poscongelamiento
con 60 % de MP. En el otro extremo los tratamientos 20-60 AV y 10-70 AV no
cumplieron con los estándares mínimos establecidos para semen descongelado
debido a que obtuvieron 30 y 20 % de MP respectivamente, en los diferentes
tiempos de evaluación. Se concluye, que las diferentes combinaciones de AC
con el diluyente no convencional SFB, ofrecieron mejores medios apropiados
para la dilución y preservación de semen en comparación con el diluyente no
convencional AV, cuando dichas concentraciones excedían 50 % de dicho gel.
ABSTRACT
COCONUT MILK (cocus nucifera), BOVINE FETAL SERUM ALOE VERA
AND THEIR COMBINATIONS FOR THE CRIOPRESERVATION
OF OVINE SEMEN
The cryopreservation of sperm cells help us to keep and use genetic
resources for long time. The objetive was to evaluate the coconut milk and
two no conventional extenders: bovine fetal serum or aloe vera (Aloe
barbadensis, Miller), and some combinations among then Blacbelly ram
semen. This work was carried out on october and November, 2004 a
Blackbelly ram. The samples were divided for working two kind of
extenders on different time prefreezing and postfreezing. It were used 50
% of coconut milk and 50 % of sodium citrate (2.9 %). The extenders had
concentrations and combinations from 10 to 70 %, finally were divided to
prove 14 diluents and a control treatment (80-0). The progresive motility
and live sperms were evaluated on five different periods: at mixing semen
at 35 ºC, ending the equilibrium time and after freezing: 48 h and 90 d.
The data analysis was done with a multiple regression model. Most of the
combinations behad according to standard parametres, with equal or
higher values than 40 % of MP. Howerever the extanders 10-70 SFB and
40-40 AV were the best diluents at 90 d postfreezing with 60 % of MP. On
the other hand the treatments 20-60 AV and 10-70 AV were better than
the standard values for unfreezing semen on different time of evaluation.
We conclude that different combinations of coconut milk with a no
conventional diluent gave better results of semen dilution and
preservation as they are compared with the AV extender when those
concentrations were higher than 50 % of AV gel.
CONTENIDO Página
RESUMEN ………………………………………………………………………. vi
ABSTRACT ……………………………………………………………………… viii
LISTA DE CUADROS …………………………………………………………. xiii
LISTA DE GRÁFICAS …………………………………………….…………… xiv
LISTA DE CUADROS DEL APÉNDICE …………………………………….. xv
INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………….. 1
REVISIÓN DE LITERATURA …………………………………………………. 3
Tecnología del Semen ………………………………………………. 3
Factores de Variación en la Producción Espermática ……………. 3
Edad del macho ………………………………………………… 3
Tamaño de los testículos ……………………………………… 3
Efectos alimentarios …………………………………………… 4
Efectos estacionarios ………………………………………….. 4
Recolección del Semen ……………………………………………… 5
Vagina artificial ………………………………………………….. 5
Electroeyaculación ……………………………………………… 6
Semen y sus Características ………………………………………… 6
Evaluación de la Calidad Seminal …………………………………... 7
Volumen …………………………………………………………. 7
Color ……………………………………………………………… 8
Consistencia …………………………………………………….. 8
Concentración …………………………………………………… 8
Motilidad …………………………………………………………. 9
Motilidad masal ………………………………………………….. 9
Motilidad progresiva …………………………………………….. 9
Morfología de los espermatozoides …………………………... 9
Diluyentes ……………………………………………………………… 10
Regulación de pH ……………………………………………….. 10
Protección contra el choque térmico ………………………….. 11
Sustancias crioprotectoras …………………………………….. 11
Fuentes de energía ……………………………………………... 12
Antibióticos ………………………………………………………. 12
Dilución del Semen …………………………………………………… 13
Diluyentes Convencionales ………………………………………….. 13
Diluyentes no Convencionales ………………………………………. 14
Aloe vera ………………………………………………………….. 14
Suero fetal bovino ……………………………………………….. 14
Agua de coco …………………………………………………….. 15
Glicerado y Equilibramiento …………………………………………. 16
Congelamiento, Envasado y Almacenamiento del Semen ………. 17
MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………………………….. 19
Descripción del Área de Estudio …………………………………….. 19
Descripción de la Población ………………………………………….. 19
Diluyentes ………………………………………………………………. 19
Preparación de Diluyentes ……………………………………………. 21
Citrato de sodio ………………………………………………….. 21
Agua de coco ……………………………………………………. 21
Suero fetal bovino ……………….………………………………. 21
Aloe vera ………………………………………………………….. 21
Recolección del Semen ………………………………………………. 21
Evaluación del Semen ………………………………………………… 22
Dilución del Semen ……………………………………………………. 23
Enfriamiento del Semen ………………………………………………. 23
Segunda Dilución o Gliceración ……………………………………… 23
Envasado y Congelamiento ………………………………………….. 24
Descongelamiento …………………………………………………….. 24
Variables a Medir ………………………………………………………. 24
Análisis Estadístico de la Información ………………………………. 25
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ………………………………………………... 26
Fase de Dilución P0 …………………………………………………… 29
Finalizado el Tiempo de Equilibramiento (P1) ……………………… 32
Concluido el Proceso de Congelamiento (P2) ……………………… 33
Cuarenta y Ocho Horas Poscongelamiento (P3) ............................ 35
Noventa Días Poscongelamiento …………………..………………… 38
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ……………………………….. 43
LITERATURA CITADA ……………………………………………………….. 45
APÉNDICE ………………………………………………………………………. 50
LISTA DE CUADROS
Cuadro Página
1 DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS (Trat.) CON
BASE EN AGUA DE COCO (AC) EN COMBINACION CON
DILUYENTES NO CONVENCIONALES: SUERO FETAL
BOVINO (SFB) O ALOE VERA (AV) …………………………..
20
2 PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y
ESPERMATOZOIDES VIVOS EN CINCO PERIODOS DE
EVALUACIÓN……………………………………………………..
27
3 VALORES DE pH MEDIDOS Y CORREGIDOS AL
MOMENTO DE PREPARAR LOS DILUYENTES ……………
28
LISTA DE GRÁFICAS
Gráfica Página
1 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de suero fetal bovino en el P0…………………...…………...
30
2 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de aloe vera en el P0……………………...…………………..
31
3 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de suero fetal bovino en el P3…………………...…………...
36
4 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de aloe vera en el P3 .………………….……………………..
37
5 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de suero fetal bovino en el P4 …………………..…………...
40
6 Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un
modelo de regresión con diferentes niveles de agua de
coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones
de aloe vera en el P4………………………………………….
42
LISTA DE CUADROS DEL APÉNDICE
Anexo Página
1 SISTEMA DE VALORACIÓN DE MOTILIDAD MASAL …….. 51
2 COMPOSICIÓN DEL AGUA DE COCO DE UN FRUTO DE
SEIS MESES DE MADURACIÓN ..........................................
52
1
INTRODUCCIÓN
El procesamiento de semen es una técnica que permite criopreservar y
disponer de células espermáticas por largos periodos de tiempo y con ello
preservar recursos genéticos, dado que tiene muchas aplicaciones, tanto en
biotecnología, como en la conservación de la especie y la medicina clínica
(Yoshida, 2000). Sin embargo, los intentos de diluir y almacenar el semen de
carnero han tenido un éxito limitado, a pesar de que la motilidad de los
espermatozoides puede mantenerse después de 24 h de almacenamiento, pero
disminuye la fertilidad al momento de la inseminación artificial (Córdoba et al.,
1989) debido a la susceptibilidad que presentan los espermatozoides de ovino
al proceso de criopreservación. Esta bien documentado que la población
sobreviviente al descongelamiento, se caracteriza por una pérdida de viabilidad
y un menor número de células móviles (Watson, 2000). Diversas sustancias se
han utilizado como diluyentes en la tecnología del semen ovino buscando
minimizar los efectos negativos, pero aún con las mejores técnicas y todos los
desarrollos en estos años la mejor recuperación de la célula después del
descongelamiento es apenas 50 % (Vishwanath y Shannon, 2000).
Nunes y Fernández (2001) encontraron resultados satisfactorios
utilizando 50 % de agua de coco y 50 % de citrato de sodio al 2.5 % en la
criopreservación de semen ovino, mientras que Rodríguez (1988) observó
excelentes resultados con la combinación de 40 % de gel de aloe vera y 54 %
de citrato de sodio al 3 %. En otro estudio, Madrid (2004) encontró el mejor
tratamiento cuando combinó suero fetal bovino al 30 % y 10 % de yema de
Huevo con una solución amortiguadora de 60 % de citrato de sodio al 2.9 %.
2
Teniendo conocimiento, respecto a los diluyentes antes mencionados, se
consideró que sus combinaciones podrían dar como resultado un protocolo
eficiente para el congelamiento de semen.
El objetivo fue evaluar agua de coco y diferentes combinaciones con
diluyentes no convencionales: suero fetal bovino o aloe vera, para la
criopreservación de semen ovino a largo plazo. Se pretende encontrar los
mejores niveles de estos extensores seminales, que ofrezcan las condiciones
necesarias para su preservación en buena calidad posdescongelamiento, y así
conservar el potencial genético de un buen semental y por consecuencia un
más rápido avance genético.
3
REVISIÓN DE LITERATURA
Tecnología del Semen
El semen puede ser procesado de diferentes maneras, pudiendo ser
usado: fresco (puro o diluido); refrigerado y congelado. El semen fresco y el
refrigerado presentan fertilidad más elevada. El congelado se preserva por un
período de tiempo indefinido si es mantenido en nitrógeno líquido a -196 ºC y es
de mayor aplicabilidad, comparado al semen refrigerado a 4 ºC, cuya viabilidad
máxima es de 48 h. Producto de la eyaculación normal de un reproductor, el
semen es compuesto de espermatozoides producidos en los testículos y una
fracción líquida producida por las glándulas sexuales accesorias (Nunes y
Fernández, 2001).
Factores de Variación en la Producción Espermática
Edad del macho. En el ovino la pubertad se asocia a un notable incremento en
la secreción de testosterona, la espermatogénesis y conducta de apareamiento.
El tamaño testicular aumenta cuando los corderos tienen de 8 a 10 semanas de
edad y peso corporal de 16 a 20 kg. Esto coincide con la aparición de
espermatocitos primarios y el crecimiento de los túbulos seminíferos, la cópula
con eyaculacion de espermatozoides viables ocurre entre los 4 y 6 meses de
edad, con un peso corporal de 40 a 60 % del equivalente al peso de un animal
maduro (Jainudeen et al., 2002).
Tamaño de los testículos. Algunos autores han observado mayor producción
de semen en relación a un tamaño mayor de los testículos. Los testículos
pequeños son casi siempre índice de infertilidad (Agraz, 1984). El tamaño de
los testículos ha demostrado ser un buen indicador de la capacidad
4
espermatogénica de un semental, como lo atestiguan numerosos trabajos
realizados en diferentes especies, principalmente la bovina. La medida más
práctica para evaluar el tamaño de los testículos es la circunferencia escrotal, la
cuál tiene una alta correlación con el peso y el volumen. A su vez, el peso
testicular está en función directa con la cantidad de tejido parenquimático
productor de esperma y, por lo tanto, con el volumen y la concentración
espermática del eyaculado (De la Vega et al., 2001).
Efectos alimentarios. La mala nutrición de los machos provoca una
disminución en la capacidad espermatogénica, especialmente durante la fase
de crecimiento. Por el contrario, una alimentación excesiva, produce un
descenso en la calidad del semen y una reducción en la líbido (Ramírez y Miller,
2004). Thwaites (1995) menciona que la desnutrición causa una progresiva
disminución del tono y volumen testicular, además indica que se observa un
aparente efecto de la frecuencia de eyaculados sobre el volumen testicular y
calidad seminal, ocasionando un estado de agotamiento y desnutrición del
macho, al ser sobre explotado en períodos cortos y sometidos a una
alimentación inadecuada.
Efectos estacionarios. Los pequeños rumiantes presentan, como sus
ancestros salvajes, un período de reposo sexual estacional de duración e
intensidad variable entre razas. Ambos sexos tienen una actividad sexual
disminuida en primavera y verano y máxima en otoño e invierno. Esta
estacionalidad resulta de una combinación, aún mal conocida, entre un ritmo
endógeno circanual y la interpretación por el sistema nervioso central de la
duración de la noche, vía la secreción de melatonina de origen pineal.
5
(Chemineau et al., 2003). Sin embargo Agraz (1984) menciona que el volumen
y la movilidad del semen aumentan durante el verano y el otoño, que son las
temporadas de reproducción habituales y que la recolección de semen es
posible todo el año, sin embargo, la concentración y calidad del semen
recolectado presenta importantes variaciones estacionales.
Recolección del Semen
La recogida del eyaculado deberá de efectuarse en las mejores
condiciones tanto para el semental como para el operador (Villena, 2002). Cada
eyaculación depende de varios factores tales como la frecuencia de las
eyaculaciones, edad del semental, tamaño de los testículos y el número de
eyaculaciones en el día de la recolección. Cada semana se recolecta semen de
un máximo de seis eyaculados por semental, con intervalos entre montas de 2 a
3 d (ABS, 1986). En el caso del carnero, la recolección de semen se realiza por
medio de dos métodos: vagina artificial y electroeyaculación (Evans y Maxwell,
1990).
Vagina artificial. Existe una correlación positiva entre estimulación sexual y
calidad de semen en cuanto a motilidad progresiva y volumen, es por ello que
es indispensable estimular correctamente a un semental dándole una o dos
montas falsas (Saacke, 1982). Finalmente se le expone la vagina artificial,
método más fidedigno en lo que respecta a la calidad de la muestra (Zemjanis,
1996) ya que simula las condiciones de presión y temperatura de las vaginas
naturales, constituida por un tubo de PVC rígido, un tubo elástico de hule y una
válvula por donde debe pasar el agua a 40 °C. En la extremidad de la vagina se
acopla un tubo colector graduado en décimas de ml, siendo el acto de
6
recolectar el semen un método simple, donde se asegura la hembra en celo
natural o inducido, presentándola al macho. Cuando este efectúa el salto se
asegura el prepucio con la mano, desviando el pene para dentro de la vagina
artificial. La eyaculación es instantánea. El material recolectado debe ser
protegido de la luz solar directa, del polvo, de la agitación y de cambios bruscos
de temperatura (Nunes y Fernández, 2001).
Electroeyaculación. El borrego responde a un menor voltaje y también
responde más rápidamente si le compara con el toro (Bearden y Fuquay, 1982).
El proceso de emisión está controlado por los nervios simpáticos lumbares
(hipogástrico), localizados en la parte anterior de la pelvis, mientras que los
nervios que provocan la erección y eyaculación están localizados
posteriormente y se originan en los nervios sacros, dependientes del pudendo
interno (Durán, 1980). La ventaja de la electroeyaculación radica en la
capacidad de recolectar semen sin que el macho experimente una respuesta
sexual por lo que no se necesita que una hembra esté en celo (Sorensen,
1986). Para la recolección de semen el electrodo se humedece o se lubrica con
vaselina y se inserta en el recto, procurando no lesionar la mucosa, un
ayudante debe sostenerlo presionando hacia el suelo de la pelvis. Luego se
aplican cortos estímulos (3 a 8 seg) a intervalos de 15 a 20 seg, después de
unos cuantos estímulos, fluirá la secreción de las glándulas accesorias y luego
el semen (Evans y Maxwell, 1990).
Semen y sus Características
El semen es el líquido generativo del macho ya que contiene los gametos
masculinos (espermatozoides), se deposita en la vagina de la hembra durante
7
la cópula o puede recogerse por medios artificiales para su estudio,
almacenamiento y/o uso en inseminación artificial. El semen lo forman dos
principales constituyentes: el plasma seminal y los espermatozoides. Las
principales sustancias orgánicas presentes en el semen de carnero son
fructosa, sorbitol, inositol, ácido cítrico, glicerilfosforilcolina, fosfolípidos,
prostaglandinas y proteínas. La fructosa es el azúcar más fácilmente
metabolizable y proporciona la mayor fuente de energía a los espermatozoides
del semen (Evans y Maxwell, 1990).
Evaluación de la Calidad Seminal
El método estándar para evaluar la fertilidad de machos reproductores,
aparte de la evaluación directa de su capacidad para causar preñez, es el
examen de semen (Ax et al., 2002) por lo que Villena (2002) menciona que las
pruebas de valoración del semen se agrupan en tres tipos de exámenes:
macroscópicas (volumen, color, consistencia, viscosidad, peso específico);
microscópicas (motilidad, concentración, formas anormales) y bioquímicas (pH
y pruebas metabólicas).
Volumen. El volumen se mide en forma directa dentro de un tubo de
recolección (Sorensen, 1986) y varía de .5 a 2 ml (Nunes y Fernández, 2001),
correspondiendo 74 % del mismo a líquido seminal y 26 % restante a
espermatozoides (Durán, 1980). Las variaciones en el volumen de semen
obedecen principalmente a factores como edad y condición del animal,
frecuencia de recolección y destreza del operario (Evans y Maxwell, 1990;
Villena, 2002) además incluye estado fisiológico del macho, raza, factores
higiénicos y alimentarios.
8
Color. Debe ser blanco en ovinos, desechándose el semen con coloración
rojiza o color chocolate, indicando presencia de sangre o pus, respectivamente.
Su aspecto varía de lechoso a cremoso, despreciándose el semen acuoso o
turbio, indicativo de un pequeño número de espermatozoides (Nunes y
Fernández, 2001).
Consistencia. El semen completo tal como es eyaculado, es un líquido denso,
cremoso, con la coloración propia de cada especie y consiste en una
suspensión de espermatozoides en el plasma seminal. A medida que se
suceden los saltos en una misma jornada, el semen se hace más claro por
disminución de la concentración de espermatozoides. El semen de carnero es
de consistencia lechosa o lactocremosa y coloración blanquecina. La tonalidad
amarillenta que pude aparecer se debe a la presencia de un derivado de la
riboflavina (Villena, 2002).
Concentración. Determinada en el microscopio o a través de
espectofotometría y significa la cantidad de espermatozoides en cada ml de
semen, la concentración media en carneros es de 3,500 a 4,000 mill
espermatozoides por ml (Nunes y Fernández, 2001). Por otra parte Villena
(2002) menciona que la producción espermática testicular diaria en el ovino es
de 10,900 mill de espermatozoides, en otra investigación, De Alba (1985)
demostró que 1 g de tejido testicular de carnero es capaz de manufacturar un
promedio de 12,200 mill de espermatozoides por día o sea 8,472
espermatozoides por minuto, de donde se deduce que a mayor volumen
testicular, corresponderá también mayor producción de espermatozoides.
Sorensen (1986) menciona que es necesario determinar el número de
9
espermatozoides por unidad de volumen, ya que esto multiplicado por el
volumen, permite conocer el número total de espermatozoides por eyaculado.
Motilidad. La motilidad se valora mediante el porcentaje de células móviles o
vivas. Dichas células pueden moverse en cualquier dirección sin importar la
velocidad con la que lo hagan (Sorensen, 1986). Sin embargo Evans y Maxwell
(1990) mencionan que existen varios parámetros de motilidad entre los que se
incluyen motilidad masal (M M) y motilidad progresiva (M P).
Motilidad masal. La estimación de motilidad de los espermatozoides se hace
sobre la base del vigor o potencia de la onda según sí está presente o no dicho
movimiento, y con una escala de 0 a 5 (Evans y Maxwell, 1990), la cual se
muestra en el Anexo 1.
La motilidad progresiva. Se define como la capacidad con que el
espermatozoide se mueve hacia delante y en línea recta y se determina al
examinar una gota de semen diluida hasta el grado en que se observen las
células de manera individual (Evans y Maxwell, 1990).
Morfología de los espermatozoides. Se realiza mediante preparaciones
coloreadas las cuales se observan a grandes aumentos las anomalías
morfológicas que pueden afectar aislada o simultáneamente a la cabeza, cuello,
pieza intermedia y cola del espermatozoide (Villena, 2002). El examen
morfológico del semen es una prueba de control de calidad. Cada eyaculado
contiene una serie de espermatozoides anormales, pero si la proporción de
éstos es muy alta entonces nos encontraremos ante un semen de baja fertilidad
(Evans y Maxwell, 1990). Nunes y Fernández (2001) mencionan que la
proporción de espermatozoides patológicos (sin cola, con doble cola, con doble
10
cabeza) dentro de la población espermática, no debe sobrepasar 15 %, y las
muestras que presenten estas características no se deben de utilizar para
congelar o para inseminar.
Diluyentes
Los diluyentes utilizados para la preservación de semen de carnero,
como de otras especies, generalmente deben tener un pH y capacidad
amortiguadora adecuados, osmolaridad apropiada y además deben proteger a
los espermatozoides contra el daño criogénico (Salamon y Maxwell, 2000) por
otra parte Bearden y Fuquay (1982) hacen mención que un buen diluyente no
únicamente tiene que incrementar el volumen de un eyaculado, si no que tiene
que proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento y prolongar su vida.
Hafez (2002) incluye otras funciones de un buen diluyente: proporcionar
nutrimentos como una fuente de energía, proteger contra el efecto nocivo del
enfriamiento rápido, inhibir la proliferación bacteriana. Por último Nunes y
Fernández (2001) menciona que debe ser de bajo costo y de fácil preparación.
Regulación del pH. La glucólisis está considerada como la principal fuente de
energía de los espermatozoides, tanto en el medio aerobio como anaerobio.
Los eyaculados de alta concentración espermática y ricos en fructosa
disminuyen rápidamente su pH debido a una acumulación de ácido láctico como
consecuencia de la fructolísis (utilización de la fructosa disponible como medio
de obtener energía para el movimiento, generándose además ácido láctico
como producto de desecho) Villena (2002). El pH óptimo de los diluyentes es lo
más cercano posible a 7 (Evans y Maxwell, 1990), aunque valores de pH de 6.5
a 7.5 son bien tolerados por los espermatozoides (Salamon y Maxwell, 2000).
11
Sorensen (1986) menciona que el amortiguador de uso común es el citrato de
sodio, y que se adiciona con la finalidad de neutralizar los productos de
desecho del metabolismo espermático, principalmente del ácido láctico.
Vishwanath y Shannon (2000) mencionan, que el citrato de sodio es una sal de
elección, dadas sus propiedades quelantes de mejorar la solubilidad de la
fracción proteica de la yema de huevo.
Protección contra el choque térmico. La yema de huevo es un componente
común en los diluyentes de semen ya que protege los espermatozoides contra
el choque frío, protegiéndolos durante el congelamiento y descongelamiento
(Salamon y Maxwell, 2000) por ello, es común utilizarla en los diluyentes para
congelamiento de semen de los animales domésticos (Holt, 2000). Por otra
parte (Salamon y Maxwell, 2000) recomiendan que la cantidad a agregar de
yema de huevo a un diluyente, depende de la composición del mismo y varía
desde un 4 hasta un 20 %. Para corroborar lo anterior Gil et al. (2003)
realizaron estudios con diversas concentraciones de yema de huevo (5, 10, 15 y
20 %) y en donde no encontraron efecto positivo significativo al aumentar la
concentración de yema de huevo encima de 10 % al descongelamiento del
semen.
Sustancias crioprotectoras. Holt (2000) hace mención que Polge y Rowson
en 1952 experimentaron con éxito las propiedades de glicerol, permitiéndole
actuar como sustancia protectora para las células que son sometidas a
congelamiento profundo. Dicho descubrimiento abrió la posibilidad de conservar
semen congelado a muy bajas temperaturas por periodos de tiempo
prácticamente indefinidos, por lo que Hafez (2002) menciona que se usa casi
12
universalmente como agente crioprotector para congelar semen. Las cantidades
y métodos para añadirlo varían, dependiendo de los diluyentes, métodos de
congelamiento y especie. Por lo general, se añade glicerol al semen después
de enfriarlo a 5 ºC; sin embargo, proporciona mayor protección cuando se le
agrega inmediatamente antes de congelar. Por otra parte Salamon y Maxwell
(2000) señalan que la concentración óptima del glicerol está dentro de la gama
de 6 a 8 % para el semen congelado por el método convencional lento. Bearden
y Fuquay (1982) indican que el glicerol se une al agua disminuyendo así el
punto de congelación de las soluciones, se forma menos hielo en su presencia
a cualquier temperatura. La concentración de solutos disminuye en forma
correspondiente. El glicerol deshidrata parcialmente a los espermatozoides,
reduciendo aún más la selectividad de la congelación de agua.
Fuentes de energía. Los espermatozoides poseen la capacidad de utilizar
sustancias de su medio ambiente inmediato para la producción de energía
(Rodríguez, 1988) por lo que son capaces de utilizar azúcares simples como
glucosa, fructosa y manosa (De Alba, 1985). La fructosa es el azúcar más
utilizado y recomendable como fuente energética en los diluyentes para semen
de carnero fresco o congelado (Salamon y Maxwell, 2000).
Antibióticos. Los antibióticos se agregan con la finalidad de prevenir la
proliferación microbiana (Evans y Maxwell, 1990) destruir los organismos
patógenos o al menos reducir el número (Yoshida, 2000) y en cierto grado,
prevenir la diseminación de enfermedades (Wiemer y Ruttle, 1987) la
combinación de penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina 1 mg/ml es un
ingrediente estándar en los diluyentes utilizados para semen en rumiantes
13
(Asher et al., 2000 y Salamon y Maxwell, 2000).
Dilución del Semen
El semen se diluye a una proporción específica, de modo que el volumen
contenga suficientes espermatozoides para lograr una fertilidad elevada sin
desperdicio de muchas células. Las tasas de dilución son más altas para semen
no congelado que para el congelado (Hafez, 2002) en donde los distintos
componentes del plasma seminal permiten mantener activos a los
espermatozoides de un eyaculado durante un período de tiempo relativamente
corto (Villena, 2002). El semen se diluye para proteger a los espermatozoides
durante el enfriamiento, congelamiento y descongelamiento (Salamon y
Maxwell, 2000). De Alba (1985) menciona que los eyaculados normales del
carnero adulto oscilan en total de espermatozoides entre 3 - 5 X 109. Esto
solamente permitiría una dilución por eyaculado de 1:12 a 1:20 para
inseminación con semen fresco o refrigerado. Nunes Y Fernández (2001)
recomiendan diluciones para semen congelado 1:9.
Diluyentes Convencionales
En La práctica habitual de congelamiento de semen ovino se ha optado
en general por el diluyente de Salamon modificado por Evans y Maxwell, que
está compuesto por tris - yema, ácido cítrico, glucosa, glicerol, yema de huevo y
agua destilada (Mareco et al., 2004). La composición del diluyente tris – yema
es la siguiente: 3.63 g de tris (hidroximetil) aminometano, 0.50 g de fructosa,
1.99 g de ácido cítrico, 14 ml de yema de huevo, 100 000 UI de penicilina, 100
mg de estreptomicina y 100 ml de agua destilada (Salamon y Maxwell, 2000).
Los productos que se utilicen para su preparación deberán ser
14
químicamente puros y disueltos en agua destilada. El diluyente con base en
citrato–yema es el que se utiliza con más frecuencia en el mundo entero; tiene
la ventaja de ser simple, práctico y poco costoso. El citrato sódico tiene la
ventaja de procurar al espermatozoide un sistema tampón que estabiliza la
reacción del medio e impide una acidificación demasiada rápida, perjudicial
para la calidad del diluyente. La solución de citrato sódico puede ser
conservada durante 15 d en refrigeración y la adición de yema de huevo se
hace en el momento de la dilución (Derivaux, 1961). La composición del
diluyente citrato de sodio como es utilizado actualmente: 2.37 g de citrato de
sodio, 0.50 g de glucosa, 15 ml de yema de huevo, 100 000 UI de penicilina,
100 mg de estreptomicina y 100 ml de agua destilada (Salamon y Maxwell,
2000).
Diluyentes no Convencionales
Aloe vera. Se ha propuesto que el gel aloe vera (Aloe barbadensis, Miller)
promueve los procesos de cicatrización y regeneración celular, emoliente,
antiinflamatorio, regenerador de tejidos, antibiótico, laxante y hasta inductor del
estro y ovulación (Rodríguez 1988 y Jiménez et al., 1995). Rodríguez (1988)
mostró que 40 % de gel de aloe vera en combinación con 54 % de citrato de
sodio al 3 %, obtuvo 49.5 % de motilidad progresiva al descongelamiento y
tasas satisfactorias de fertilidad con inseminación intrauterina, situándolo como
un buen diluyente para semen ovino.
Suero fetal bovino. Parks et al. (1976) demostraron las propiedades del suero
sanguíneo al ser agregado en los diluyentes para proteger a los
espermatozoides contra el choque térmico, en otros estudios Chandler et al.
15
(1976) mencionan que la presencia de suero sanguíneo en cantidades de 20 %
(v/v) en el diluyente incrementa el metabolismo y las tasas de consumo de
oxígeno, con la consecuente producción de ácido láctico e incremento en las
condiciones de anaerobiosis y cambios en las características iónicas del medio,
lo que al parecer es responsable de la aglutinación característica. En recientes
estudios Madrid (2004) encontró los mejores tratamientos con base en suero
fetal bovino (SFB) con 10 % de yema de huevo en congelamiento profundo, ya
que obtuvo 65 % de motilidad progresiva (MP) y 70 % de espermatozoides
vivos (EV) en 90 d poscongelamiento.
Agua de coco. Desde que se comprobó que el agua de coco es un eficiente
diluyente para semen de mamíferos domésticos se creó la primera patente
biológica brasileña donde el Dr. José Ferreira Nunes es el autor. El punto de
partida inicio cuando fue aislada del agua de coco una molécula perteneciente
al grupo de las auxinas esto es el ácido 3-Indol-Acético (JYP), la cual le confiere
a los espermatozoides de diferentes especies un incremento en la motilidad y
porcentaje de espermatozoides vivos, aumentando también la tasa de fertilidad,
además de permitir su conservación durante periodos más largos (FUNCAP,
1999). Los Diluyentes con base en agua de coco han sido ampliamente
estudiados y utilizados en el noroeste brasileño, debido a su excelente eficacia
y bajo costo (Nunes, 1998). Por otra parte Nunes y Fernández (2001)
mencionan que el agua de coco (Cocus nucifera), perteneciente a la subfamilia
Cocosidea, de la familia Palmea, está compuesta de soluciones ácidas
naturales y estériles, conteniendo sales, proteínas, vitaminas y minerales
(Anexo 2). En la fase de maduración inicial, esto es, el fruto verde con seis
16
meses de edad, el agua presenta osmolaridad entorno de 500 miliosmoles y pH
4.5. Silva (1990) evaluó in vitro el semen de ovinos, después de realizada la
recolección, cada eyaculación fue dividida en dos porcentajes iguales, siendo
una diluida en agua de coco con osmolaridad y pH corregidos y la otra fue
diluida en leche en polvo glucosado, concluyendo que los diluyentes utilizados
demostraron eficiencia como medio de dilución para semen de ovinos.
Glicerado y Equilibramiento
La incorporación de glicerol al semen, es un proceso que debe realizarse
de manera gradual, ya que si se realiza con rapidez, destruye a los
espermatozoides, por lo que Pérez (1995) recomiendan la adición de glicerol en
forma paulatina, dividiendo la cantidad de diluyente con glicerol necesaria en
cuatro porciones (10, 20, 30 y 40 %, para un total de 100 %) y agregando cada
porción en intervalos de 15 min a 5 °C para minimizar los efectos deletéreos de
las altas concentraciones de glicerol. Por otra parte Hafez (2002) menciona que
algunos agregan el glicerol lentamente por goteo o en pequeñas cantidades en
un período de 1 h; otros recomiendan la adición en un solo paso. La mezcla de
semen y diluyente se deja reposar durante varias horas antes de congelarla,
para permitir que las células espermáticas se equilibren con el diluyente
(normalmente a 5 ºC). Un tiempo aproximadamente de 4 a 6 h es óptimo,
dependiendo del medio utilizado. Pasado este tiempo de equilibrio es evaluado
nuevamente el semen, en este momento el semen deberá tener mínimo, una
motilidad progresiva de 50 % (Giles, 1993). El propósito del equilibramiento es
permitir la traslocación del agua y por lo tanto reducir los efectos dañinos de la
nucleación del hielo intracelular durante el proceso de congelamiento y
17
descongelamiento (Vishwanath y Shannon, 2000).
Congelamiento, Envasado y Almacenamiento del Semen
Giles (1993) recomienda que una vez transcurridas las 3 h de
equilibramiento, el semen debe ser conservado de manera que permita una
aplicación fácil y rápida. Por eso el mismo es colocado en pajillas de .5 ml para
posterior refrigeración o congelamiento. Salamon y Maxwell (2000) mencionan
que el congelamiento de semen en pajillas se realiza por medio de suspensión
en vapores de nitrógeno líquido y la velocidad de enfriamiento se regula por la
distancia de las pajillas a nivel del nitrógeno líquido. En donde Lahnsteiner et al.
(2000) mencionan que la curva de enfriamiento es importante para el
congelamiento de pajillas, obteniéndose los mejores resultados cuando la
temperatura disminuye en forma de una parábola. Maxwell et al. (1995)
mencionan que dichas condiciones se consiguen al suspender las pajillas a una
altura de entre 4 y 6 cm sobre el espejo de nitrógeno líquido (-196 ºC), y la
altura que ha demostrado ser idónea para congelamiento de pajillas de .25 y .5
ml es de 4 cm.
Nunes y Fernández (2001) mencionan que el procedimiento para
envasar y congelar es simple, se asegura la pajilla por la porción superior
(extremidad cerrada), colocando la opuesta en el semen diluido y llenarla por
aspiración. Enseguida se golpea suavemente en la punta con el objetivo de que
quede una pequeña parte sin semen en la extremidad, para poder taparla
posteriormente con polvo de alcohol polivinílico. Posteriormente se congela el
semen en un termo de boca ancha exponiéndolo a vapores de de nitrógeno
líquido, para enseguida sumergir las pajillas en el nitrógeno líquido en donde
18
alcanzarán una temperatura de -196 ºC. Los espermatozoides de carnero
soportan temperaturas de congelamiento que pueden ir de -75 a -125 ºC
(Salamon y Maxwell, 2000) y una tasa de enfriamiento que puede ir de 10 a 100
ºC/min, independientemente de la cantidad de glicerol del diluyente (Fiser y
Fairtfull, 1986). Enseguida se descongela una pajilla a 35 ºC durante 40 seg y
se evalúa la concentración y la motilidad progresiva que debe ser mínimo de 35
% (Giles, 1993)
Independientemente del método de envasado, el semen congelado se
almacena sumergido en nitrógeno líquido (-196 ºC) en contenedores especiales
de diferentes capacidades que se consiguen fácilmente de manera comercial
(Evans y Maxwell, 1990). Una consideración importante cuando se almacena
semen por largos periodos de tiempo es la disminución en la fertilidad de dicho
semen durante el almacenamiento (Salamon y Maxwell, 2000). First et al.
(1961) reportaron que la motilidad de los espermatozoides disminuye durante
los primeros 2 meses de almacenaje y que después permanece sin cambios.
Por otra parte Yoshida (2000) menciona que la viabilidad del semen
criopreservado no excede los 50 años. Salamon y Maxwell (2000) señalan que
la fertilidad del semen almacenado por 27 años permanece inalterable, por lo
que durante largos periodos de tiempo es factible y posibilita el establecimiento
de bancos de recursos genéticos.
19
MATERIALES Y MÉTODOS
Descripción del Área de Estudio
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Procesamiento de Semen de
la Facultad de Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chihuahua, con
coordenadas de 28º 38’ latitud norte y 106º 04’ longitud oeste, a una altitud de
1,440 msnm con una precipitación media anual de 336 mm y una temperatura
media anual de 18.6 ºC (INEGI, 2001).
Descripción de la Población
Se utilizó un ovino de la raza Blackbelly como fuente de células
espermáticas, con una edad de 5 años, peso de 78 kg y circunferencia escrotal
de 31 cm, al cual se le realizó previamente un examen físico y capacidad
reproductiva. Se desparasitó interna y externamente con ivermectina (ivermetin,
laboratorio calier de Argentina), se hizo una aplicación intramuscular de
vitaminas (A, E, D) y selenito de sodio (laboratorio vitalebs). Se le proporcionó
una dieta con base en concentrado (250 g/d) con 12 % de proteína,
complementada con heno de alfalfa y agua ad libitum.
Diluyentes
Se empleó 50 % de agua de coco y 50 % de citrato de sodio al 2.9 % en
combinación con el diluyente no convencional: suero fetal bovino (SFB) o aloe
vera (AV), dichos diluyentes tuvieron concentraciones y combinaciones desde
10 a 70 %, en total se probaron 14 diluyentes y un testigo. Los tratamientos
contenía 14 % de yema de huevo, 1 mg/ml de estreptomicina, 1000 UI/ml de
penicilina, en caso de fructosa se utilizaron 1, 2 y 2.5 g/100 ml para testigo, SFB
y AV respectivamente. Los ingredientes utilizados se enlistan en el (Cuadro 1).
20
CUADRO 1. DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS (Trat.) CON BASE
EN AGUA DE COCO (AC) EN COMBINACION CON DILUYENTES NO CONVENCIONALES: SUERO FETAL BOVINO (SFB) O ALOE VERA (AV)
Ingredientes (%) 1 Trat.
Diluyente no convencional
Combinación
final 2 Concentración de diluyentes
con base 100 % 3AC + citrato
de Sodio
Testigo 86 0 80-0 100 – 0
75 11 70-10 87.5 - 12.5 64 22 60-20 75 – 25 54 32 50-30 62.5 – 37.5
SFB 43 43 40-40 50 – 50 32 54 30-50 37.5 – 62.5 22 64 20-60 25 - 75 11 75 10-70 12.5 – 87.5
75 11 70-10 87.5 - 12.5 64 22 60-20 75 – 25 54 32 50-30 62.5 – 37.5
AV 43 43 40-40 50 – 50 32 54 30-50 37.5 – 62.5 22 64 20-60 25 - 75 11 75 10-70 12.5 – 87.5
1 Además de estos ingredientes todos los tratamientos contenían 14 % de yema
de huevo. 2 Al agregar a los ingredientes 14 % de volumen sobre volumen (v/v) de glicerol
sus porcentajes iniciales se modifican para quedar como se muestra en la combinación final, en donde el primer número nos indica la combinación AC más citrato de sodio y el segundo número es el diluyente no convencional.
3 El primer número es la combinación AC más citrato de sodio y el segundo número es el diluyente no convencional.
21
Preparación de Diluyentes
Citrato de sodio. Se diluyeron 2.9 g de citrato de sodio en 100 ml de agua
desionizada.
Agua de coco. Los cocos de preferencia deben ser de seis meses de
maduración ya que a esa edad contienen en su interior agua la cual, para usarla
debe ser filtrada en papel del número 42.
Suero fetal bovino. Se obtuvo en la empresa “Productos Biológicos del
Pacífico” y “PAA Laboratorios, Inc. División México”. Para poder preparar el
diluyente, el suero se descongeló a temperatura ambiente por un lapso de 12 h,
posteriormente se centrifugó a 500 rpm durante 30 min y por ultimo se filtró con
papel del número 42.
Aloe vera. Para prepararla se cortaron pencas de sábila (una fue suficiente
para preparar 100 ml), se lavaron con agua desionizada, se eliminó la cubierta
dejando expuesto el gel, el cual se licuó y filtró a través de dos gasas y por
último se depositó en un recipiente estéril.
Con un potenciómetro se midió el pH de cada diluyente, regulándose con
hidróxido de sodio 0.2 molar a todos los diluyentes con pH menor a 6.5.
Recolección del Semen
El borrego fue llevado al área de recolección contigua al laboratorio de
procesamiento de semen, en donde se utilizó una borrega como señuelo. Para
la colecta del semen se utilizó la vagina artificial, utilizando la técnica descrita
por Evans y Maxwell (1990). El tubo elástico fue de mayor longitud que el tubo
de PVC, de modo que una vez introducido en él se revirtieron sus bordes
fijándolos al tubo de PVC mediante anillos elásticos. De este modo se formó
22
una cámara de doble pared destinada a contener agua y aire, la cantidad de
agua que se añadió fue aproximadamente 2/3 del volumen del tubo y tuvo una
temperatura de 48 a 50 ºC, para que al momento de ser utilizada se encontrará
entre 42 y 45 ºC. En la extremidad de la vagina se acopló un tubo colector
graduado en décimas de ml, en el cual se depositó el semen después de la
eyaculación, siendo el acto de recolectar el semen un método simple, donde se
asegura la hembra en celo natural o inducido, presentándola al macho y cuando
éste efectúa el salto se asegura el prepucio con la mano, desviando el pene
hacia dentro de la vagina artificial, donde la eyaculación fue instantánea.
Evaluación del Semen
Después de la recolección, se retiró el tubo y se evaluó el semen
macroscópicamente donde se observo el volumen, el color y la densidad;
posteriormente se colocó en baño María a 35 °C y se tomó una muestra para
ser evaluado microscópicamente observando la motilidad progresiva, la
motilidad masal y el porcentaje de espermatozoides vivos, estos parámetros
fueron determinados visualmente con ayuda de un microscopio de luz (Leica
con monitor sony) con aumento de 400 y 100 diámetros respectivamente. Los
criterios utilizados para manejar el semen durante el procesamiento, fueron
como mínimo: 85 % de espermatozoides vivos; 80 % de motilidad progresiva; 1
ml de volumen y menos de 15 % de anormales. Los porcentajes de
espermatozoides vivos (EV) y anormales fueron determinados por medio de un
frotis, cuya preparación fue la siguiente: en un portaobjetos temperado se
colocó una pequeña gota de semen, a la cual se le agregó otra gota de
colorante eosina – nigrosina y se homogenizó con un palillo; enseguida se
23
realizó el frotis, el cual se secó al aire, para posteriormente realizar un conteo
de 100 células espermáticas en diferentes campos del frotis, con la ayuda del
microscopio conectado a un monitor con un objetivo de 40X.
Dilución del Semen
Después de la etapa de evaluación, cumpliendo los parámetros antes
establecidos de calidad seminal, prosiguió la fase de dilución, la cual tiene una
concentración para cada dosis de aproximadamente 120 millones de
espermatozoides por pajilla. Se utilizó una dilución práctica recomendada por
Nunes y Fernández (2001), donde para una parte de semen, se agregan nueve
partes de diluyente (1:9). De acuerdo al volumen del eyaculado, se agregó la
cantidad de diluyente “A” al semen.
Enfriamiento del Semen
Cuando el volumen del eyaculado del ovino era mayor o igual de 1 ml se
probaron dos tratamientos, para lo cual el eyaculado se dividió en dos
fracciones. El enfriamiento del semen fue de manera progresiva en la cámara
de refrigeración (Casson Type MRS1), donde la temperatura descendió
paulatinamente hasta llegar a 5 ºC, durante 2 h aproximadamente, de tal
manera que el semen adquirió la temperatura de 5 ºC en forma gradual (Giles,
1993). Para lograr lo antes mencionado el semen con diluyente “A” fue colocado
en baño María a 35 °C en un vaso precipitado.
Segunda Dilución o Gliceración
A la fracción “B” se le añadió 14 % de v/v de glicerol y también se enfrió de 35 a
5 ºC, una vez alcanzada esa temperatura se añadió al semen en cuatro
24
porciones (10, 20, 30 y 40 %), con un tiempo de 15 min entre la adición de cada
porción, con la finalidad de disminuir en lo posible los efectos osmóticos debido
a la adición del glicerol (Watson, 2000). El tiempo de equilibrio fue de 3 h.
Envasado y Congelamiento
El semen diluido fue envasado e identificado por tratamiento en pajillas
francesas con capacidad de 0.5 ml, las pajillas se congelaron en vapor de
nitrógeno líquido, bajando la temperatura a 80 ºC en un tiempo de 12 min, para
tal caso se usó una hielera cerrada de unicel colocando 5 cm de nitrógeno
líquido y una cama de pajillas a 5 cm del líquido y por ultimo las pajillas se
sumergieron en nitrógeno en donde alcanzaron una temperatura de -196 ºC.
Descongelamiento
Por tratamiento se descongelaron en agua a 37 ºC durante 30 seg, tres
pajillas para evaluar inmediatamente cada período de evaluación.
Variables a Medir
La evaluación de los diluyentes se realizó en cinco períodos de tiempo. Período
de dilución del semen a 35 ºC (P0), se analizó con dos finalidades: determinar
que porcentaje de espermatozoides se veían afectados al momento de agregar
el diluyente y observar el descenso al momento de finalizar el tiempo de
equilibramiento. Al finalizar el tiempo de equilibramiento (P1) se evaluó con el
objetivo de examinar la habilidad de cada diluyente al finalizar dicho tiempo. Al
concluir el proceso de congelamiento (P2) se evaluó para determinar que
porcentaje de espermatozoides sobrevivieron a este proceso. A las 48 h
poscongelamiento (P3), se evaluó con la finalidad de determinar la
25
habilidad de cada diluyente como protector durante el congelamiento profundo
(-196 °C). A los 90 d poscongelamiento (P4) se evaluó con el objetivo de
detectar cambios en la viabilidad del semen debido al tiempo de
almacenamiento.
En cada período, las variables medidas fueron: porcentaje de células con
motilidad progresiva (MP) y porcentaje de células vivas (EV).
Análisis Estadístico de la Información
Los datos se analizaron mediante un modelo de regresión múltiple con
intercepto igual a cero del paquete estadístico SAS (Statical Análisis System,
2001) donde se ajustó la cantidad de agua de coco al 100 % (Mongomery y
Runger, 1996).
Ajustándose un modelo para las variables MP y EV en los diferentes
periodos de tiempo: al diluir el semen a 35 ºC, finalizado el tiempo de
equilibramiento, concluido el proceso de congelamiento, 48 h y 90 d
poscongelamiento. Una vez obtenido los parámetros estimados de las variables
agua de coco y diluyente no convencional (SFB o AV), con la ayuda del
programa MINITAB (Versión 13) se gráfico la variable MP en los diferentes
tiempos.
26
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En total se utilizaron ocho eyaculados de un ovino las cuáles fueron
divididos para trabajar dos tratamientos por sesión, obteniendo en promedio un
volumen de 1.20 ml con 89.4 % de motilidad progresiva; 91.2 % de
espermatozoides vivos y 5.4 % de anormales. Los resultados para motilidad
progresiva (MP) y porcentaje de espermatozoides vivos (EV) se muestran en el
(Cuadro 2) en los diferentes tiempos de medición.
Los valores de pH de los distintos diluyentes corregidos al momento de
prepararlos (Cuadro 3), se encuentran dentro de los recomendados para la
criopreservación de semen ovino (Salamon y Maxwell, 2000). En lo que se
refiere al agua de coco (AC), Nunes y Fernández (2001) mencionan que en la
fase de maduración inicial, esto es, el fruto verde con seis meses de edad
presenta un pH de 4.5, aunque en esta investigación no se pudo determinar la
edad, variedad y lugar de procedencia de los cocos, a ello se le podría atribuir a
que el pH fue de 5.9 y no coincidiera con el reportado por los investigadores
brasileños.
López (2001) también midió el pH a un diluyente 100 % suero fetal
bovino (SFB) y reportó un pH de 7.5, el encontrado en esta investigación fue de
7.1. Por otra parte el mismo autor trabajó con un diluyente 100 % aloe vera (AV)
pero éste a su vez estaba compuesto únicamente de 45 % de gel de AV y el
otro 55 % era de citrato de sodio al 2.9 %, donde encontró un pH de 6.6. En
esta investigación también se midió el pH del gel de AV y se encontró que fue
de 4.7. La diferencia puede deberse a que la solución de citrato de sodio tiene
un pH de 7.6 y tal vez la concentración de sodio que manejo
27
CUADRO 2. PORCENTAJE DE MOTILIDAD PROGRESIVA Y ESPERMATOZOIDES VIVOS EN CINCO PERIODOS DE EVALUACIÓN
% de Motilidad Progresiva
% de Espermas Vivos
Trat.
Combinación
P0a
P1b
P2c
P3d
P4e
P0a
P1b
P2c
P3d
P4e
1 80 - 0 80 50 40 40 40 80 60 40 40 40 2 70 -10 SFB 80 70 40 40 40 85 75 40 40 40 3 60 -20 SFB 90 60 55 55 50 90 85 55 55 50 4 50 – 30 SFB 85 80 45 45 40 85 80 45 45 40 5 40 – 40 SFB 80 75 50 50 40 85 75 50 50 40 6 30 – 50 SFB 90 70 60 60 50 90 85 60 60 50 7 20 – 60 SFB 90 70 50 50 50 90 70 50 50 50 8 10 – 70 SFB 90 80 70 70 60 90 80 70 70 70 9 70 -10 AV 80 60 40 40 40 80 80 50 50 40
10 60 -20 AV 85 80 50 50 50 85 80 60 60 60 11 50 – 30 AV 85 60 50 50 50 85 60 50 50 50 12 40 – 40 AV 85 85 60 60 60 85 85 70 70 60 13 30 – 50 AV 85 60 50 50 50 85 60 50 50 50 14 20 – 60 AV 85 80 30 30 30 85 80 30 30 30 15 10 – 70 AV 90 60 20 20 20 90 85 20 20 20
a Al diluir el semen a 35 ºC, b finalizado el tiempo de equilibramiento, c concluido el proceso de congelamiento, d 48 h y e 90 d poscongelamiento.
28
CUADRO 3. VALORES DE pH MEDIDOS Y CORREGIDOS AL MOMENTO DE PREPARAR LOS DILUYENTES
Trat.
Combinación
pH encontrado
pH corregido
1 80 - 0 6.4 6.6 2 70 -10 SFB 6.59 6.59 3 60 -20 SFB 6.81 6.81 4 50 – 30 SFB 6.83 6.83 5 40 – 40 SFB 7 7 6 30 – 50 SFB 7.18 7.18 7 20 – 60 SFB 7.2 7.2 8 10 – 70 SFB 7.15 7.15 9 70 -10 AV 6.4 6.5
10 60 -20 AV 6.3 6.5 11 50 – 30 AV 6.2 6.6 12 40 – 40 AV 6.0 6.9 13 30 – 50 AV 5.8 6.5 14 20 – 60 AV 5.5 6.7 15 10 – 70 AV 5.3 6.7
29
López (2001) elevó el pH. Es por ello que en esta investigación todos los
diluyentes con diferentes concentraciones de AV y el diluyente testigo (80-0)
tuvieron que corregirse el pH con hidróxido de sodio 0.2 molar.
Fase de Dilución (P0)
Una vez evaluado el semen macroscópicamente (color y volumen) y
microscópicamente (MP y EV) siguiendo los criterios establecidos por Ax et al.
(2002) y determinado parámetros mínimos para su procesamiento (López,
2001), se inició la fase de dilución descrita por Nunes y Fernández (2001).
En la mayoría de los tratamientos se pudo observar una disminución en
la MP y EV entre el momento de la obtención del semen y el momento de
agregar el diluyente “A” a 35 ºC, lo cual se le atribuye al efecto de dilución
(Maxwell y Johnson, 1999) ya que los espermatozoides responden a la dilución
con un aumento inicial de la actividad metabólica seguido por una pérdida de la
motilidad y un aumento en el daño de membrana (Johnson et al., 2000) por otra
parte Watson y Martín (1976) atribuyen este efecto a una reducción en los
componentes del plasma seminal, disturbios en los componentes osmóticos y
electrolíticos en el diluyente.
Aunque la mayoría de los diluyentes conservó una motilidad arriba de 80
% (Gráfica 1 y 2), también se puede observar en ambas gráficas que al
combinar AC con SFB o AV a 35 °C (diluyente “A”), también llamado P0, que
los tratamientos 10-70 de ambos diluyentes no convencionales (SFB o AV)
fueron los que mayor motilidad progresiva presentaron. El tratamiento testigo
(80-0) presentó en este período 80 % de MP y EV, dichos valores son 5 y 15 %
menores con los comparados por Nunes y Fernández (2001) y Uchoa et al.
30
Gráfica 1. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo
de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P0.
31
Gráfica 2. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo
de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P0.
32
(2002) al diluir semen ovino y canino respectivamente en 50 % de AC, 25 %
agua destilada y 25 % de citrato de sodio al 5 % con osmolaridad y pH
corregidos. En caso del semen ovino, dichos investigadores encontraron esa
MP al incubar el semen a 15 ºC durante 5 h; para el semen canino observó esa
MP (95 %) a los 90 min de haber diluido el semen con una osmolaridad
ajustada entre 304 y 306 miliosmoles. La diferencia con el tratamiento testigo
puede deberse a que en esta investigación no se midió ni corrigió la
osmolaridad de dicho diluyente.
Comparando los resultados de los dos diluyentes no convencionales en
P0 (Cuadro 2), puede observarse que las diferentes combinaciones de AC con
AV fue en donde mayor se observó el efecto de dilución, comparado con los
diferentes tratamientos de AC con SFB como diluyente no convencional.
Finalizado el Tiempo de Equilibramiento (P1)
Para todos los tratamientos se añadió glicerol como crioprotector (14 %
v/v) usando el método de cuatro pasos descrito por Pérez (1995) y dándoles 3 h
de tiempo de equilibrio. Comparando tratamientos con base 100 % AV (45 % de
gel AV, 55 % citrato de sodio al 2.9 %) y 100 % SFB, López (2001) hizo
combinaciones 1:1 con los diluyentes citrato-yema, leche entera
semidescremada y saliva artificial-Opuntia ficus indica (23 % extracto de nopal,
77 % saliva artificial).
Ambos tratamientos 100 % AV y SFB presentaron 70 % MP pero al
realizar las combinaciones 1:1 AV y SFB disminuyó a 60 % MP. En la presente
investigación no se mezclaron los diluyentes no convencionales; se realizaron
diferentes combinaciones de AC con un diluyente no convencional SFB o AV,
33
encontrándose motilidades menores con diversos tratamientos de 50 y 60 % de
MP (Cuadro 2), siendo estos los que mayor efecto negativo presentaron al
finalizar el tiempo de equilibramiento con 50 y 60 % de MP, sin embargo
mantuvieron valores aceptables al finalizar la etapa de equilibramiento (Giles,
1993) que es un mínimo 50 % de MP.
En este mismo período Madrid, (2004) evaluó tres niveles de yema de
huevo (10, 20 y 30 %) en sustitución del diluyente no convencional (leche,
nopal, aloe vera y suero fetal bovino), con 60 % de citrato de sodio al 2.9 %,
observando para los tratamientos con base en SFB 80 % de MP. Sus datos son
similares a los de esta investigación con el tratamiento 10-70 SFB con la misma
MP.
El tratamiento 40-40 AV no mostró ningún cambio al finalizar el periodo
de equilibramiento manteniendo la misma motilidad (85 % MP) que al agregarse
el diluyente a 35 ºC. Entre P0 y P1 puede observarse (Cuadro 2) que los
tratamientos con base en AC y su combinación con SFB disminuyeron en
promedio 16.52 % de MP y 10.57 % de EV. Para los tratamientos con base en
AC y su combinación con AV disminuyeron 18.49 % de MP y 10.92 % EV, esto
puede deberse a los efectos dañinos que ejerce la adición y el contacto con el
glicerol, cuyos efectos osmóticos y tóxicos al penetrar la membrana son bien
conocidos (Holt, 2000).
Concluido el Proceso de Congelamiento (P2)
En esta fase se analizaron los cambios entre el periodo P0 y P2 que
corresponde una vez concluido el procesamiento de semen, comparando los
valores en promedio con cada diluyente hubo una disminución de 38.84 % de
34
motilidad progresiva (MP) y 39.83 % de espermatozoides vivos (EV) para los
tratamientos con base en agua de coco (AC) y su combinación con suero fetal
bovino (SFB) y 49.5 % de MP y 44.5 % de EV para los tratamientos con base
en AC y su combinación con aloe vera (AV). Comparando ambos diluyentes
siguió ofreciendo en promedio mejores resultados en cuanto a MP y EV las
diferentes concentraciones de AC y SFB como diluyente no convencional.
Los cambios ocurridos en este período pueden deberse a que algunos
espermatozoides sufren daños irreversibles en el congelamiento profundo a -
196 ºC, concordando con investigaciones de Holt (2000) en donde hace
mención que existen efectos dañinos a los espermatozoides durante el proceso
de congelamiento, sufriendo estos una dramática pérdida de calidad al
descongelamiento. Por otra parte Salamon y Maxwell (1995) hacen mención
que el congelamiento y descongelamiento de semen ovino conduce a cambios
severos en su estructura y función. Valcárcel et al. (1994) mencionan que entre
estos cambios se encuentran: alteraciones en la MP, características de
movimientos e integridad de la membrana.
Los tratamientos que más daño le ocasionaron a los espermatozoides en
el congelamiento fueron 20-60 AV y 10-70 AV, ya que presentaron 30 y 20 % de
MP respectivamente (Cuadro 2) y por lo tanto no cumplen con los parámetros
mínimos establecidos para semen descongelado de 35 % de MP (Giles, 1993).
Por otra parte el tratamiento 10-70 SFB y 40-40 AV fueron los que mayor
protección le dieron a los espermatozoides durante el congelamiento profundo
ya que mostraron 70 y 60 % de MP respectivamente y en lo que respecta a EV
ambos tratamientos presentaron 70 %.
35
Cuarenta y Ocho Horas Poscongelamiento (P3)
Entre los periodos P2 y P3 no hubo cambios ya que son pocos días,
según lo reportado en trabajos First et al. (1961) al descongelamiento de
semen, en donde observó que la motilidad de los espermatozoides congelados
disminuye rápidamente durante los primeros meses de almacenaje y
principalmente en el primer mes y después de ese tiempo, el semen permanece
prácticamente sin cambios.
Las diferentes combinaciones y concentraciones de AC y SFB (Gráfica
3), muestran una MP aceptable, teniendo como mínimo 40 %, para el
tratamiento testigo (80-0), 70-10 SFB y 60-20 SFB, no ocurriendo lo mismo con
el tratamiento 10-70 SFB que fue el mejor con 60 % de MP, estos resultados
concuerdan con lo encontrado por Madrid (2004) el cual combinó SFB al 30 % y
10 % YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 %, obteniendo MP de 65 %.
En lo que se refiere a las diferentes concentraciones y combinaciones de
AC y AV no ocurrió lo mismo (Gráfica 4) que lo que se observó con el diluyente
no convencional SFB ya que cuando el tratamiento tuvo las mayores
concentraciones de AV (60 y 70 %) la MP se vio afectada, presentando apenas
30 %. Esto puede deberse a que el AV no contiene la suficiente cantidad de
proteínas y azúcares, porque aunque se haya corregido el pH, dichas
concentraciones no pudieron dar a los espermatozoides medios apropiados de
dilución como lo menciona Hafez (2002).
Los bajos porcentajes de MP y EV con los tratamientos 20-60 AV y 10-70
AV también pueden atribuirse a la densidad que presenta el gel de AV, y al
agregar el glicerol no puede diluirse perfectamente, evitando que penetre la
36
Gráfica 3. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo
de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P3.
37
Gráfica 4. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P3.
38
AV también pueden atribuirse a la densidad que presenta el gel de AV, y al
agregar el glicerol no puede diluirse perfectamente, evitando que penetre la
cantidad necesaria requerida para la protección de los espermatozoides durante
el congelamiento profundo. Sin embargo López (2001) reportó MP menores con
un diluyente 100 % AV (45 % AV, 55 % citrato de sodio al 2.9 %) con apenas 10
% de MP a las 48 h poscongelamiento, donde atribuyó que fue necesaria la
yema de huevo (YH) para el proceso de congelamiento.
Madrid (2004) agregó tres diferentes niveles de YH (10, 20 y 30 %) en
sustitución de los diluyentes no convencionales. Al combinar AV al 30 % y 10 %
de YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 %, encontró MP de 30 %, atribuyendo
que para preservar células espermáticas no son recomendables cantidades
menores de 20 % ya que no logran proteger en su totalidad a la membrana del
espermatozoide. Sus resultados no concuerdan con Rodríguez (1988) ya que el
utilizó 10 % de YH en un diluyente con base en AV al 40 % en combinación con
citrato de sodio, donde obtuvo 49.5 % de MP al descongelamiento.
Está investigación utilizó la cantidad recomendada por Salamon y
Maxwell (2000) de 14 ml de yema de huevo y dichos resultados coinciden con
Rodríguez (1988) encontrándose (Gráfica 4) MP arriba de 40 % cuando las
combinaciones no excedían de 50 % de gel de AV. Cardoso et al. (2000) evaluó
semen canino diluido en AC, encontrando mejores resultados al adicionar 20 %
de YH y 4 % de glicerol, mejorando la calidad espermática al descongelado.
Noventa Días Poscongelamiento (P4)
En este tiempo si hubo cambios mínimos con P3 pero únicamente para
las diferentes concentraciones y combinaciones de AC y SFB, comparando P0
39
con P4 de los mismos tratamientos se observó que en general hubo una
disminución de 45.4 % de MP y 44.7 % de EV, ya que el semen de ovino sufre
daños irreversibles al ser sometido a los efectos del congelamiento, el cuál
mayormente ocurre en la membrana espermática (Watson, 2000) por lo que
Valcárcel et al. (1994) mencionan que al descongelar el semen no es evidente
el efecto en la motilidad pero que si se reduce drásticamente la integridad de la
membrana, por lo que recomienda evaluarla por medio de tintes fluorescentes.
Por otra parte al evaluar AC y su combinación con diferentes
concentraciones de AV (Cuadro 2) puede observarse que a partir de concluido
el proceso de congelamiento (P2) ya no hubo ningún cambio en la motilidad de
los espermatozoides, dichos tratamientos se comportaron de la misma manera
como lo menciona Madrid (2004), en donde a partir de las 48 h
poscongelamiento ya no hubo cambio alguno para MP y EV. Aunque las
combinaciones con base en AC con SFB coincidieron con lo señalado por First
et al. (1961), en donde se observó que el semen fue susceptible durante los
primeros meses a sufrir daños y después permaneció prácticamente igual.
Tal vez la diferencia con el gel de AV en combinación con diferentes
niveles de AC se deba a que todos los daños irreversibles que le ocasionaron a
los espermatozoides fueron de P0 a P2 y por ello ya no hubo cambios. Los
tratamientos con base en AV tuvieron en promedio durante los cinco períodos
de evaluación (P0 a P4) una disminución de 49.58 % de MP y 44.5 % de EV,
siendo mejor en promedio todos los tratamientos, con una mínima diferencia los
de SFB para MP. En la (Gráfica 5) puede apreciarse una ligera disminución de
MP en la mayoría de las diferentes combinaciones y concentraciones de AC y
40
Gráfica 5. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo
de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de suero fetal bovino en el P4.
41
SFB, sin embargo son aceptables, teniendo como mínimo 40 % de MP, el
tratamiento 10-70 SFB siguió siendo el mejor ahora con 60 % de MP,
coincidiendo los resultados con los obtenidos por Madrid (2004).
Con los diluyentes con base en AC y AV no ocurrió lo mismo, ya que
mantuvo la misma MP (Gráfica 6) que en P3, debido a esto la discusión de esta
gráfica será omitida, ya que es idéntica a la (Gráfica 4). Madrid (2004) con 20 %
de AV, 20 % de YH y 60 % de citrato de sodio al 2.9 % reportó 50 % de MP a
los 90 d poscongelamiento, en esta investigación se encontró la mejor MP
cuando el gel de AV tuvo 50 % con citrato de sodio (40-40 AV) encontrándose
60 % de MP (Cuadro 2), tal vez se deba a que con esas concentraciones se
encuentran los nutrientes necesarios para ayudar en la criopreservación de
células espermáticas.
En el caso de López (2001) a los 90 d poscongelamiento los
tratamientos 100 % AV y SFB apenas tenían 7 y 15 % de MP respectivamente y
los únicos tratamientos con valores aceptables para semen descongelado
fueron el control, CY y sus combinaciones 1:1 con (SOP, AV y SFB), en donde
atribuye que es necesaria la YH como protector contra el choque térmico,
coincidiendo con Holt (2000) que menciona que por ello es común utilizarla en
los diluyentes para congelamiento de semen de los animales domésticos.
42
Gráfica 6. Porcentaje de motilidad progresiva predicha por un modelo
de regresión con diferentes niveles de agua de coco y sus combinaciones con diferentes concentraciones de aloe vera en el P4.
43
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La mayoría de los diluyentes fueron capaces de mantener un porcentaje
de motilidad progresiva y espermatozoides vivos aceptables durante los
procesos de dilución, congelamiento y descongelamiento de semen.
Las diferentes combinaciones de AC con diferentes concentraciones del
diluyente no convencional SFB, ofrecieron medios mas apropiados para la
dilución y preservación de semen en comparación con el diluyente no
convencional AV, cuando dichas concentraciones excedían el 50 % de gel de
aloe vera.
Para diluir el semen fresco, se pueden recomendar las concentraciones y
combinaciones 10-70 SFB y 40-40 AV ya que fueron los mejores tratamientos
debido a su estabilidad mostrada durante todo el proceso de congelamiento.
Las combinaciones 10-70 SFB y 40-40 AV fueron los mejores
tratamientos y son recomendables como componentes de medio de dilución de
semen por su eficiencia en la fase de poscongelamiento a los 90 d, en el otro
extremo los tratamientos con concentraciones 20-60 AV y 10-70 AV no son
recomendables para la criopreservación de semen ovino, ya que los resultados
muestran que fueron incapaces de mantener los estándares mínimos
recomendados como diluyentes para criopreservación de semen.
Se recomienda validar los mejores tratamientos con diferentes razas de
ovinos, incrementando el número de sementales y eyaculados por semental
para observar si cada diluyente presenta las mismas cualidades, al igual se
recomienda que al descongelar semen se evalué por medio de tintes
fluorescentes el daño que sufre la membrana espermática ya que el semen
44
ovino al descongelado presenta excelente motilidad pero muy poca fertilidad al
inseminar artificialmente con semen criopreservado. También se recomienda
probar los diluyentes que presentaron excelente motilidad a los 90 d
poscongelamiento en programas de inseminación artificial para determinar si
ofrecen valores aceptables en porcentajes de preñeces por inseminación
artificial con laparoscopia ya que está técnica presenta excelentes resultados
con semen fresco diluido y por último no se recomienda utilizar más del 50 % de
gel de aloe vera como diluyente, ya que es perjudicial para la viabilidad de los
espermatozoides.
45
LITERATURA CITADA
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Editorial Limusa. México, D. F. 253 pp.
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ANEXO 1. SISTEMA DE VALORACIÓN DE MOTILIDAD MASAL
Valor
Clase
Descripción
5 Muy buena Densa, con ondas de movimiento muy rápidas. No se pueden observar las células individuales. El 90 % o más de los espermatozoides son activos.
4 Buena Movimiento vigoroso, pero las ondas y los remolinos no son tan rápidos como en el anterior. Alrededor de 70 a 35 % de células activas.
3 Regular Ondas con movimiento lento. Se aprecian espermatozoides aislados. El 45 a 65 % de las células son activas.
2 Pobre No aparecen ondas aunque se observan movimientos de espermatozoides. Sólo viven el 20 a 40 % de las células espermáticas y su movilidad es pobre.
1 Muy pobre Muy pocos espermatozoides (cerca de 10 %) viven. Movimientos débiles.
0 Muertos Sin espermatozoides móviles. Adaptado de Evans y Maxwell (1990).
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ANEXO 2. COMPOSICIÓN DEL AGUA DE COCO DE UN FRUTO DE SEIS MESES DE MADURACIÓN
Aminoácidos µg/ ml Aspártico 5.4 Glutámico 78.7 Serina 65.8 Glicina 13.9 Aspargina 10.4 Treanina 26.3 Alanina 177.1 Glutamina 13.4 Lisina 22.5 Arginina 16.8 Prolina 21.6 Valina 15.1 Leucina 31.6 Fenilalanina 10.2 Tirosina 3.1 Aminobutírico 168.8 Homoserina 5.2 Histina, Metionina y Hidroxiprolina (trazas) Azúcares mg/ml Sacarosa 8.9 Glucosa 2.46 Fructosa 2.51 Vitaminas mg/ml Ácido nicotínico 0.64 Ácido pantoténico 0.52 Biotina 0.02 Riboflavina 0.01 Ácido fólico 0.003 Tiamina y Piridoxina (trazas) Minerales mg/100ml Potasio 312.0 Cloro 183.0 Sodio 105.0 Fósforo 37.0 Magnesio 30.0 Azufre 24.0 Hierro 0.1 Cobre 0.04 Calcio (trazas)
Fuente: Nunes y Fernández (2001).