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Actualización en los métodos
diagnósticos de Sífilis
Dr Leonardo Chanqueo Jefe Unidad Infectología & Laboratorio Microbiología
03 de Mayo 2016
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Temario
• Introducción y epidemiología
• Test directos
• Test serológicos
• Experiencia local
• Algoritmos de estudio de Sífilis
• Conclusiones
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Primary and Secondary Syphilis — Rates of Reported
Cases by Age and Sex, United States, 2014
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Microbiología
• Ha sido difícil la determinación taxonómica de las espiroquetas dado que son fastidiosas y no crecen en los cultivos.
• Utilizando 16S rRNA (Paster y cols) agruparon las secuencias de las en un sólo phylum que contiene 5 cluster:
– Treponema
– Spirochaeta
– Borrelia
– Brachyspira
– Leptospira
• Los 4 miembros del género Treponema son morfologicamente identicos y pese a los avances en biología molecular su diferenciación se realiza en base a distribución geográfica, epidemiología, manifestaciones clínicas y hospedero.
– Treponema pallidum subsp pallidum causa Sífilis
– T pallidum subsp pertenue causa Yaws
– T pallidum subsp endemicum causa Sífilis Endémica
– T carateum causa Pinta
Foto Susan Lindsley, CDC
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Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60
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Curso Natural de una Sífilis no tratada
11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
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Etapas Clínicas de la Sífilis
Normas de Manejo y Tratamiento de las Infecciones de Transmision Sexual (ITS) Ministerio de Salud, Chile, 2008.
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Diagnóstico en pacientes con úlcera o lesion (“chancro”)
Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6
Gayet et al. Emerging Infectious Diseases • Vol. 21, No. 1, January 2015
Dark field photomicrograph of
a T. pallidum bacterium CDC
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Diagnóstico serológico de Sífilis
• El diagnóstico de sífilis sigue siendo la detección de Ac. no treponémicos (TNT) (cardiolipinas) y Ac. Treponémicos (TT) – Test No Treponémicos (TNT)
• Monitorización o seguimiento de la enfermedad
– Test Treponémicos (TT)
• Confirmación la prsencia de una infección
• La S y E de ambos tests varía: – Según test – Etapa de la enfermedad
Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60
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Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6
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Test no treponemicos
USR
(Unheated Serum Reagin)
RPR
(Rapid Plasma Reagin)
TRUST
(Toluidine Red Unheated Serum
TEST)
VDRL
(Venereal Disease Research Laboratory)
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Test no treponémicos
• Todos son test de floculación cuya interpretación es subjetiva
• Miden los niveles de Ig G/M producidos por el hospedero en respuesta al material lipoideo (ppalmente cardiolipinas) liberado desde las células dañadas
• Cardiolipinas liberadas por la espiroquetas
• Baratas y laboriosas
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
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Comparación entre el VDRL y RPR
VDRL RPR
Significado Venereal Disease Research
Laboratories
Rapid Plasma Reagin
Antígeno Preparación diaria
Contiene: Cardiolipina-
Colesterol y Lecitina
Contiene cardiolipina,
lecitina, colesterol, 10%
choline chloride, EDTA
Incorpora partículas de
carbón
Preparación No automatizada
Operador dependiente
No automatizada
Operador dependiente
Visualización Microscopica Macroscopica
Sensibilidad
Sifilis primaria
78%
86%
Diagnóstico en LCR Si No
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Test no treponémicos
• Todo lo test reactivo debiese ser informado con cuantificación
• Los títulos
– se correlacionan con la actividad de la enfermedad y son utilizados
para seguimiento
– descienden habitualmente después de una terapia exitosa
– habitualmente van descendiendo progresivamente, sin embargo en
muchos pacientes permanecen reactivos (serología residual) en
títulos bajos
• Pacientes con títulos más altos tienen una gran caída en los
controles posteriores
• La evaluación de un paciente debe ser realizada idealmente
con el mismo test y en el mismo laboratorio
Morales-Munera CE, et al. FR - Sifilis: actualizacion en el manejo diagnostico y terapeutico. Actas Dermosifiliogr. 2014
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
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Parametro VDRL USR RPR TRUST
Metodo Floculacion Floculacion
Floculacion
Floculacion
Muestras Suero / LCR Suero Suero, Plasma Suero, Plasma
Vol (ul) 50-100 50-100 50-100 50-100
Tiempo de
ejecucion
15 min 15 min 15 min 15 min
FDA Si Si Si Si
Sensibilidad (%)
Primaria 67-78 80 60-86 70-85
Secundaria 96-100 100 100 100
Terciaria 85-95 95 98 98
Especificidad 96-99 98-99 93-99 98-99
Diagnostico de Sifilis
con Test No Treponemico
11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
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Efecto de prozona
• Corresponde a un “Falso Negativo” de la técnica
• Son muestras informadas como “no reactivo”, a menos que la muestra sea diluida
• Ocurre en muestras con altos títulos de Ac
• Principalmente en sífilis secundaria (alrededor de 1-2%), llegando a un 10% en pacientes VIH (+)
Arch Dermatol Vol. 116 Jan 1980
Acta Med Colomb Vol. 39 No 1 2014
South Med J 2004;97(4)
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Relación Antígeno/Anticuerpo
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Falsos positivos de los test no
treponémicos
• FP agudas (< 6
meses)
– Enfermedades febriles
– Inmunizaciones
– Embarazo
• FP crónicos
– Infección por VHC
– Infección por VIH/SIDA
– Enfermedades autoinmunes
– Drogadicción EV
– Cánceres
– 3ra edad
– Malaria
– Enfermedad de Chagas
– Tuberculosis
– Lepra Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
Falsos positivos : 3 - 40%
Títulos bajos < 1/8
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Fig 1. Algoritmo Tradicional para el
diagnostico
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
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Test no treponémicos
• Desventajas – Poca Especificidad
– Laborioso
– Subjetivo
– Manual / manipulacion
– Deteccion de etapas mas tardias
– Efecto de prozona
• Ventajas – Alta Sensibilidad
– Bajo costo
– Requiere poco equipamiento
– Util en la monitorizacion de los pacientes
Interpretación de resultados de un TNT reactivo
• Va a depender de la población testeada
• El VPP de un TNT incrementa con la combinación de un TT
• Un TNT realizado en una población de bajo riesgo debe ser confirmado con un TT, dado que puede ser un falso positivo
• Un TNT debe ser también interpretado de acuerdo a la etapa de sífilis sospechada
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Test Treponémicos
TTHA /TPPA/ MHA -TP
FTA-ABS
Western Blot / LIA
ELISA / CIA / EIA /IC
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Test Treponémicos
• Fueron desarrollados utilizando la cepa de
Nichols de T.pallidum y usando células o
Ag derivados de T.pallidum
• Detectan IgG o IgM según el kit
• Son detectados previo a la detección de
TNT y permanecen de por vida, aún con
terapia exitosa
Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2
Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980
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Test de aglutinación indirecta:
TPHA y TPPA
• Los antígenos son extraidos de: – TPHA (Treponema pallidum
hemagglutination assay) • antígenos T. pallidum sobre GR
– TPPA (Treponema pallidum particle agglutination assay)
• antígenos T. Pallidum con partículas de gelatina
• La S y E no son optimas en etapas primarias
• TPPA sería mejor que TPHA, posiblemente debido a la estructura homogénea de las partículas de gel
TPHA Test Principle
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Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708
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MHA-TP (Micro-hemaglutinación indirecta para
Treponema pallidum)
3 4
Pocillo 3 Reactivo control
(GR no sensibilizados)
Pocillo 4 Reactivo Antígeno
(GR sensibilizados)
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11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015
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• Es una inmunofluorescencia indirecta (IFI)
• Utiliza como Ag un liofilizado de T. pallidum (Nichol´s
strain)
• Previamente el suero del paciente ha sido absorvido
con un sorbente
• Sorbente es un extracto de un T. phagedenis no
patogenico (con el objeto de eliminar la reacción
cruzada con otros treponemas)
• Después de la remoción de los Ac no ligados, se
incuba con un conjugado fluorescente de Ac anti
globulina humana
• Test (+) visualización de espiroquetas fluorescentes al
microscopia
• Es un poco mas sensible que el TPHA y TPPA
• Examen operador dependiente
• Ocasionalmente hay FP (fluorescencia no especifica)
Fluorescent Treponemal Antibody
Absorption (FTA-ABS) test
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Western Blotting (WB) & Line
immunoassay (LIA)
• Utilizan antigenos de T.pallidum sobre un gel de poliacrilamida (WB) o en una tira de nylon (LIA)
• Disponibles IgG e IgM
• IgG LIA: TpN47, TpN17, TpN15 y TmpA
• S y E > 98%
BJID 2008; 12(April)
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ELISA / CIA / EIA
• Utilizan antígenos recombinantes
• CIA (quimioluminiscencia) & EIA (multiplex bead enzyme immunoassay) son los que tienen un mayor rendimiento
• El desempeño de estos ensayos para screening difiere segun plataforma
• La reproducibilidad sería mejor con la CIA
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Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708
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Fig 2. Algoritmo Reverso para el
diagnostico
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
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CID 2010:51 (15 September) • Sen a et al.
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• El uso de un algoritmo reverso en el estudio de sífilis podría sobre diagnosticar y además sobre tratar pacientes en algunos circunstancias
• Las recomendaciones de un algoritmo reverso podrían no ser apropiadas en países con patrones diferentes de seroreactividad, sistemas de salud y epidemiología de la enfermedad
• Es necesario realizar mayores análisis y costos asociados a esta forma alternativa de realizar tamizaje dado el incremento en el uso de TT en EEUU
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Resultado
ELISA TP Reactivo
VDRL No reactivo
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El uso de Las Pruebas Rapidas para Sifilis. Copyright © Organizacion Mundial de
la Salud en nombre del Programa Especial de Investigaciones y Ensenanzas sobre
Enfermedades Tropicales (TDR) 2007
*** En una poblacion de 10.000 habitantes
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Fig 3. Algoritmo Reverso para el
diagnostico segun recomendaciones
del ECDC (European Centre for Disease
Prevention and Control)
TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test
EIA: enzyme immunoassay
CIA: chemiluminescence immunoassay
2014 European Guideline on the Management of Syphilis
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2014 European guideline on the management of syphilis
© 2014 European Academy of Dermatology and Venereology
(TT): T. pallidum Haemagglutination test
(TPHA), Micro-Haemagglutination Assay for T. pallidum
(MHA-TP), T. pallidum Passive Particle Agglutination test
(TPPA), Fluorescent Treponemal Antibody absorption test
(FTA-abs test), Treponemal Enzyme Immunoassay (EIA),
Chemiluminescence Immunoassay (CIA)
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UK Standards for Microbiology Investigations
Syphilis Serology 2015
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Historia
paciente
Test y resultado Interpretación Seguimiento
EIA/CIA/MFI RPR TP-PA
Desconocida No reactivo N/A N/A No evidencia serológica
de sífilis
Ninguno, a menos
exista indicación
clínica
Desconocida
Reactivo Reactivo N/A Sífilis no tratada o
recientemente tratada
Ver guías de
tratamiento
Desconocida
Reactivo No reactivo No reactivo
Probable Falso positivo Ninguno, a menos
exista indicación
clínica
Desconocida
Reactivo
No reactivo
Reactivo
Posible sífilis (ej: precoz
o latente) o previamente
tratada
Requiere
evaluación e
historia clínica
Historia conocida
de sífilis
Reactivo
No reactivo
Reactivo o N/A
Sífilis antigua, tratada
exitosamente
No
CIA, chemiluminescence immunoassay; EIA, enzyme immunoassay; MFI, multiplex flow immunoassay
N/A, not applicable
RPR, rapid plasma reagin
TP-PA, Treponema pallidum particle agglutination.
http://www.cdc.gov/std/treetment/2010/
Interpretación y seguimiento siguiendo flujograma reverso
de screening de sífilis
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Consideraciones para seguir un
algoritmo
• Volumen de muestras recibidas
• Carga del laboratorio y recursos humanos
• Prevalencia e incidencia de sifilis en la población
• Costos
• Desempeño del test a usar
• Necesidades del clínico
• Recomendaciones locales www.aphl.org
Can J Infect Dis Med Microbiol Vol 26 Suppl A January/February 2015
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