CRISTINA IBARRALaboratorio de Fisiopatogenia
Departamento de FisiologíaFacultad de Medicina, UBA
CONGRESO DE NEFROLOGÍA PEDIÁTRICA 21 de Junio de 2012
ACCIÓN DE LA TOXINA SHIGA EN ÓRGANOS BLANCO. ESTRATEGIAS DE PREVENCIÓN
Historia natural de la infección bacteriana
3- 4 días
90%
6 - 8 días
EHEC ingresa al organismo
resolución
1 - 2 días
10%
SUHTrombos plaquetarios en arteriolas y capilares.Anemia hemolítica microangiopática.Hipoperfusión y microinfartos en órganos.
diarrea sanguinolenta
colitis hemorrágica
diarrea acuosadolor abdominal
Subunidad A
5 Subunidades B
Gal1
Gal2
Glc
Membrana plasmática
Receptorglicolípido Gb3
Mecanismo de acción de Stx1 y Stx2
(a) Trancitosis independiente de Gb3; (b) Transporte paracelular durante la transmigración de PMN; (c) Vía Gb3 estimulado por la infección con EHEC; (d) Traslocación por las células de Paneth; (e) Traslocación por las células M.
Vías potenciales de pasaje de Stx en la barrera intestinal
Reproducido de Schuller S. Toxins 3: 626, 2011
Acción de Stx2 en la mucosa colónica humana
Stx2
Fiorito et al Dig Dis Sc 45:480, 2000Pistone et al Braz J Med Biol Res 37: 799, 2004
Stx2 produce destrucción de la mucosa con desprendimiento de células epiteliales, vaciado de células calciformes y edema. Los linfocitos y polimorfonucleares invaden y destruyen las glándulas colónicas. H&E.200×.
95% O2 5% CO2
Cámara de Ussing
cámara transductora
Colon humano
mucososeroso
Dispositivo de detección fotoeléctrico
Control Stx2, 10 ng/ml Stx2, 100 ng/ml
EHEC altera la funcionalidad e integridad del colon humano
Gerhardt et al., VTEC2012, Amsterdam, Paises Bajos
Las cepas STEC O157 y no O157 inhiben la absorción de agua a través del colon humano in vitro
STEC O157:H7 STEC O113:H21
STEC O157: H7 y O113:H21 causan similar destrucción de la mucosa intestinal con desprendimiento de células epiteliales, vaciado de células caliciformes y edema. H&E. 200×
Efectos de Stx2 y SubAB en la mucosa colónica humana
STEC O113:H21 cepa 98NK2 y sus derivadas mutadas en Stx2 o en subtilasa –SubAB-, inhiben en la misma proporción la absorción de agua a través del colon humano in vitro.
La cepa salvaje 98NK2wt y la mutada 98NK2∆subAB causan destrucción de la mucosa intestinal y edema en el corion interglandular. En cambio, la mutada 98NK2∆stx2 destruye sólo el epitelio superficial. En todos los casos hay pérdida de células caliciformes. H&E. 200×.
98NK2∆subAB 98NK2∆stx2
98NK2wtControl
factor de von Willebrand
citoqueratina Ag memb tub. distal
CERH
CEGH
contraste de fase PECAM-1 Fusión de imágenes
Cultivos primarios de células epiteliales y endoteliales renales
600 ×
200 ×
Glomérulos2° digestión
con colagenasa
Cultivo de la suspensión
celular
1° digestión con
colagenasa
Túbulos
CEGH
CERH
A- Control, 72hs B- Stx2 10ng/ml, 24hs
C- Stx2B 100ng/ml, 24hs D- Stx2B 100ng/ml, 72hs
200×
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Control Stx2 10 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 72 h
Áre
a ce
lula
r, %
Con
trol
0
20
40
60
80
100
120
Control Stx2 10 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 24 h Stx2B 100 ng/ml, 72 h
Núm
ero
de c
élul
as, %
Con
trol
Stx2 altera la morfología de las células les renales-CERH
Pistone et al., Microbes and Infection 8: 410, 2006
Stx2 inhibe la viabilidad celular y síntesis de proteínas y produce apoptosis
Stx2 CERH 24h
0
25
50
75
100
10-6 10-5 10-4 10-3 10-110-2 100
Stx2 (µg/ml)
Viab
ility
(%)
7.7%
G2/M
G1Control, 72 h
A
G1
G2/M
Stx2, 10 ng/ml 72 h
55.4%
Perfil de fluorescencia de CERH marcadas con ioduro de propidio
Silberstein et al Pediatric Nephrol 23: 1981, 2008
Stx2 inhibe la absorción de agua de CERH
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240
20
40
60
80
100 ApoptosisNecrosis
*
Tiempo (h)C
EGH
(%)
Acción de Stx2 en cultivos primarios de CEGH
Time (h)
Apoptotic cells(%)
Necrotic cells(%)
0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
1 10.0 ± 3.0 19.0 ± 6.0
2 12.0 ± 3.1 22.0 ± 4.5
4 5.2 ± 0.1 41.0 ± 15.3
6 19.0 ± 16.2 12.0 ± 3.0
24 36.1 ± 14.2 69.5 ± 25.0
Stx2, 10 ng/ml
Control200×
Stx2, 24 hsStx2, 4 hs
Amaral et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos
0
25
50
75
100
10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100
Stx2 (µg/ml)
***
Stx2 CEGH 24h
Viab
ility
(%)
Contrastes de fase Gb3 fusión de imágenes
Gb3 es localizado en la superficie de las células endoteliales por inmunocitoquímica con anti-CD77
marcado con FITC y microscopio confocal
600×
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 240
20
40
60
80
100ApoptosisNecrosis
*
*
Tiempo (h)
CEG
H (%
)
0
25
50
75
100
10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
SubAB (µg/ml)
* * **
100
Viab
ility
(%)
Time (h)
Apoptotic cells(%)
Necrotic cells(%)
0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0
1 22.0 ± 3.3 19.0 ± 4.0
2 22.3 ± 3.0 13.5 ± 3.0
4 26.0 ± 7.0 18.5 ± 7.1
6 37.4 ± 2.5 20.0 ± 5.0
24 66.1 ± 11.5 17.0 ± 5.0
SubAB, 3 µg/ml
Control200×
Control SubAB, 6h SubAB, 24h
Acción de Subtilasa en cultivos primarios de CEGH
Inhibidores específicos de la síntesis del receptor Gb3
GlcCer (GL1) LacCer Gb3
UDP-Gluc
CeramidaGlcCer sintasa
Genz-C-9 en experimentación
Miglustat Zavesca. Actelion Pharm Lab
Inhibidores de GLCer sintasa
1R, 2R)-nonanoic acid [2-(2’,3’-dihydro-benzo [1-4]dioxin-6’-yl)-2-hydroxy-1-pyrrolidin-1-ylmethyl-ethyl]-amide-L-tartaric acid salt
N-butyldeoxynojirimycin (NBDNJ)
Aprobado por ANMAT para Enfermedad de Gaucher
C-9 inhibe la síntesis del Gb3 e impide la acción de Stx2 sobre CERH
Silberstein et al J Epith Biol Pharmacol 1: 71, 2008
C-9 impide la apoptosis de CERH y protege la proliferación celular
Velazquez et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos
C9 (µM) % Viabilidad 24 h C9
% Viabilidad24 h C9 , 24 h Stx2
0 94.0 ± 1.2 54.0 ± 1.5
0.05 80.1 ± 7.3 72.1 ± 4.3
0.5 85.0 ± 3.6 87.0 ± 10.0
1 87.5 ± 3.5 87.3 ± 7.3
5 83.2 ± 8.6 93.0 ± 8.50.00 0.05 0.50 1.00 5.00 0.00 0.05 0.50 1.00 5.000
25
50
75
100C9 + Stx2 (10ng/ml)
C9 + SubAB (3µg/ml)*
C9 (µM)
Viab
ility
(%)
Amaral et al., VTEC2012, Amsterdam, Países Bajos
Ct C90.0
0.5
1.0
1.5
Gb3
( µg/
1.1
06 CEG
H)
St Gb3 CEGH
2 µg 1 µg Ctrl + C9
ensayo enzimático
fluorométrico
Cromatografía en capa delgada
C-9 inhibe los receptores Gb3 e impide la acción de Stx2 en CEGH
0 100 200 300 500 750 10000
50
100
150MGMG + Stx2 (10ng/ml)
** * * * *
MG (µM)Vi
abili
ty (%
)
Miglustat impide la acción de Stx2 en CERH y CEGH
Amaral et al, VTEC2012, Amsterdam, Países BajosVelaquez et al. VTEC2012, Amsterdam,Paises Bajos
CERHCEGH
Ratas SD fueron inoculadas con 1-4 ml sobrenadante de cultivo de E. coli recombinante que expresa Stx2 y contiene LPS (sStx2).
LD50: 3 ml que expresa 5µg Stx2 y contiene 120 ng LPS produce una mortalidad del 50% en 48 hs.
Modelo experimental de SUH en ratas
Zotta et al, Pediatric Nephrol 23: 559, 2008
*P < 0,01 ratas controles
comparadas con ratas experimentales
Ratas controles Ratas Experimentales
Tiempo de tratamiento 24 h 48 h 24 h 48 h
Peso del animal (g) 251 ± 4 (6) 245 ± 8 (6) 257 ± 5 (6) 192 ± 4* (6)
Ingesta de comida (g) 11,9 ± 0,4 (6) 12,3 ± 0,5 (6) 9,5 ± 0,6 (6) 7,4 ± 0,8* (6)
Ingesta de agua (ml/día) 42,1 ± 1 (6) 43,0 ± 2,0 (6) 57,9 ± 8,9* (6) 20,5 ± 0,1* (6)
Volumen de orina (ml/día) 25,1 ± 4,0 (6) 19,1 ± 1,8 (6) 39,2 ± 1,0*(6) 13,0 ± 3,0 (6)
Creatinina plasmática (µmol/l) 41 ± 2 (6) 43 ± 2 (10) 98 ± 2* (6) 124 ± 1,0* (10)
Urea plasmática (mmol/l) 6,1 ± 0,2 (6) 6,4 ± 0,3 (10) 24,0 ± 2,0* (6) 31,0 ± 2,0* (10)
Clearance creatinina (ml/min) 1,0 ± 0,2 (6) 1,1 ± 0,2 (6) 0,53 ± 0,01* (6) 0,10 ± 0,02* (6)
Ratas controles Ratas Experimentales
N° plaquetas (×109/l) 84 ± 0,2 (10) 33 ± 0,3* (10)
N° leucocitos (×109/l) 7,3 ± 0,1 (10) 11,2 ± 0,2* (10)
Hb (mg/100 ml) 14,5 ± 1,3 (10) 9,7 ± 2,0* (10)
Hto (%) 41,3 ± 2,6 (10) 21 ± 5* (10)
LDH (U/l) 308 ± 102 (4) 9736 ± 95* (4)
Parámetros fisiológicos en ratas con SUH
Daños histológicos en riñón
Necrosis glomerular y tubular, trombos capilares y re-duplicación de la membrana basal. 1000×.
H&E JMS
H&fosfotúngstica Control
* * *
Control
Inmunolocalización de Stx2 en riñón
Inmunolocalización de la toxina en membrana basal y citoplasma de túbulos renales y mesangio glomerular
Acción del C-9 en el modelo de SUH en ratas
Silberstein et al. Pediatric Res 69: 390, 2011.
- 2d -1d 0 1d 2d
Genz-C-9 oral10-15 mg/día/rata
Stx2
sacrificio para estudios de
órganos
sobrevivencia
C-9 evita la insuficiencia renal aguda
Control 1 día Stx2C-9 administrado 2 días antes
y 1 día después de Stx2
C-9 evita los daños histológicos producidos por Stx2
La mortalidad por Stx2 disminuye por previa incubación con Genz-C-9
- 2 - 1 + 1 + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 +70
IngestaDiarrea
Resolución espontánea ~ 85%
SUH ~ 15%
Ventana para intervenir
PREVENIR LA INFECCION POR STEC
La progresión de la infección por STEC en niños
Laboratorio de Fisiopatogenia
Investigadores
María Marta Amaral, Dra Cs BiológicaClaudia Silberstein, Dra Cs FisiológicasElsa Zotta, Dra Medicina
Doctorandos
Elizabeth Gerhardt, Lic Cs BiológicasFederico Ochoa, médicoNatalia Velazquez, Lic. Cs Biológicas
Colaboradores
Dr Horacio A RepettoDepto Pediatría, Facultad de Medicina, UBA
Dra Marta Rivas, Sección Fisipatogenia, ANLS-Malbrán
Dr Mariano Gimenez, Hospital de Clínicas, UBA
Dr James PatonUniversidad de Adelaida, Australia
Asociación Lucha contra el Síndrome Urémico Hemolítico –LuSUH-: www.lusuh.org.arLatin American Coalition for Escherichia coli Research –LACER-: http://microbiology.utmb.edu/lacer/index.html
Agradecimientos