Diversificación de la producción de estilbenos en cultivos celulares de vid mediante ingeniería

metabólica

Ascensión Martínez Márquez

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Departamento de Agroquímica y Bioquímica

Facultad de Ciencias

Diversificación de la producción de estilbenos en cultivos celulares de vid mediante ingeniería

metabólica

Ascensión Martínez Márquez

Tesis presentada para aspirar al grado de Doctora en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Alicante

Mención de doctora internacional

Programa de doctorado en Biologia experimental y aplicada

Dirigida por: Roque Bru Martínez

Alicante 2016

La Dra. Dª. MARIA JOSÉ BONETE PÉREZ, Directora del Departamento de

Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de Alicante,

CERTIFICA

Que los trabajos experimentales conducentes a la elaboración de la presente memoria

titulada “DIVERSIFICACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ESTILBENOS EN CULTIVOS

CELULARES DE VID MEDIANTE INGENIERÍA METABÓLICA” presentada por Dª.

ASCENSIÓN MARTÍNEZ MÁRQUEZ para aspirar al grado de Doctora han sido

realizados en el Departamento de Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de

Alicante bajo la dirección del Dr. D. ROQUE BRU MARTÍNEZ.

Y para que conste a los efectos oportunos firmo el presente certificado en Alicante, a

28 de noviembre de 2016

Fdo: Maria José Bonete Pérez

El Dr. D. ROQUE BRU MARTINEZ, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular

del Departamento de Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de Alicante,

CERTIFICA

Que los trabajos conducentes a la elaboración de la presente memoria titulada

“DIVERSIFICACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ESTILBENOS EN CULTIVOS

CELULARES DE VID MEDIANTE INGENIERÍA METABÓLICA” presentada por Dª.

ASCENSIÓN MARTÍNEZ MÁRQUEZpara aspirar al grado de Doctora, han sido

realizados bajo mi dirección.

Y para que conste a los efectos oportunos firmamos el presente certificado en

Alicante, a 28 de noviembre de 2016

Fdo: Roque Bru Martínez

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de ciencia e innovación (Proyectos:

BIO2011-29856-C02-01, BIO2011-29856-C02-02 y BIO2014-51861-R), Conselleria

d’Educacio, Cultura I Sport de la Generalitat Valenciana (FPA/2013/A/074) y por

Fondos Europeos de Desarrollo Regional (FEDER).

Los resustados de este trabajo han sido publicados en los siguientes artículos:

Martínez-Márquez A, Morante-Carriel J, Ramírez-Estrada K, Cusidó R. M, Sellés-

Marchart S, Palazon J, PedreñoM.A, Bru-Martínez R (2015) A reliable protocol for

the stable transformation ofnon-embryogenic cells cultures of grapevine

(Vitisvinifera L.) and Taxus x media.Journal of Biological Methods Vol. 2(2) e21.doi:

10.14440/jbm.2015.51.

Martínez-Márquez A, Morante-Carriel J, Ramírez-Estrada K, Cusidó R. M, Palazon J,

Bru-Martínez R (2016)Production of highly bioactive resveratrol analogues

pterostilbene and piceatannol in metabolically engineered grapevine cell

cultures. Plant Biotechnology Journal, pp. 1–13. doi: 10.1111/pbi.12539.

Agradecimientos

Me gustaría expresar en estas líneas mi agradecimiento a todas las personas que de algún modo han contribuido a lo largo de estos años a la realización de este trabajo tanto fuera como dentro del laboratorio.

En primer lugar, a mi director de tesis, el Dr. Roque Bru Martínez por la importante contribución a mi formación durante todo este tiempo. Agradecerle su constante dedicación, su apoyo y su forma de ser paciente y comprensivo. Gracias por todo.

A mis compañeros de laboratorio: Susana, María José, Juan Carlos, Mayte, Jaime, Antonio y Juanjo, con los que he compartido muchos momentos haciendo que el laboratorio sea una segunda casa. Gracias a todos por su inestimable ayuda en la ejecución de esta tesis, porque con todos y cada uno he aprendido algo, por su apoyo, consejos y amistad.

Al resto de compañeros del Departamento de Agroquímica y Bioquímica, por vuestra ayuda y ánimos durante todo este tiempo. Especialmente a mis compañeras de batalla, Anna y Virginia (en el inicio). Gracias por todos estos años de amistad y aventuras no solo por los pasillos y los laboratorios sino fuera de ellos.

Agradecer a las personas de otros departamentos e instituciones que me han ayudado y han contribuido en este trabajo y en mi formación: Al Dr. Jose Martín Nieto y en especial a las chicas del laboratorio Carmen y Mary, del Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. A la Dra. Mª Ángeles Pedreño y sus chicas, especialmente a Lorena, de la Universidad de Murcia. A los Dres. Javier Palazón y Rosa Mª Cúsido, y todos los que conforman el laboratorio, de la Universidad de Barcelona. Gracias a todos por recibirme en vuestros laboratorios con la mayor simpatía y agrado, poniendo a mi disposición todo aquellos que he necesitado.

Como olvidar a los compañeros y amigos: Alba, Pedro, Rebeca, Lamia, Noelia. Gracias por todos los momentos vividos. Me siento afortunada de haber podido contar con vosotros. A Rubén, mi gran compañero y amigo, quien ha estado a mi lado sufrido conmigo parte de este trabajo, gracias por tu cariño, paciencia, compresión y respeto.

Y por último y no menos importante, a mis padres: Antonio y Asun, y mi hermano Antonio, a quienes va dedicada esta tesis, por vuestra comprensión, esfuerzo y apoyo incondicional, esto no hubiera sido posible sin vosotros. Gracias por quererme sin más. No puedo olvidar a mis abuelos: Argimiro y Ascensión, “los abuelitos”, a quien también va dedicada esta tesis, por todo el cariño que siempre me han transmitido.

Gracias a todos.

i

ÍNDICE

Introducción

I. Metabolismo de estilbenos y cultivo celular de vid……………………………………..…... 1 I.1. Estilbenos.……………………………………………………………………………....... 1

I.1.1. Síntesis de estilbenos……………………………………………………....……... 1 I.2. Resveratrol…………………………………………………………………..…….…….. 3 I.3. Pterostilbeno……………………………………………………………………………… 6 I.4. Piceatanol…………………………………………………………………………………. 7 I.5. Elicitores…………………………………………………………………………………….. 8 I.6. Cultivo de células vegetales como fuente para la producción de metabolitos……… 9

I.6.1. Cultivo celular de vid como biofactorias para la producción de resveratrol….. 11 I.7. Mejora genética e ingeniería genética de vid: Aplicación al metabolismosecundario………………………………………………………………………………………. 18

II. Transformación vegetal……………………………..……………………………………….. 22 II.1. Ingeniería metabólica en un sistema de cultivo celular……………………............... 22 II.2. Requisitos biológicos para la transformación de cultivos celulares…………………. 23 II.3. Métodos de transferencia génicam directa………..……...………………………….. 24

II.3.1. Transferencia génica de protoplastos mediante compuestos químicos……... 25 II.3.2. Electroporación…………………………………………………………………….. 25 II.3.3. Bombardeo de partículas (biolística)…………………...……………………… 26

II.4. Transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens…………………… 27 II.4.1. Cocultivo………………………………………………………………………….. 30 II.4.2. Agroinfiltración………………..………………………………………………….. 31 II.4.3. Agro-drenching………………………………………………………………….… 32

II.5. Vectores………………………………………………………………………………….. 33 II.5.1.Vectores basados en plásmido Ti……………………………………………… 33

II.5.1.1. Sistema de clonación Gateway……………………………………….. 33 II.5.2. Vectores de transformación directa y casettes lineales……………………... 36 II.5.3. Vectores virales…………………………………………………………………... 37

Referencias……………………………………………………………………………………… 38

Objetivos……………………………………………………………………………………….… 55

CAPÍTULO 1: A reliable protocol for the stable transformation of non-embryogenic cells cultures of grapevine (Vitis vinifera L.) and Taxus x media

Abstract............................................................................................................................ 60 Introduction…………………………………………………………………………………..... 60 Material and Methods…………………………………………………………………….….. 62

Plant material…………………………………………………………………………….… 62 Transformation reagent ………………..…………………………………………………. 63 Transformation Protocol …………………………………………………...…………….. 63 Fluorescence microscopy ……………………………………………………….……….. 64 DNA extraction, amplification and analysis…………………......................................... 65 Protein extraction and analysis…………………………………………………………... 65 Elicitation of transformed grapevine cell culture and resveratrol analysis………......... 66

Results…………………………………………………………………………………………… 67 Establishment of Vitis/Taxus-transformed cell culture.……........…………………….. 67 Molecular characterization of Vitis/Taxus -transformed cell culture………….……... 70 Extracellular accumulation of stilbenoids in grapevine cell cultures upon elicitation 72

Discussion…………………...…………………………………………………………...…… 73 References……………………………………………………………………..…….………… 78

ii

CAPÍTULO 2: Production of highly bioactive resveratrol analogues pterostilbene and piceatannol in metabolically engineeredgrapevine cell cultures

Abstract............................................................................................................................ 86 Introduction…………………………………………………………………………………..... 87 Material and Methods…………………………………………………………………….….. 90 Plant material…………………………………………………………………………….… 90

Reagents…………………………………..…………………………………………………. 90 Plant material preparation for gen cloning……………………………….....…………….. 91 RNA isolation and cloning of ROMT and STS cDNA……………………………...…….. 91 Construction of the binary vector and Agrobacterium transformation.…...................... 92 Transient expression in Nicotiana benthamiana…………………………………………. 93 Stable transformation of grapevine cell culture………………………………………… 93 DNA extraction, amplificationand analysis………………………………………………... 94 Protein extraction and western blot………………………………………………………... 94 ROMT enzyme assay……………………………………………………………………….. 95 Elicitation of transformed grapevine cell cultures………………………….………......... 95 Determination of stilbenoids………………………………………………………………... 95

Results…………………………………………………………………………………………… 96 Biosynthesis of resveratrol derivatives in Nicotiana leaves…………………………….. 96 Establishment of grapevine transformation cell culture..……........…………………….. 98 Molecular characterization of grapevine transformed cell culture……………………… 98 Accumulation of stilbenoids in grapevine cell cultures upon elicitation………………... 101

Discussion…………………...…………………………………………………………...…… 105 Concluding remarks…………………………………………………………………………. 111 References……………………………………………………………………..…….……….…113

CAPÍTULO 3: A tau class glutathione-S-transferase is involved in trans-resveratrol transport out of grapevine cells

Abstract............................................................................................................................ 119 Introduction…………………………………………………………………………………..... 119 Material and Methods…………………………………………………………………….….. 123

Plant material…………………………………………………………………………….… 123 Elicitor or adsorbent compounds treatments……………………………………………... 123 DIGE analysis………………………………………………………………………………... 123 RNA isolation, cDNA synthesis and real-time quantitative PCR……………………….. 124 Cloning of VvGST-2 cDNA…………………………………………………………………. 124 Construction of binary vector and Agrobacterium transformation……………………… 125 Transient expression assay in grapevine cells…………………………………………… 125 Stable transformation of grapevine cell culture…………………………………………... 126 Molecular characterization of transformed grapevine cell cultures…………………….. 127 Analysis of stilbenoids………………………………………………………………………. 127 Statistical analysis…………………………………………………………………………… 128

Results……………………………………………………………………………………………128 Paralogs of GST co-express with t-R biosynthetic proteins and genes and correlate with t-R extracellular accumulation…………………………………………… 128 V. vinifera cv. Gamay cell cultures can be stably transformed with GST-2

under constitutive expression………………………………………………………………. 133 Constitutive expression of GST-2 in grapevine cells leads to extracellular production of trans-resveratrol…………………………………………………………….. 136 VvGST-2 is a membrane-associated protein…………………………………………….. 140

Discussion…………………...…………………………………………………………...…...… 141 References……………………………………………………………………..…….………… 146

iii

Conclusiones…………………………………………………………………………………… 153 Anexo 1…………………………………………………………………………………………... 159 Anexo 2…………………………………………………………………………………………... 161 Anexo 3……………………………………………………………………………………..……. 166

v

Abreviaturas

4CL:4-cumaril-CoA ligasa

AS: acetosiringona C4H: cinamato 4-hidroxilasa

CDs: ciclodextrinas

CHS: chalcona sintasa

c-R:cis-resveratrol

CYP1B1: citocromo P450 hidroxilasa 1B1

CYP1A2: citocromo P450 hidroxilasa A2

DIMEB: 2,6-di-O-metill-β-ciclodextrina

DW: peso seco

EDTA: ácido etilén-diamino-tetraacético

DIGE: “diferential in gel electrophoresis”

DTT: ditiotreitol

FW: peso fresco

GST: glutatión-S-transferasa

HPLC:cromatografia líquida de alta presión

HPLC-MS: cromatografia líquida de alta presión-espectrometría de masas

JA: ácido jasmónico

JM: jasmonato de metilo

MBCD: 2,6 dimetil-β-ciclodextrina

MeJA: metil jasmonato

NEC: cultivos no embriogénicos

PA: proantocianidinas

PAL: fenilalanina amonioliasa

PEG: polietilenglicol

PKS: policétido sintasa

PMSF:fluoruro de fenilmetilsulfonilo

PVP: polivinilpirrolidona

vi

qRT-PCR: PCR cuantitativa en tiempo real

RAMEB: β-ciclodextrinas aleatoriamente metiladas

ROMT: resveratrol O-metiltransferasa

SAM: S-(5´-Adenosil)-L-metionina clorido dihidrocloruro

SDS: dodecilsulfato sódico

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico

SNPs: polimorfirmo de un solo nucleótido

STS: estilbeno sintasa

TFE: trifluoroetanol

TLC: cromatografia en capa fina

t-Pc: trans-piceida

t-Pn: trans-piceatanol

t-Pt: trans-pterostilbeno

t-R: trans-resveratrol

UV: Ultravioleta

XIC: cromatograma de ion extraído

vii

Resumen

El auge de la utilización de los cultivos celulares vegetales para la producción de

metabolitos secundarios de interés, debido a su importancia biosanitario,

farmacológico y/o industrial, esta promoviendo la busqueda de estrategias eficientes

para la obtención de altas producciones. En el caso de los cultivos celulares no

embriogénicos de vid (Vitis vinifera) la respuesta, ante patógenos y elicitores, es la

inducción de la síntesis y acumulación extracelular de estilbenos. Grandes cantidades

de trans-resveratrol (t-R) se producen cuando las células se estimulan con

ciclodextrinas metiladas (MBCD), solas o combinadas con jasmonato de metilo

(MeJA). La obtención de cultivos celulares con mayor capacidad de biosíntesis y

acumulación extracelular de resveratrol o capaces de convertilo en derivados

bioactivos naturales ha hecho que se plante la utilización de otras estrategias como la

ingeniería metabólica. La aplicación de esta tecnología de transformación genética en

cultivos no embriogénicos en general, y en particular, de vid, es limitada. Eficientes

métodos de transformación son una prioridad para aplicar con éxito la ingeniería

metabolica. En esta tesis, el desarrollo de un método fiable y eficiente, mediado por

Agrobacterium, para la transformación de cultivos celulares de vid (Vitis vinifera

cv.Monastrell y cv. Gamay) ha sido puesto a punto, obteniéndose líneas celulares

transgénicas mantenidas durante más de 15 meses sin perdida de la expresión del

gen integrado, y sin efectos perceptibles en el crecimiento celular y en la acumulación

extracelular de t-R en comparativa con las líneas no transformadas. Un promedio de la

estimación de la eficiencia de transformación obtenida mediante este método ha sido

de 20 y 17 callos transformados por gramo de peso fresco en Vitis vinifera cv.

Monastrell y cv. Gamay, respectivamente, manteniéndose de 90-95% de los callos

obtenidos bajo continua selección. El establecimiento de un método de transformación

es el primer paso para mejorar la ruta de biosíntesis de estilbenos, de t-R y derivados

de t-R. El t-R tiene una actividad farmacológica demostrada, sin embargo los

derivados de t-R como pterostilbeno o piceatanol, presentan mayor biodisponibilidad

viii

oral y bioactividad que el t-R, pero son mucho menos abundantes en fuentes

naturales. Por lo tanto, para obtener de manera eficiente estos derivados hay una

necesidad de desarrollar nuevos sistemas de bioproducción. En este trabajo, se ha

diseñado una estrategia combinantoria de la elicitación con MBCD y MeJA, como

punto de partida para la obtención de t-R, junto con la expresión constitutiva de

resveratrol O-metiltransferasa de vid (VvROMT) o hidroxilasa citocromo P450 humana

(HsCYP1B1) para la producción de pterostilbeno y piceatanol, respectivamente, en

cultivos transformados. Los cultivos celulares de vid elicitados transformados con el

enzima VvROMT produjerón pterostilbeno, el cual fue detectado intra y

extracelularmente, en una nivel de microgramos por litro. Los cultivos celulares de vid

elicitados transformados con el enzima HsCYP1B1 produjerón alrededor de 20 mg/L

de cultivo de piceatanol, mostrando un aumento de siete veces en relación con el

cultivo silvestre, y alcanzó una distribución extracelular de hasta el 45% de la

producción total. El transporte del t-R tiene una gran relevancia biotecnológica y

fisiológica; sin embargo tales vías, en su mayoría, son desconocidas. Un experimento

de proteómica diferencial, DIGE, se llevo a cabo para explorar los perfiles de expresión

de proteínas biosintéticas de t-R y de otras proteínas que cuya coexpresión mostrarán

potenciales proteínas implicadas en dicha respuesta celular. La correlación de

glutation-S-transferasas (GSTs) de clase tau con varias isoformas de estilbeno sintasa,

fenilalanina amonioliasa y la producción de t-R junto con análisis de qRT-PCR hizo

posible el establecimiento de un candidato, GST-2. La expresión constitutiva de GST-2

en cultivos celulares de vid sin elicitar produjo una acumulación extracelular de t-R,

sobretodo cuando los medios de cultivo contenían compuestos adsorbentes de t-R

como PVP y β-ciclodextrina. Además, la expresión transitoria de GST-2 fusionada con

GFP en células de vid mostró una doble localización, membrana plasmática y

tonoplasto, evidencia que apoya la participación de unaGST específica de la clase tau

en el transporte de t-R al medio extracelular.

Introducción :

Introducción

1

I. Metabolismo de estilbenos y cultivo celular de vid

I.1. Estilbenos

Los estilbenos son compuestos fenólicos de bajo peso molecular que se localizan de

manera específica como compuestos bióticos inducidos o fitoalexinas en tejidos de plantas

no lignificadas (Langcake y Pryce, 1976), y de manera general como resultado de síntesis

constitutiva en tejidos lignificados (Bavaresco y Fregoni, 2001). Además de encontrarse en

la familia Vitaceae, los estilbenos se sintetizan en una serie de familias de plantas,

incluyendo Pinaceae, Myrtaceae, Fagaceae, Liliaceae, Moraceae y Papilionaceae (Morales

et al., 2000). Dichos estilbenos actúan como compuestos antifúngicos, lo cual permite a la

planta superar un ataque de patógenos. Los estilbenos de vid incluyen varios compuestos

que derivan de la estructura de trans-resveratrol (t-R, 3,4', 5-trihidroxiestilbeno), y se pueden

encontrar en formas monómericas u oligómericas, como dímeros, trímeros y tetrámeros.

I.1.1. Síntesis de estilbenos

En la familia Vitaceae, los estilbenos, como otros compuestos fenólicos, derivan

biosintéticamente de la vía fenilpropanoide (Figura 1). La síntesis de estilbeno está regulada

por el desarrollo de los diferentes tejidos y tipos celulares, pero también se puede activar en

respuesta al estrés ambiental, como heridas, infección por patógenos o radiación UV

(Morales et al., 2000). El primer enzima de la vía fenilpropanoide, la fenilalanina amonioliasa

(PAL) cataliza la producción de ácido cinámico a partir de fenilalanina. El ácido cinámico es

hidroxilado en posición 4 por el enzima cinamato 4-hidroxilasa (C4H) convirtiéndose en

ácido p-cumárico. Posteriormente, el enzima 4-cumaril–CoA ligasa (4CL), liga CoA al ácido

p-cumárico para producir p-cumaril-CoA. El t-R se sintetiza como un producto final mediante

la condensación de una molécula de p-cumaril-CoA con tres moléculas de malonil-CoA en

una reacción catalizada por la estilbeno sintasa (STS). La última reacción compite por sus

substratos con la vía de flavonoides, en la que interviene el enzima chalcona sintasa (CHS)

en la condensación de p-cumaril-CoA con tres moléculas de malonil-CoA para producir un

compuesto diferente, la chalcona.

Introducción

2

Figura 1

Esquema simplificado de la ruta biosintética de estilbenos. Los estilbenos se derivan de la vía fenilpropanoide gracias a STS. Una ruta alternativa es la síntesis de flavonoides gracias a CHS

STS es un miembro de la superfamilia de chalcona sintasa de Tipo III policétido

sintasas (PKS) (Austin y Noel, 2003; Flores-Sánchez y Verpoorte, 2009; Yu y Jez, 2008).

Las CHSssonPKSs ubicuas en plantas, que catalizan el primer paso de la ruta de biosíntesis

de flavonoides. En contraste, las STSs, que comparten entre el 75 y 90% de identidad de

secuencia de aminoácidos con CHSs, se encuentran en un número limitado de especies de

plantas (Morales et al. 2000). Las más conocidas son las de cacahuete (Schöppner y Kindl,

1984), vid (Melchior y Kindl, 1991; Wiese et al., 1994) y varias especies de pino (Fliegmann

et al., 1992). El análisis filogenético de las familias de genes STS y CHS mostró que los

genes de STS han evolucionado de manera independiente de los genes de CHS varias

veces en el transcurso de la evolución (Tropf et al., 1994). Tras la secuenciación del genoma

de vid, el análisis de las secuencias confirmaron el gran tamaño de esta familia multigénica,

Introducción

3

con un número estimado de 20-40 genes de STS (Jaillon et al., 2007; Velasco et al., 2007).

Es de destacar que la familia de genes de fenilalanina amonio liasa (PAL), que codifica para

el primer enzima de la vía fenilpropanoide, se ha expandido en paralelo a la familia de genes

STS en Vitis. De hecho, la familia PAL la forman 13 genes en vid, mientras que sólo

contiene 4-8 miembros en Arabidopsis thaliana, arroz y álamo (Velasco et al., 2007). En

plantas monocotiledóneas, la caracterización funcional de un gen CHS-like de Sorghum

bicolor identificó la proteína codificada como una estilbeno sintasa (Yu et al., 2005). Este

gen, llamado SbSTS1, fue el primer ejemplo de estilbeno sintasa en plantas

monocotiledóneas.

I.2. Resveratrol

Estructuralmente, el t-R tiene una fórmula molecular de C14H12O3, con un peso

molecular de 228,25 g/mol y consta de dos anillos aromáticos unidos por un puente vinílico.

La presencia del doble enlace facilita la isomerización espontánea de trans- a cis- del

resveratrol bajo luz UV (Siemann y Creasy, 1992) (Figura 2). Aunque la forma trans es la

más abundante en la naturaleza (Jayatilake et al., 1993; Gorham et al., 1995), se han

reportado que se produzcan isómeros cis (Jeandet et al., 1995; Ingham, 1976).

Figura 2

Estructura molecular de trans- y cis- resveratrol. La isomerización se produce de forma espontánea bajo radiación UV.

La síntesis de estilbenos puede ser constitutiva o inducida por un gran número de

estreses bióticos y abióticos (Ku et al., 2005; Tassoni et al., 2005; Bru et al., 2006; Kiselev et

t-R c-R

hʋ

Introducción

4

al., 2007). En vid el t-R se acumula en las bayas, principalmente en el exocarpo o piel

durante todo el desarrollo del fruto. Las STSs se expresan en el exocarpo de las bayas a lo

largo del desarrollo y sus niveles disminuyen significativamente en paralelo con el metabolito

en bayas maduras (Fornara et al., 2008).

La piel de uva contiene de 50 a 100 µg de resveratrol por gramo fresco, y la

concentración en el vino puede variar desde 0,1 a 12 mg por litro (Goldberg et al., 1994;

Jeandet et al., 1991; Okuda and Yokotsuka, 1996). El hallazgo epidemiológico de una

relación inversa entre el consumo de vino tinto y la incidencia de enfermedades

cardiovasculares fue nombrado como "the french paradox", lo cual es consistente con la

conocida bioactividad del t-R (Renaud and de Lorgeril, 1992; Bors and Michael, 2002). El

resveratrol presenta actividad antioxidante, anti-trombogénica, anti-inflamatoria,

cardioprotectora, neuroprotectora, y actividad preventiva y terapéutica de cáncer

(Ramprasath and the Jones, 2010; Jang et al., 1997; Hung et al., 2000). Resultados fiables

proporcionan ideas interesantes sobre el efecto de este compuesto en el aumento de la

esperanza de vida de levaduras y mamíferos (Howitz et al., 2003; Baur et al., 2006). El t-R

activa a SIRT1 deacetilasa dependiente de NAD (SIR2 en la levadura) y aumenta la

supervivencia celular mediante la estimulación de SIRT1-dependiente de desacetilación de

p53. SIRT1 es un modulador aguas abajo de las vías de restricción calórica que produce

efecto beneficioso sobre la homeostasis de la glucosa, la sensibilidad a la insulina y el

aumento de la esperanza de vida (Howitz et al., 2003; Baur et al., 2006).

En la planta, el t-R sirve como sustrato para diferentes enzimas, algunas de las

cuales todavía no han sido caracterizadas, produciendo una amplia gama de derivados

(Figura 3). Las piceidas son producidas por glicosilación; la adición de un carbohidrato

puede alterar la hidrofilicidad, estabilidad, localización subcelular y la bioactividad de

productos naturales como estos (Gachon et al., 2005).Una proporción significativa del total

puede acumularse como glucósidos en especies de plantas productoras de estilbenos. En

bayas sanas de diferentes variedades de uva se acumulan 0.29 a 4.19 y 0.48 a 4.18mg/kg

de cis- y trans-piceida, respectivamente (resveratrol 3-O-β-glucósido, Figura 3) (Gatto et al.,

Introducción

5

2008). La glicosilación de estilbenos se piensa que podría estar involucrada en su

almacenamiento vacuolar, el transporte desde el citoplasma al apoplasto, y en la protección

de la degradación peroxidativa (Morales et al., 1998). Otra razón para la glicosilación de

estilbenos por glucosiltransferasas no específicas endógenas, y posterior almacenamiento

en vacuolas, es como una forma de proteger a las células de efectos potencialmente tóxicos

de los estilbenos (Hipskind y Paiva, 2000). Hasta la fecha solo se ha descrito una enzima

con actividad glicosilante de resveratrol pero no específica, también utiliza ácidos

hidroxicinámicos (Hall and De Luca, 2007)

Figura 3 Metabolismo del resveratrol Un gran número de estilbenos naturales son oligómeros, dímeros, trímeros y

tetrámeros derivados del acoplamiento oxidativo de resveratrol o derivados de resveratrol.

La diversidad de oligómeros de estilbenos y los posibles mecanismos que conducen a su

formación han sido revisados (Morales et al., 2000). Los oligómeros de resveratrol se

Introducción

6

denominan viniferinas (Figura 3). Aunque se han hecho considerables progresos en el

estudio de la biosíntesis de t-R, la enzimología de la síntesis de viniferinas en vid es aún

incompleta. Hasta ahora, la peroxidasa se ha considerado el único enzima de plantas

asociado con la oxidación de t-R a viniferinas (Morales and Ros Barceló, 1997; Morales et

al., 1997; Szewczuk et al., 2005) a través de un proceso similar a la formación de oligómeros

de lignanos (Langcake and Pryce, 1977 a, b).

I.3. Pterostilbeno

Schmidlin et al. 2008 descubrieron el enzima Resveratrol O-metiltransferasa (ROMT)

como el responsable de catalizar la metilación del resveratrol para producir pterostilbeno

(Schmidlin et al., 2008, Jeong et al., 2014). Este también ha sido identificado como una

fitoalexina de vid, encontrándose en bayas de uva sanas como estilbeno constitutivo (Pezet

y Pont, 1988). El pterostilbeno junto con el resveratrol y sus derivados piceidas y viniferinas,

se acumulan en las hojas de vid infectadas por Plasmopara viticola (Langcake et al., 1979).

Ademas, también se produce en bajas cantidades durante la preparación de protoplastos de

vid (Commun et al., 2003).

Existen varios derivados metilados de resveratrol de origen natural, incluyendo

pterostilbeno (3,5-dimetoxi-4'-hidroxi-trans-estilbeno; t-Pt) (Figura 3), 3,4',5-

trimetoxiestilbeno, pinostilbeno (3,4'-dihidroxi-5-metoxi-trans-estilbeno), y

desoxirapontigenina (3,5-dihidroxi-4'-metoxi-trans-estilbeno) (Wang et al., 2010). Evidencias

significativas sugieren que los derivados metilados de resveratrol son tanto o más efectivos

que el resveratrol con respecto a sus actividades antifúngica, quimioprotectora y antitumoral,

antioxidante, antiinflamatoria y neuroprotectora tal y como se indican para el compuesto

original, resveratrol (Adrian et al., 1997; Alessandro et al., 2000; Pérez et al., 2004; Chao et

al., 2010; Fulda et al., 2010; Rimando et al., 2002; Paul et al., 2009; Stivala et al., 2001;

Satheesh et al., 2006), y además con propiedades farmacocinéticas superiores (Remsberg

et al., 2008; Kapetanovic et al., 2010). Los estudios de relación estructura-actividad de

derivados de resveratrol son de gran interés para el desarrollo de agentes quimioprotectores

más estables y potentes.

Introducción

7

I.4. Piceatanol

El piceatanol es un derivado 3'-hidroxilado del resveratrol (trans-3,3',4,5'-tetrahidroxi-

estilbeno; t-Pn), que se encuentra en vid y otras plantas. Es un producto natural conocido

por sus propiedades antienvejecimiento, antiinflamatorias y sus efectos preventivos de

cáncer (Brisdelli et al., 2009). En los seres humanos, el piceatanol se produce como un

metabolito principal del resveratrol por hidroxilasas dependientes de citocromo P450,

CYP1B1 y CYP1A2, en microsomas de hígado (Potter et al., 2002; Piver et al., 2004).

Además, el metabolismo del t-R en dos metabolitos principales, piceatanol y otro

tetrahidroxiestilbeno, es catalizado por los enzimas recombinantes humanos CYP1A1,

CYP1A2 y CYP1B1 (Piver et al., 2004). Así, el resveratrol se considera que funciona como

un profármaco que es finalmente convertido en el principio activo piceatanol en el hígado

humano (Potter et al., 2002), demostrando funciones adicionales, como por ejemplo,

propiedades anticancerígenas. El piceatanol fue identificado como principio antileucémico

obtenido a partir de un extracto de planta (Ferrigni et al., 1984), que exhibía actividad de

inhibición de tirosina quinasa (Geahlen and McLaughlin, 1989). Estudios posteriores han

demostrado que inhibe una variedad de tirosina quinasas implicadas en la proliferación

celular, incluyendo las MAP quinasas (Fleming et al., 1995), la tirosina quinasa implicada en

la fosforilación de la tubulina (Peters et al, 1996), quinasas que están implicados en la

fosforilación de factores de transcripción (Su and David, 2000), y varias otras tirosina

quinasas que se sobreexpresan en diferentes tipos de cáncer (Thakkar et al., 1993), y

actividad antiparasitaria (Piotrowska et al., 2012),

Los estilbenos se clasifican como fitoestrógenos debido a su similitud estructural con

el estrógeno endógeno estradiol (Figura 4). La proteína CYP1B1 se expresa en células

tumorales yes conocido que tiene actividad de hidroxilación aromática, catalizando la

conversión de estradiol a 4- hidroxiestradiol (Spink et al., 1994; Hayes et al., 1996). Del

mismo modo, el resveratrol también puede sufrir hidroxilación aromática por CYP1B1 (Potter

et al., 2002; Piver et al., 2004).

8

Figura 4

Estructura molecular del resveratrol, piceatanol, estradiol, 4-hidroxiestradiol, diethilestilbentrol y 3,4,5,4'-tetrahidroxi-estilbeno. Cartografía del fitoestrógeno resveratrol en el marco de esteroides de estradiol.

I.5. Elicitores

Los elicitores son sustancias químicas procedentes de diversas fuentes que pueden

desencadenar respuestas fisiológicas y morfológicas, y la acumulación de fitoalexinas

(Bavaresco and Fregoni, 2001). Los elicitores pueden ser abióticos tales como la radiación

UV, iones metálicos y compuestos inorgánicos, y bióticos como hongos (Langcake and

McCarthy, 1979; Hoos and Blaich, 1989; Dercks et al., 1995; Adrian et al., 1996), bacterias

(Paul et al., 1998), virus o herbívoros, componentes de la pared celular vegetal, así como los

productos químicos que se liberan en las plantas por el ataque de patógenos o herbívoros

(Langcake and Pryce, 1976). En el último caso, los elicitores pueden ser liberados tras la

acción de enzimas secretadas en la infección de microbios o plantas. Es bien conocido que

Introducción

9

el tratamiento de las plantas con elicitores, o el ataque por patógenos incompatibles,

provoca una serie de reacciones de defensa, incluyendo la acumulación de una serie de

metabolitos secundarios defensivos tales como fitoalexinas en las plantas intactas (Darvill

and Albersheim, 1984) o en cultivos celulares (Bru et al., 2006; Lijavetzky et al., 2008).

Existen varias clases diferentes de componentes que pueden sustituircompletamente

los elicitores fúngicos en el efecto de elicitación. Estos incluyen poli- u oligosacáridos tales

como la quitina, y quitosano (Rabea et al., 2003), xiloglucanos, laminarina y otros ß-

glucanos y sus fragmentos, y oligogalacturónidos (Darvill et al., 1984), proteínas (por

ejemplo, harpin (Wei et al., 1992) o elicitinas tales como criptogeina (Ricci, 1997) o péptidos

(por ejemplo, 13-pep (Brunner et al., 2002), sistemin, y flg22 (Felix et al., 1999)).

En vid, el t-R se sintetiza en las hojas y en el fruto debido a condiciones de estrés

biótico, causado por la infección con Botrytis cinerea (Jeandet et al., 1995; Bavaresco et al.,

1997; Keller et al., 2003), Plasmopara viticola (Langcake, 1981), Erysiphe necator (Romero-

Pérez et al., 2001), Rhizopus stolonifer (Sarig et al., 1997), Aspergillus sp. (Bavaresco et al.,

2003; Vezzulli et al., 2007). Además, extractos y productos de enzimas fúngicas de hongos

inducen la síntesis de viniferinas (Liswidowati et al., 1991; Calderon et al., 1993a). El

quitosano es un derivado de un componente estructural de la pared celular de los hongos

que imita un ataque de hongos (Ferri et al., 2009; Santamaria et al., 2011). El uso del

quitosano en cultivos de células de V. vinifera cv. Barbera estimula la producción endógena

de t-R. Los cultivos de células de V. vinifera cv. Gamay también responden a la presencia de

laminarina y oligogalacturónido (Poinssot et al., 2003) sintetizando t-R. Además, la

bioproducción de t-R en cultivos celulares de vid elicitados con oligosacáridos cíclicos como

ciclodextrinas (CD) (Morales et al., 1998; Bru et al., 2006) también ha sido demostrada.

I. 6.Cultivo de células vegetales como fuente para la producción de metabolitos

Una de las aplicaciones más interesantes y prometedoras del cultivo de células

vegetales es su uso como factorías biológicas para la producción de metabolitos a niveles

de viabilidad comercial.

Introducción

10

El cultivo de células vegetales se ha propuesto como un sistema valioso para la

producción de una amplia gama de metabolitos secundarios importantes desde un punto de

vista biotecnológico (Oksman-Caldentey and Inzé, 2004). Los metabolitos secundarios de

plantas son recursos únicos para productos farmacéuticos, cosméticos, nutracéuticos y

productos químicos. Aunque la extracción directa del materia prima vegetal y la síntesis

químicason las vías clásicas de obtención de los compuestos naturales, el cultivo de células

vegetales ha surgido como una prometedora alternativa para la producción de metabolitos

que son difíciles de obtener mediante síntesis química, que están presentes en cantidades

muy pequeñas en las plantas o cuando el material vegetal es difícil de obtener en

cantidades apropiadas.

Las células vegetales son biosinteticamente totipotentes, lo que significa que cada

célula en cultivo conserva la información genética completa y por lo tanto, tiene capacidad

para producir la gama de productos químicos que se encuentran en la planta madre. Las

ventajas de esta tecnología sobre la producción mediante agricultura convencional o

recolección de material silvestre son:

Independencia de las variaciones geográficas y estacionales, así como de diversos

factores ambientales.

Sistema de producción definido, que asegura el suministro continúo de productos,

calidad y rendimiento uniforme.

Permite la síntesis de compuestos que no se pueden obtener a través de recursos

agronómicos.

Evita la sobreexplotación de recursos naturales escasos o en peligro de extinción.

Los metabolitos secundarios que han sido aislados, hasta el momento, de tejidos y

cultivos en suspensión de plantas superiores se muestran en la Tabla 1.

Introducción

11

Tabla 1: (Adaptada de Stockigt et al., 1995) Fenilpronanoides Alcaloides Terpenoides Quinonas Esteroides

Antocianinas Acridinas Carotenos Antroquinonas Glicósidos cardiacos

Cumarinas Betalainas Monoterpenos Benzoquinonas Pregnenolono

Flavonoides Quinolizidinas Sesquiterpenos Naftoquinonas derivativas

Hidroxicinamoil derivativos

Furonoqui nonas

Diterpenos derivativos

Isoflavonoides Harringtoninas Triterpenos

Lignanos Isoquinolinas

Fenilpropenos Indoles

Proantocianidinas Purinas

Estilbenos Piridinas

Taninos Alcaloides tropano

El cultivo de células vegetales también se ha propuesto como un robusto sistema

para sintetizar proteínas biológicamente activas, ya que proporcionan ciertas ventajas sobre

plantas enteras y otros sistemas de expresión (Hellwing et al., 2004). Del mismo modo, las

suspensiones celulares de vid se ha utilizado para llevar a cabo diferentes estudios básicos,

tales como regulación del transporte de glucosa (Conde et al., 2006), detección de azúcar y

requerimientos de calmodulina (Vitrac et al., 2000) o la implicación de las vías de

señalización en respuesta de elicitores específicos (Vandelle et al., 2006; Faurie et al.,

2009), y para los procesos específicos de baya, tales como el estudio del transporte de

glucosa y su regulación por el transportador de monosacárido VvHT1 (Conde et al., 2006) o

el estudio de la vía de transducción de señal inducida de la biosíntesis de antocianinas por

azúcar (Vitrac et al., 1999). Además, las suspensiones celulares se han propuesto como

material adecuado para el estudio del desarrollo de la baya de uva (Sharathachandra et al.,

2011; Martínez-Esteso et al., 2011a).

I.6.1. Cultivo celular de vid como biofactorias para la producción de resveratrol

Los cultivos de células vegetales han sido usados como una estrategia

biotecnológica para producir metabolitos secundarios de interés comercial (Nakagawa et al.,

1986; Christen and Gibson, 1991; Shimomura et al., 1991; Vanisree et al., 2004; Fernández-

Introducción

12

Pérez et al., 2012; Malik et al., 2011). En este sentido, las suspensiones celulares de vid se

han utilizado previamente para producir estilbenos (Bru et al., 2006; Krisa et al., 1999; Teguo

et al., 1996; Tassoni et al., 2005). Debido a que la producción de trans-resveratrol (t-R) en

cultivos celulares de vid en medio de crecimiento reveló un bajo nivel de acumulación

(Teguo et al., 1996; Krisa et al., 1999; Ku et al., 2005; Tassoni et al., 2005), diversas

estrategias han sido consideradas para mejorar la producción de t-R, tales como infección

de patógenos, estrés ambiental, biotransformación utilizando un suministro exógeno de

precursores biosintéticos o inductores químicos, empleo de elicitores y la manipulación

genética.

Como se resume en la Tabla 2, se han hecho muchos esfuerzos para superar la baja

capacidad de las células de vid en cultivo para sintetizar altos niveles de t-R.

13

Tabla 2: Producción de resveratrol en cultivos celulares de Vitis (Adaptado de Kiselev et al., 2011 and Jeandet et al., 2016)

Especie y cultivar Tipo de cultivo Inductor/Elicitor/ Precursor Maximal cantidad de trans-resveratrol Referencia

Vitis amurensis Rupr.

Callos

Fenilalanina Ácido salicilico

MeJA Transformacion con gen rolB Transformacion con gen rolC

5-azacitidina, Bloqueo metilación DNA

0.05% DWa, 0.003% FWa, 2.4 mg/La 0.05% DWa, 0.003% FWa, 4.7 mg/La 0.06% DWa, 0.003% FWa, 2.3 mg/La

3.15% DWa, 0.195% FWb, 200–315 mg/Lb 0.14% DWa, 0.006% FWa, 14.3 mg/La 0.10% DWa, 0.004% FWa, 5.1 mg/La

Kiselev et al. 2007 Kiselev et al. 2007 Kiselev et al. 2007 Kiselev et al. 2007

Dubrovina et al. 2010 Kiselev et al. 2010

Vitis labrusca L. cv. “Washington Concord”

Cultivo suspensión celular

L-Alanina 0.22% DWb, 0.011% FWb, 2.2 mg/Lb Chen et al. 2006

Vitis vinifera L. cv. Barbera Cultivo suspensión celular

MeJA Control

14

DW: Peso seco, FW: Peso fresco, MeJA: Metil jasmonato, DIMEB: 2,6-di-O-metil-β-ciclodextrina, RAMEB: β –ciclodextrinas aleatoriamente metiladas. a Indica la cantidad de resveratrol obtenido en el artículo citado b Indica la cantidad de resveratrol calculada a partir del contenido de resveratrol en terminos de acumulación de biomasa fresca o seca dado en células vegetales, normalmente acumulado en 10-20 g/L biomasa seca y en 200-300 g/L biomasa fresca de células cultivadas.

Vitis vinifera cv. Negramo Cultivo suspensión celular

coronatina (10 µM) 35 mg/La Taurino et al.2015

Vitis vinifera cv. Monastrell Cultivo suspensión celular

DIMEB (50 mM) y coronatina (1 µM) DIMEB (50 mM)y MeJA (100µM)

943 mg/La 1600 mg/La

Almagro et al. 2015

Introducción

15

Los procesos de elicitacion son un valioso activo utilizado en biotecnología para

producir metabolitos secundarios altamente apreciados. Las células de vid se han utilizado

principalmente para la producción de t-R. Elicitores alternativos a la infección por patógenos

(Langcake and Pryce, 1977a) se han utilizado para aumentar las respuestas de defensa que

incluyen la expresión de genes relacionados con la defensa y la acumulación de estilbenos.

Entre ellos, el ß-1,3-glucano laminarina (Aziz et al., 2003), quitosano (Ferri et al., 2009), Na-

ortovanadato (Tassoni et al., 2005) y ciclodextrinas (CDs)(Bru and Pedreño, 2003; Bru et al.,

2006), los cuales desencadenan acumulación de t-R en el medio extracelular.

Las CDs son oligosacaridos cíclicos de seis a ocho residuos de α-D-glucopiranosa

unidas por enlaces glucosidos α (14) que contienen una cavidad central relativamente

hidrófoba y una superficie exterior hidrófila (Figura 5). Estos azucares naturales se derivan

del almidón por la acción de la ciclodextrina glicosil transferasa microbiana (Szejtli, 1982), el

producto principal de los cuales es el anillo de siete miembros llamado βCD. Las CDs

modificadas (alquiladas, esterificadas, glicosiladas o sustituidas) son preparadas por

modificación química de los grupos hidroxilo libres en las posiciones 2, 3 y/o 6 de los

residuos de glucosa. Existe toda una serie de CDs modificados disponibles en el mercado

con una estructura química definida (Bru et al., 2006).

Figura 5

Esquema α, β, ϒ-ciclodextrinas

Trabajos anteriores, demostraron las propiedades de la 2,6 dimetil-β-ciclodextrina

(MBCD) como un verdadero elicitor, la cual induce tanto la biosíntesis de resveratrol como la

Introducción

16

acumulación extracelular en cultivos celulares de vid (Morales et al., 1998). Entre las

diferentes βCD modificadas, las metiladas y las hidroxipropiladas causaron la mayor

producción de esta fitoalexina, que se transloca a través de las paredes celulares y se

acumula en el medio de cultivo (Bru et al., 2006).

El ácido jasmónico (JA) y su derivado volátil metil jasmonato (MeJA) (Figura 6) han

demostrado ser transductores de señales de elicitores en la producción de metabolitos

secundarios (Farmer et al., 2003) que tiene lugar en las respuestas de defensa de las

plantas. La aplicación exógena de jasmonatos como compuestos de señalización,

incluyendo JA, MeJA, así como sus compuestos conjugados, a cultivos celulares o plantas

intactas estimulan la biosíntesis de metabolitos secundarios (Gundlach et al., 1992; Mueller

et al., 1993; Tamogami et al., 1997). Sin embargo, la cantidad de estilbenos secretada al

medio de cultivo celular de vid tratados solo con MeJA es insignificante (Krisa et al., 1999;

Gundlanch et al., 1992).

Figura 6

Estructura de ácido jasmonico y metil jasmonato

Curiosamente, la combinación de ambos elicitores, MBCD y MeJA, lleva a un

aumento de ocho veces en la acumulación de resveratrol extracelular en comparación con

MBCD sola, demostrándose un efecto sinérgico en cv. Monastrell (Lijavetzky et al., 2008) cv.

Gamay (Martínez-Esteso et al., 2011b), y siendo el sistema más eficiente, con una

conversión global del 30% del carbono de azúcar en carbono resveratrol (Almagro et al.,

2013).

Introducción

17

La producción de t-R a gran escala utilizando cultivos in vitro de vid es técnicamente

factible ya que la generación y el mantenimiento de la biomasa celular se acompañan de un

alto rendimiento de resveratrol (Tabla 3).

Por otra parte, la modificación genética y la ingeniería metabólica son enfoques

biotecnológicos prometedores que podrían mejorar la producción de estilbenos,

particularmentet-R. Dado que STS condensa tres moléculas de malonil-CoA y una molécula

de cumaril-CoA para formar resveratrol (Rupprich et al. 1980) y estos están presentes en

todas las plantas, muchos investigadores han utilizado la sobreexpresión de los genes STS

para generar t-R en plantasno productoras (Kobayashi et al., 2000; Giorcelli et al., 2004;

Husken et al., 2005; Schijlen et al., 2006; Schwekendiek et al., 2007). La transformación de

células de vid con el gen Vst1 bajo el control del promotor PR10 resultó en un aumento en

los niveles de t-R aunque sólo después del tratamiento de elicitación (luz UV o infección

Botrytis) (Coutos-Thévenot et al., 2001).

La integración de genes rol individuales de A. rhizogenes en el genoma de la planta y

la transformación con cepas silvestres de Agrobacterium puede mejorar la biosíntesis de

ciertos grupos de metabolitos secundarios (Palazon et al., 1998; Bonhomme et al., 2000),

pudiéndo ser una estrategia para aumentar la producción de t-R. Resultados fiables, han

demostrado que rolB y rolC de A. rhizogenes mejoran la producción de t-R en cultivos

celulares de Vitis amurensis Rupr. (Kiselev et al., 2007; Dubrovina et al., 2009 and 2010). Un

nivel de expresión alto de rolB resultó en un aumento de más de 100 veces en la producción

t-R en el cultivo transformado en comparación con el cultivo control. RolB puede aumentar la

producción de t-R a través de la mejora selectiva de la expresión de genes específicos de

las familias PAL y STS en V. amurensis (Kiselev et al., 2009). Desafortunadamente, estos

callos transformados mostraron una morfología globular compacta y, en comparación con la

naturaleza friable de callos normales, estos no eran compatibles con el establecimiento de

suspensiones celulares.

Table 3: Produccion de estilbenos y resveratrol (cis- y trans-isomeros) en cultivos celulares de vid crecidos en bioreactor (Adaptado de Almagro et al., 2013).

Introducción

18

Diseño

bioreactor

Modo

proceso

Volumen trabajo

(L)

Vitis cv/

sacarosa (g/L)

Elicitor

Estilbeno y

rendimiento de resveratrol (mg/g FW) y localización

Referencia

Tanque agitado

Batch, una etapa

15

Gamay Fréaux /60

No

0.11 Intracelular (solo piceida)

Decendit et al., 1996

Batch, una etapa

2

Gamay Fréaux /50

No

0.54-0.70 Intracellular (solo piceida)

Chen et al., 2006

Batch, dos etapa

0.8

Barbera/30

Chitosan

1.2 Total (Estilbeno monomerico)

Ferri et al., 2011

Batch, , una etapa

2

Rootstock 41B/30

MeJA

1.0 Extracelular + 0.1 intracelular (en ambos casos resverartol) Extra ε-viniferin extracelular

Donnez et al., 2011

Batch, una etapa

1.2

Gamay/20

CDs

3.1 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina et al.,

2013

CDs + MeJA

13.5 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina et al.,

2013

Columna burbujeo forma V

Batch, una etapa

1.2

Gamay/20

CDs

2.2 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina et al.,

2013

CDs + MeJA

13.5 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina et al.,

2013

Columna burbujeo cilindrica

Tres ciclos Fed-batch, una etapa

5.8 x 3

Gamay/20

CDs + MeJA

11 x 3 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina (2012)

Tres ciclos Fed-batch, dos etapa

5.8 x 3

Gamay/20

CDs + MeJA

11.2 x 3 Extracelular resveratrol

Vera-Urbina (2012)

I.7. Mejora genética e ingeniería genética de vid: Aplicación al metabolismo

secundario

La mejora genética de la vid se basa en el mejoramiento convencional, que es muy

limitado debido a un largo periodo de pre-fructificación, poliploidía y a la naturaleza

altamente heterocigótica de los cultivares existentes (Gray and Meredith 1992; Nakano et

Introducción

19

al., 1994). Por su parte, la ingeniería genética depende de la disponibilidad de recursos de

germoplasma y de la identificación de genes de interés (de Burger et al., 2009; Reisch et al.,

2012). La finalización del proyecto de secuencia del genoma de la vid hace 8 años ha

abierto la puerta a los estudios genéticos en profundidad (Jaillon et al., 2007; Velasco et al.,

2007). Muy recientemente, Di Genova et al. (2014) secuenciaron un cultivar de uva de mesa

y en comparación con el genoma de referencia del genotipo PN40024 (Jaillon et al., 2007),

permitió la identificación de 240 nuevos genes, así como numerosas variantes estructurales

y SNPs. Los análisis transcriptomicos realizados por GeneChip (Almagro et al., 2014), RNA-

seq (Venturini et al., 2013; Zenoni et al., 2010) proporcionan información de ARNs (Carra et

al., 2009; Han et al., 2014; Mica et al., 2010; Pantaleo et al., 2010; Wanget al., 2011). Toda

esta información podría ser explotada para identificar genes o dilucidar vías involucradas en

la biosíntesis de metabolitos.

La anotación del genoma con herramientas bioinformáticas da indicaciones sobre el

papel de los genes recién descubiertos, sin embargo, esta estrategia resulta a menudo

insuficiente para la caracterización de su función y regulación. La función de un gen puede

ser investigado por la anulación o disminución de su expresión. En ausencia de colecciones

de mutantes, que es el caso de la vid, se puede utilizar el método de la interferencia de ARN

(ARNi). Desde los experimentos pioneros de Ecker and Davis (1986), métodos eficientes se

han reportado para alterar la expresión génica a través de ARNi en plantas (Huang et al.,

2012; Mc Ginnis, 2010; Ossowski et al., 2008; Small, 2007). La sobreexpresión o expresión

erronea de un gen también pueden causar fenotipos anormales, lo que permite la

identificación de los componentes de la vía no detectados por análisis de la pérdida de

función (Prelich, 2012).

La tecnología de transferencia génica ofrece la oportunidad de expresar secuencias

exógenas en tejidos de plantas destino y de interferir en la expresión genética endógena.

Por tanto, esto ayuda a la caracterización de la función y regulación de genes recién

descubiertos. La transformación estable permite el estudio de la expresión génica estable a

nivel de planta completa. Este enfoque ha demostrado ser útil para los estudios funcionales

Introducción

20

en plantas herbáceas modelo tales como Arabidopsis thaliana y Nicotiana benthamiana,

debido a la fácil regeneración de transformantes estables (Goodin et al., 2008; Koornneef

and Meinke, 2010). Sin embargo, la transformación estable sigue siendo un proceso largo y

azaroso en plantas leñosas y no es adecuado para análisis a gran escala, especialmente en

vid. A pesar de los enormes progresos realizados en la última década, sigue siendo difícil

generar plantas transformadas de vid completas de manera estable (Vidal et al., 2010).

Alternativamente, la transformación de raíces mediada por A. rhizogenes proporcionan un

interesante sistema para estudios funcionales (Hu and Du, 2006). En vid, Gómez et al.

(2009) produjeron raíces transgenicas para localizar posibles transportadores de antocianina

(AM1 y AM3) al tonoplasto. Utilizando el mismo sistema, la expresión ectópica de

VvMYBPA1 o VvMYBPA2 proporciono pistas sobre su papel en la regulación de la vía de

proantocianidinas (PA) (Terrier et al., 2009). Del mismo modo, Höll et al. (2013) ha

demostrado recientemente el papel de VvMYB15 en la síntesis de estilbenos glicosilados.

Alternativamente, la transformación mediada por A. tumefaciens de cultivos celulares no

embriogénicos proporcionan una herramienta para los estudios que abordan la

caracterización funcional de genes de interés en la vid. Gollop et al., 2002 obtuvieron

suspensión celular transgénicas para estudiar la expresión del gen de la dihidroflavonol

reductasa y el análisis de su región promotora, enzima implicada en la biosíntesis de

antocianinas y la síntesis de proantocianidina en vid.

Ensayos de expresión transitoria proporcionan la manera más eficiente para estudiar

muchos genes en un tiempo muy corto. De hecho, durante un corto período de tiempo

inmediatamente después del cultivo con A. tumefaciens, muchas copias del transgén se

transcriben activamente en las células de la planta, lo que permite una expresión de hasta

1000 veces mayor que en los tejidos transformados de manera estable (Janssen and

Gardner, 1989). Debido a la actual falta de colecciones mutantes en la vid, los ensayos de

expresión transitoria constituyen un enfoque apropiado para descifrar la enorme cantidad de

información genética que esta disponible. Los sistemas heterólogos se pueden utilizar y han

demostrado ser útiles. Por ejemplo, la agroinfiltration de hojas de N. benthamiana permitió

Introducción

21

obtener información sobre el papel del enzima antocianina O-metiltransferasa en vid, así

como su localización en el citosol (Hugueney et al., 2009). Utilizando el mismo sistema de

expresión transitoria, también se logró la caracterización funcional de varios genes de

estilbeno sintasa (Parage et al., 2012). Ademas, se localizo el cassette proteico ATP-binding

ABCC1 en el tonoplasto (Francisco et al., 2013). El bombardeo de partículas en células de

cebolla también puede ayudar a investigar la localización de proteínas de vid, como se

muestra para el transportador de zinc ZIP3 en la membrana plasmática (Gainza-Cortes et

al., 2012).

Introducción

22

II. Transformación vegetal

II.1. Ingeniería metabólica en un sistema de cultivo celular

El metabolismo vegetal representa una enorme fuente de compuestos bioactivos con

importancia farmacéutica y biotecnología. Actualmente, los metabolitos más comercializados

son extraídos de plantas nativas o son semisintetizados de intermediarios metabólicos. Sin

embargo, el proceso de obtención de estos metabolitos es eclipsado por el bajo rendimiento

y las numerosas dificultades técnicas (Xu et al., 2013). La creciente demanda de metabolitos

vegetales con fines industriales, estimula la utilización de nuevas estrategias tecnológicas

tales como la transformación genética, lo que se ha venido en denominar ingeniería

metabólica. Esta consiste en rediseñar vías naturales a través de la sobreexpresión o

represión de genes nativos, o la introducción de transgenes (Jarboe et al., 2010), con el

objetivo final de ser capaz de utilizar los organismos para producir sustancias valiosas a

escala industrial de una manera rentable. Si bien la ingeniería metabólica en procariotas es

una tecnología con múltiples recursos técnicos bien desarrollados, en comparación, las

plantas están en desventaja (Morgan and Rhodes, 2002; Toya y Shimizu, 2013; Xu et al.,

2013). Aún así, el potencial de la ingeniería metabólica en plantas es enorme debido a la

gran diversidad de metabolitos presentes en plantas en comparación con otros organismos

(Fernie et al., 2011).

El cultivo de células vegetales y tejidos se utiliza cada vez más en la producción de

metabolitos secundarios bioactivos con aplicación comercial tales como shiconina, taxol,

alcaloides (Nakagawa et al., 1986; Christen et al., 1991; Shimomura et al., 1991; Vanisree et

al., 2004; Fernández-Pérez et al., 2013 y Malik et al., 2010). Sin embargo, a pesar de los

extensos estudios sobre la normalización del crecimiento celular y la selección de líneas

celulares de alto rendimiento, el número de casos en que los metabolitos secundarios son

producidos en cultivo in vitro es relativamente bajo. La ingeniería metabólica en un sistema

de cultivo celular tiene el doble propósito de aumentar los rendimientos de producción de

metabolitos secundarios y de corrección de ciertas etapas en rutas metabolicas. Para

aumentar la producción de ciertos metabolitos en especies de plantas normalmente

Introducción

23

productoras, para transferir (parte de) una vía a otras especies de plantas, o cuando hay

interés en la producción de nuevos compuestos aún no producidos en la naturaleza por las

plantas, se plantean dos enfoques generales. En primer lugar, diferentes métodos son

empleados para cambiar la expresión de uno o unos pocos genes, superando así los pasos

que específicamente limitan la velocidad en la vía, para cerrar vías competitivas, y disminuir

el catabolismo del producto de interés. En segundo lugar, se llevan a cabo intentos de

cambiar la expresión de genes reguladores que controlan múltiples genes implicados en la

biosíntesis. Si el objetivo es disminuir la producción de un determinado compuesto o grupo

de compuestos no deseados, varios enfoques son posibles. La eliminación de una etapa

enzimática de la vía podría ser útil, por ejemplo, reduciendo el nivel del correspondiente

ARNm a través de las tecnologías antisentido, cosupresión o ARN de interferencia, o

mediante la sobreexpresión de un anticuerpo contra el enzima. El método del gen

antisentido ha sido utilizado con éxito para cambios en el color de las flores (Bennett, 1993).

La desviación del flujo a una vía competitiva o un incremento en el catabolismo del

compuesto podrían ser métodos útiles con el mismo objetivo de diminuir la producción de un

compuesto o compuestos no deseados.

Existen excelentes métodos de transformación para la obtención de material

transgénico como la transformación mediada por Agrobacterium para el desarrollo de

cultivos celulares estables (Bortesi et al., 2012; Gollop et al., 2002), la transferencia directa

de genes en protoplastos (Benediktsson et al., 1995; Craig et al., 2005; Hassanein et al.,

2009; Saumonneau et al., 2012), o el bombardeo de partículas (Rajasekaran, 2013;

Torregrosa et al., 2002), y la posibilidad de su aplicación práctica (Bortesi et al, 2012); así

como, sistemas transitorios de transformación de plantas utilizando Agrobacterium (Bechtold

et al., 1993; Santos-Rosa et al., 2008).

II.2. Requisitos biológicos para la transformación de cultivos celulares

Usando cualquiera de los métodos de transformación es posible introducir ADN en

las células vegetales. En el proceso, sólo una pequeña proporción de las células diana

reciben el ADN durante estos tratamientos, y sólo una pequeña proporción de estas células

Introducción

24

sobreviven al tratamiento y el ADN introducido se integra de forma estable (Franks y Birch,

1991; Grant et al., 1991). Por tanto, es esencial detectar o seleccionar las

célulastransformadas entre un gran exceso de células no transformadas (Birch y Bower,

1994) de manera eficiente.

Los requisitos esenciales en un sistema de transferencia génica para la producción

de células transgénicas son: (a) la disponibilidad de un gran numero de células diana

competentes que conserven la capacidad proliferativa (b) un método para introducir ADN en

células, y (c) un procedimiento para seleccionar las células transformadas.

Numerosos métodos han sido desarrollados para introducir e integrar ADN foráneo

en las células vegetales. Los métodos para la transferencia de genes en la vid implican la

transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, o métodos químicos/físicos para la

transferencia directa de genes a las células vegetales.

La selección de células vegetales transformadas es un paso importante en la

ingeniería genética de plantas. Para ello, sistemas de seleccion que generen un número

considerable de transformantes primarios no quiméricos son utilizados, por ejemplo, genes

que confieren resistencia a un agente químico selectivo (Wilmink y Dons, 1993), o genes

que confieren un fenotipo que permite la detección visual o física (Bowen, 1993; Reichel et

al., 1996). La selección por resistencia a antibióticos proporciona una ventaja continua a las

células transformadas, que de otro modo podrían ser enmascaradas por un número mucho

mayor de células no transformadas en proliferación (Fromm et al., 1990; Janssen y Gardner,

1989). Por lo tanto, es uno de los métodos más efectivos por la facilidad de reconocimiento

de los transformantes. El establecimiento del agente selectivo y su concentración efectiva es

uno de los pasos más importantes.

II.3. Métodos de transferencia génica directa

En los métodos de transferencia génica directa, el gen de interés entra en la célula

vegetal huésped sin la ayuda de un vector. La transferencia directa de genes requiere

permeabilización de las membranas de protoplastos por un tratamiento químico o mediante

Introducción

25

electroporación para permitir la captación directa de ADN, o bombardeo de los tejidos

vegetales a alta velocidad con micro partículas recubiertas con el ADN de interés.

II.3.1. Transferencia génica de protoplastos mediante productos químicos

La captación directa del ADN por protoplastos puede ser estimulada por productos

químicos como el polietilenglicol (PEG). Este método fue descrito por Krens et al. 1982. La

técnica es tan eficiente, que prácticamente todos los sistemas de protoplastos han

demostrado ser transformables. El PEG a alta concentración (15-25%) puede precipitar

macromoléculas iónicas, como ADN y estimular su absorción por endocitosis sin producir

daño en los protoplastos. Esto es seguido de la formación de pared celular y de la iniciación

de la división celular. Posteriormente, estas células son plaqueadas a baja densidad en el

medio de selección.

Los protocolos basados en la transferencia génica de protoplastos para la

transformación estable de vid están poco desarrollados, debido a que el cultivo y la

regeneración de protoplastos de Vitis sp. se ve obstaculizada por la liberación de grandes

cantidades de polifenoles y fitoalexinas en el medio de cultivo (Commun et al., 2003; Reustle

and Natter, 1994). Sin embargo, se desarrollo un método interesante en el que las plantas

enteras de V. viniferacv. Koshusanjaku fueron regeneradas a partir de protoplastos a través

de embriogénesis somática (Zhu et al., 1997). Sin embargo el uso de protoplastos tratados

con PEG preparados a partir de suspensiones celulares de Cabernet Sauvignon han sido

usados para localización subcelular de proteínas (Hichri et al., 2010), para el análisis

funcional de promotores (Saumonneau et al., 2012) y para el estudio de interacción

proteína/proteína (Saumonneau et al., 2008) o ADN/proteína (Marchive et al., 2013).

II.3.2. Electroporación

La electroporación implica el uso de pulsos eléctricos cortos de alta intensidad de

campo aplicados a protoplastos, células o tejidos. El pulso es generado por la descarga de

un condensador a través de los electrodos en una cámara de electroporación. O bien, se

utiliza un pulso de onda rectangular de alto voltaje (1,5 kV) y duración corta o un pulso de

Introducción

26

baja tensión (350 V) de larga duración. Estos pulsos aumentan la permeabilidad de

membrana; es decir, hacen poros transitorios en la membrana plasmática que facilita la

captación de ADN foráneo. Los fragmentos de ADN foráneo entran a través de los agujeros

al citoplasma y luego al núcleo. A continuación, se seleccionan las celulas transformadas.

Este método, introducido por Fromm et al. 1985, es una de las varias técnicas de

rutina para la transformación eficiente. Sin embargo, ya que la regeneración a partir de

protoplastos no siempre es posible, a menudo se utilizan células cultivadas o explantes de

tejido.

Las frecuencias de transformación pueden ser mejoradas aún más por: (i) el uso de

la intensidad de campo de 1.25 kV/cm, (ii) la adición de PEG después de añadir el ADN, (iii)

el desconchado térmico de protoplastos a 45 °C durante 5 minutos antes de añadir el ADN y

(iv) el uso de ADN lineal en lugar de circular.

En la vid, la electroporación de protoplastos ha sido generalmente utilizada para la

inoculación de virus (Valat et al., 2000, 2006). A finales de 1990, se propuso este método

para investigar diversos promotores de STS (Brehm et al., 1999).

II.3.3. El bombardeo de partículas (biolística)

En Klein et al. 1987, se describio un método por el cual la entrega de ADN en las

células de órganos de plantas intactas o células cultivadas se realiza por un proceso

llamado bombardeo de partículas. Las pequeñas partículas de alta densidad,normalmente

de 1-3 pm de diámetro de tungsteno u oro, recubiertas con el ADN de interés, son

aceleradas a gran velocidad por una pistola de partículas.La aceleración se logra ya sea por

una carga explosiva (explosión de pólvora) o mediante el uso de ondas de choque iniciadas

por una descarga eléctrica de alto voltaje. Estas partículas con alta energía cinética

penetran en las células, atravesando las paredes celulares y membranas, llevando el ADN

foráneo al interior de las células bombardeadas. El bombardeo de partículas permite la

manipulación de células de plantas intactas u órganos de cualquier especie. Las células

diana pueden ser polen, células cultivadas, células de tejidos y meristemos diferenciados.

Introducción

27

En vid, la biolística se ha usado para la transformación del hibrido Chancellor (Hebert

et al., 1993; Kikkert et al., 1996) y V. vinifera cv. Chardonnay (Vidal et al., 2003). Ademas,

este método también ha sido usado para inocular el virus de arrepollado de la vid en

portainjertos híbridos (Valat et al., 2003). Aunque la biolística es principalmente usada como

un método de transformación estable, también es usado para ensayos de expresión

transitoria. Al respecto, los primeros estudios funcionales fueron propuestos por Torregrosa

et al. (2002) and Verriès et al. (2004), para describir la transformación de suspensiónes

celulares de Cabernet Sauvignon, y realizar análisis de la región promotora de los genes de

la alcohol deshidrogenasa. Desde entonces, las suspensiones celulares de Chardonnay, en

gran medida, se han utilizado para los estudios funcionales de genes implicados en la

síntesis de flavonoides (Bogs et al., 2007; Czemmel et al., 2009; Deluc et al., 2008; Harris et

al., 2013; Hichri et al., 2010; Höll et al., 2013; Walker et al., 2007). Más recientemente,

secciones de hoja de Chardonnay y embriones somáticos de Thompson seedless fueron

sometidas a bombardeo de partículas para el estudio de la regulación de los genes de

defensa VvPGIP (Joubert et al., 2013).

El bombardeo de partículas sigue siendo bastante difícil de realizar y requiere el

ajuste de un número de variables críticas tales como la presión de helio, diámetro de las

partículas, la preparación del cartucho o la distancia del material vegetal diana. Además, es

un método costoso, debido a la necesidad de comprar un dispositivo biolístico y consumibles

caros. Aun asi, algunas de sus ventajas como no limitación en la variedad de especies o

genotipo y la construcción simple del plásmido, lo hacen ser un único método de

transformación. Además, la biolística permite la cotransformación con múltiples genes (Vidal

et al., 2010).

II.4. Transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens es un fitopatógeno del suelo que infecta naturalmente

sitios de la planta herida, causando la enfermedad de agalla de corona debido a la

transferencia de ADN de las células bacterianas a las células de plantas huésped a través

de un sistema de secreción bacteriano de tipo IV (T4SS) (Fronzes et al., 2009). Las primeras

Introducción

28

evidencias que apuntan a esta bacteria como el agente causal de la agalla de la corona se

remontan a principios del siglo XX (Smith and Townsend, 1907). Desde ese momento, por

diferentes razones un gran número de investigaciones se han centrado en el estudio de esta

enfermedad neoplásica y su agente patógeno causante. El interés sobre la enfermedad de

agalla de corona era evidente debido a que la formación de tumores podía ser el resultado

de la transferencia de genes de A. tumefaciens a células de plantas infectadas.

A. tumefaciens tiene la capacidad excepcional de transferir un fragmento de ADN (T-

DNA) del plásmido inductor de tumores (plásmido Ti) en el núcleo de las células infectadas,

donde se integra de forma estable en el genoma huésped y se transcribe, causando la

enfermedad de la agalla de corona (Nester et al., 1984; Binns and Thomashow, 1988)

(Figura 7). El T-DNA contiene dos tipos de genes: los genes oncogénicos, que codifica

enzimas implicadas en la síntesis de auxinas y citoquininas, responsable de la formación de

tumores; y los genes que codifican para la síntesis de opinas. Estos compuestos, producidos

por la condensación entre los aminoácidos y los azúcares, son sintetizados y excretados por

las células de la agalla y consumidos por A. tumefaciens como fuentes de carbono y

nitrógeno. Fuera de la región de T-DNA se encuentran los genes para el catabolismo de

opina, los genes implicados en el proceso de transferencia del T-DNA a la célula vegetal y

los genes implicados en la transferencia conjugativa de plásmidos bacteria-bacteria

(Hooykaas y Schilperoort, 1992; Zupan y Zambryski, 1995).

Figura 7

Esquema del plasmido Ti de Agrobacterium

Introducción

29

Hoy en día, muchas especies agronómicamente y hortícolamente importantes se

transforman de forma rutinaria usando esta bacteria, y la lista de especies que es

susceptible a la transformación mediada por Agrobacterium parece crecer diariamente

(Gelvin, 2003). Como género, Agrobacterium puede transferir ADN a un amplio grupo de

organismos que incluye numerosas especies de angiospermas, dicotiledóneas y

monocotiledóneas (Anderson y Moore, 1979; DeCleene y Deley, 1976; Gelvin, 2003; Porter,

1991). La capacidad para introducir y expresar diversos genes foraneos en plantas, se

describió por primera vez en 1984 para tabaco, y se ha extendido a más de 120 especies en

por lo menos 35 familias (Birch, 1997). En Vitis sp. se desarrollaron métodos de

transferencia génica mediada por Agrobacterium a principios de 1990. Baribault et al. (1989)

muestraron los primeros éxitos en la transformación de suspensiones celulares de Cabernet

Sauvignon. Para los fines de la ingeniería genética de planta, el aspecto más importante

puede ser la gama de cepas diferentes de Agrobacterium (Gelvin, 2003). Las cepas de A.

tumefaciens utilizadas con más frecuencia para la expresión transitoria o estable de vid

poseen un background cromosómico de C58: GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell, 1986),

C58C1 (pCH32) (Hamilton et al., 1996) y EHA105 (Hood et al., 1993). Las cepas C58C1

(pCH32) y EHA105 contienen copias adicionales de genes vir que las hace hipervirulentas.

El método de transformación más comúnmente elegido es un sistema de vector

binario derivado de A. tumefaciens, donde un vector contiene los genes para ser transferidos

y el otro los demás genes (genes vir, no transferidos) que participan en las funciones

necesarias para que se produzca la transferencia (McBride and Summerfelt, 1990). El

sistema se basa en un plásmido Ti 'desarmado' donde los genes responsables de la

enfermedad de agalla de corona han sido eliminados. El ADN foráneo se limita por unas

secuencias a la derecha e izquierda (25 pares de bases cada uno) y son los únicos

elementos de Agrobacterium que se transfieren junto con el T-DNA. Este método asegura

que una región definida del ADN se transfiere de manera precisa al nuevo genoma huésped.

Introducción

30

II.4.1. Cocultivo

El cocultivo con A. tumefaciens es el método más utilizado para obtener plantas

transformadas de manera estable. Los cultivos celulares se infectan con Agrobacterium

recombinante, el cual lleva el plásmido Tidesarmado. El tejido infectado a continuación, se

cultiva (cocultiva) en medio de regeneración durante 2-3 días, tiempo en el cual se produce

la transferencia del T-DNA que porta los genes foráneos. Después de esto, las células

transformadas se transfieren a medio de selección, suplementado con una concentración

letal de un antibiótico para eliminar selectivamente las células no transformadas.

Entre las variables clave en la transferencia génica mediada por Agrobacterium se

incluye Agrobacterium, genotipo de la planta, tratamiento con inductores de los genes vir,

como acetosiringona, extractos celulares heridos, células alimentadoras o azúcares, pH,

temperatura, concentración de células, condiciones de luz, y duración del cocultivo (Li et al.,

2006); tipo de explanto, calidad, precultivo (van Wordragen and Dons, 1992), tratamiento

hormonal (Gafni et al., 1995), heridas, o infiltración (Bidney et al., 1992); y el uso de agentes

antibacterianos adecuados (Lin et al., 1995), antagonistas de etileno (De Block et al., 1989),

y/o inhibidores de la metilación (Palmgren et al., 1993) para reducir el daño y/o el

silenciamiento génico de las células vegetales tratadas. Con la cantidad de variables es

evidente por qué son necesarios estudios de optimización de transformación estable, asi

como, es muy recomendable llevar a cabo ensayos de expresión transitoria como

indicadores de las condiciones adecuadas para la transferencia génica (Ishida et al., 1996).

Estas optimizaciones proporcionaninformación para ensayos de expresión estables y

transitorios en vid (Perl et al., 1996; Iocco et al., 2001; Li et al., 2001, 2004, 2011, 2012;

Gollop et al., 2002; Vidal et al., 2010; Jelly et al., 2012). La duración del tiempo de cocultivo

es esencial en el nivel de expresión de los transgenes. Li et al. (2006) demostraron que el

nivel de expresión de los transgenes se incrementa con la duración del tiempo de cocultivo:

alrededor de 50% de los embriones expresó un gen marcador después de 24 h de cocultivo,

y casi 100% después de 48 h. Una exposición de más de 96 horas, hizo que disminuyera

drasticamente la prevalencia del gen marcador expresado en embriones, y los tejidos

Introducción

31

mostraran pardeamiento y dejaran de crecer. De hecho, el principal inconveniente del uso

de Agrobacterium es la inducción de necrosis en los tejidos vegetales, probablemente como

resultado de la infección bacteriana. Perl et al. (1996) sugirieron que la intensidad de

pardeamiento depende del genotipo de la planta y el protocolo de cultivo y medio de la cepa

bacteriana. La necrosis de los tejidos vegetales se puede reducir por precultivo en un medio

que contiene carbón activo durante unos días (Jelly et al., 2012; Li et al., 2006) o mediante

la reducción de concentración bacteriana y preacondicionamiento de las bacterias en el

medio de cultivo de la planta (Iocco et al., 2001). Las etapas de lavado y cultivo de

embriones en papel de filtro después de cocultivo, así como la adición de antioxidantes

como DTT al medio de cultivo, también se ha demostrado como útil para reducir del

pardeamiento de tejido (Li et al., 2006, 2008; Perl et al., 1996).

II.4.2. Agroinfiltración

A. tumefaciens puede ser infiltrarado en hojas de plantas usando dos métodos

diferentes. El primer método emplea una jeringa sin aguja que es llenada con la suspensión

bacteriana y a continuación, se presiona contra el lado inferior de una hoja, envés. La

entrada de la suspensión bacteriana es a través de los estomas (Zottini et al., 2008). Este

método es rápido y simple, pero tiende a restringir la expresión de los genes a las zonas de

infiltración. El segundo método consiste en sumergir las hojas o plantas enteras en

suspensión bacteriana y aplicar vacío para facilitar la penetración de la suspensión

bacteriana en las células del mesófilo. Al contrario al método de infiltración con jeringa, la

infiltración por vacío permite la expresión génica en toda la hoja. Es posible infiltrar por vacio

ya sea hojas desprendidas (Bertazzon et al., 2012; Guan et al., 2011; He et al., 2013; Le

Henanff et al., 2009; Santos-Rosa et al., 2008; Xu et al., 2010, 2014) o las hojas no

desprendidas, es decir plantas enteras (Kurth et al., 2012; Visser et al., 2012).

Curiosamente, se ha demostrado un efecto de la posición de la hoja en la eficiencia de agro-

infiltración. La primera hoja completamente expandida muestra mayor expresión de genes

que la segunda hoja en plántulas de 8 a 10 semanas (Santos-Rosa et al., 2008). La agro-

infiltración se realiza generalmente en los tejidos de plántulas jóvenes cultivadas in vitro. A

Introducción

32

menudo las plantas de invernadero han sido consideradas como recalcitrantes para esta

técnica (Wroblewski et al., 2005; Zottini et al., 2008). Sin embargo, Ben-Amar et al. (2013)

estableció un protocolo para agroinfiltrar hojas de plantas de invernadero, utilizando un

dispositivo de vacío. Esta técnica hace que sea posible llevar a cabo ensayos transitorios sin

instalaciones de cultivo de tejidos aséptico, como con N. benthamiana o tabaco.

La agroinfiltración ha sido clásicamente utilizada para la introducción de

construcciones génicas conducidos por un plásmido Ti. Adicionalmente, sin embargo, este

método ha permitido la introducción de vectores derivados de virus en varios cultivos de

V.vinifera (Kurth et al., 2012).

II.4.3. Agro-drenching

La infiltración de hojas es el método más común