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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
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Tesis Doctoral
Diversidad genética y estructuraDiversidad genética y estructurapoblacional en razas nativas de maízpoblacional en razas nativas de maíz
(Zea mays ssp. mays) del Noroeste(Zea mays ssp. mays) del NoroesteArgentino: presente y pasado delArgentino: presente y pasado del
germoplasma autóctonogermoplasma autóctono
Lia, Verónica V.
2004
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor de laUniversidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas de la
Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Lia, Verónica V.. (2004). Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz(Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_LiaCita tipo Chicago:
Lia, Verónica V.. "Diversidad genética y estructura poblacional en razas nativas de maíz (Zeamays ssp. mays) del Noroeste Argentino: presente y pasado del germoplasma autóctono". Tesisde Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2004.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3766_Lia
.J
Diversidad genética y estructüra
poblacional en razas nativas de maíz
(Zea mays ssp. mays) del Noroeste Argentino:
presente y pasado del germo olasma autóotono
,.. «A‘ ‘ ¡'7""Mwo'wm
Genetic diversity and population structure in maize
Iandraces from Northwestern Argentina: insights from
archaeiogical and extant specimens
Tesis DoctoralLic. Verónica V. Lia
DirectorasDra. Viviana A. ConfalonieriDra. Lidia Poggio
2004 3 7+"
Laboratorio de Genética‘Departamento de Ecología, Genética y EvoluciónUniversidad de Buenos Aires
Portada: Maíces nativos del Noroeste Argentino. Fotografía gentileza Ing. JuliánCámara Hernández, Laboratorio de Recursos Genéticos Vegetales “N.I.Vavilov",
Facultad de Agronomía, UBA.
A Sebi,
por ser Ia luz de mi vida
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Dra. Viviana Confalonien’ por las horas compartidas, por acompañarme en
todas las formas posibles y por el estímqu que significó para ml. A la Dra. Lidia Poggio por
su generosidad, por su confianza y por su apoyo.
Agradezco especialmente a la Dra. Cecilia Comas por permitir que me iniciara en la
investigación y dar el primer paso para llegar hoy hasta aquí.
Agradezco al Dr. Carlos Naranjo por proporcionarme el material de trabajo y por su afecto y
paciencia ante mis reiteradas llamadas telefónicas a Lidia.
Agradezco al lng. Julián Cámara Hernández y a la Ing. Ana María Miante Alzogaray por el
tiempo que me han dedicado y por su valiosa contribución a este trabajo y a ml
conocimiento sobre el maiz. AI Ing. Cámara Hernández quiero agradecerle enormemente
por obsequiarme sus tan codiciadas ilustraciones, fotos y acuarelas.
A la Dra. Norma Ratto, agradezco las muestras arqueológicas, su ayuda y consejo
permanentes y Ia posibilidad de incursionar en la arqueología.
Agradezco al Dr. Terry Brown por abn'rme las puertas de su laboratorio y proveerrne los
materiales y asesoramiento necesarios para llevar a cabo el estudio de los ejemplares
arqueológicos.
Agradezco al Dr. Jim Holland por cedenne (y hacerme llegar) tan desinteresadamente las
lineas, a pesar de las complicaciones de pasarlas por la Aduana.
Agradezco al Lic. Regino Cavia, a la Dra. Romina Barrozo y a la Dra. Isabel Gómez
Villafañepor su asesoramiento para el tratamiento estadístico de los datos (también a Isa,
Romi y Regi por ser mis amigos).
Agradezco a Alex, en su carácter de Dra. y amiga, por su tiempo, por su ayuda y por su
aporte a esta tesis.
Agradezco a mi mamá por mimanne y consentirrne tanto, con o sin tesis de por medio. A
mi papá por traerrne a la Facultad durante toda mi carrera (y algunos años más también),
por cargar botellas de acético, impresoras, contrabandear semillas y por preguntar por Ia
polimerasa. A mis hermanos Florencia, Gaspar, Rafaela y Luciana por ayudarme a
despejar mi mente y darme alegría (casi siempre), A Cristina por ser tan generosa. A la
familia Piana por su apoyo incondicional. A Eli por su aliento permanente, por sus
oraciones y espíritu de superación.
Agradezco a Ceci B., a Marina y a Sara por su ¡nvalorable ayuda y por su constante
presencia, aún en la distancia. A Amalia tengo que agradecerle tanto que no sé cómo
escribirlo. Agradezco a Noe su paciencia, su consideración y su cariño.
Agradezco a Santi por tantas discusiones, por su interés y por ser mi amigo. A Laura.
Marce, Paula, Gracielita, Pao, Carta, Nati, Gra, M. Isabel, Andrea, Mariana B., Man’ana L.,
Pablo y Florencia por su amistad y por compartir sus días y cerebros conmigo.
Quiero agradecer también, a los nuevos amigos que conoci durante la realización de este
trabajo, es decir a todos los miembros del Laboratorio de Genética (desde el 58 hasta el 65
inclusive).
Agradezco a mis viejos amigos, Be, Ceci, Seba, Rodri, Lula, Man",Regi, Isa y Romi por
estar presentes en todo momento y aguantarme. A los no biólogos, por escucharme hablar
de la tesis sin parar, y por intentar comprender de lo que estaba hablando.
Agradezco al CONICET, a la Universidad de Buenos Aires y a la Fundación Antorchas por
financiar este proyecto y a esta becaria.
Por último, quiero expresar mi más profundo agradecimiento al Dr. J. H. Hunziker por su
ejemplo y sus enseñanzas que me acompañarán siempre.
Resumen
El maiz, Zea mays ssp. mays, es uno de los cultivos más importantes de América y ha
estado vinculado con la actividad humana desde los inicios de la agricultura. Su
distribución abarca todo el continente, encontrándose en una amplía gama de ambientes
tanto en sus formas comerciales como nativas. En la República Argentina, las razas
nativas exhiben una gran variedad ecológica y morfológica; sin embargo, Ia
caracterización genética del germoplasma autóctono es casi inexistente. Estudios previos
realizados en razas nativas del Noroeste Argentino (NOA) revelaron la existencia de una
correlación positiva entre cromosomas B y altitud, sugiriendo un significado adaptativo
para estos elementos supemumerarios. Con el objeto de describir la diversidad genética de
razas nativas y estudiar la dinámica poblacional sobre el gradiente altitudinal descripto, se
examinaron los patrones de variación de 18 Ioci microsatélites. Tres de estos Ioci fueron
analizados en ejemplares arqueológicos del NOA a fin de establecer su relación con las
razas actuales. Los resultados del presente estudio permiten concluir que: 1) las razas
nativas del NOA representan una fuente importante de diversidad para ampliar la base
genética de los programas de mejoramiento; 2) los ejemplares arqueológicos son más
afines a las razas pertenecientes al Complejo Andino, que a otras razas actuales de la
región; 3) procesos selectivos determinan el mantenimiento del gradiente altitudinal de
cromosomas supemumerarios.
Palabras clave: maiz — razas nativas — ADN antiguo — variabilidad microsatélite
diversidad genética — cromosomas supemumerarios - variación clinal.
Abstract
Maize, Zea mays ssp. mays, is the principal domesticated crop of the New World. lts many
cultivars and Iandraces are currently adapted to a broad range of environments from
Canada to Argentina. In spíte of the morphological and ecological diversity of argentinian
Iandraces, no attempts have been made to date to determine the extent of genetic variatíon
within local germplasm. Previous studies have shown a positive correlation between altitude
and B chromosome frequencies in several Iandraces from NW Argentina, which suggests
that supemumerary elements may be subjected to selective pressures. The patterns of
variatíon of 18 microsatellite loci were examined in order to assess the genetic diversity and
population dynamics along the above mentioned cline. Three microsatellite Ioci were also
used to determine the affiliations of archaeological specimens to extant Iandraces. Three
main conclusions can be drawn from the present study: 1) the Iandraces of NW Argentina
are a valuable source of diversity to enlarge the genetic basis of breeding programs; 2) the
archaeological specimens are more closer related to the races of the Andean Complex,
than to any of the other races examined; 3) selection plays a role in the maintenance of the
altitudinal cline of B chromosomes.
Keywords: maize Iandraces - ancient DNA —microsatellite variatíon —genetic diversity —
supemumerary chromosomes —clinal variatíon.
INTRODUCCIÓN
I1. EL GENERO ZEA (GRAMINEAE) 1I2. EL MAiz- ZEA MAYs SSP. MAYs 3I2.1. ORIGEN Y DISPERSIÓN 3|2.2. EL REGISTROARQUEOLÓGlCO 5
|2.2.1. Macro y microfósiles 5|2.2.2. Estudios moleculares 7l3. RAZAS NATIVASDE MAiz DEL CONTINENTE AMERICANO 9
I3.1. DIVERSIDAD MORFOLÓGICA 9¡3.2. DIVERSIDADGENETICA 10l3.3. VARIABILlDADCROMOSOMICA 13
l3.3.1. Cromosomas supemumerarios 13l3.3.2. Heterocromatina 14I3.3.2. Cromosomas supemumerarios, heterocromatina. contenido de ADNy van'ablesambientales 1l4. RAZAS NATIVAs DE MAiz DEL NOROESTE ARGENTINO 17I4.1. GENERALIDADES 17l4.2. DIVERSIDADMORFOLÓGICA 17I4.3. DIVERSIDADGENETICA 18l4_4. VARIABILIDADCROMOSOMICA 19
l4.4.1. Cromosomas supemumerarios 19l4.4.2. Contenido de ADNy heterocromatina 19l4.4.3. Cromosomas supemumerarios, heterocromatina y variables ambientales 20l5. OBJETIVOS 21
MATERIALES Y MÉTODOS
M1. MUESTRAS 23M1.1. EJEMPLARES ACTUALES 23M1.1.1. Razas nativas 23M1.1.2. Líneas 23M12. EJEMPLARESAROUEOLOGICOS 25M2. ANALISIS DE LA VARIABILIDADDE LOCI MICROSATELnES 29M2.1. MÉTODOS EXPERIMENTALES 30
M2.1.1. Ejemplares actuales 30M2.1.1.1. Selección de loci 30M2.1.1.2. Extracción de ADNgenómico total 30M2.1.1.3. Cuantificación de ADN 30M2.1.1.4. Amplificación por PCR 33M2.1.1.5. Visualización de los productos de amplificación 33M2.1.1.5.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida 34M2.1.1.5.2. Tinción con Nitrato de Plata 34M2.1.1.6. Secuenciación de variantes alélicas 34M2.1.2. Ejemplares arqueológicos 35M2.1.2.1. Selección de loci 35M2.1.2.2. Extracción de ADN genómico total 36M2.1.2.3. Amplificación por PCR 37
M2.1.2.4. Visualización de los productos de amplificación 38M2.1.2.5. Purificación, clonado y secuenciación de fragmentos 38M22. ANALISIS DE DATOS DE SECUENCIA 39
M2.2.1. Edición y Alineamiento 39M2.2.2. Búsqueda en bases de datos 39M23. ANALISIS DE LADIVERSIDADY ESTRUCTURA POBLACIONAL 40M2.3.1. Modelos de evolución de Iocimicrosatélites 40M2.3.2. Cálculo de frecuencias alélicas 41M2.3.3. Índices de diversidad genética 41M2.3.4. Equilibriode Hardy-Weinberg 42M2.3.5. Estmctura poblacional 43M2.3.5.1 Prueba de pennutación de tamaños alélicos 44M2.4. ANALISIS DE LAS RELACIONES INTRAE INTERREGIONALES 45
M2.4.1. Análisis de agmpamiento entre poblaciones del NOA 45M2.4.2. Análisis de agrupamiento entre poblaciones del NOAy razas de América 46M2.4.2.1. Método fenético 46M2.4.2.2. Método Bayesiano para la inferencia de estructura poblacional 46M2.5. ANALISIS DE LAASOCIACIÓN ENTRE VARIABLESGENÉTICAS, CITOGENÉTICAS Y ALTITUD48
M2.5.1. Relación entre frecuencias génicas y número de cromosomas B 48M2.5.2. Correlación entre distancias geográficas, altitudinales e índices dediferenciación 48
RESULTADO;
R1. DIVERSIDADGENETICA 50R.1.1. RAZAS NATIVASACTUALES 50
R.1.1.1. Diversidad y riqueza alélica 50R.1.1.2. Secuencia nucleotidica de los alelos microsatélites 59R1.2. RAZAS NATIVASARQUEOLOGICAS 67R1.2.1. Locus Phi127 72R1.2.2. Locus Phi029 75R1.2.3. Locus Phi059 77R1.2.4. Afinidades entre ejemplares arqueológicos y razas actuales 77R2. ESTRUCTURA POBLACIONAL 78R2.1. EQUILIBRIODE HARDY-WEINBERG 78R2.2. DIFERENCIACIÓNGENETICA 80R3. RELACIONES INTRAE INTER REGIONALES 84R3.1. EL NOROESTE ARGENTINO 84R32. EL NOROESTE ARGENTINO Y SU INSERCIÓN EN EL CONTINENTEAMERICANO 84R3.2.1. Reconstrucción en base a métodos fenéticos 86R3.2.2. Reconstrucción en base al método bayesiano 92R4. ASOCIACIÓN ENTRE VARIABLES GENÉI’ICAS, CITOGENÉTICAS Y ALTITUD 98R4.1. CORRELACIÓN ENTRE FRECUENCIAS ALÉLICAS Y NÚMERO MEDIO DE BS POR INDIVIDUO
R42. DIFERENCIACION GENETICA Y GRADIENTES ALTITUDINALES 98
DISCUSIÓN
D1. DIVERSIDAD GENETICA EN LAs RAZAS DE MAÍZDEL NOA: IMPLICANCIASPARA LACONSERVACION DE GERMOPLASMA 102
D2. MICROSATÉU'I’ES Y ESTUDIOS EVOLUTIVOS 107Da. DISTRIBUCIÓN DE LA VARIABILIDADGENÉTICA 1 1303.1. ESTRUCTURA GENETICA INTRAPOBLACIONAL 1 1303.2. DIFERENCIACIÓNGENETICAENTRE POBLACIONES 115D4. LAS RAZAS DEL NOA Y su RELACIÓNCON LOS COMPLEJOS RACIALES DE AMERICA 1 18DS. ADN ANTIGUO: UNA HERRAMIENTA PARA EL SEGUIMIENTOTEMPORAL DE Los PATRONESDE VARIACIONGENETICA 122D5.1. CRITERIOS DE AUTENTICIDAD 12405.2. CONSERVACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOSEN EJEMPLARES AROUEOLOGICOS DEL NOA 12505.3. INFERENCIASPOBLACIONALES 128DS. CROMOSOMAS SUPERNUMERARIOS Y GRADIENTES ALTITUDINALES 1 30
CONCLUSIONES 1:5
BIBLIOGRAFÍA 137
APÉNDICE
PROTOCOLOS DE EXTRACCIONDE ADN 151
DELLAPORTAY COL. (1983) MODIFICADO 151YANG Y COL. (1998) MODIFICADO 151SOLUCIONES 152ELECTROFORESIS DE GELES DE AGAROSA 152ELECTROFORESIS DE GELES DE POLIACRILAMIDA 152SECUENCIACIÓN 153PROTOCOLO DE PRECIPITACIÓN CON ISOPROPANOL 153FRECUENCIAS ALELICAS 1 55DIVERSIDADGENETICA 171
CONTRASTES DE STUDENT-NEWMAN-KEULS(ZAR 1984) 171ANALISIS DE EJEMPLARES AROUEOLOGICOS 171
INTRODUCCIÓN
Raza Blanco
Introducción
El maiz, Zea mays ssp. mays. es uno de los cultivos más importantes de América y
ha estado vinculado con la actividad humana desde los inicios de la agricultura. Las razas
nativas presentan una gran diversidad morfológica, bioquímica y citogenética,
extendiéndose a lo largo de todo el continente a través de una amplia gama de climas y
ambientes. En Ia República Argentina, la incorporación del cultivo en las sociedades del
pasado se remonta a tiempos muy anteriores a la conquista y sus usos originarios han
quedado plasmados en las costumbres actuales de los habitantes del Noroeste y Noreste
del país. A pesar de su valor histórico. cultural y agronómico, la caracterización genética de
estos recursos es casi inexistente. El presente trabajo propone hacer un relevamiento de
la variabilidadgenética oontenida en ejemplares actuales y arqueológicos de razas nativas
del Noroeste argentino a fin de establecer su relación con los complejos raciales del
continente americano y determinar la influencia de procesos históricos y selectivos en los
patrones de distribución morfológicosy citogenéticos previamente documentados.
I1. EL GÉNERO ZEA (GRAMINEAE)
El género Zea L. comprende un conjunto de gramíneas anuales y perennes
originarias de México y América Central. La clasificación propuesta por lltis & Doebley
(1980), Doebley (1990b) y lltis & Benz (2000), divide al género en las siguientes
secciones, especies, subespecies y razas:
Sección Luxuriantes
Zea diploperennis lltis. Dobley & Guzmán
Zea perennis (Hitchc.) Reeves &Mangelsdorf
Zea quun'ans (Durieu 8.Ascherson) Bird
Zea nícaraguensis lltis& Benz
Sección Zea
Zea mays L.
subsp. mexicana (Schrader) ltlisRaza Chalco
Raza Central Plateau
Raza Nobogame
subsp. parw'glumis lltis 8. Doebley
subsp. huehuetenangensis (lltis&Doebley) Doebley
subsp. mays lltis & Doebley
La característica morfológicaque distingue al maiz, no sólo de sus congéneres, sino
también de todo el resto de las gramineas. es la presencia de una mazorca polistica, con
numerosos granos de gran tamaño incapaces de desarticularse sin la intervención del
hombre, lo cual le impide desarrollarse en estado silvestre. Las restantes especies y
subespecies del género, también conocidas bajo el nombre de teosintes, poseen, en
cambio, una espiga pequeña, dística, y con pocos granos que logran desarticularse
fácilmente (DOEBLEY& ILTIS1980).
La distribución del maiz abarca toda Ia extensión del continente americano, ya sea
a través de sus formas autóctonas o por intermedio de las variedades comerciales,
extendiéndose además al resto del mundo, en donde fue introducidotras el descubrimiento
de Améri a fines del siglo XV.La distribuciónde los teosintes es, por el contrario, mucho
más restringida, limitándose sólo a ciertas zonas de México, Honduras, Guatemala y
Nicaragua (DOEBLEY& ILTIS1980; ILTIS8. DOEBLEY1980; |LTIS& BENZ 2000).
Dentro de la Sección Luxuriantes,dos de sus especies son anuales, Zea quurians y
Zea nicaraguensis, y dos perennes, Zea diploperennis y Zea perennis, en tanto que en la
Sección Zea todas las subespecies y sus razas son anuales (DOEBLEY& ILTIS1980; ILTIS&
BENZ2000).
El número cromosómico de la mayoría de las especies que integran el género Zea
es 2n=20, siendo las únicas excepciones Zea perennis, con 2n=40, y Zea nicaraguensis,
cuyo 2n no ha sido aún determinado. El nivel de plodía de Zea mays ssp. mays ha sido
objeto de discusión desde los primeros estudios cromosómicos realizados en este cultivo.
En la actualidad, las evidencias citogenéticas y moleculares coinciden en sugerir que tanto
el maíz como las restantes especies del género, serían alopoliploides crípticos de origen
antiguo, con un número básico de x=5 (MOLINA& NARANJO1987; NARANJOet al. 1990;
POGGIO et al. 1990; NARANJO et al. 1994; MOORE et al. 1995; GAUT & DOEBLEY 1997;
GONZALEZ2004).
En las plantas, la abundancia y el comportamiento meiótico de los híbridos
interespecificos proveen una medida de las diferencias génicas y estructurales entre los
genomas de las especies involucradas, y, consecuentemente, de las relaciones evolutivas
entre ellas. Dentro de la sección Zea, la hibridación interespecifica es un fenómeno
frecuente entre Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. mexicana, como asi también entre
Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. huehuetenangensis; mientras que, por el contrario,
los híbridos entre Zea mays ssp. mays y Zea mays ssp. parviglumis son prácticamente
inexistentes en la naturaleza (DOEBLEYet al. 1987a). Desde el punto de vista citogenético,
los tres tipos de híbridos muestran meiosis regular y niveles normales de fertilidad del
2
Introducción
polen (DOEBLEY& ILTIS 1980; ILTIS8. DOEBLEY1980). Si bien estos resultados parecen
indicar muy bajos niveles de diferenciación genómica entre las subespecies, estudios
recientes de citogenética molecular han demostrado que el grado de homología entre los
genomas correspondientes a las subespecies de la sección Zea es menor a lo inicialmente
supuesto (GONZALEZ2004). El análisis de las afinidades genómicas mediante hibridación in
situ (GISH - del inglés Genomíc in situ hybn'dízation)mostró que a pesar de que Zea mays
ssp. mays posee mucha mayor homología con Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp.
parviglumisque con Zea mays ssp. huehuetenangensis, las divergencias genómicas entre
maíz y las dos primeras son de magnitud apreciable (GONZALEZ2004; GONZALEZet al.
2004; POGGIOet al. 2004).
En la sección Luxuriantes, todos los híbridos interespecíficos analizados -Zea
luxun'ans x Zea diploperennis . Zea perennis x Zea diploperennis, Zea luxun'ans x Zea
perennis- exhibieron irregularidades meióticas (NARANJOet al. 1994; POGGIOet al. 1999;
GONZALEZ2004), al igual que los híbridos interseccionales (DOEBLEY& ILTIS1980; ILTIS&
DOEBLEY1980; GONZALEZ2004). En ambos casos, las irregulandas observadas fueron
atribuidas tanto a las diferencias en el número cromosómioo de las especies parentales,
como a la divergencia entre sus genomas. En particular. la única especie con 2n=40, Zea
perennis, fue también Ia que evidenció mayor divergencia genómica con respecto a sus
congéneres en los estudios de citogenética molecular realizados por Gonzalez (2004).
|2. EL MAÍZ- ZEA MAYSssp. MAYS
l2.1. Origen y dispersión
La teoría más aceptada en relación con el origen del maiz. basada en evidencias
morfológicas, citogenéticas y moleculares. propone que éste habría derivado del teosinte
anual Zea mays subsp. parviglumis (BEADLE1932; DOEBLEY1990b; MATSUOKAet al.
2002b). Sin embargo. debido a la magnitud de las diferencias morfológicas entre ambas
entidades. otros autores han postulado la existencia de un “maíz silvestre", actualmente
extinto o bien desconocido, que habría dado lugar a la variante domesticada (teoria
tripartita) (MANGELSDORF& REEVES 1939; MANGELSDORF1974).
Los procesos de domesticación pueden producirse a partir de un único evento. o por
el contrario, ser de eventos múltiples, repetidos tanto en el tiempo como en el espacio. En
este sentido, la gran diversidad del maiz a nivel morfológico y molecular ha resultado dificil
de conciliar con la pérdida de variabilidad asociada a los cuellos de botella por los que
3
generalmente atraviesan las plantas domesticadas, llevando al surgimiento de hipótesis
contrapuestas en cuanto al número de eventos de domesticación involucrados en el on'gendel cultivo.
Diversos argumentos han sido presentados en favor de la teoría del evento único
(DOEBLEYet al. 1986b; DOEBLEY1990b; MATSUOKAet al. 2002b). Según Doebley, Goodman
8. Stuber (1986b), los altos niveles de variabilidad observados podrían ser explicados através de un incremento en la tasa de evolución del maíz como consecuencia de la
intervención del hombre y de la selección artificial. Asimismo, la introgresión de variantes
alélicas provenientes de teosintes ha sido otra de las justificaciones esgrimidas para dar
cuenta del patrón antes mencionado (DOEBLEY1990b).
Por su parte, Randolph (1959), Mangelsdorf (1974), Kato (1984) y, más
recientemente. Goloubinoff, Paabo & Wilson (1993) han propuesto que el maiz se habría
originado en forma recurrente a partir de distintas poblaciones de teosinte, conservando así
gran parte de Ia diversidad presente en sus progenitores.
Según evidencias citogenéticas, bioquímicas y moleculares. el maíz habría surgido
en América Central hace aproximadamente 7.500 —10.000 años, extendiéndose luego
hacia Norte y Sudamérica (lLTIs1983; MATSUOKAet al. 2002b). La ubicación geográfica del
sitio de origen coincidiría, al menos en parte, con las localidades actualmente habitadas por
su supuesto progenitor Zea mays ssp. parviglumis, los valles de los ríos Balsas y Lerma
en el Sudoeste mexicano (DOEBLEY1990a). La llegada del maiz a América del Norte habría
tenido lugar a través de la región sur del Suroeste de los Estados Unidos entre los años
750 y 500 a.C., esparciéndose luego hacia el centro y Este del país hasta llegar a Canadá
(DOEBLEYet al. 1983b).
Los primeros estudios acerca del patrón de dispersión hacia América del Sur fueron
realizados sobre la base del análisis citogenético de razas nativas (MCCLINTOCKet al.
1981). Según los mismos, el maiz habría sido originalmente introducido en los Andes
Centrales sin sufrir nuevas contribuciones genéticas sino hasta tiempos más recientes,
probablemente provenientes del Este de Brasil. Nuevas evidencias obtenidas a partir del
análisis de Ioci microsatélites (MATSUOKAet al. 2002b) sugieren que el ingreso del maiz en
América del Sur se habría producido inicialmente a través de las tierras bajas, llegando
hasta los Andes en una etapa posterior.
I2.2. El registro arqueológico
Gran parte de las inferencias en relación con el origen y dispersión del maíz se han
basado en las características morfológicas, citogenéticas y bioquímicas de sus
representantes actuales. Como se verá a continuación, el registro arqueológico brinda la
oportunidad de contrastar estas inferencias con una fuente de información independiente.
ya sea a través de las aproximaciones clásicas, o de las más recientes metodologíasmoleculares.
l2.2.1. Macro y microfósiles
Las evidencias macrobotánicas más antiguas en relación con las fases iniciales de
la domesticación del maíz provienen de los valles de Tehuacán y Oaxaca en México (LONG
et al. 1989; BENZ2001).
Los restos arqueológicos encontrados en las cuevas de Coxcatlán y San Marcos, en
el valle de Tehuacán, fueron considerados durante mucho tiempo representantes de los
“maíces silvestres” propuestos por la teoría tripartita (BENZ1999). Inicialmente datados
como correspondientes a los 6.000-4.500 a.C., estudios posteriores demostraron que la
antigüedad de dichos vestigios no superaba los 5.500 años (BENZ& ILTIS1990). Más aún. a
pesar de que muchas de sus características concordaban con rasgos considerados
primitivos, un nuevo análisis morfológico de los mismos ejemplares reveló un gran parecido
con las razas actuales y una tendencia al incremento en el diámetro del raquis y tamaño
del grano a lo largo de la sucesión temporal (BENZ& ILTIS1990).
Uno de los resultados más sorprendentes de estas investigaciones surge de la
comparación estadistica de la morfología de los malces primitivos de la cueva de San
Marcos con un conjunto de razas mexicanas y un maíz reventador o popcom de Argentina
(Argentine Pop) a través del método de componentes principales (PCA). Los restos
arqueológicos resultaron significativamente distintos a las razas de México, aunque
indistinguibles del Argentine Pop. Estas observaciones fueron interpretadas como
consecuencia de la conservación de formas primitivas en las zonas periféricas de la
distribución, tras haber sido sustituidas por formas especializadas en el área de origen
(BENZ & ILTIS1990).
La reciente datación de ejemplares provenientes de Guilá Naquitz, Oaxaca, ubica a
estos últimos como los más antiguos descriptos hasta el momento con una antigüedad de
ca. 6.200 años (BENZ2001). A pesar de un desfasaje de aproximadamente 700 años con
respecto a los restos más antiguos de Tehuacán, la diferenciación morfológica entre los
individuos de ambos sitios es prácticamente nula (BENZ2001).
Algunos sitios más tardíos de México,el sudoeste de los Estados Unidos, como asi
también de Centroamérica, fueron descriptos por Mangelsdorf en una serie de trabajos (ver
revisión BENZ1994). Sin embargo. sus conclusiones han sido cuestionadas debido a Ia
falta de registro de las mediciones y datos originales y al sesgo que parece haber
introducido en ellas la “teoría tripartita" (BENZ1994).
De Io anteriormente expuesto se desprende que los registros más antiguos hallados
hasta la fecha provienen de los valles de las tierras altas de Mexico, y no de las zonas
próximas al río Balsas, como cabría esperar si fuera esta la localización geográfica del
centro de origen. Una posible explicación para este hecho viene dada por las
desfavorables condiciones de preservación que caracterizan a los ambientes cálidos y
húmedos, a Io cual debe sumarse la poca atención que ha recibido el área en las
investigaciones arqueológicas.
Algunas de las herramientas comúnmente utilizadas para la detección e
identificación de restos vegetales en sitios arqueológicos de áreas tropicales son los
granos de polen, los granos de almidón y los fitolitos. Los fitolitos son estmcturas silíceas
presentes en los tejidos vegetales que resultan en muchos casos específicas de ciertos
grupos de plantas. y cuya conservación es frecuente en las distintas capas estratigráficas.
como así también en los elementos cerámicos.
Con el fin de determinar la utilidad de su aplicación en el estudio del origen del maíz,
Pipemo & Pearsall (1993) examinaron la estructura de los fitolitos en teosintes, Tn'psacum
y en 11 razas de maíz, entre las que se encontraba el maíz reventador Argentine Pop
estudiado por Benz & Iltis (1990). Los fitolitos de dichos ejemplares demostraron tener
ciertas peculiaridades que los diferenciaban tanto de los de otras razas como los de los
teosintes, lo cual, en vistas de la similitud hallada por Benz e Iltis (1990) con los ejemplares
de la cueva de San Marcos, llevó a proponer su utilización como marcadores de maiz
primitivoen las secuencias arqueológicas.
Si bien el origen mesoamericano del maiz es prácticamente indiscutido, el debate
parece haberse desplazado hacia un nuevo terreno: la antigüedad de la introducción del
cultivo en América del Sur. Según Pipemo & Pearsall (1998), diversos estudios
provenientes de fitolitos, granos de polen y granos de almidón apoyan la hipótesis de una
dispersión temprana hacia las regiones del Sur de Centroamerica y Norte de América del
Sur (7.000-5.000 AP). Asimismo, los granos de polen hallados por Pope y col. (2001) en
capas de ca. 7.000 años de antigüedad en las inmediaciones de Tabasco sobre el golfo de
6
México. contribuyen a dar sustento a dicha hipótesis. Por su parte, tanto Smith (1998)
como Staller & Thompson (2002) sostienen que la aparición del maiz en Sudamérica
habría sido mucho más tardía (1200-2000 a.C.). Sin embargo, todos los argumentos
expuestos por dichos autores fueron convincentemente refutados por Pearsall (2002;
2004) sobre la base de nuevas evidencias surgidas del análisis de fitolitos y gránulos de
almidón provenientes de restos arqueológicos de Ecuador.
De aceptar el escenario de introducción temprana, la presencia en Sudamérica de
fitolitos de malz desde hace ya 7.000 años implica que el proceso de domesticación se
habría iniciado en etapas bastante anteriores a lo evidenciado por el registro
macrobotánioo. De hecho, los ejemplares más antiguos descriptos hasta la fecha ya
presentan gran parte de los atributos morfológicos que caracterizan a la inflorescencia del
maiz actual, lo cual constituye una importante diferenciación con respecto a su supuesto
progenitor, el teosinte Zea mays ssp. parviglumis.
I2.2.2. Estudios moleculares
La posibilidad de extraer ácidos nucleicos a partir de restos fósiles, arqueológicos,
ejemplares de museo y residuos forenses ha permitido incorporar una nueva dimensión al
estudio del pasado y de la evolución molecular.
El término ADN Antiguo (ADNa) o “Ancient DNA"comprende todo resto de material
genético proveniente de organismos muertos o de deshechos extracorpóreos de
organismos vivos. Debido al estado de deterioro del ADN, los procedimientos utilizados
para su purificación deben ser ajustados para satisfacer estrictos criterios de autenticidad
incorporando precauciones especiales destinadas a evitar la contaminación y la formación
de artefactos de amplificación durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(PAABO 1989b; HERRMANN & HUMMEL 1994; COOPER & WAYNE 1998; COOPER & POINAR
2000; MAROTA8. ROLLO2002).
En el maiz, las investigaciones realizadas hasta el momento han verificado la
presencia de ADN en buen estado de conservación en manos y can'ópsides
arqueológicas. pudiendo obtenerse fragmentos de secuencias correspondientes a genes
nucleares y mitocondriales. Los estudios pioneros en la materia fueron realizados por
Rollo y col. (1988; 1991). quienes caracterizaron y amplificaron los ácidos nucleicos
extraídos a partir de can'ópsides de 1000 años de antigüedad, provenientes de un
enterratorio de la región costera del Perú (sitio Huari). Mediante ensayos de sensibilidad a
RNAsa, determinación de la composición de bases por HPLC (del inglés High Performance
Liquid Chromatography) y evaluación de las propiedades antigénicas. pudo establecerse
que la mayor parte del extracto correspondía a ácido ribonucleico (ARN). La presencia de
de ácidos nucleicos de origen endógeno pudo ser confirmada a través de Ia amplificación
de 130 pares de bases (pb) del gen mitooondn'al Cox I (citocromo oxidasa c -—subunidad I),
100 pb del ADN altamente repetitivo HZa y 90 pb del elemento transponible Mu (ROLLOet
al. 1994). Estos primeros estudios, si bien tuvieron fundamental importancia abriendo el
camino para investigaciones posteriores. no continuaron su desarrollo. Fueron Goloubinoff
y col. (1993). en cambio, quienes aplicaron por primera vez las técnicas de ADN antiguo
para el abordaje de problemas evolutivos en maiz. A partir de datos de secuencia de 315
pb del gen Adh2, Alcohol Deshídrogenasa 2, se demostró que Ia divergencia nucleotidica
entre los alelos provenientes de los especímenes arqueológicos era similara la observada
entre alelos de las muestras contemporáneas, y que, en algunos casos. los alelos
“antiguos” eran más parecidos a los actuales, de maíz o teosinte, que entre si. Dos
conclusiones derivaron de estas observaciones: 1) la variabilidaddocumentada en maiz no
responde a una aceleración de la tasa de sustitución como lo habían propuesto otros
autores (ver sección I2.1.); y 2) la divergencia de las variantes alélicas presentes en el
maiz es anterior al evento de domesticación. Esto último llevó a proponer que la
conformación del pool génioo del maíz sería consecuencia de eventos múltiples de
domesticación, o bien, de procesos de introgresión temprana con las especies de teosintes
(GOLOUBlNOFFet al. 1993).
Más recientemente. Jaenicke y col. (2003) incorporaron también ejemplares
arqueológicos en sus investigacionesacerca de los caracteres seleccionados en las etapas
iniciales de la domesticación. A pesar de que las evidencias macrobotánicas han permitido
establecer cuáles habrian sido las caracteristicas morfológicas de la mazorca sujetas a
selección por parte de los cultivadores aborígenes, otros aspectos. tales corno la
arquitectura de Ia planta o las estructuras de almacenamiento de almidón, no han podido
ser analizados debido a la naturaleza fragmentan'a de los restos comúnmente hallados en
los sitios arqueológicos (marlos desgranados, mazorcas carbonizadas).
El estudio de la base genética de la diferenciación morfológica entre Zea mays ssp.
mays y los teosintes provee una nueva herramienta para superar este obstáculo. Tres
genes aparentemente involucrados en el proceso de domesticación han sido identificados y
caracterizados: teosinte branched 1 (tb1), prolamin box binding factor (pbf) y sugary 1 (su1)
(JAENICKE-DESPRÉSet al. 2003). Jaenicke y col. (2003) hallaron que la diversidad alélica
presente en maiz para dichos genes era mucho más reducida que lo observado en su
supuesto progenitor, Zea mays ssp. parviglumis. AI extender el análisis a muestras
arqueológicas de entre 4.300 y 650 años de antigüedad, provenientes del Noreste de
México y de las sierras de Mogollón en Nuevo México, Estados Unidos. el patrón de
8
variación alélica obtenido llevó a sugerir que tanto las características relacionadas con la
arquitectura de la planta (tb1) como con las propiedades bioquímicas de proteinas y
almidón (pbf, su1) ya habrian sido seleccionadas en los inicios de la historia del cultivo y
antes de su ingreso en los Estados Unidos.
¡3. RAZAS NATIVAS DE MAÍZ DEL CONTINENTE AMERICANO
I3.1. Diversidad morfológica
El estudio de Ia diversidad morfológica en las razas de maíz de México tuvo sus
inicios a principios del siglo XX en los trabajos de Vavilov y colaboradores, quienes se
ocuparon fundamentalmente de caracteres de índole agronómica. Posteriormente,
Anderson incluyó nuevos atributos en sus análisis e incorporó el concepto de variación
poblacional y regional, generando asi, grandes categorías taxonómicas que siguen siendo
utilizadas hasta la fecha (citado por BENZ1994). Continuando con su legado, Wellhausen,
Roberts, Hernández y Mangelsdorf coleccionaron, evaluaron y describieron Ia amplia
diversidad de las razas mexicanas, siendo este referente el que se utilizarla años más
tarde para describir las razas de Latinoamérica, dando lugar a los folletos conocidos como
“The Races of Maize Book/ets" (citado por BENZ1994).
Desde entonces, más de 300 razas han sido descriptas en el continente americano,
en su mayoría provenientes de las zonas de mayor diversidad, México y la región ando
peruana. Los caracteres más importantes utilizados para la discriminación de formas
raciales incluyen la morfología de la mazorca, la arquitectura de la planta, las adaptaciones
agro-ecológicas y el origen geográfico de los ejemplares analizados. El estudio de la
morfología de la mazorca involucra Ia determinación de la forma y longitud del raquis,
número de hileras de granos, espesor y ancho de granos, ancho y profundidad de las
cúpulas, así como también diámetro del marlo y raquis, entre otros (SANCHEZG. et al.
1993)
La aplicación de técnicas de taxonomía numérica a un conjunto de 219 razas
latinoamericanas permitió identificar 14 complejos raciales cuya composición coincide, casi
en su totalidad, con las afinidades propuestas en base a los análisis morfométricos
convencionales (GOODMAN& McK. BIRD1977). Siguiendo la numeración y nomenclatura
originalmente asignada por Goodman y McK Bird (1977) los grupos definidos son: I.
Grupo Cónico (Conical Group); Il. Dentados del Caribe (Caribbean Dents); Ill.
Reventadores del Sur de América (Southern Popcoms); IV. Reventadores del Norte de
América del Sur (Northern South American Popcoms); V. Harinosos de Tierras Bajas
(Low/and Flours); Vl. Grupo Chapalote (Chapalote Group); VII. Razas del Noroeste de
América del Sur (Northwestem South American Races); VIII.Razas del Sur de América del
Sur (Southern South American Races); IX. Cómeos de los Andes del Sur (South Andean
Flints); X. Complejo Andino Central (Central Andean Complex); XI. Dentados Blancos del
Sur Modernos (Modem Southern White Dents); XII. Grupo Cuzco (Cuzco Group); Xlll.
Grupo Humahuaca (Humahuaca Group); XIV.Grupo Cravos (Cravos).
En los Estados Unidos, se delimitaron diez grupos raciales para la clasificación
taxómica de las razas de maiz de la región (GOODMAN& BROWN1988). Éstos son: I.
Han'nosos y Cómeos del Norte (Northern Flints and Flours); ll. Harinosos y Cómeos de las
planicies (Great Plains Flint and Flours); lll. Pima-Papago (Pima-Papago); IV.
Semidentados del Sudoeste (Southwestem Semidents); V. Doce hileras del Sudoeste
(Southwestem 12 Row); VI. Harinosos del Sudeste (Southeastem Flours); VII. Dentados
del Sur (Southem Dents); Vlll. Dentados del Sur Derivados (Derived Southem Dents). lx.
Cómeos del Sudeste (Southeastem Flints); x. Dentados del Cinturón Maicero (Corn Belt
Dents).
La breve enumeración presentada basta para delinear la complejidad de las
relaciones entre las razas y las dificultades en la identificación de grupos evolutivamente
significativos. Es por ello que la integración de datos morfológicos y moleculares. así como
un muestreo más exhaustivo de las áreas marginales de la distribución, son requisitos
fundamentales para lograr un sistema natural de clasificación de las razas de maíz de
América.
l3.2. Diversidad genética
El análisis de la variabilidadgenética de las razas de maíz americanas alcanzó gran
magnitud en los años '80 , gracias a la utilización de la técnica de electroforesis de
isoenzimas. Goodman y Stuber (1983) describieron la variación isoenzimática en las razas
de Bolivia. Estos estudios revelaron una constitución isoenzimática común para las
morfológicamentediversas razas andinas. mostrando. además, una fuerte correlación entre
la altitud del cultivo y ciertas frecuencias alélicas. Un patrón de correlación similar entre
distintos alelos isoenzimáticos y altitud fue encontrado por Doebley y col. (1985a) al
analizar las razas de México.
Asimismo, el grado de diferenciación observado entre los maíces Cómeos del Norte
de los Estados Unidos (Northern Flints) y los Dentados del Sur (Southern Dents) dio
10
sustento a la división taxonómica previamente propuesta en base a características
morfológicas, y contribuyó a determinar el origen hibrido interracial de los maices Dentados
de las zonas centrales del Oeste de EEUU. (DOEBLEYet al. 1983a; DOEBLEYet al. 1986a;
DOEBLEYet al. 1988).
En las razas de Guatemala, los datos isoenzimáticos obtenidos por Bretting y col.
(1990) mostraron la existencia de dos complejos: uno correspondiente a las poblaciones
de tierras altas y el otro a las poblaciones de regiones bajas, aún cuando algunas de ellas
habían sido asignadas a la misma raza según criterios morfológicos.
La relación existente entre las razas de las islas del Caribe y las de las zonas
continentales ha sido difícil de determinar. En este caso, los estudios isoenzimáticos
llevados a cabo por Bretting y ool. (1987a) pusieron de manifiesto una gran afinidad entre
dicho germoplasma y las razas del Norte de América del Sur, y no asi con las razas de laszonas continentales de México.
Además de su utilidad para establecer las relaciones entre distintas entidades, los
datos provistos por los estudios isoenzimáticos permiten poner a prueba las hipótesis
vinculadas con el proceso de domesticación a través de las estimas de variabilidad.
Asumiendo que el surgimiento del maiz se produjo a partir de Zea mays ssp. parviglumís
en un único evento relativamente reciente (ca. 10.000 años), y de no mediar fenómenos de
introgresión recurrentes, los niveles de variabilidad del taxón domesticado deberían verse
sustancialmente reducidos con respecto a los de su progenitor silvestre. Dos estadísticos
comúnmente utilizados para estimar la variabilidad en poblaciones naturales, el número
promedio de alelos y la heterocigosis esperada promedio, permiten comparar la diversidad
genética entre ambos taxones. Según Doebley y Goodman (1984), los niveles de variación
observados en Zea mays ssp. parviglumis son superiores a lo descripto para Zea mays
ssp. mays, siendo muy altos los primeros y moderados los segundos. Sin embargo, al
examinar en detalle los valores de los estadísticos, estas diferencias no parecen ser tan
evidentes. Mientras que para la subespecie mays la heterocigosis esperada promedio por
población y el número promedio de alelos son de 0,229 y 4,37, respectivamente; para la
subespecie parviglumis dichos valores ascienden a 0,261 y 4,67. Más aún, al calcular la
heterocigosis esperada para cada subespecie como un todo, considerando en forma
conjunta todas las poblaciones de cada una de ellas, este parámetro adquiere el mismo
valor para las dos entidades (0,311). Si bien estas estimas provienen de un número
pequeño de poblaciones, especialmente en el caso de los datos de maíz, estudios
posteriores realizados por Goodman y Stuber (1983) y Sanchez G. y col. (2000) arrojaroncifras similares.
Otro de los aspectos relevantes que surge de la comparación de los patrones de
variabilidad, particularmente en el caso de plantas con importancia económica, es
cuantificar la diversidad contenida en los materiales autóctonos y determinar qué
porcentaje de esta última se halla representado en las variedades comerciales. Como
ejemplo puede mencionarse lo encontrado por Goodman y Stuber (1983) para las razas de
Bolivia:una muestra de 50 plantas de cualquiera de las razas bolivianas posee el mismo
número de alelos isoenzimátioos que todo el conjunto de lineas endocriadas (¡nbred lines)
más utilizadas en los Estados Unidos. Estas observaciones ponen de manifiesto la
importancia de las razas nativas en la conservación de recursos y futuros programas de
mejoramiento.
AI introducirse las técnicas de ADN como procedimiento de rutina en los estudios
sistemáticos, la mayor parte de los trabajos en el género Zea se centraron en dilucidar las
relaciones de parentesco y los patrones de introgresión entre las especies del grupo,
especialmente entre el maiz y los teosintes de la sección Zea, y no asi en documentar Ia
diversidad genética de las razas del cultivodoméstico. De este modo, una amplia van'edad
de marcadores moleculares -sitios de restricción en ADN de cloroplasto y mitocondn'as
(TIMOTHYet al. 1979; DOEBLEYel al. 1987b; DOEBLEY1990b), datos de secuencia de los
espaciadores transcriptos de genes n'bosomales (ITS — Internal transcribed Spacer)
(BUCKLER& HOLTSFORD1996), datos de secuencia del gen Alcohol Deshidrogenasa (Adh
1) (EYRE-WALKERet al. 1998), datos de secuencia del gen de la proteína de reserva
seminal GIobulina-1 (gb/1) (HILTON8: GAUT1998)- fue utilizada para inferir las relaciones
filogenéticas entre las especies y subespecies del género y para determinar la dinámica delevento de domesticación.
Inicialmente desarrollados como una herramienta de mapeo y caracterización de
germoplasma en lineas e híbridos comerciales de maiz (CHINet al. 1996; TARAMINO&
TINGEY1996; SMITH1997; SENIORet al. 1998), los marcadores microsatélites, también
conocidos como loci SSR (del inglés Simple Sequence Repeats), no tardaron en
incorporarse a los estudios evolutivos. En una primera etapa, Matsuoka y ool. (2002a)
evaluaron los niveles de variación y los patrones mutacionales de 59 loci en lineas, razas
nativas y teosintes de ambas secciones, verificando la utilidadde los cebadores diseñados
para Zea mays ssp. mays en las demás especies y subespecies del género. Zea mays ssp.
mexicana y Zea mays ssp. parviglumis presentaron los valores de diversidad más altos.
con un número promedio de alelos por locus de 4,32 y 4,8, respectivamente, seguidos por
Zea mays ssp. mays, Zea mays ssp. huehuetenangensis, Zea diploperennis, y Zea
luxun'ans en último lugar. con 2,19 alelos por Iocus.
Introducción
Una vez establecida la idoneidad de los microsatélites para el estudio de las
relaciones intra- e inter-específicas en el género, Matsuoka y col. (2002b) analizaron 99
Ioci en 193 accessions de maiz provenientes de todo el rango de distribución pre
colombino, desde Argentina hasta Canadá, y 64 accessions de los teosintes de la sección
Zea, cubriendo completamente su distribución geográfica actual. A pesar de que las
conclusiones resultantes de este trabajo se relacionan fundamentalmente con la
domesticación y mtas de dispersión del maiz en una escala macro-geográfica (ver sección
l2.1), una de sus principales contribuciones consiste en proveer un excelente marco de
referencia para nuevos estudios a nivel poblacional y regional.
|3.3. Variabilidad cromosómica
Zea mays ssp. mays constituye un interesante ejemplo de variación en el contenido
de ADN a nivel intraespecífico. Las diferencias en el tamaño del genoma radican
principalmente en el número de cromosomas supemumerarios (cromosomas B) y el
contenido de heterocromatina de los cromosomas del complemento regular (A).
l3.3.1. Cromosomas sugmumeran’os
Los cromosomas B o supemumerarios son cromosomas extras, no esenciales para
el organismo, que no reoombinan con ningún miembro del complemento regular y tienen
modos de herencia irregulares y no mendelianos (JONES& REES 1982; JONES1995; JONES
& HOUBEN2003). Su mantenimiento en las poblaciones naturales ha sido explicado
mediante dos modelos (ver revisión CAMACHOet al. 1997). El modelo heterótioo propone
que los cromosomas B permanecen en las poblaciones debido a que confieren algún tipo
de ventaja adaptativa a los individuos portadores. Según el modelo parasltico, en cambio,
los cromosomas B se perpetúan gracias a los denominados fenómenos de acumulación o
“impulso” (drive), independientemente de sus efectos beneficiosos o perjudiciales. Este
último parece ser el caso en la mayoria de los sistemas vegetales estudiados hasta el
momento. La acumulación puede ocurn'r durante la meiosis, asegurando el pasaje de los
cromosomas a la gameta funcional, o bien durante las divisiones mitóticas del grano de
polen (JONES a HOUBEN2003).
En el maíz, dos mecanismos están involucrados en la generación del "impulso" : 1)
no-disyunción en la segunda mitosis del polen, y 2) fecundación preferencial de la oósfera.
(RANDOLPH 1941; ROMAN 1947; CARLSON 1970; CARLSON 1986; SHI et al. 1996; CHIAVARINO
1997; GONZALEZ-SANCHEZet al. 2003).
13
Introducción
Hasta hace pocos años. la herencia de los cromosomas B de maíz a través de la vía
materna se consideraba mendeliana, sin haberse detectado mecanismo de impulso
positivo alguno (RANDOLPH1941; BLACKWOOD1956). Sin embargo, Rosato (1997) logró
obtener líneas de baja tasa de transmisión femenina. en donde el porcentaje de células con
cromosomas B después de la división era inferior al 50 por ciento, sugiriendo la existencia
de genes que promueven la pérdida de Bs en la meiosis femenina.
La capacidad de los cromosomas B para llevar a cabo la no-disyunción está
controlada genéticamente por los propios B. La regiones eucromáticas distal y proximal son
indispensables para impedir la separación de las cromátidas hermanas, actuando
principalmente sobre la región centromérica (heterocromatina centromérica). La no
disyunción puede interpretarse como un mecanismo que incrementa el número de
individuos con dos B en las poblaciones, aún cuando Ia frecuencia de Bs sea baja
(CARLSON & ROSEMAN 1992).
Otro de los factores que intervienen en el impulso de los cromosomas B es su
capacidad para ser transmitidos a las gametas durante la meiosis. Esto se produce gracias
a la presencia de mecanismos que suprimen la pérdida meiótica cuando se encuentran
como univalentes, y como consecuencia de un incremento en el entrecruzamiento para
formar bivalentes, cuando se encuentran en dosis más altas (CHIAVARINO1997; GONZALEZ
SANCHEZet al. 2003). Los cromosomas B poseen, además, genes que aumentan la
frecuencia de recombinación de los cromosomas A en la microsporogénesis (CARLSONet
al. 1993).
Las razas nativas de maíz presentan polimorfismos numéricos para cromosomas B
y su presencia ha sido determinada a lo largo de toda su distribución geográfica (LONGLEY
1938; BIANCHIet al. 1963; MCCLINTOCKet al. 1981; BREÏTING 8. GOODMAN1989; PORTER 8.
RAYBURN1990). Sin embargo, son pocos los estudios poblacionales y, en la mayoria de los
casos, el tamaño muestral es reducido. La incidencia de los polimorfismos numéricos para
cromosomas B en las poblaciones de razas nativas argentinas será presentada en detalle
en las secciones subsiguientes.
l3.3.2. Heterocromatina
El término heterocromatina hace referencia a regiones del genoma que se
encuentran altamente condensadas en forma permanente y son transcripcionalmente
inactivas (LEWlN1994).
Gran parte de Ia heterocromatina del maíz puede ser vísualizada en meiosis durante
la fase de paquitene como un nudo o “knob”mediante técnicas de tinción convencionales.
14
Introducción
Dichas zonas heterocromáticas están localizadas en 34 sitios polimórficosa lo largo de los
10 cromosomas que conforman el complemento haploide de maiz (KATO1976). Ward
(1980) determinó que existe una correspondencia entre los nudos paquiténicos y las
regiones teñidas diferencialmente en preparados mitóticos sometidos a la técnica de
bandeo C (bandas C). Las zonas heterocromáticas correspondientes a las regiones
centroméricas y del organizador nucleolar también pueden ser observadas mediante
modificaciones del bandeo C (CHOW8. LARTER1981; Gu et al. 1985). Asimismo, numerosos
estudios han demostrado la existencia de una correlación positiva entre porcentaje de
heterocromatina y contenido de ADN tanto en maiz oorno en teosintes (LAURIE& BENNETT
1985; RAYBURNet al. 1985; PORTER 8. RAYBURN1990; TITO et al. 1991).
La composición de las regiones heterocromáticas no es uniforme en todo el genoma
del maíz. Los knobs están compuestos por repeticiones en tandem de dos tipos de
unidades con un tamaño de 180 y 350 pb respectivamente, pudiendo alcanzar los miles o
millones de copias. Experimentos de hibridación in situ utilizando como sonda las unidades
de repetición caracteristicas de centrómeros (CentC) y de los nudos paquiténicos han
revelado la existencia de variación en el tamaño de las regiones centroméricas entre los
cromosomas, asi como también en el tamaño y composición de los knobs (ANANlEVet al.
2000).
La presencia y tamaño de nudos paquiténicos han sido utilizados por McClintocket
al. (1981) para la caracterización de las razas nativas de maiz del continente americano.
Los resultados de este análisis han sido la base de diversas hipótesis acerca de la relación
entre las razas y su dispersión hacia Norte y Sudamérica (ver sección I2.1). Sin embargo,
estudios recientes han puesto en duda la utilidad de los nudos paquiténicos para la
inferencia de relaciones entre razas debido a la gran influencia de los procesos de impulso
meiótico en la dinámica poblacional de los mismos (BUCKLERet al. 1999).
Independientemente de las interpretaciones filogenéticas posteriores, el detallado estudio
de la morfología y patrones de distribución de los knobs realizado por McClintock y col.
(1981) reveló una marcada estructuración geográfica de los complejos cromosómicos.
especialmente para Sudamérica. México y las regiones Norte y Oeste de Guatemala
exhibieron la mayor diversidad en relación con los tipos, tamaños y combinaciones de
knobs. En contraposición a este patrón, los malces de las tierras altas occidentales de
América del Sur, territorio que comprende la región andina desde Colombia hasta el Norte
de Chile y Argentina, resultaron ser notablemente uniformes en su composición
cromosómica, caracterizándose por una ausencia casi total de knobs, con excepción de
dos pequeños ubicados en los brazos largos de los cromosomas 6 (región 3) y 7. La gran
15
uniformidad observada llevó a McCIintock y col. (1981) a acuñar el término Complejo
Andino en referencia a este últimoconjunto de razas.
l3.3.2. Cromosomas sugemumerarios. heterocromatinal contenido de ADN y variablesambientales
Diversos estudios sobre contenido de ADN, distribución y frecuencia de
cromosomas B, nudos paquiténicos (knobs) y bandas C en maíz han demostrado que
existe una estrecha relación entre estas variables y componentes ambientales. En la Tabla
1 se presenta un resumen de las asociaciones observadas por diferentes autores en razas.
variedades y líneas de maíz de América y Europa.
Tabla 1. Relación entre tamaño del genoma. heterocromatina. cromosomas B, latitud y altitud.
Antecedentes en razas nativas de maíz. variedades y líneas de America y Europa.
Asociación Correlación Material Referencia
Contenido de ADN-latitud Negativa 22 Lineas de Norteamérica (RAYBURNet al. 1985)
Contenido de ADN-latitud Negativa 11 variedades de México y EEUU. (LAURIE8. BENNETT1985)
Contenido de ADN-altitud Negativa 8 poblaciones de Mexico (RAYBURN8. AUGER1990b)
Contenido de ADN-altitud Negativa 12 poblaciones de Nuevo Mexico (RAYBURN1990)
Contenido de ADN-altitud Positiva 12 poblaciones de Arizona (RAYBURN& AUGER1990a)
Knobs-altitud Negativa 15 poblaciones de Guatemala (MANGELSDORF8. CAMERON1942)
Knobs-altitud Negativa Poblaciones de Latinoamerica (LONGLEY& KATO-Y1965)
Knobs-altitud Negativa 21 poblaciones de México (BENNETT1976)
Knobs-altitud Negativa 300 poblaciones de Centroamérica (BRETTING8. GOODMAN1989)
Knobs-Iatitud Negativa 425 poblaciones de Italia (BIANCHIet al. 1963)
Knobs-latitud Negativa 21 poblaciones de Mexico (BENNE'I'I'1976)
Knobs-Bs Negativa 33 poblaciones de Norteamérica (LONGLEY1938)
Knobs-Bs Negativa 425 poblaciones italianas (BIANCHIet al. 1963)
Bandas C —Bs Ausente 12 poblaciones de Arizona (PORTER8. RAYBURN1990)
Bs —altitud Negativa 300 poblaciones de Centroamerica (BRETTING8. GOODMAN1989)
Bs - altitud Ausente 12 poblaciones de Arizona (PORTER& RAYBURN1990)
Todos los estudios coinciden en la existencia de una correlación negativa entre
contenido de ADN y latitud, knobs y altitud, así como también entre knobs y latitud. Por Io
tanto, aquellas poblaciones provenientes de regiones de menor altura o más próximas al
Ecuador presentarían mayor cantidad de knobs que las ubicadas en zonas más altas o
más próximas a los polos.
La relación entre contenido de heterocromatina y cromosomas B muestra resultados
discordantes, pudiendo observarse una asociación negativa, o bien, ausencia de
16
asociación, dependiendo del parámetro utilizado para la evaluación de la cantidad de
heterocromatina, esto es número de nudos paquiténicos Obandas C, respectivamente.
Del mismo modo, la frecuencia de cromosomas B parece estar negativamente
correlacionada con la altitud en poblaciones provenientes de América Central, mientras que
no es posible verificar esta asociación en poblaciones provenientes de Arizona.
l4. RAZAS NATIVASDE MAÍZDEL NOROESTE ARGENTINO
|4.1. Generalidades
El Norte de la República Argentina puede dividirse en dos vastas regiones en IOque
al cultivo del maiz se refiere: la región andina O Noroeste y la planicie mesopotámico
chaqueña (Horovitz, 1935).
El Noroeste Argentino (NOA) forma parte de la esfera de expansión de las razas de
maiz procedentes del centro de diversidad ando-peruano. Los malces propios de esta zona
son malces autóctonos Oindigenas descendientes de los cultivados por los habitantes pre
colombinos de la región. En Ia actualidad, el maíz continúa siendo uno de los alimentos
principales de los pobladores locales. Las parcelas dedicadas a la labranza son pequeñas,
pudiendo tener entre unos pocos metros cuadrados hasta algo menos de una hectárea. La
mayoria de los cultivadores realiza las labores con arado de reja tirado por mulas y efectúa
la siembra a mano en surcos. Los maíces asi producidos se utilizan casi integramente
para el consumo familiar (Cámara Hernández, 1998).
Además de su valor histórico y cultural. las variedades autóctonas de maiz poseen
numerosos caracteres que constituyen una riqueza potencial para la agricultura moderna.
A pesar de ello, pocos estudios se han ocupado de la caracterización genética de lasmismas.
A continuación se presenta una breve reseña de los antecedentes acumulados
hasta el momento en relación con la variabilidad morfológica. genética y cromosómica de
las razas nativas de maiz de la República Argentina, con especial énfasis en la región
Noroeste.
I4.2. Diversidad morfológica
La gran diversidad morfológica de los materiales autóctonos de la República
Argentina fue puesta de manifiesto en el año 1980 por Torregrosa y colaboradores en su
“Clasificación preliminar de formas raciales de maiz y su distribución geográfica en la
República Argentina" (TORREGROSAet al. 1980). Años más tarde. considerando forma.
17
tamaño, diámetro, y número de hileras en la mazorca, diámetro de marlo, forma, tamaño e
indentación de los granos, colores del pericarpio, aleurona y endospenna, asi como
también la textura de los granos, Cámara Hernández y Miante Alzogaray (1997) pudieron
identificar56 formas raciales, 34 de las cuáles son características del Noroeste.
|4.3. Diversidad genética
Los primeros estudios de variabilidad genético-morfológica registrados en razas
nativas de maiz de nuestro país fueron realizados por Horovitz (1935) sobre la base de la
variación alélica para los caracteres de coloración de la aleurona y del pericarpio del grano.
Si bien la interpretación genética de estas observaciones puede ser sujeta a
cuestionamientos debido al estado del conocimiento de la época, las principales
conclusiones de este trabajo merecen ser destacadas. En primer lugar, Horovitz (1935)
comprobó que toda la serie de alelomorfos descripta para maíz se hallaba representada en
los maices autóctonos, encontrándose además, variantes exclusivas de la región. Por otro
lado, la marcada estructuración geográfica de los alelos lo llevó a postular que los maices
del Noroeste y de Ia planicie mesopotámico-chaqueña provendrlan de dos centros de
origen diferentes coincidentes con la regiones de agricultura pre-hispánica propuestas por
Vavilov: la región incásica o ando-peruana y la región guaranltica o austro-brasileña,
respectivamente.
Casi siete decadas más tarde, Sánchez y Goodman (2000) analizaron los patrones
isoenzimáticos de 28 accessions correspondientes a 22 razas de la República Argentina y
de la República Oriental del Uruguay como parte de su estudio de las razas de maiz de
América. Los niveles de variación encontrados para las razas argentinas estuvieron entre
los más bajos descriptos, junto con los hallados para los materiales de las Islas del Caribe,
siendo la mayor parte de las estimas de variabilidad del orden del 60% de lo observado en
Méxicoy Guatemala, las zonas de diversidad más alta.
En su descripción de la variación microsatélite de las razas de maiz, Matsuoka y
col. (2002b), incluyeron también 4 accessions de Argentina pertenecientes a las razas
Capia Garrapata, Capia Amarillo, Oke y Cristal Sulino. Dado que cada accession fue
representado por tan sólo un individuo, no fue posible calcular ningún tipo de parámetro
poblacional.
Considerando lo anteriormente expuesto, resulta evidente que la caracterización
genética del germoplasma autóctono de Ia República Argentina es aún incompleta,
limitando las posibilidades de explotación de estos recursos para el mejoramiento de uno
de los cultivos de mayor importancia económica del pais.
Introducción
l4.4. Variabilidad cromosómica
I4.4.1. Cromosomas supemumerarios
Rosato (1997) y Rosato y col. (1998) investigaron el polimorfismo numérico para
cromosomas B en 21 poblaciones nativas de maiz pertenecientes a 13 razas cultivadas
entre 80 y 3.620 m de altura. Las frecuencias poblacionales de individuos portadores de
cromosomas B oscilaron entre 0 y 94%, mientras que el número de Bs por individuo varió
entre 0 y 8, siendo O, 1, 2 y 3 las dosis más frecuentes. Las frecuencias medias
encontradas en las poblaciones nativas argentinas de maiz son las más altas descriptashasta el momento.
Los mecanismos de la herencia de cromosomas B en razas nativas de maíz del
Noroeste Argentino fueron estudiados por Chiavarino (1997). Su análisis de la tasa de
transmisión en la raza Pisingallo (VAV 6313) confirmó la estabilidad somática de los
cromosomas supemumerarios y la no-disyunción en la segunda mitosis del polen,
verificando además la existencia de fecundación preferencial. Estos estudios demostraron
que la tasa de transmisión se encuentra bajo control genético y que los genes involucrados
no modifican el comportamiento meiótioo, sino que influyen en la receptividad de la oósfera
para los núcleos esperrnátioos con Bs. Asimismo, el diseño experimental permitió poner de
manifiesto que los genes controladores de la tasa de transmisión forman parte del
complemento regular (A). o lo que es lo mismo, no se encuentran localizados en loscromosomas B.
I4.4.2. Contenido de ADNy heterocromatina
El contenido de ADNy la cantidad de heterocromatina fueron estudiados por Rosato
(1997) en 11 poblaciones pertenecientes a 6 razas nativas del NOA. La variación
intrapoblacional en el contenido de ADN del complemento regular fue del 36% (5,00-6,8
pg), mostrando similitud con lo encontrado para 32 poblaciones de Estados Unidos y
México (LAURIE & BENNETI' 1985; PORTER 8. RAYBURN 1990; RAYBURN 1990; RAYBURN &
AUGER 1990a; RAYBURN& AUGER 1990b).
La caracterización de la heterocromatina mediante bandeo fluorescente con 4-6
diamidino-2-phenylindol (DAPI) y bandeo C, permitió ratificar la concordancia entre
bandas DAPI+ y bandas C+. Las poblaciones analizadas presentaron polimorfismo y
politipismo para el número de bandas en su complemento regular (rango número de
bandas por individuo: 1-14). En la mayoría de los individuos. las bandas estuvieron
localizadas en sólo uno de los brazos cromosómicos en posición terminal o subtenninal,
detectándose además heteromorfismo para el tamaño de las mismas.
En lineas generales, la constitución cromosómica descripta por Rosato (ROSATO
1997) concuerda con las observaciones de Mc.Clintock (1981) para las razas de
Sudamérica, evidenciándose una preponderancia de poblaciones con bajo número de
bandas, principal característica del denominado Complejo Andino.
I4.4.3. Cromosomas supemumer‘ariosl heterocromatina y variables ambientales
EI análisis de los patrones de distribución de cromosomas B. heterocromatina y
contenido de ADN hallados por Rosato (1997), reveló la existencia de las siguientes
asociaciones entre variables citogenéticas y ambientales: 1) el contenido de ADN del
complemento regular (A-ADN)se correlaciona negativamente con la altitud de cultivo; 2) el
número de bandas heterocromáticas se correlaciona negativamente con la altitud de
cultivo; 3) el número medio de Bs por individuo se correlaciona positivamente con la altitud
del cultivo;4) el número de bandas heterocromáticas se correlaciona negativamente con el
número medio de Bs por individuo.
El aumento de la frecuencia de cromosomas B, y paralelo decrecimiento en el
número de bandas heterocromáticas, fue interpretado por Rosato (1997) como un efecto
compensatorio para mantener un nucleotipo “óptimo”. La evaluación conjunta de estas
evidencias llevó a sugerir que la variación clinal del contenido de A-ADN, asl como del
número de bandas heterocromáticas, y su relación inversa con la frecuencia de
cromosomas B sobre el gradiente altitudinal tendría un significado adaptativo (ROSATO
1997; POGG|Oet al. 1998; ROSATOet al. 1998).
Los patrones de variación clinal pueden ser originados por la existencia de fuerzas
selectivas de diferente intensidad a lo largo de un gradiente o ser consecuencia de
procesos demográficos. En este últimocaso. los gradientes pueden formarse debido a la
interacción entre deriva y flujo génico restringido, o al contacto secundario entre dos
poblaciones aisladas y diferenciadas con respecto al carácter en cuestión. Si bien la
hipótesis adaptativa es una posibilidadcierta, la incidencia de procesos demográficos en el
origen y mantenimiento de los gradientes altitudinales descriptos por Rosato (1997) no
puede dejar de ser contemplada.
Una estrategia para distinguir entre las hipótesis adaptativas y las demográficas
consiste en analizar los niveles de diferenciación de marcadores neutros. La lógica
subyacente es que mientras los efectos de la selección serán locus especificos. los
procesos demográficos afectarán a todo el genoma en su conjunto. Por Io tanto. si la
20
Introducción
variación clinal responde a procesos demográficos, los patrones de variación
correspondientes a los marcadores neutros exhibirán un paralelismo con los del carácter
originalmente vinculado al gradiente.
I5. OBJETIVOS
La abundancia. neutralidad y alto grado de polimorfismode los loci microsatélites de
maíz (CHINet al. 1996; TARAMINO& TINGEY1996; SMITH1997) hacen de estos marcadores
una herramienta ideal para el estudio de los patrones de variabilidad y diferenciación de las
poblaciones del NOA, y en particular de aquellas que integran el gradiente altitudinal de
cromosomas B descripto por Rosato (1997). En virtud de ello, y considerando los
anteoendentes presentados en las secciones anteriores se plantearon los siguientes
objetivos para el desarrollo del presente trabajo:
l. Caracterizar los polimorfismos de Ioci microsatélites en poblaciones de razas
nativas de maíz del Noroeste Argentino.
ll. Estudiar los patrones de distribución de la variabilidad dentro y entre poblaciones.
III. Comparar los patrones de variación alélica de ejemplares arqueológicos con los
correspondientes a razas nativas actuales.
IV. Determinar la existencia de patrones de estructuración geográfica y/o temporal de
los genotipos de ejemplares arqueológicos.
V. Establecer las afinidades genéticas entre las razas del NOA y otras razas delcontinente americano.
VI. Establecer la incidencia de procesos demográficos y selectivos en el mantenimiento
del gradiente altitudinal de cromosomas B previamente descn'pto para las poblacionesincluidas en este estudio.
MATERIALES Y MÉTODOS
.,»L%Aii.;¡.
3%
ï iaa.5‘ J
M‘W'MW«¿way
MGMNOHÍHÜNÉQ
ía"'
O
Raza Amarillogrande
Materiales y Métodos
M1. MUESTRAS
M1.1.Ejemplares actuales
M1.1.1. Razas nativas
Las poblaciones de razas nativas de maiz incluidas en el presente estudio
constituyen un subconjunto de las pertenecientes al gradiente altitudinal descripto por
Rosato (1997) Rosato y col. (1998). Las colecciones fueron realizadas directamente en los
lugares de cultivoy posteriormente conservadas en el Laboratorio de Recursos Genéticos
Vegetales "N.I. Vavilov", Facultad de Agronomia, Universidad de Buenos Aires, y en el
Instituto Fitotécnico de Santa Catalina, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.
Universidad Nacional de La Plata y CIGEN (CONICET-UNLP-CIC).
La determinación de los materiales coleccionados fue llevada a cabo por el Ing.
Julián Cámara Hernández y la Ing. Ana María Miante Alzogaray.
En la Tabla 2 se indica la identificación de herban'o, procedencia. raza, altitud de
cultivo. porcentaje de individuos con Bs, y número medio de cromosomas B por individuo
en las poblaciones analizadas. En cada una de ellas se evaluaron entre siete y doce
plantas madre. estudiándose dos a tres individuos por mazorca. Todos los individuos
fueron identificados con un número de modo de poder establecer su genotipo multilocus y
la presencia o ausencia de cromosomas supemumeran‘os.
La ubicación geográfica y patrón de distribución de los cromosomas B en las
distintas localidades se presenta en la Figura 1.
M1.1.2. Lineas
Un conjunto de lineas endocn’adas (¡nbred lines) pertenecientes al banoo de
germoplasma de los EE.UU. (Colección MM. Goodman, North Carolina State University)
gentilmente cedidas por el Dr. Jim Holland, fueron utilizadas como patrón de referencia
para el establecimiento de equivalencias entre los alelos observados en las poblaciones de
razas nativas argentinas y los descriptos en la literatura.
A fin de abarcar la máxima diversidad posible. las líneas se seleccionaron
incluyendo representantes de todos los grupos obtenidos a partir del análisis de
agrupamiento realizado por Senior y col. (1998) en base a marcadores microsatélites (94
lineas, 10 ganos). Éstas son: A632. B164, B77, 837, Oh43. Tx303, CM37, CM105, C103,
l29. K55, Va102. L317. DE811. EPI , SA24, HP301 y W64a.
23
Materiales y Métodos
Tabla 2. Procedencia y caracteristicas de las poblaciones estudiadas. a nombre
de las poblaciones corresponde a su identificaciónde herbario.
Población Procedencia Raza Altitud de Frecuencia Númerocultivo de medio de
(m.s.n.m.*) individuos Bs porcon Bs' individuo‘l
Dentro del gradiente altitudinal
VAV6167 El Puesto, Dpto. Santa Altiplano 3000 55,9 1,29Victoria, Salta, Argentina.
VAV6485 Colonia San José. Dpto. Blanco 2670 77,3 1,80Tilcara, Jujuy, Argentina.
VAV6480 La Ciénaga de Amarillo 2420 71,2 1,60Pumamarca. Dpto. grandeTumbaya, Jujuy, Argentina
VAV6484 Tumbaya, Dpto. Tumbaya, Amarillo 2010 8,2 0.20Jujuy, Argentina. chico
VAV6476 Termas de Reyes, Dpto. Amarillo 1690 19,6 0,26Capital, Jujuy, Argentina. chico
VAV6313 Los Toldillos, Piedras Pisingallo 1600 45,6 0,69Blancas, Dpto. Ambato,Catamarca, Argentina.
VAV6482 La Candelaria, Dpto. Orgullo 910 10,2 0,12Candelaria, Salta. cuarentónArgentina.
Fuera del gradiente altitudinal
VAV6473 Susques, Dpto. Susques. Altiplano 3600 0 0Jujuy, Argentina.
'm.s.n.m.: metros sobre el nivel del mar. ' Datos tomados de Rosato (1997).
Materiales y Métodos
Figura 1. Localización geográfica y patrón de distribución de cromosomas B en las
poblaciones analizadas. La altura de los cilindros representa la frecuencia de individuos
portadores de cromosomas B P < ). EI color de los cilindros corresponde a la altitud del
cultivoen metros sobre el niveldel mar (m.s.n.m.) según se indica en la leyenda.
M12. Ejemplares arqueológicos
Los ejemplares arqueológicos analizados en el presente trabajo de tesis provienen
de diversos sitios arqueológicos de la Provincia de Catamarca y fueron legados por la Dra.
Norma Ratto, la Dra. Carlota Sempé y el Dr. Alejandro Haber.
El marco tempo-cultural correspondiente a cada muestra fue asignado de acuerdo
con las evidencias contextuales del sitio, siguiendo el esquema de periodización propuesto
para el NOA (ORGAZ& RATTo2000). Según este esquema, los tiempos arqueológicos
agroalfareros pueden dividirse en: Período Temprano (300 a.C. hasta los 650 AD), Periodo
Medio (650 al 850 AD) y Período Tardío (850 al 1480 AD). Hacia el último cuarto del siglo
XV, se separa la Fase Inca (550-430 AP), momento en el que el Noroeste Argentino fue
25
anexado al imperio Inca, seguida por una fase Hispano-indígena, y finalmente un Período
Colonial hacia los siglos XVI y XVII.
Las identificaciones taxonómicas fueron realizadas por el Ing. J. Cámara Hernández
y la Ing. A.M. Miante Alzogaray (Laboratorio de Recursos Genéticos Vegetales “N.I.
Vavilov", Facultad de Agronomia, UBA).
En la Tabla 3 se detalla el sitio arqueológico, Período. tipo de resto. contexto de
recuperación y raza de los especimenes estudiados.
Tabla 3. fio de origen, período, tipo de material y raza de los ejemplares
arqueológicos.
Sltlo Ublcaclón geográfica Alt-ltud Periodo Materlal Razarn.s.n.m (contexto)
Tebenquiche Chico
TC1-TC2 Quebrada de Tebenquiche 3650 Temprano Martos BIancoyOcho
Chico. al Oeste del Salar de Medio (residencial) Rayas —Ocho
Antofalla. Dpto. Antofagasta rayasdela Sierra,Catamar Tardío
Comme] Muestras noadjudicables a
raza actual *
Punta Colorada
Sitio no.3 a 12 Km al Este de Las 2500 Medio Martos Capia-Pisingallo
Lomita Angosturas. frente al paraje (funerano)_ Playa de Neblinas, sobre la
Cementeno . . .margen Izqmerda del no
Guanchin-Chaschuil. Dpto.
Tinogasta. Catamarca
Lorohuasi
Ruta ProvÍnCÍal45. Pasaje 2000 Tardío Can'ópsides Capia - Pisingallo
Lorohuasi.Dtpto. Tinogasta. ¡ncaiw (funerario) _Chaucha-Ros¡ta
Catamarca Colorado (Blanco
Criollo)
Batungasta
Cuenca infen'ordel Río La 1500 Tardlo Martos Capia-Pisingallo
Troya, Quebrada de La ¡nm (residencial)
Troya. en la confluencia con
el valle de Abaucán, Dpto.
Tinogasta. Catamarca.
' Podrian pertenecer a la raza Rosita. con espigas muy pequeñas y con glanos reventadores muy pequeños. citada
para la Argentina por el Ing. Agr. L. R. Parodi como originaria del Valle de Humahuaca y de los Valles Calchaquies.
Esta raza no ha sido hallada en los materiales actuales. Las espigas de este sitio manifiestan también caracteresvinculados con esta raza.
26
Materiales y Métodos
Los fechados radiocarbónicos correspondientes a los sitios Tebenquiche y Punta
Colorada, obtenidos en el presente trabajo a través de la firma Beta Analytic Radio Carbon
Dating Laboratory, confirman la antigüedad infen'da en base a las evidencias contextuales.
En el caso de Tebenquiche, los ejemplares examinados se ubican en la etapa más tardía
del asentamiento (Muestra 7: 360140 A.P.; Muestra 54: 370140 A.P.).
En la figura 2 pueden observarse las caracteristicas morfológicas y condiciones de
preservación de los manos y cariópsides provenientes de los distintos sitios.
1 5am
Tebenquiche - 350 A.P.*Contexto residencial. Puna Men'dional.
1 50m
, Batungasta - 400 A.P.*Contexto residencial. Valle Mesotennal
g
"5am
Punta Colorada - 1300 A.P.*Contexto funerario. Valle Mesotermal.
'1
Q v
%‘o%..50 '83,,1 50m
Lorohuasi - 400 A.P.*Contexto funerario. Valle Mesotermal
FIGURA2. Características y sitio de origen de los ejemplares arqueológicos(Pcia. de Catamarca, Argentina).*Antiguedad aproximada.A.P.:años antes del presente
Materiales y Métodos
M2. ANÁLISIS DE LA VARIABlLlDADDE LOCI MICROSATÉLITES
Los loci microsatélites o repeticiones de secuencias simples (SSR- del inglés Simple
Sequence Repeats) están compuestos por repeticiones en tándem de un motivode dos a
seis pares de bases flanqueadas por regiones conservadas no repetitivas, idealmente de
copia única.
Secuencias de estas características se encuentran ampliamente distribuidas en el
genoma de todo tipo de organismos. Desde el punto de vista funcional, los loci SSR suelen
estar ubicados en regiones no codificantes. Pese a ello, la neutralidad de estos marcadores
está, en algunos casos, sujeta a cuestionamientos, ya que se ha demostrado su
participación en regiones regulatorias (KASHI& SOLLER1999).
La tasa de mutación de los microsatélites es del orden de 10'2 —10'5,dependiendo
del Iocus y del organismo, siendo notablemente superior a Ia de las mutaciones puntuales
(10'9 -10"°). Es por ello que estas regiones exhiben un alto grado de polimorlismo
originado, principalmente, por la variación en el número de repeticiones. Diversos
mecanismos han sido propuestos para explicar este particular modo de evolución: el
“slippage” o "deslizamiento" de la enzima polimerasa durante la replicación del ADN,
recombinación desigual y conversión génica (HANCOCK1999).
La presencia de secuencias conservadas no repetitivas en tomo al motivo de
repetición hace posible la amplificación selectiva de los diferentes loci microsatélites a
través de la reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR —Polymerase Chain Reaction). De
este modo, los individuos homocigotas para una variante alélica dada presentarán un único
tipo de producto de amplificación, mientras que en el caso de los heterocigotas se
obtendrán dos fragmentos de tamaños distintos. La determinación del número y tamaño
de los alelos en cada individuo requiere de un sistema capaz de discriminar fragmentos
cuyo largo puede llegar a diferir en tan sólo una base. Esto puede lograrse mediante
electroforesis en gel de poliacn'lamida, utilizando condiciones similares a las
empleadas para geles de secuenciación, o a través de electroforesis capilar y detección
por fluorescencia inducida por láser.
Dado su alto grado de polimorfismo,su naturaleza básicamente neutra y su carácter
codominante, los microsatélites se han convertido en una de las herramientas mas
utilizadas en estudios poblacionales, evolutivos y de mapeo genético.
29
M2.1.Métodos experimentales
M2.1.1. Ejemplares actuales
M2.1.1.1. Selección de loci
La elección de los Ioci SSR se llevó a cabo en base a la información disponible en Ia
base de datos MaizeDB (www.agron.missouri.edu), actualmente MaizeGDB
(http:llwww.maizegdb.org), tomando como referencia los resultados obtenidos por
Senior y col. (1998) en la caracterización de 94 lineas comerciales pertenecientes al banco
de germoplasma de maiz de los Estados Unidos (Colección M.M. Goodman, North
Carolina State University) y lo descripto por Matsuoka y ool. (2002a; 2002b) para 99 Ioci
SSR en razas nativas de maiz y teosintes.
Se estudiaron dos loci independientes por cada par cromosómioo. con excepción
de los pares 8 y 9, en donde sólo pudo analizarse un único locus. Los 18 loci analizados
fueron seleccionados a partir de la evaluación experimental de un total de 39 marcadores,
tomando como criterio su reproducibilidad y facilidad de interpretación (Tabla 4).
M2.1.1.2. Extracción de ADNgenómico total
El ADN genómico total de los individuos pertenecientes a las razas nativas se
extrajo a partir de plántulas de entre 5 y 7 dias de germinación siguiendo el protocolo de
Dellaporta y col. (1983) con ligeras modificaciones (Ver Apéndiae).
La germinación de los granos se llevó a cabo en caja de Petri con algodón
humedecido, bajo condiciones iniciales de oscuridad durante 48 horas a una temperatura
de aproximadamente 28°C, seguido de 1 a 5 días en condiciones de luz continua a la
misma temperatura.
En el caso de las líneas, y debido a que no fue posible obtener ADNamplificable por
PCR mediante el protocolo de Dellaporta y col. (1983), el ADN se extrajo directamente a
partir 200 a 300 mg de can'ópsides pulverizadas en aire líquido, utilizando el protocolo
estándar de CTAB para extracción de ADN vegetal (MILLIGAN1998).
M2.1.1.3. Cuantiflcación de ADN
El ADN genómico se cuantificó mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1% (p/v) y tinción con Bromuro de Etidio (0,5 pg/ml), utilizando como referencia
concentraciones conocidas del fago Lambda digen’docon las enzimas de restricción EcoRl
y Hind III (Promega). Se sembró un volumen de muestra de 12 ul, incluyendo 2 ul de
buffer de siembra. La electroforesis se llevó a cabo en buffer TAE 1X a un voltaje
30
0999009VLV1VOW09WL9109199V999W19VO0LL9VSO'L0¿0L5IUqOVSVSLSVOSLLVLOQLLSLSSLOOVSLSVSLSLOOLSLVS0VSO‘L-ZO'L6188an0J.J.J.0WOLL000LLV9190000991909V09LV99V91141991W9V90'9SLOOUV11V0990VOV0919Wl909910V091lV099LU10W9V90'9ZSUÜIUQ1100LL0000V01101010000V9V9V90LV9019VW909V170'9600W00V000V009V1119W0llW9W0101V01V09u0909VL0'9.99LL5IUQW1V990001VOV000VLVO91V0000199W101091119V00'9EVOLÜIUq0010V10V90V90W09V01‘v‘0llLV991009V10190090119110V90'9¿out/dV9190W0100VlV000l9190101910LL9100V100099VW'S¿MLB/UGLL100WV91111000V09990V0919V191V00lVOV0199V€_0'9.OOUÜIUqJ.J.VJ..LLVE)0199V9V.LJ.J.0W0999llVSVOSLSLOOLLLLSWVBLVO1080'17980L9w’71009VJ.9.I.09V09V010010W9LV9V010¿sowoovsvovosvovmomouso'90'17ZQZÜIUQvoowgmvovmoguswLLLOV0009V09V9VWOV00VlO'V.98W!LOLOLLLLLOVOOSOOSLLSSVWSWSVSVSVSVOOOSS9V0L'S860L5IUqV119V9199V91109999V0V199V90119V019V9009V9V60'8¿ELL5qu9V0990010V100W000WOVSLLVSVSVOLLVSVOLOLOOSLO0V.LV90'8esa/ud0V001100lV91919L99019W000VVVW90910V99V01VWWOV10VVO‘S660!t/dLLOW9W90V900V009LL9VO0LL1Vwsosvoewovomoouomomu10-1000VO'Q.GZONU99V9110WOW09101091V09V19V09V09091VW109V80'8SZSLÓIUG00LLOL109V1909109VOV00191V0010109u010019V60'2OZQLÜIUG1919V900010090VOVW011WV99W9910W99100911V091V1V101980'Z4.¿zuudV009l910109lVW19V20.LVVVOV900V09V1199V909VW'Z8L0L5IUQ1090910100V0101WVOVSOMOOLSWOVSVOSLVSJ.9VLL'LEZLZÜIUqV0190V0100V09009001V9VO0L0V9V01099019u9100109‘v‘00010801.¿saludV100.LVJ.J.09.LV090.LV090909VOV91W9109V00190VOL19V.LOSO'L9¿L5IUqV1V9919V011W19900001010W0191V0909V0009V80'L998L5IUQossomoovvvowmovwLSVLSVOOOOLSVOLLVSOE)9VLO'L6¿LL5IU<7
,e-,9eme/¡ea.819pJewuod(.u!q)
uogouadaaeogwosowmo
SSJOPBQSOapOAuowuogoezueomsnoo1'(,,)oosuefierunuooueogpugessopegouanoasumen;so¡a¡esono100/301'nguesopeuesaJuenuanouaas¡euogoqqodogpmse¡e919dsopeuogooepssaJopemewso1'sopeflesuamuewsongw[OO]so¡apquodyosea'7elqel
sopozawÁse|euelew
MaterialesyMétodos
Tabla4.DescripcióndelosIocimicrosatéliteensayados(cont.).Losmarcadoresseleccionadosparaelestudio
blacionalseencuentranresaltadosenris.LosIocicuosalelosfueronsecuenciadosseindicanconunasterisco(*).
LocusLocalizaciónMotivodeCebadores
CromosómicaRepetición
(biï)Fomard5'-3'
híO69"7.05CCTAGACACCGCCGTGGTCGTC
phi121"8.03CCGAGGAAAATGGAGCCGGTGAACCAbnlg20468.04AGTTGGTGAAACGGTGAAATGAbnlg11768.05AGACTCCTCAAAACCTAGGTGACA phi0689.01ATGTACACACGCTCCGACGATTACbnlg12099.04AGGTCCCGGGCAGAATAATACCbnlg17149.04AGCATCATGGAGGCATAT_GTCGphi04110.00AGCCTTGGCTCCCAGCGCCGCAAAphí059*.10.02ACCAAGCTAATTAAGGCCGGTCATCCCbnlg107910.03AGCGTACGTCGTTGCTGTCTGTbnlg151810.04AGAGCTGTACACGCAGTAGGCAGGCTCTGTTAATTCGATCGC
M136010.07AGTCTGCTCATCCACAACTTGCAGAACGTGAAGCTGAGCGTT
*Bin:Segmentocorrespondienteaunintervandemapeodeaproximadamente20centiMorgans.Lanomenclaturaconsisteenunnúmeroentero(parcromosómico)seguido pordosdecimaies.
Reverse5'-3’AGTCCGGCTCCACCTCCTTC TTGGTCTGGACCAAGCACATACAC
CTGGTGAGCTTCACCCTCTC CACCGATGATGGTGAGTACG TCTTCTCCACCAGAGCCTTGTAAG TTCCTCCTI'GAAGTGCTCGT ACACATTTA_G_ACCCACCCCA GATCCAGAGCGATTTGACGGCA TCCGTGTACTCGGCGGACTC CAGTACGTGCAGTCCCTCCT
32
constante de aproximadamente 10 Volts/cm durante 1 hora. La visualización del ADN se
realizó por transiluminación con luz ultravioleta (U.V.). La composición de las soluciones
buffer utilizadas se encuentra detallada en el apéndice.
M2.1.1.4. Amplificación por PCR
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 25 ul en tubos
de 0,5 ó 0,2 ml con y sin pared delgada, partiendo de aproximadamente 100 ng de ADN
molde. Se utilizó la Taq polimerasa y demás reactivos de Promega o Invitrogen en las
siguientes concentraciones finales por reacción:
Buffer 1XCleg 1,5 mMDesoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) 125 uMCebador Forward 30 ngCebador Reverse 30 ngTaq Polimerasa 0,5 unidadesH20destilada estéril hasta 25 ul
La amplificación se llevó a cabo en un tennociclador Eppendorf Mastercycler bajo un
perfil de PCR de tipo “touchdown” según se detalla a continuación:
Desnaturalización inicial 94°C 4 min.
10 ciclos
Desnaturalización 94°C 1 min.Hibridación 68 —58 °C ó 65- 55 °C 1 min(gradiente 1°C I ciclo)Extensión 72 °C 1 min
20 ciclos
Desnaturalización 94°C 1 min.Hibridación 58 °C ó 55 °C 1 minElongación 72 °C 1 min
Extensión final 72 °C 7 min
M2.1.1.5. Visualizacióndelos productos de amplificación
A fin de verificar la presencia de productos tras la reacción de amplificación, 8 a 10
pl de muestra fueron sembrados en geles de agarosa al 2,5% (p/v) y sometidos a
electroforesis según se detalló para la cuantificación. El mayor porcentaje de agarosa
requen'do en este caso respondió a la necesidad de separar fragmentos pequeños (80 —
150 pb). Las muestras positivas fueron posteriormente analizadas mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida.
33
Materiales y Métodos
M2.1.1.5.1. Electroforesis en geles de poliacrílamida
La separación de los productos de amplificación se efectuó mediante electroforesis
vertical en gel de poliacrilamida (6% Acrilamida-bisacrilamida 19:1) de 0,4 mm de espesor
en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M) utilizando el equipo Sequi-Gen GT®de Bio
Rad. El armado de los geles y preparación de los vidrios para la posterior tinción con plata
se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante.
El volumen de siembra fue de 5 ul por calle, incluyendo 2,5 pl de muestra y 2,5 pl de
buffer de siembra. Previo a la siembra, las muestras fueron desnaturalizadas por
calentamiento a 94°C durante 7 minutos, utilizando un termociclador o baño de agua, y
posterior enfriamiento rápido a 0°C. El gel fue sometido a una pre-corrida en buffer TBE 1X
hasta alcanzar una temperatura de 50°C.La electroforesis de las muestras se llevó a cabo en buffer TBE 1X durante
aproximadamente dos horas a una potencia constante de 60W, con un voltaje variable de
entre 1200 y 1400 volts y con control de temperatura (máx. 55°C).
Para un mejor aprovechamiento, algunos geles recibieron dos siembras separadas
a distintos intervalos de tiempo (rango 15-30 min), dependiendo del tamaño de los
fragmentos sembrados en cada una de ellas.
M2.1.1.5.2. Tinción con Nitrato de Plata
La tinción de los geles se realizó utilizando el kit de tinción Silver SequenceTM DNA
Staining Reagents (Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Una vez secos los geles, los patrones electroforétioos obtenidos fueron registrados
mediante digitalizaciónde la imagen utilizando un scanner hogareño.
La determinación del tamaño de los fragmentos se realizó por comparación con el
marcador de peso molecular de simple cadena 30-330 AFLP®DNA Ladder (Invitrogen) en
forma manual y fue posteriormente corroborada mediante el programa GelPro Analyzer
4.0 (Copyright 1996-2000, Media Cybemetics, L.P).
M2.1.1.6. Secuencíación de variantes alélicas
La identificación de los procesos que originan la variabilidad alélica en los Iocí
microsatélites resulta fundamental para la elección de los estadísticos a aplicar en la
estimación de los parámetros poblacionales.
A tin de contar oon evidencias acerca del patrón mutacional de aquellos Ioci para los
cuales no existía información previa al respecto y de generar la información necesaria
para Ia comparación de los ejemplares arqueológicos, se procedió a la secuenciación de
los productos de amplificación para las diferentes variantes alélicas encontradas (Tabla 4).
34
En una etapa inicial, esto permitió, además. corroborar la identidad de los productos de
amplificación, verificar el motivo de la repetición para cada microsatélite y determinar el
tamaño exacto de los alelos.
Por cada estado alélioo observado, se eligió un individuohomocigota tomado al azar
entre todas las poblaciones analizadas y se procedió a la amplificación del Iocus
correspondiente. En el caso de las variantes alélicas encontradas únicamente en
heterocigosis, fue necesario incluirun paso extra de amplificación selectiva con el objeto de
permitir su individualización.El procedimiento consistió en separar electroforéticamente los
alelos en geles de poliacrilamiday una vez tenidos, tomar con la punta de una aguja estéril
Ia porción del gel correspondiente al alelo deseado. sumergirla en una mezcla de reacción
similar a la empleada para las amplificaciones de rutina y re-amplificarla bajo los mismos
perfiles de temperatura descriptos anteriormente. En todos los casos, el tamaño de los
productos amplificados y la ausencia de productos inespeclficos fueron oonstatados
mediante la siembra de una alícuota en geles de poliacrilamida.
Los productos así obtenidos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al
2.5% p/v, recortándose las correspondientes bandas oon un escalpelo o cubreobjetos de
vidrio. Para la purificación de las mismas, se utilizó el QlAquick Gel Extraction kit (QIAGEN)
según las instrucciones del fabricante, reuniendo entre 3 y 5 réplicas por individuo a fin de
alcanzar la masa necesaria para la reacción de secuenciación. Finalizada la elusión de los
productos purificados. éstos fueron sacados en una centrífuga al vacío (SpeedVac) y
enviados al servicio de secuenciación automática de la Universidad de Alcalá, Alcalá de
Henares, España. La reconstrucción de los alelos involucró la secuenciación de ambashebras.
M2.1.2. Ejemplares argueolggicos
Las tareas experimentales relacionadas oon la extracción. amplificación y
secuenciación de ADN a partir de muestras arqueológicas fueron realizadas en el
Laboratorio del Prof. Terry Brown, Department of Biomolecular Sciences. University of
Manchester Institute of Science and Technology (UMlST),Reino Unido.
M2.1.2.1. Selección de Ioci
Uno de los aspectos fundamentales para el estudio del ADN antiguo es poder
verificar la identidad de los productos amplificados a través de la comparación de sus
secuencias nucleotldicas con las correspondientes a ejemplares actuales. Es por ello que
la elección de los locí a ser analizados en las muestras arqueológicas se basó en la
35
Materiales y Métodos
disponibilidadde datos de secuencia para las razas actuales de maíz y otras especies de
teosintes. Siguiendo este criterio, y tomando en consideración la facilidad de amplificación
e interpretación genética en muestras actuales, los Ioci examinados en las muestras
arqueológicas fueron: phi059, phi127 y phi029 (Tabla 4).
M2.1.2.2. Extracción de ADNgenómico total
Los extractos de ADN antiguo fueron realizados en un laboratorio exclusivamente
acondicionado para ese fin, con las correspondientes drogas y equipos. El mismo se
encontraba físicamente aislado de las instalaciones para extracción y amplificación de ADNmoderno.
Como parte de los procedimientos de control de contaminación, el ingreso a este
laboratorio se realizó sin haber tenido contacto alguno con cualquier otra instalación en
donde se manipulara ADN por un periodo de al menos 12 hs. Una vez dentro, se utilizó
guardapolvo, cofia. barbijo y dos pares de guantes de látex de modo de poder descartar el
par exterior durante la manipulación de las muestras sin exponer Ia piel del operador. Antes
de comenzar la extracción, todas las superficies, incluyendo equipos. fueron desinfectadas
con hipoclorito de sodio al 5% (Sigma). Aquellas superficies más sensibles a la acción
corrosiva de este agente fueron limpiadas con el reactivo comercial DNAaway (Molecular
Bioproducts).
En los ocasiones en las que fue necesario preparar soluciones en el Laboratorio de
trabajo, las mismas fueron irradiadas con luz U.V. en una cámara de ultravioleta para
cross/ínking (Stratalinker® UV Crosslinker Stratagene) durante toda la noche antes de ser
ingresadas al recinto de ADN antiguo, y nuevamente irradiadas durante media hora unavez dentro del mismo.
Las muestras. tips, pipetas y demás elementos utilizados durante el protocolo de
extracción fueron irradiadas durante 5 minutos de cada lado. previo al comienzo del
trabajo. En todos los casos se emplearon tips con filtro.
Las muestras se pulverizaron en seco, utilizando morteros previamente
autoclavados, sumergidos en hipocloritode sodio 5% e irradiados con luz U.V.
La extracción de ADN se efectuó según el protocolo de Yang y col. (1998) basado
en una modificación de los procedimientos correspondientes al PCR Qiaquick PCR
Purification kit (QIAGen) (Ver Apéndice). Cada ronda de extracción incluyó además. dos
muestras blanco sin agregado de material biológico que fueron procesadas
simultáneamente con el conjunto restante y utilizadas luego como controles durante la
reacción de PCR.
36
Los extractos así obtenidos se conservaron a -20°C en el laboratorio de ADN
antiguo y se tomaron alícuotas que fueron trasladadas al laboratorio de PCR para su
posterior amplificación.
M2.1.2.3. Amplificaciónpor PCR
Las reacciones de amplificación fueron preparadas en un laboratorio de uso
exclusivo para PCR, bajo flujo laminar, utilizando tips con filtro y sometiendo todos los
materiales a irradiación con luz ultravioleta durante 10 minutos.
Debido a la imposibilidad de cuantificar el ADN molde, los volúmenes de extracto
incluidos en las mezclas oscilaron entre 1-10 ul, incluyéndose también diluciones (1/2, 1/5,
1/10) con el objeto de minimizar el efecto de potenciales inhibidores.
Antes del agregado de la enzima polimeras, la mezcla de reacción fue irradiada con
luz U.V. durante 5 minutos. Las condiciones de amplificación óptimas se encuentran
detalladas a continuación:
Buffer con (NH4)2804 1XCleg 2 mMDesoxirn'bonucleótidos trifosfato (dNTPs) 125 uMBSA (New England BioLabs Inc.) 150 ug/mlCebador fomard 90 ngCebador reverse 90 ngTaq Polimerasa Fermentas 1.25 unidadesHzo Mili-Q hasta 50 ul
La amplificación se llevó a cabo en un tennociclador Eppendorf Mastercycler bajo
los siguientes perfiles:
Desnaturalización inicial 94°C 4 mín.35 ciclos
Desnaturalización 94°C 1 min.
Hibridación 1 min.phi127 47 °Cphi029 50 °Cphi059 55 °C
Elongación 72 °C 1 minExtensión final 72 °C 6 min
Luego de la primera ronda de amplificación, las muestras positivas oon baja
concentración de producto fueron sometidas a re-amplificación, sin adición de BSA,
disminuyendo a 30 el número de ciclos. e incrementando en 2 °C Ia temperatura de
hibridación.
Todas las amplificaciones incluyeron controles de extracción y controles de
amplificación sin adición de muestra de ningún tipo.
M2.1.2.4. Visualización de los productos de amplificación
La presencia de producto tras la reacción de PCR fue verificada mediante
electroforesis en geles verticales de poliacrilamida (0,5 cm de espesor) al 10% (v/v) en
buffer TBE 1X y posterior tinción con Bromuro de Etidio. Finalizada la separación
electroforética de los fragmentos. los geles fueron sumergidos en solución de Bromuro de
Etidio (2ul ml") durante 15 min. enjuagados en agua destilada durante 10 min. y
analizados a través de transiluminación con luz U.V.Como marcador de peso molecular se
utilizaron 150 ng de fago Lambda digeridos con la enzima Pst1 (Fennentas).
M2.1.2.5. Purificación, clonado y secuenciación de fragmentos
La purificación, clonado y secuenciación fueron llevados a cabo en el Laboratorio
de trabajo utilizandoun set de reactivos dedicados exclusivamente a estos procedimientos.
Los productos de amplificación. previamente punficados utilizando el PCR Qiaquick
PCR Purification kit (QIAGen), fueron clonados utilizando el kit TOPO TA Cloning Version
P (Invitrogen)de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
El análisis de los clones consistió en la amplificación por PCR de los plásmidos
contenidos en las colonias positivas (colony PCR). la identificación de colonias con
fragmentos del tamaño esperado mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 % (p/v),
y Ia secuenciación de los productos amplificados, luego de su de purificación empleando el
PCR Qiaquick PCR Purification kit (QlAGen).
La mezcla de reacción utilizada para la colony PCR fue distribuida en dos etapas.
En la primera, los clones fueron removidos de la placa con una punta de micropipeta y
38
Materiales y Métodos
colocados en tubos eppendorf de 0,5 ml conteniendo 1,5 ul de Buffer 10X, 1,5 ul de Cleg
(25 mM), 2 ul de dNTPs (125 uM) y 17,9 ul de agua Mili-Qestéril. Posteriormente, y a
medida que se disponían en la placa del termociclador, cada tubo recibió 1,125 ul de una
mezcla de Taq polimerasa (0.6 u) (Fermentas) y cebadores universales M13F y M13R (50
ng).
La amplifiación de los clones se efectuó en un termociclador marca Techne utilizado
únicamente para productos de clonado, siguiendo el siguiente programa:
Desnaturalización inicial 94°C 10 min.25 ciclos
Desnaturalización 94°C 1 min.Hibridación 55 °C 1 minExtensión 72 °C 1 min
Extensión final 72 °C 10 min
Las reacciones de secuenciación fueron realizadas con el kit ABI Big Dye
Sequencing kit version 3 (PE Applied Biosystems). La mezcla de reacción estuvo
compuesta por: 1 ul de ADN purificado (30-50 ng), 1 ul de cebador universal M13R (100
ng/pl), 2 ul de Kit Big Dye y 1 ul de agua Mili-Qestén‘l.
El perfil de PCR consistió en 25 ciclos de: desnaturalización a 94°C durante 1 min,
hibridación a 55 °C durante 1 min, y extensión a 60 °C durante 4 min.
Finalizado el paso anterior, las muestras fueron sometidas a precipitación con
Isopropanol (ver Apéndice). Finalmente, las reacciones fueron corridas en un secuenciador
automático ABI PRISM 377 DNA Analyzer (PE Applied Biosystems) perteneciente al
Servicio de Secuenciación del UMIST,Manchester, Reino Unido.
M22. Análisis de datos de secuencia
M2.2.1. Edición y Alineamiento
Una vez obtenidas las secuencias parciales de cada variante alélica, las mismas
fueron editas y ensambladas utilizando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor
(HALL1999). La alineación se llevó a cabo por medio el programa ClustalW (HIGGINSet al.
1994) con modificaciones manuales.
M2.2.2.Búsgueda en bases de datos
El análisis de los fragmentos obtenidos a partir de los ejemplares arqueológicos
reveló Ia presencia de productos de amplificación cuya secuencia nucleotídica no
39
correspondía a la región microsatélite esperada. A fin de determinar el posible origen de las
mismas, se procedió a su comparación con las secuencias depositadas en las bases de
datos de acceso público. Para ello se analizó tanto la secuencia nucleotldica como su
correspondiente traducción aminoacldica en todos los posibles marcos de lectura,
utilizando las herramientas BLASTN, BLASTX, y TBLASTX disponibles a través del NCBI
(httpzllwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Siguiendo el criterio propuesto por Meyers et. al (2001 ),
sólo se consideraron significativas aquellas coincidencias cuyo E-value fuera inferiora 10'5.
M23. Análisis de la diversidad y estructura poblacional
M2.3.1. Modelos de evolución de loci microsatélites
La evaluación estadística y posterior interpretación evolutiva de los polimorfismos
hallados para los loci microsatélites requiere del uso de modelos capaces de explicar el
origen y mantenimiento de los mismos.
A pesar de su aparente simpleza, los mecanismos mutacionales propios de los
microsatélites no son aún del todo claros y diferentes evidencias experimentales han
puesto de manifiesto la incidencia de procesos evolutivos complejos en los patrones de
variación descriptos hasta el momento. Variables tales como la pureza y número de bases
del motivo de repetición, asl como la existencia de restricciones en el tamaño máximo
alcanzable, influyen diferencialmente sobre los distintos Ioci resultando en una sumatoria
de efectos cuyo comportamiento mutacional es dificil de modelar (ESTOUP& CORNUET
1999).
Gran parte de los estadísticos empleados para el análisis de Ioci SSR fueron
originalmente desarrollados para marcadores isoenzimáticos, asumiendo el modelo de
mutación de alelos infinitos, inflnite alle/e model o IAM. (KIMURA& CROW 1964). Según
éste, cada mutación da lugar a una nueva variante, que resulta electroforéticamente
distinguible de las existentes. Asi, dos alelos con igual movilidad electroforética
necesariamente compartirán un origen común, es decir, serán idénticos por descendencia.
Sin embargo, la variación alélica observada en los Ioci microsatélites generalmente
deriva de la ganancia o pérdida de una o más repeticiones. De este modo, el surgimiento
de alelos con igual número de repeticiones puede darse reiteradas veces en forma
independiente. Las variantes resultantes serán idénticas en estado, pero no idénticas por
descendencia, violando así los supuestos del modelo de alelos infinitos.
Dado que la estimación de los parámetros poblacionales depende de los
mecanismos mutacionales subyacentes, diversos modelos han sido propuestos a fin de
4o
Materiales y Métodos
lograr una representación más realista. El modelo de mutación de "a pasos", stepwíse
mutatíon model o SMM (KIMURA& OHTA1978), describe la variación observada a través de
Ia ganancia o pérdida de una única unidad de repetición por cada evento. En cambio, el
modelo de “dos fases", two phase model o TPM (DIRIENzoet al. 1994) considera que las
mutaciones pueden dar lugar a modificaciones de X repeticiones, en donde p es la
probabilidad de X=1, mientras que para el resto de los valores, X sigue una distribución
geométrica con una probabilidad 1-p. A diferencia de los anteriores, el llamado K-allele
model (CROW& KIMURA1970) permite considerar las limitaciones en el tamaño de los
alelos. Éste postula la existencia de Kestados alélicos, en donde cada uno de ellos puede
mutar hacia los otros K-1estados posibles con una probabilidad constante de p/K-1.
Sólo dos de estos modelos, IAM y SMM, han alcanzado el desarrollo analítico
necesario para su aplicación en estudios poblacionales. Además de los aspectos
vinculados con la existencia de homoplasia, una diferencia fundamental entre ambos es
que, mientras en el IAMel tamaño de los alelos no provee ningún tipo de información, en el
SMM este parámetro constituye una medida del grado de divergencia entre las
poblaciones.
El ajuste de los datos a uno u otro modelo puede ser evaluado en forma directa
mediante estudios de progenie y análisis de secuencia, o bien, a través de la comparación
entre los valores observados y esperados de estadísticos tales como heterocigosis,
número de alelos y varianza en el número de repeticiones (ESTOUP& CORNUET1999).
M2.3.2. Cálculo de frecuencias alélicas
Las frecuencias alélicas fueron calculadas mediante el método de conteo directo a
partir de los genotipos individuales encontrados en cada una de las poblacionesanalizadas.
M2.3.3. Indices de diversidad genética
Los parámetros utilizados como estimadores de la variabilidad genética fueron: la
heterocigosis media esperada por locus (He),el número promedio de alelos por locus (A)y
la riqueza alélica (R).
La heterocigosis o diversidad genética fue calculada a partir de las frecuenciasalélicas utilizando el método descripto por Nei (1987)
He: (1/L) z 1-zx¡2
Donde
41
Materiales y Metodos
L=número de Iocianalizados
x¡=frecuencia de los i-aIelos
Siendo
0 < He < 1
EI número promedio de alelos por Iocus (A) se obtuvo oomputando la media
aritmética del número de alelos presentes en cada uno de los Iocus analizados.
El indice de riqueza alélica (R) (EL MOUSADIK8. PETIT1996) constituye una medida
del número de alelos y, a diferencia de A, es independiente del tamaño muestral
2N - Ni
2n
R=Z 1——[2T]
N¡ = número de alelos de tipo i en el conjunto de 2N genes.
2n
R estima el número de alelos diferentes que se espera encontrar en una sub
muestra de tamaño 2n tomada a partir de una población compuesta por 2N genes (n s N).
Si la unidad en estudio es Ia población (Rs), n corresponde al número de individuos del
locus con menor cantidad de genotipos y el N considerado es el tamaño de la población en
cuestión. En cambio. si la unidad en estudio es el conjunto de poblaciones (Ri), el N
considerado es el número total de individuos analizados. Ambos estadísticos fueron
calculados utilizando el programa F-Stat (GOUDET1995).
La comparación estadistica de los Indices Hay R entre las distintas poblaciones se
llevó a cabo mediante un análisis de varianza no paramétrico, utilizando la prueba de
KruskaI-Wallis (ZAR 1984). Las comparaciones de a pares se realizaron según el
procedimiento de Student-Newman-Keuls (ZAR1984).
M2.3.4. Eguilibriode Hardy-Weinberg
El ajuste a las proporciones de Hardy-Weinberg se evaluó a través del test de
scores utilizando el estadístico U (ROUSSEr8. RAYMOND1995). Las hipótesis alternativas de
exceso y deficiencia de heterocigotas se analizaron separadamente según lo descripto en
la documentación del programa GENEPOP versión 3.4 (RAYMOND& ROUSSET1995).
42
M2.3.5. Estructura poblacional
El grado de diferenciación entre poblaciones se analizó bajo los modelos de alelos
infinitosy de mutación de a pasos según se describe a continuación.
- Modelo de Alelos infinitos (IAM)
Asumiendo un modelo de alelos infinitos, Ia estructura genética de las poblaciones
fue analizada por medio de los índices de Fijación: F|s. F|T y FST (WRIGHT1965; WRIGHT
1978). El significado de los mismos puede resumirse en función de los valores de
heterocigosis esperada y observada a través de las reformulaciones propuestas por Nei
(1977):
HT- HI =MF¡r=——— FIS Fsr=HT-HSHT Hs HT
donde.
HT: heterocigosis esperada en la población total
H.=heterocigosis observada promedio por población
Hs: heterocigosis esperada promedio por población
Así, F¡T es una medida del exceso o defecto de homocigotas en la población total,
F¡S es una medida del efecto del apareamiento no aleatorio dentro de las subpoblaciones,
mientras que FST da cuenta del efecto de la subdivisión dela población total.
Los índices de fijación fueron estimados a través del método de análisis de la
varianza propuesto por Weir y Cockerham (1984). La significación de los mismos se llevó
a cabo a través del método de perrnutaciones incluido en el programa F-STAT versión
2.9.3.2 (GOUDET1995) y de las pruebas de homogeneidad de frecuencias a través del test
Exacto de Fisher implementadas en GENEPOP versión 3.4 (RAYMOND& Rousssr 1995).
En todos los casos, las comparaciones múltiples fueron sometidas a la corrección de
Bonferroni (RICE1989). donde
a = l-(l —a')" con n = número de comparaciones.
- Modelo de mutación de a pasos (SMM)
Asumiendo un modelo de mutación de a pasos, Slatkin (1995) demostró la relación
entre el índice Fsr y el promedio de las sumas de cuadrados de las diferencias de tamaño
entre alelos. En base a la teoria de coalescencia puede establecerse que,
43
í-nFST =
t
en donde í es el tiempo de coalescencia promedio entre dos alelos tomados al azar
en la población total, y tCes el tiempo de coalescencia promedio entre dos alelos tomados
al azar de la misma subpoblación.
Si se consideran dos poblaciones diferenciadas, el tiempo de coalescencia
promedio será menor entre alelos de una misma subpoblación, que entre un par de alelos
cualesquiera de Ia población total. Según el modelo de mutación de a pasos, la diferencia
en el número de repeticiones es una medida del grado de divergencia entre los alelos, y es
por eso que es posible establecer una relación entre los tiempos de coalescencia y lasdiferencias de tamaño entre las distintas variantes.
De acuerdo con Slatkin esta relación viene dada por,
E(3') —E(Sw) = ï—_rc = FW15(3) í
en donde 5' es el promedio de las sumas de cuadrados de las diferencias en el
tamaño alélico para la población total, y Swes la medida correspondiente a las
subpoblaciones, siendo el estadístico análogo
_ g _SWE
Rsr
M2.3.5.1 Prueba de pennutación de tamaños ale/¡cos
La elección del estadístico a utilizar como medida de diferenciación depende del
patrón mutacional de los Ioci analizados y de la contribución relativa de mutación, deriva y
migración en el proceso de divergencia.
Aún cumpliéndose estrictamente los supuestos del SMM , existen situaciones en
las que el tamaño de los alelos presentes en un conjunto de poblaciones no resulta
informativo con respecto al grado de diferenciación genética entre las mismas. Así, cuando
la tasa de mutación es mucho menor que Ia tasa de migración. o bien cuando el tiempo de
divergencia entre las poblaciones es relativamente corto, las estimas de Rsr y FSTtienden
a convergir hacia el mismo valor (HARDYet al. 2003). En cambio, en aquellas situaciones
44
Materiales y Métodos
en las que las diferencias en los tamaños alélicos son efectivamente informativas, RST
resultará mayor que F37 (SLATKIN1995), con lo cual la utilización de este último estadístico
resulta inapropiada, llevando a la subestimación de la diferenciación poblacional.
A fin de seleccionar el estadístico más adecuado para el análisis de los Ioci
previamente identificados como SMM por Vigoroux y col. (2002), se aplicó el test de
permutación de tamaños alélicos (HARDYet al. 2003) según se encuentra implementado en
el programa SPAGeDi (HARDY& VEKEMANS2002). La prueba consiste en generar una
distribución del estadístico R57asumiendo que las diferencias en los tamaños alélicos no
contribuyen a la diferenciación poblacional. La distribución nula se construye mediante un
procedimiento de aleatorización basado en la permutación de tamaños entre categorías
alélicas. Esto es, dadas las categorias alélicas a, b y c de tamaños 2, 4 y 8.
respectivamente. el proceso de permutación reasignara los tamaños sin modificar la
constitución original de los individuos (aa, bb, ab, etc.), calculando luego un nuevo Pm por
cada ronda (pRsr). La significación de la prueba se obtiene computando el número de pRST
mayores al Fm observado. Dado que el promedio de los pRc-nes igual al valor esperado de
FSTpara el conjunto inicial de datos, este algoritmo permite poner a prueba Ia hipótesis
nula Ho: F57 = R57, con H1: RST>FST.De aceptarse Ho, F57 será el estimador preferido por
presentar menor varianza (HARDYet al. 2003).
M2.4.Analisis de las relaciones intra e interregionales
M2.4.1. Análisis de agrupamiento entre mblaciones del NOA
A fin de establecer los patrones de relación entre las poblaciones estudiadas, se
realizó un análisis de agrupamiento mediante el método de Neighbor-Joining (NJ) (SAITOU
& NEI 1987) a partir de las medidas de distancia genética de Nei (Ds)(NEl1972) entre
pares de poblaciones. Las mismas fueron calculadas en base a las frecuencias alélicas
poblacionales, utilizando el programa MICROSAT (MINCHet al. 1995-1996). El estadístico
(5p.)2propuesto por Goldstein y col. (1995) para el análisis de loci SSR no fue considerado
debido a que los datos no satisfacen los supuestos del modelo involucrado en sudesarrollo.
La matriz original fue sometida a remuestreo mediante el metodo de bootstrapping
incluido en MICROSAT. El algoritmo de NJ se llevó a cabo según se encuentra
implementado en el paquete Phylip3.6 (FELSENSTEIN1991-2004).
45
Materiales y Métodos
M2.4.2. Análisis de agrupamiento entre poblaciones del NOAy razas de América
La incorporación de las razas de maiz del NOA al marco provisto por las
investigaciones de Matsuoka y col. (2002b) (ver introducción, sección I3.2.) debió ser
llevada a cabo a través del análisis de genotipos multilocus individuales. La metodología
convencional, basada en el uso de las frecuencias alélicas poblacionales. no pudo ser
aplicada debido a las caracteristicas del muestreo realizado por dichos autores (1 a 2
individuos por localidad).
El genotipo multilocus de cada uno de los individuos fue definido en base a los 10
lociSSR comparables entre ambos conjuntos de datos.
La reconstrucción de las relaciones se realizó empleando dos estrategias diferentes
según se detalla a continuación:
M2.4.2.1. Método fonético
El grado de similitud entre individuos se estudió a través de la proporción de alelos
compartidos, utilizándose como medida de distancia
BAC:-In proporción de alelos compartidos
Este estadístico resulta adecuado para el análisis de Ioci microsatélites, ya que no
supone patrón mutacional alguno y su varianza es reducida (GOLDSTEINet al. 1995). La
matriz de datos originalse sometió a remuestreo mediante bootstrapping, calculándose las
matrices de UTO x UTO (Unidad Taxonómica Operativa) correspondientes a cada una de
las réplicas, y realizando los agrupamientos según el método de NJ, tal como se describió
en la sección anterior.
La lógica subyacente al análisis de genotipos individuales mediante técnicas
similares a las empleadas en estudios filogenéticos radica en el mayor parecido esperable
para el acervo génico entre individuos pertenecientes a la misma población, o unidad
taxonómica en estudio, hecho que. a su vez. debería verse reflejado en los agrupamientosresultantes.
M2.4.2.2. Método Bayesiano para la inferencia de estructura poblacional
El método desarrollado por Pritchard y col. (2000) permite. a partir de los genotipos
multilocus de un conjunto de individuos, la identificación de grupos cuya distribución de
genotipos se ajusta a Io esperado para una población panmíctica en ausencia de
desequilibrio de Iigamiento. Esto implica evaluar el ajuste a un modelo cuyos parámetros
46
Materiales y Métodos
son, en el caso más simple de una serie de situaciones consideradas, la probablidad de
pertenencia de cada individuoa un grupo determinado y las frecuencias alélicas en cada
uno de los grupos.
Desde el punto de vista metodológico. el algoritmo consiste en encontrar aquellos
valores de los parámetros que maximicen la probabilidad de obtener los datos observados.
Para ello utilizael marco teórico de la estadistica bayesiana y los métodos de Monte Carlo
basados en cadenas de Markov (MCMC-Markov Chain Monte Carlo) para la estimación de
las funciones de probabilidad correspondientes (ver descripción original del método para
más detalles).
Asumiendo que el conjunto de individuos analizados representa una mezcla
proveniente de un número desconocido de poblaciones (K), es posible hallar el valor de K
que maximice la probabilidad de los datos, o. puesto en otros términos, identificar el
número de “unidades genéticas ideales" que conforman la muestra. sin necesidad de una
delimitación a priori de las poblaciones. El valor obtenido puede resultar menor, igual o
mayor al número de entidades originalmente definidas como poblaciones en base a
criterios geográficos. morfológicoso comportamentales, dando cuenta. así, de la presencia
de un patrón de estructuración que seria, de otro modo, indetectable.
Originalmente desarrollado como una herramienta para determinar la existencia de
estructuración críptica en estudios de mapeo por asociación y para la asignación de
individuos a sus probables poblaciones de origen, aplicaciones posteriores del método han
utilizado el patrón de fragmentación obtenido tras sucesivos incrementos de K para la
inferencia de relaciones entre grupos, haciendo una interpretación análoga a Ia de los
esquemas de ramificación de los árboles filogenéticos (ROSENBERGet al. 2001; ROSENBERG
et al. 2002; HEUERÏZe! al. 2004). En particular, es este último enfoque el que será utilizado
en el presente estudio para la integración de las razas del NOAen el contexto de los datosexistentes.
Todos los análisis se llevaron a cabo oon el software STRUCTURE (PRITCHARDet al.
2000) e incluyeron tres a cinco repeticiones para cada valor de K, realizándose 500.000
iteraciones tras un período de bum-in de 100.000 iteraciones. Asimismo, se asumió la
independencia de las frecuencias génicas entre poblaciones y que el genoma de cada
individuo podia estar constituido por la contribución de una o más de las poblaciones
inferidas (admixture model). Los criterios utilizados para la elección del valor óptimo de K
estuvieron basados en las recomendaciones provistas por la documentación del programa.
En el caso de obtener distintos valores de K con probabilidades semejantes, se consideró
siempre el valor de K más pequeño a fin de capturar la mayor estnictura posible evitando
patrones de estructuración trivial generados por un incremento ficticio del número de
47
Materiales y Métodos
poblaciones. Otros elementos considerados como indicios de ausencia de estructura
poblacional real fueron: a) la asignación de una proporción simétrica del genoma de los
individuos (1/K) a cada una de las poblaciones propuestas; b) la falta de reproducibilidad
de las asignaciones en las diferentes repeticiones de un mismo K.
M2.5.Anállsls de la asociación entre variables genéticas, cltogenétlcas y altitud
Tres variables citogenéticas se encuentran asociadas con el gradiente altitudinal
descripto por Rosato y col. (1997; 1998) para las poblaciones del NOA: número medio de
cromosomas B por individuo, número de bandas heterocromáticas o knobs y contenido de
ADN de los autosomas (A-ADN).Sin embargo, sólo la primera pudo ser comparada en
relación con los patrones de diferenciación de los marcadores microsatélites debido a la
falta de informacióncon respecto al número de bandas heterocromáticas y contenido de A
DNAcorrespondientes al subconjunto de poblaciones incluidas en el presente estudio.
Todos los análisis fueron realizados utilizando la definición original de Rosato
(1997), según Ia cual la variable número medio de cromosomas B por individuo
corresponde a un promedio promedio poblacional, calculado tomando la media aritmética
del número de cromosomas B presentes en cada uno de los individuosde la población.
M2.5.1. Relación entre frecuencias génicas y número de cromosomas B
La asociación entre frecuencias alólicas de los loci microsatélites y número medio
de cromosomas B por individuo (É ) se analizó mediante el coeficiente de correlación de
rangos de Spearman utilizando el programa STATISTICA (STATSOFI'1999). El límite de
significación fue modificado de acuerdo con la corrección de Bonferroni (RICE1989).
M2.5.2.Correlación entre distancias geggráfigsl altitudinales e índices de diferenciación
La incorporación de la variable citogenética número medio de cromosomas B por
individuo al análisis de correlación entre matrices requiere contar con una medida que
describa la relación entre pares de poblaciones. La medida elegida consistió en tomar el
módqu de la diferencia de los valores de É para cada población (DifB,‘y= É, - É" ).
La comparación de las matrices de diferenciación genética con las correspondientes
a distancias geográficas. altitudinales y de diferencias poblacionales en el número medio
de cromosomas B por individuo se llevó a cabo a través del test de Mantel provisto por el
subprograma ISOLDE del paquete GENEPOP versión 3.4 (RAYMOND& ROUSSET1995).
48
RESULTADOS
Raza Pisingallo
Resultados
R1. DIVERSIDAD GENETICA
R.1.1.Razas nativas actuales
R.1.1.1. Diversidad y rigueza alélica
El análisis de 18 Iocímicrosatélites en 147 individuos provenientes de 8 poblaciones
de razas nativas de maiz del NOA permitió detectar un total de 184 alelos. siendo el
número promedio de alelos por Iocus (A) de 10.2. Los patrones electroforéticos de los loci
con mayor polimorfismose presentan en la Figura 3.
Esta cifra resultó notablemente inferior a los 28.7 alelos por Iocus hallados en
estudios previos realizados en razas nativas americanas provenientes de todo el rango de
distribución del cultivo sobre la base de 99 loci microsatélites (MATSUOKAet al. 2002b),
como asi también a los 20.9 alelos por locus observados en el análisis de 240 lineas de
maiz pertenecientes al banoo de germoplasma de EEUU, utilizando los mismos 99 loci
(LIUet al. 2003).
Diez de los 99 loci descriptos por Matsuoka y col. (2002b) fueron incluidos en el
presente estudio con fines comparativos. Dado que las marcadas discrepancias en el
número promedio de alelos pueden ser producto de las diferencias en la naturaleza de los
loci analizados en cada caso. se computó el promedio de alelos por Iocus empleando
únicamente los 10 Ioci compartidos. Considerando este subconjunto, las poblaciones del
NOA presentaron un total de 131 alelos (A = 13.1), lo cual constituye una importante
proporción (71%) de la variación encontrada para los 18 loci estudiados. En las razas
nativas estudiadas por Matsuoka y ool. (2002b). de aqul en más citadas como “razas de
América" o “razas del continente americano", el número promedio de alelos por Iocus.
calculado a partir de los 10 Iocí compartidos, descendió a 20.9. mientras que en las lineas
el mismo se redujo a 17,7. De este modo, el porcentaje de la diversidad contenida en las
razas del NOAasciende al 63% de lo encontrado en las razas de América. y al 78% de lo
hallado para las lineas.
Las diferencias en el número de individuospueden también considerarse una fuente
adicional de distorsión al realizar análisis comparativos. Sin embargo, al independizarse de
esta limitación utilizando el Indice de riqueza alélica (Rs). indice que tiene en cuenta las
diferencias en el número de individuosde las poblaciones analizadas, los porcentajes de
diversidad contenidos en las razas del NOApermanecieron prácticamente inalterados oon
respecto a lo observado para el número de alelos (NOAvs. razas de América: 67%; NOA
vs. líneas: 80%).
50
ONDAQ-SU'“Oddc-so'máO-lQ-SU'OGG-i¡sn-:0"
001036en—=U'
140 pb
100 pb
200 pb
120 pb
170 pb
140 pb
330 pb
200 pb
180 pb
110 pb
Figura 3. Patrones electroforéticos correspondientes a los Ioci microsatélites con mayoresniveles de polimorfismo.
140 pb
100 pb
100 pb
120 pb
170 pb
140 pb
330 pb
200 pb
180 pb
11o pb
En la Figura 4 se muestra la distribución del número de alelos por locus en las
poblaciones del NOA y su comparación con datos tomados de la literatura
correspondientes a razas nativas de Argentina, Sudamérica, continente americano. y líneasendocriadas.
Tres de los 131 alelos descriptos para el NOA en los 10 Ioci SSR comparables
constituyen alelos únicos o exclusivos de la región. sin haber sido encontrados en razas
nativas ni en líneas. Las frecuencias alélicas poblacionales y equivalencias de
nomenclatura de los alelos únicos se describen en las Tablas A1-A18del Apéndice.
El 4,5% (6/131) de los alelos encontrados en el NOA se hallan presentes en las
líneas, pero no en razas nativas. Estos alelos se distribuyen en forma homogénea en las
poblaciones estudiadas, sin observarse asociación particular con ninguna de las razas.
Una posible explicación para la presencia de alelos compartidos entre líneas y razas
del NOA, y su ausencia en otras razas nativas de América, es la introducción reciente de
germoplasma comercial por parte de los cultivadores de la zona. Se analizó, entonces, el
origen y características de las líneas correspondientes, siguiendo la división propuesta por
Liu y col. (2003) (NSS= non-stiff sta/k; SS: Stifi sta/k; TS= Tropical y Semitropical;
Popcorn, Sweet Corn y mezcla). Todas las líneas portadoras de los mencionados alelos
pertenecen a los grupos NSS. TS y mezcla. Dos de ellos son alelos exclusivos de las
líneas en donde fueron descriptos (F6, CML322).
En relación con las razas nativas, 15 de los 124 alelos compartidos entre las
poblaciones del NOA y demás razas de América, no fueron descriptos previamente para
Sudamérica. Nuevamente, y dado que gran parte de las lineas han sido desarrolladas a
partir de razas nativas de América Central, este patrón puede ser considerado una
consecuencia de incorporaciones recientes a través de variedades comerciales. Sin
embargo, 4 de los 15 alelos no se hallan presentes en ninguna de las 240 lineas
analizadas por Liu y col (2003). Factores históricos relacionados con las rutas de
dispersión inicialdel maiz y la conservación de variantes “raras” en áreas marginales de la
distribución, como lo es el NOA,pueden contribuir a explicar Ia ausencia de estos alelos en
el resto de Sudamérica.
Con respecto a la República Argentina, el número de alelos detectados por
Matsuoka y col. para el subconjunto de loci compartidos fue de 36, mientras que,
considerando los datos provistos por el presente estudio, esta cifra se incrementó en más
del triple. alcanzando un total de 131 alelos.
A nivel regional, el número promedio de alelos por Iocus (A) en las poblaciones del
NOA presentó un rango de 2,667 - 6,111, siendo las poblaciones 6482 (Orgullo
52
Cuarentón) y 6473 (Altiplano) las de mayor y menor número de alelos, respectivamente
(Tabla 5). Las estimas de riqueza alélica (Rs) mostraron un valor mínimo de 2,434 para la
población 6473 y un valor máximo de 5.311 para 6476 (Tabla 5).
Los valores de heterocigosis promedio esperada (He) oscilaron entre 0,357 y
0,661 (Tabla 5). En concordancia con Io observado para Rs, la población 6473 resultó ser
la menos variable. mientras que, a diferencia de Io hallado para el número de alelos, la
población con mayor diversidad fue 6476 (Amarillo chico). Las poblaciones restantes
mostraron niveles de heterocigosis superiores a 0,550.
La evaluación estadistica de los Indices R8 y He a través de la prueba de Kruskal
Wallis reveló la existencia de diferencias significativas para el conjunto total de poblaciones
(Rs: H(g.._=7¡N=144)=21.11889, p< 0.004; He: H(g_._=7¡N=144)=17,56395, p< 0,014). En ambos
casos, sólo resultaron significativos los contrastes correspondientes a las comparaciones
de a pares entre la población 6473 y todas las restantes (Tablas A19-A20del Apéndice).
Resultados
Figura 4. Variabilidad microsatélite en razas nativas de maíz del Noroeste Argentino.
Comparación con los niveles descriptos en la literatura para: a) razas nativas de la República
Argentina (MATSUOKAet al. 2002b); b) razas nativas del continente Americano y Sudamérica
(MATSUOKAet al. 2002b); c) líneas endocriadas del banco de germoplasma de EE.UU. (LIUet
al. 2003).
a)Repúuim Ngemina (ra-4)
I NOA("2147)
NúmerodeMelon
b)
‘5' INQA (N=147)[Sudm (NI70)¡Continente American)(N
NúmerodeMelo:
_ A,-A 77”, ._...e_.___’
phfl37 bng1018 hay 1209 bng1287 bnlg1070 bI'Ig1182 bdg1866 bnlg1732 17091360 bnlg252Loma
c)
NúmeroIl-Aldo.
m7 Mgma “¡71209 ¡1191237 “91070 bígflü mames ¡»191732 “913m mas:Locus
54
Tabla5.DiversidadgeneticaenrazasnativasdemaizdelNoroesteArgentino.Rangoalélico:tamañosextremosdelosalelosencontradosenpares debases.A:númerodealelos.Entreparéntesisseindicaelnúmerodealelosexclusivosparacadapoblación.Rs:riquezaalélicapoblacional.HE: heterocigosisesperada. Población
Locus
PhiNcPhiPhiPhiPhiPhiBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlg 1211350370691270590291700116510181209128710701182186617321360252Promedio
6473 Rango9711213019111214814820815112617415021280126100117156 alélico120132203124157154218155136164254132102127 A(0)1223222433145142612,667Rs1222.6671.58821.5563.1692.9932.66713,7144.25713.71425.49112,434 H.00.3890.4120.4260.0590.50.0560.3580.5960.50500.7170.48500.6810.4910.74700,357 6167 Rango9711212818511214814820614912616814821278116100109152 alélico12216020312416115821815913817815626080134102155160 A(0)13442436645592621054,500Rs1271439233.6801.95437232.7145.3515.4083.5384.4114,7618.29619265.94429.5854.4254.186 H.00.4750.6570.4340.1470.6190,4840.7120.7610.5480.5630.7370.8930.1370.8370.4890.9290.690,562 “¿5 Rango9711213017811214814820414912617214821280110100119152 alélico122160203161159220161140176158256100130104165164 A(8)14341336754613363974,889Rs13.9462.9923.76912.9782.7695.56.8534.5313.9855.63111.8892.5385.66338.4546.5234,612 H.0.6890.4870.70200.6060.5420.780,8530.6630.7180.7340,9470.1510.7690.6360.9050.830,612
o
Tabla5.DiversidadgenéticaenrazasnativasdemaizdelNoroesteargentlno(cont.).Rangoalélico:tamañosextremosdelosalelosencontradosen paresdebases.A:númerodealelos.Entreparéntesisseindicaelnúmerodealelosexclusivosparacadapoblación.Rs:riquezaalélicapoblacional.HE: heterocigosisesperada. PoblaciónLocus
PhiNcPhiPhiPhiPhiPhiBnlgBnlgBn/gBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBnlg 1211350370691270590291700116510181209128710701182186617321360252Promedio
6480 Rango971121301911121481482081491241661482127811098117152 alélico12213220312416115621816113618015626080136104177160 A(3)142323367575122741855,333Rs13.5751.8952,41.9992.8812.6655,5166l5223.4455.5294,8419.1821.45,7493178911.6714.2434,350 H.00.5250.1580.4910.3480.5810.5090.8150.8430.5850.7500.7780.8990.040.8040.5140.9240.6650,568 6484 Rango9711213019111214814820814912616614821280110100109152 alélico120160203126161160218163138176156258136104179162 A(4)14332336644561731464,500Rs13.2562.8852.9981.9592.52.55.6715.4613.7673.8064.4765.28215.9592.510.0535.1543,902 He00,578(M0.6490.1930.5010.4820.804047510.4970.5640.7610.75200.8070.5390,9010.6790.556 6476 Rango971121281911121481482021431241721502127811098109152 alélico130160203124161156218165192180164256116134110171160 A(12)1543444776451051041355,611Rs14.9763.8332.9783.6673.9963.8126.9526.6415.66644.7699.3374.3339.1413.81011.7844.9095,311 He0.7650.6630.5910.5870.7230.4850.8940.8030.780.650.7850.910.3110.8860.4320.9360.7050,661
O
56
Tabla5.DiversidadgenéticaenrazasnativasdemaízdelNoroesteargentino(cont.).Rangoaiéiico:tamañosextremosdelosaleiosencontradosenparesdebases.A:númerodealeios.Entreparéntesisseindicaelnúmerodealeiosexclusivosparacadapoblación.Re:riquezaaléiicapoblacional.HE:heterocigosisesperada. Población Locus
PhiNcPhiPhiPhiPhiPhiBn/gBn/gBnlgBn/gBnlgBnlgBnlgBnlgBnlgBn/gBnlg1211350370691270590291700116510181209128710701182186617321360252
Promedio
6313 Rango9711513019111214814a20814111016614a2127a108100109150.aiéiico122164203126161162212157162A(s)1353334257363954,333Rs12.9334.99332,9962,9993.9261.9964.3335.7934.8372.0526.6093 3.932H.00.5350.3370.64406350.5810.6980.2710.7330.6880,5976482 Rango9711212813511214a14a20314111a1661442127810693103152Aiéiioo120160203126161153 A(15)
6,111
2.4353.7823.4015.3826.8374,9605.5345,5719,6665.2499.6183.8827.1554.7235,006
0.3590,6130.710,5370.4150.640.7530.8180.810,7880.7840.8970,7810.8760.6350.7340.5890,652
He
O
Los estadísticos descriptos proveen una medida de los niveles de diversidad de las
poblaciones estudiadas. Sin embargo, no brindan informaciónacerca de las semejanzas, o
diferencias, en la composición alélica de las mismas. A fin de analizar este punto, se
procedió a la determinación del número de alelos exclusivos presentes en cada una de
ellas. Se consideraron “exclusivos”de cada población a aquellos alelos presentes sólo en
una de las poblaciones del NOA,y ausentes en todas las restantes. sin importar su estado
en las razas de América o lineas endocriadas. La población con mayor número de alelos
exclusivos resultó ser 6482, seguida en orden decreciente de abundancia por 6476, 6313,
6485. 6484 y 6480, hasta llegar a cero en 6167 y 6473 (Tabla 5).
El número y posible origen de los alelos exclusivos que distinguen al NOA con
respecto a las razas de América y/o a las líneas ya ha sido descripto en los párrafos
anteriores. Es por ello que el análisis a continuación se centrará en los alelos que resultan
exclusivos al comparar entre sl a las poblaciones del NOA. pero que también se
encuentran presentes tanto en razas como en líneas (para detalles sobre la identidad y
frecuencia de los alelos exclusivos ver Apéndice, Tablas A1-A18). En todos los casos, los
alelos identificados presentaron frecuencias similares en razas y lineas, con valores que
oscilaron entre 0,003 y 0.157, sin observarse indicios de una mayor influencia de una u otra
fuente sobre las poblaciones del NOA.
Es interesante destacar que los únicos alelos exclusivos encontrados en las
poblaciones 6480 y 6484. corresponden al más variable de los marcadores analizados, el
Iocus bnlg1360.
Bajo el modelo de mutación de a pasos (SMM),el grado de superposición entre el
rango de tamaños alélicos de las poblaciones provee una medida de la diferenciación entre
las mismas. Según los análisis de progenie realizados por Vigouroux y ool. (2002), nueve
de los 18 Ioci incluidos en el presente estudio mostraron un patrón mutacional de tipo
SMM (bn/91018, bnlg1209. bn/g1287, bnlg1070, bnlg1182, bnlg1866, bnlg1732, bnlg1360,
bnng52). La dinámica mutacional de los nueve loci restantes será discutida en la sección
siguiente.
Como puede apreciarse en la Tabla 5. el rango alélioo de los Ioci SMM resultó
similar en todas las poblaciones, con algunos casos extremos en 6482 (Orgullo
Cuarentón). Lo mismo pudo verificarse para los Ioci no SMM, en donde se observó una
gran homogeneidad en la distribución de los tamaños alélicos entre poblaciones.
58
Resultados
R.1.1.2. Secuencia nucleotldica de los alelos microsatélites
Diversos métodos indirectos pueden ser utilizados para medir el ajuste de un
determinado locus microsatélite al modelo de mutación de a pasos (SMM) sin tener que
recurrir a las pruebas de progenie. Uno de los más comúnmente empleados se basa en el
patrón de distribución de los tamaños alélicos. De acuerdo con las predicciones del
modelo. el surgimiento de nuevas variantes se produce como consecuencia de la ganancia
o pérdida de una unidad de repetición. Asi, las diferencias de longitud entre alelos deberán
consistir en un número de pares de bases que sea múltiplodel motivo en cuestión. Sin
embargo. el mero análisis de los tamaños alélicos y su varianza no permite obtener
información inequívoca acerca de la naturaleza de las diferencias observadas y de los
mecanismos que les dieron origen. La secuenciación de las variantes alélicas, en cambio,
brinda una herramienta mucho más potente para determinar el modo de evolución de un
locus, y es por ello que fue elegida como estrategia para el análisis desarrollado en el
presente estudio.
Se secuenciaron 55 alelos pertenecientes a 9 Ioci con motivos de repetición de dos
(phi037, nc135, bnlg1700, bnlg1165), tres (phi059, phi069. phi121), cuatro (phi127) y seis
(phi029)pares de bases.
Los Ioci phi121, phi069 y phi059 presentaron motivos imperfectos con escasa
variación en el número de repeticiones entre alelos (Figuras 5a. 5d, 5f). Los dos primeros
constituyen casos extremos, en los que resulta dificil identificar la región microsatélite
esperada. En el locus phi059, el motivo es fácilmente distinguible. aunque prácticamente
invariable, con diversas inserciones involucradas en las diferencias de tamaño observadas.
En los Ioci nc135, phi037 y phi127 se obtuvieron patrones mixtos, en donde parte
de la variación se explica por diferencias en el número de repeticiones y otra parte se debe
a cambios en las zonas flanqueantes (Figuras 5b. 5c, 5e). En particular, el Iocus phi037
tiene una distribución bimodal, en la cual los alelos de mayor tamaño exhiben distintas
inserciones cuya longitud varía entre 3 y 27 pb. Los alelos 156 y 160 de este Iocus se
caracterizan. además. por la presencia de un tramo de poli-T de extensión variable en la
región inmediatamente anterior a la zona microsatélite, siendo el número de repeticionesdel motivo inferiora lo encontrado en los alelos más cortos. La variación hallada en el Iocus
phi037 ejemplifica las limitaciones del análisis de tamaños alélicos como único criterio para
la determinación del modelo mutacional. Como puede apreciarse en la Figura 5c, todos los
alelos difieren en un número par de bases; sin embargo, las diferencias no son atribuibles a
la ganancia o pérdida de repeticiones.
59
EI motivo microsatélite descripto en la base de datos MaizeGDB para el Iocus
phi029 posee una composición mixta de seis pares de bases (CCCT-CT).A pesar de ello.
las únicas diferencias encontradas en cuatro de los siete alelos secuenciados —Alelos148,
150, 154 y 156- corresponden al dinucleótido CT (Figura 59). Por su parte, los Alelos 158,
159 y 162 exhibieron un comportamiento heterogéneo, alternando tetranucleótidos CCCT y
dinucléotidos CT en la porción anterior al tracto de repeticiones CT (Figura 59).
Los únicos loci que mostraron un patrón de variación estrictamente compatible con
el modelo SMMfueron bnlg1700 y bnlg1165, ya que todos los cambios que intervienen en
la modificación del largo de sus alelos se encuentran restringidos al número de
repeticiones de la región microsatélite (Figuras 5h, 5i).
En resumen, los resultados aqul presentados indican que la variación hallada para
los loci phi121, phi059, nc135, phi037, phi069, phi127 y phi029, no es susceptible de ser
analizada bajo los supuestos del modelo SMM. Por su parte, las diferencias observadas
entre los alelos correspondientes a los loci bnlg1700 y bnlg1165 coinciden con lo esperado
tanto por el modelo de mutación de a pasos (SMM), como por el modelo de dos fases
(TPM) (DI RIENZOet al. 1994i.
La convergencia de los tamaños alélicos, es decir la existencia de alelos idénticos
en estado pero no idénticos por descendencia, tanto entre poblaciones como dentro de una
misma población, es una de las consecuencias esperadas según el modelo SMM. Sin
embargo, aún sin asumir dicho modelo. mutaciones puntuales en la secuencia
nucleotídica, o bien la combinación de inserciones y deleciones en las regiones
flanqueantes al motivo de repetición, pueden dar lugar a Ia coexistencia de variantes
alélicas distintas dentro de una misma categoria de electromorfos.
Considerando la gran incidencia de inserciones y deleciones en la diversidad alélica
observada, se decidió secuenciar variantes de igual tamaño provenientes de las diferentes
poblaciones analizadas en este estudio. Para ello se eligió el locus phi059, dado que se
contaba, además, oon los datos de secuencia de Ilneas de malz y otras especies del
género Zea (Figura 5f).
El alelo 148 presentó una similitud promedio del 99,7% entre las variantes de maíz
analizadas (excluyendo las bases indetenninadas). La única base variable corresponde a
la posición 132, dividiendo a los electromorfos en dos grupos, uno portador de "G"y otro de
“C”.Los alelos 148 de Zea quun'ans y 147 de la línea W64A resultaron 100% idénticos al
grupo portador de "C”, oon excepción de una deleción en la posición 136 del alineamiento
para el último de los mismos.
60
El alelo 152 representa un claro caso de convergencia en el tamaño alélico. Tanto la
variante de la población 6482 como en la descripta para la líneas Tzi10 exhiben el mismo
número de repeticiones. Sin embargo, esta última se caracteriza por la presencia de una
inserción de 4 pb en las posiciones 30 a 33 del alineamiento, mientras que la primera
posee una inserción de 4 pb en las posiciones 71 a 74.
A pesar de diferiren tan sólo una base con respecto a los alelos 152 y 154 de maíz,
diversos eventos de inserción y deleción distinguen al alelo 153 de Zea diploperennis,
poniendo de manifiesto las dificultades de aplicación de los marcadores microsatélites más
allá del nivel de especie. En forma similar, los alelos 157 de maiz presentan una identidad
promedio del 99,1% por ciento, mientras que su similitud promedio con Ia variante de la
subespecie Zea mays ssp. huehuetenangensis desciende al 95,4 %.
Figura5.Secuenciasnucleotídicasdelasvariantesalélicascorrespondientesa9Iocimicrosatéiitesdemaíz.Entreparéntesisseindicael tamañorealdelosaIeIosenparesdebases.a:secuenciastomadasdeMatsuokaet.al(2002a).b:secuenciasobtenidasmediantebúsquedaenia basededatosgenómicademaiz.Z.I.:Zeaquun'ans;Z.d.:Zeadiploperennis;Z.m.h.:Zeamaysssp.huehuentenangensis.LasrecuadrosindicanIa localizacióndelaszonasderepetición.M=AoC;R=AoG;Y=CoT;N=baseindeterminada. a)Locusphi121—Motivoderepeticiónesperado:CGG
102030405060708090100
Melo97(99) Melo97a(99)Lineano17""T’I‘uTA1an102‘(102)Lin-aB73"TTuT
tiiúiiti***tú**t**ii**t****t***tttikttriii****rii
GGCCGCGGCGGPAG" GGCCGCGGCGG'AuC
b)Locusnc135—Motivoderepeticiónesperado:
Malo112(113)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTTTT"T.’-‘.nAm 0519091)(114)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTA1010115(115)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTMalo118(116)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTMelo120(119)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTC-pquACA A1010122(122)CACAAAGAGCAGCCCACTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTCTC"flAvACA
iit*xtxiitiiixttdkkxksit*kk*t**k1*í***&***xx**xkkxáx*kxt*A*x***i*****k*xki**ix*i*klwkkAxkkii**i*tíi***x**sii*xi
CTCTCTCTM------- CTCTCTCTCTC-----oo};anA
c)Locusphi037—Motivoderepeticiónesperado:CT
|....l....i....i....l....|....l....|....I....I....I....l....l....I....I....I
31010128(128)CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGACGTMalo130(130)CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGACGTG10813!)(130)CCCAGC’I‘CCTGTTGTCGGCTCAGACGTmalo132(132)CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGACGT1.1.10156(154)CCCAGC'I‘CCTGTTGTCGGCTCAGACGTMilo160(160)CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGACGTA1010164(166)CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGACGT
k«x***t*tí«**x**ixaiíkx****xx**s ’t*«*****««*xtiix***xttküi**x
E-i E19
Ü U
1401516170180
.|....|....i....|....l....l....l....l....l...
Melo128(128) AJ.an130(130) G10813(130) Aielo132(132) Malo156(154)“JAAA Aielo160(160)“¿VACAMelo164(166)su}:ACA
*»*x«xxtxxxxrtikxkixxv**ttx!Axxxlrkíiikxs*xx
62
Figura5.(cont.) d)Locusphi069-Motivoderepeticiónesperado:GAC
Alelo Alelo
OH0
r-I4Alelo Alelo
oHwHq Alelo Alelo
185(190) 191(197) 200(203) 203(207) 185(190) 191(197) 200(203) 203(207)
1020
30405060708090100110120130
....I....I....I....l....I....I....I....I,...l....I....I....i....i....l....I....I....I....1....1....I....I....l....I....I....I....|
naunnvnnu
1*wrr*****************w************«*************x****ii****i**«***
e)Locusphi127-—Motivoderepeticiónesperado:GTCT
¡101°
3.9.3O 0 C22"!
¡lolo
112(111) 126(125)
1020
30405060708090100110120
..l....I....I....|....|....I....I....i....l....I....l....|....I....I....i
ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGAT
¡ükwtiii***iü***iixifiiwiifii
GTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCT
**rxx*t**x*
«*x****x*******tiix******xkk*k*1
63
Figura5.(cont.). f)A1310
Locusphi059-Motivoderepeticiónesperado:ACC
118-(118)Linea¡272
102030405060708090100110
120
130
....|....|....|....¡....|....|....¡....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....g....|....|....|
147.(147)Linea"SAA 148(148)6473 148(148)6480 148(148)6482 148.(148)2.1. 148l(148)Lina;B73
AAGCTAATTAAGGCCGGTCATCCCTCTTCTAGCTCGTTTCATTATCCATGGCGGAGGAGAAGCIACCACCACCACCACCTGTTCCACCACAAGAAGGACGAGGAGCAG
1521526482
152LineaT2110
153.153Z.d.
154
154a154LineaCIL254
CTCGCC CTCGCC
AAGCTAATTAAGGCCGGTCATCCCTCTTC
ACCACCACC ACCACCACC
1571576476
cmvw
F F r r rn n n n mn n a H H
Pmr4
¡lalo ¡lalo ¡lalo
157.157Znh 161(161)6482 1611(161)Lina;¡554 118.(118)Lina!¡272
ifi****ú*****t*úútiiittiiikii***r**ii**t**t*i***************iüitiiitia***i**********ttitt
150160
CCGCCGAGTACACGGA
A1010
147.(147)Lina:w641
(148)6473
WCF OÜ ÜW W
¡aDCHsu
ONO.)ÑÑÑÍHHHH
(148)6482
148.(148)2.1. 148!(148)LíneaB73
GCCGGGGGTACGGCGAGTCCGCCGAGTACACGGA
152(152)6482
(152)Lino:T2110
z.d.
(154)6476
1541(154)LínnaCIL254 157(157)6476 157(157)6473 157(157)6482 157(157)6480 157(157)6484 157.(157)Linea¡0117 157.(157)z.m.h. 161(161)6482 1611(161)Línea¡554
iitrttiiiiiiüiii
64
Figura5.(cont.). g)Locusphi029—Motivoderepeticiónesperado:CCCT/CT
102030405060708090100110120130
..I....I....l....|....|....I....I....l....1....l....l....I....I....l....l....|....|....l
A1010148149I'CCCTCTCTCTCTCT Melo162160 CCCTCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTTCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGC
ik
i*k&<****kí*iiiak*t**x
Malo162160
h)Locusbnlg1700-Motivoderepeticiónesperado:AG
102030405060708090100110120130
Malo202(203) Malo216(217)AGAGAGAGAbP
htranuvnwmatáakxanhnwmik*************xvz****auauc*ynhniaumahnhhhhhkikíiifiixkiksk‘ki'kskic‘kkkici*k**
140150160170180190200210
.I....I....I...l...
Aielo202(203) A101021s(217)
iciskítiü<íztyiúixxixúxvtkícka
65
99
***x*#**x****x*%
*****»xx****»#***#**
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*******&*4*x*****»**
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9V:opmadsaU9!0!19d9.1ap0Anow—99;¿Bluqsnoo7(I'(‘3uoo)'gemBH
Resultados
R1.2.Razas nativas arqueológicas
Se analizaron 57 especimenes, incluyendo marlos y cariópsides. De acuerdo con lo
esperado para ejemplares arqueológicos (PAABo1989a), los extractos de ADNobtenidos a
partir de las muestras provenientes de los sitios Batungasta, Lorohuasi y Punta Colorada
presentaron fragmentos de bajo peso molecular (0,1 - 0,8 kb) (Figura 6). Sin embargo, una
fracción de los fragmentos recuperados en los ejemplares correspondientes al sitio
Tebenquiche resultó de tamaño similar al encontrado en muestras de ADNgenómico de
especimenes actuales.
2638 Db
+———— 805 Db
339 Db
¿am12345678910Figura 6. Extracción de ADNa partir de ejemplares arqueológicos. Electroforesisen gel de
agarosa 1% (p/v). Calles 1, 2, 3: individuos sitio Lorohuasi; 4: individuo Punta Colorada; 5, 6:
individuos Batungasta; 7, 8, 9: individuos Tebenquiche; 10: Marcador de peso molecular
Lambda-Pstl.
Los ejemplares de mayor envergadura permitieron la realización de 2 a 4
extracciones, verificándose los mismos patrones de amplificación en todos los casos. La
reproducibilidadde los experimentos fue constatada a través de rondas independientes de
PCR, realizándose entre 2 y 4 réplicas por muestra.
La tasa de éxito para la amplificación de las regiones microsatélites fue del 15,8%
para el Iocus phi127 (9 muestras de un total de 57 pudieron ser amplificadas y analizadas
previa clonación o por secuenciación directa), del 3,5% (2/57) para el locus phi029 y del
67
1,75% para el Iocus phi059 (1/57) (Tabla 6). Dado que las posibilidades de conservación
disminuyen a medida que se incrementa la longitud del fragmento, la notoria diferencia en
Ia tasa de éxito del marcador phi127 con respecto a los dos restantes puede ser atribuida a
las diferencias de tamaño en los productos de amplificaciónesperados en cada caso (110
126 pb Vs. 148-161pb).
Tabla 6. Aielos microsatzrites encontrados en ejemplares arqueológicos de razas
nativas de maiz del Noroeste Argentino. No. de clones: número de clones que presentaron
la secuencia microsatélite esperada / número total de clones con inserto analizados. NAR= No
adjudicable a raza actual. S.D.= secuenciación directa.
Slllo de colección Tipo de No. de
Individuo (antigüedad) resto Raza Aielo clones
Phi127
7C Tebenquiche Mario NAR 112 5 /10
(370 AP)54 Tebenquiche Mario NAR 112 8 l 20
(370 AP)20 Lorohuasi Cariópside Pisingallo 112 5 / 39
(400 AP)22 Lorohuasi Cariópside Capia 112 2 / 53
(400 AP)38 Lorohuasi Cariópside Morocho 112 S.D.
(400 AP)39 Lorohuasi Cariópside Chaucha 112 5 / 18
(400 AP)40 Lorohuasi Cariópside Chaucha 112 1 / 5
(400 AP)51 Punta Colorada Mario Indeterminada 112 5 / 5
(1300 AP)52 Punta Colorada Mario lndeterminada 112 9 / 11
(1300 AP)Phi029
38 Lorohuasi Cariópside Morocho 154 8/ 11(400 AP)
40 Lorohuasi Cariópside Chaucha 154 1 / 2(400 AP)
Phi059
54 Tebenquiche Mario NAR 157 S.D.
(370 AP)
La proporción de individuos que presentó productos de amplificación compatibles
con la longitud alélica descripta para razas actuales fue del 43,8%. Sin embargo, muchos
de ellos no pudieron ser clonados ni secuenciados en forma directa, mientras que otros
resultaron ser contaminantes y productos inespecificos cuyo origen no pudo ser
68
determinado. Asimismo, tres de los nueve individuos en donde pudo establecerse el
genotipo para el locus phi127, presentaron además, fragmentos cuyas secuencias
corresponden a distintas regiones de los retrotransposones Huck-1 y Zeon-1 de maíz
(Tabla 7).
Como puede observarse en la Tabla 7, Ia mayor parte de los productos
inespecíficos con posible asociación a bacterias del suelo u otros organismos
contaminantes, proviene de manos y no de cariópsides, siendo particularmente abundantes
en los individuos del sitio Tebenquiche. Este hecho concuerda con la presencia de ácidos
nucleioos de alto peso molecular en dichas muestras, Io cual está generalmente vinculado
con la ocurrencia de contaminación microbiana tanto en restos óseos como vegetales
(COOPER1994; ROLLOet al. 1994). Para una descripción detallada del número de productos
de PCR y clones analizados. ver Tabla A21 del apéndice.
Por otro lado, los indicios de contaminación observados en los marlos de
Tebenquiche probablemente reflejen sus condiciones de preservación, ya que los mismos
fueron recuperados en ambientes domésticos, en contextos tales como lentes de estiércol
o derrumbes de muros (Haber, com. pers.) . Entornos de estas caracteristicas promueven
la conservación de maten’alvegetal no carbonizado en estrecho contacto con la flora del
suelo.
Tabla7.CaracterizacióndesecuenciasnucleotidicasnocorrespondientesaIocímicrosatélitesampliflcadasapartirdeejemplares arqueológicos.NAR=noadjudicablearazaactual.ns=coincidenciasnosignificativas(E-value<10°).nm=ausenciatotaldecoincidenciasparaelfragmento completo.
Phi127 Phi029
Sitiodecolección
Muestra
EEB
Tebenquiche Tebenquiche Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Lorohuasi Pta.Colorada Pla.Colorada Pta.Colorada Pta.Colorada Pta.Colorada Pta.Colorada Tebenquiche
Tipoderesto Mario Marlo
cariópside cariópside cariópside cariópside cariópside can'ópside cariopside cariópside
Mano
Morocho ChauchaPisingallo Pisingallo Chaucha Pisingallo
Capia Capia
Pisingallo Pisingallo Pisingallo
Capia Capia CapiaNAR
TamañoNo.de
22692 128 128 110 95 110 86 110 129 134 136 116 111 207
s-Nv-v-Pi-r-LOv-LDNFI-N
EastN
E-valueglaetx
E-value
tblastxE-value
ns
Z.maysHuck-1RT Z.maysHuck-1RT Z.maysHuck-1RT Z.maysZeon-1RT
ns ns ns ns ns ns ns
Homosapi
ns ns ns
Nm Bacillushalodurans Thermobacillus xy/anilyflcus Clostridiumstercoran'um59xp-4
Zexp-G Bexp-6
Sexp-33 89xp-38 89xp-38 69xp-26
Neurosporacrassa Nm Ns
Zexp-SNm
Nm Nm
Bexp-a
Cytophagahutchinsoniiaexp-11Pseudomonasputida Burkholden'afungorum Bradyrhizobium [agonicum
1exp-7 1exp-7
ns BaciI/usha/odurans Thermobacillus xylanilyticus Clostridiumstercoran'um39xp-5
4exp-8 29xp-7
ns ns ns ns Neurosporacrassa ns ns ns ns ns
29xp-4 29xp-11
70
Tabla7.Caracterizacióndesecuenciasnucleotidlcasamplificadasapartirdeejemplaresarqueológicos.(Cont.)
Phi029 Phi059
Muestra
7C 27 27 28138
15 56 56 55278 27B 273 278
7D 38 35138
STtlodecolección
Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Pla.Colorada Pla.Colorada Pta.Colorada Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Tebenquiche Lorohuasi Lorohuasi Pla.Colorada Pla.Colorada
Tlpoderesto Mario Mario Marlo Mario Marlo Mario Marlo Marlo Mario Mario Mario Marlo Mario Mario Marlo Mario
cariópside can'ópside
Mano Mario
Pisingallo
NAR NAR
Blancoyocho
rayasNAR NAR NAR NAR NER
Morocho
Capia' Capia
NI
TamañoNo.de
(hp) 157 157 119 128 87248 131 98 156 167 167 104 174 146 149 126 169 207 156 160
clones
Blast?!
ns ns ns ns ns ns ns
E-value
D.S.Leishmaniabresiliensis3exp-4 D.S. D.S. D.S. D.S.
ns ns ns
Blaatx
Ns Ns Ns Vibn'oalgirolyticus Nm Ns Ns Nm
1exp-5
Ns Ralstoniasolanacearum1exp-5 Ralstoniasolanecearum1exp-5
Sfreptomycescoo/¡color1exp-17Ns
ns ns ns
Streptomyoes
vin'dochromogenes
ns ns ns ns Í
Sexp-G
Ns Ns Streptomycescae/¡color1exp-3 Slreptomyces vindichmmogenesNs
1exp-8
Ns Ns Ns
E-value
tblaatxE-value
ns ns ns Vibn'oalgírolyticus ns ns ns nm
4exp-6
ns RalstoniasolanacearumZexp-S Ralstoniasolanaoearum29xp-5 Streptomycescae/¡colorSexp-3 Z.maysPCO147721mRNA39xp-3 Strepromycesavennitilis9exp-3 Streptomycescae/¡color9exp-5 Streptomycesavennitilis1exp-4 Streptomyces89xp-11 vin'dichromogenesns
Xanthomonas campestn's Homosapiens ns ñ
3exp-3 80xp-3
R1.2.1. Locus Phi127
La totalidad de los individuos estudiados para el Iocus phi127 resultó homocigota
para la variante alélica 112 (Tabla 6). A pesar de que el estado de deterioro que caracteriza
al ADN antiguo puede interferir con la correcta representación de ambos alelos en
individuos heterocigotas, la alta frecuencia del alelo 112 en poblaciones actuales, tanto
argentinas como de Centroamérica, permite suponer que los genotipos obtenidos no se
encuentran distorsionados debido a razones experimentales.
Las secuencias de los ejemplares arqueológicos, incluyendo tanto clones como
productos de secuenciación directa, mostraron una identidad promedio del 98,3 % con
respecto al alelo 112 presente en poblaciones actuales, detectándose un total de 24
sustituciones correspondientes a 22 sitios variables (Figura 7). El 87% (21/24) de las
sustituciones fueron mutaciones únicas o singletons, es decir, sólo se hallaron presentes
en 1/43 secuencias analizadas. Una alta proporción de los sing/etons (9/21) correspondió
a transiciones de tipo C/G —>T/A.
La similitud promedio entre clones de un mismo producto de amplificación fue del
97,7%. En la mayoría de los casos, la similitud promedio entre clones resultó inferior a la
similitud promedio con respecto a la secuencia actual. indicando que gran parte de las
diferencias observadas entre las muestras actuales y las arqueológicas no serían producto
de la divergencia, sino artefactos generados por las condiciones de preservación del ADN
o bien por las sucesivas rondas de amplificación (errores de la enzima Taq polimerasa). De
hecho, al construir las secuencias consenso correspondientes a los ejemplares
representados por más de un clon, todos los consensos resultaron 100% idénticos a la
secuencia actual. con excepción dela muestra 51. que presentó una identidad del 98%.
Solamente dos individuos, la cariópside 40 del sitio Lorohuasi y el marlo 51 del sitio
Punta Colorada. mostraron un patrón de variación que podria corresponder a eventos
mutacionales reales. En el individuo51, cinco de las seis secuencias obtenidas presentan
una “T' en la posición 88 del alineamiento. caracteristica que comparte con el único clon
estudiado del individuo 40, y con los clones c1 del individuo 22 (lnd.22-c1) y c4 del
individuo 39 (lnd.39-c4) (Figura 7). Asimismo, 4/6 secuencias poseen una “A” en la
posición 96. al igual que lo observado para el alelo actual 126 y para los clones lnd.22-c1 e
lnd.39-c4.
Por su parte, el individuo 40 exhibió, además, mutaciones puntuales en la zona
correspondiente al motivo de repetición del microsatélite (posiciones 34 y 38) y en la
región contigua a la inserción de dos pares de bases que caracteriza a los alelos actuales
72
114 y 126 (posición 87). No obstante, los datos de este individuo deben ser tomados con
cautela dado que provienen de un único clon.
Considerando la antigüedad del ejemplar 51, y con el objeto de determinar si la
presencia de la variante “T”en la posición 88 de los alelos arqueológicos podia deberse a
la retención de un polimorfismoancestral, se procedió a comparar los motivos presentes en
el alelo 112 de Zea mays ssp. parvíglumis y Zea mays ssp. mexicana. En ninguno de los
dos casos se encontró una "T"para la posición 88, observándose una divergencia de 1.8%
con respecto a la secuencia dela subespecie mays.
El análisis de las frecuencias alélicas en las poblaciones actuales reveló la
existencia de dos grupos con diferencias significativas para el locus phi127. En el primero,
constituido por las poblaciones 6473, 6480, 6484, 6167 y 6485, el alelo 112 tiene una
frecuencia de entre 0,78-1, mientras que en el segundo, integrado por 6313, 6482 y 6476,
el mismo se encuentra en frecuencias de entre 0,43 y 0,54. Si bien la probabilidad de hallar
Ia variante 112 es alta para ambos grupos, lo cual dificulta Ia asignación de las muestras
arqueológicas a uno u otro de ellos, los resultados obtenidos parecen indicar una mayor
afinidad entre los ejemplares antiguos y el conjunto de razas del primer grupo, cuyas
caracteristicas morfológicas y citológicas permiten asignarlos tentativamente al Complejo
Andino definido por McCIintocky col. (1981) (Ver Introducción, sección I3.3.2)
Este hecho no es del todo sorprendente si se considera que la población 6313
corresponde a la raza Pisingallo en donde una serie de análisis morfológicos,
cromosómicos y genéticos han puesto de manifiesto su gran diferenciación con respecto a
las demás razas y líneas de maíz (MCCLINTOCKet al. 1981; BENZ8. ILTIS1990; PIPERNO&
PEARSALL1993; LIUet al. 2003). Asimismo, la población 6482 pertenece a la raza Orgullo
Cuarentón, una raza incipiente generada hace aproximadamente 40 años merced a la
incorporación de variedades comerciales en el germoplasma autóctono (CAMARA
HERNANDEZ & MIANTEALZOGARAY 1997).
'eueo_IxeLudssSÁBLUeezz'Lu'Lu'zfsywnlfiweddsssÁeweezz'd'w'z'ng6uasepe|egasueguanouaessoog69|oaanesaJE|dLuefeap('p's)emaupuogoegouenoasepsopnpOJdÁ(o)sauopesmuagpuodseuoosegouanoasse1"soo!69|oanb1eKsolemnesaJelduJaIauasexuasaJdseogmeSGMJBUBAs2|apeogpnoepnuegouenoas'¿zuqdsnoo-l'¿eJnGHllVVQl11919399V999319V9V1VV099333919V031.LVVDLLBLLLVSVO‘JLVSOVOJ.LSllllSllO.I.309131913191V99VV9913VV99103911V091V1VZHOIOIV'W'W'Z
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(Eloumt06N(ll00W0’Woz0|
Resultados
R1.2.2. Locus Phi029
Los dos individuos cuyo genotipo pudo ser determinado para el Iocus phi029
presentaron la variante alélica 154 en homocigosis (Tabla 6). Nuevamente, si bien la
ausencia de heterocigotas puede deberse a limitaciones técnicas, la alta frecuencia del
alelo 154 en las poblaciones y razas previamente estudiadas es compatible con las
observaciones realizadas. Asimismo, la mayor parte de las variantes alélicas actuales de
este locus presentan una longitud inferior a 154 pb. con Io cual el tamaño de los
fragmentos recuperados de las muestras arqueológicas no deberia influiren la detección
de heterocigotas.
La identidad promedio entre los clones fue del 96% para el ejemplar arqueológico 38
(Raza Morocho) y del 99% para el 40 (Raza Chaucha), en tanto que la identidad promedio
con respecto al alelo 154 actual fue del 98% y 97%, respectivamente. Se identificaron 24
sitios variables. 18 de los cuales corresponden a singletons, siendo el 71% de las
sustituciones transiciones de tipo C/G —>TIA (Figura 8).
AI igual que Io observado para el Iocus phi127. el individuo 40 presentó ciertas
características distintivas a nivelde secuencia. Los dos clones recuperados presentan una
"T" en lugar de una “C” en las posiciones 47. 62, 79 y 101 del alineamiento (Figura 8).
estando las tres primeras dentro o inmediatamente contiguas al motivo de repetición. AI
incluiren la comparación la totalidad de las variantes alélicas del locus, como asi también
los alelos 154 correspondientes a Zea mays ssp. mexicana y Zea mays ssp. paNiqumis.esta zona muestra una estructura variable en donde todos los cambios involucran
transiciones de tipo C-T. Sin embargo, es de destacar que en el individuo40 la única base
representada en las posiciones variables, tanto del Iocus phi127 como del Iocus phi029,sea la “T”.
AIestudiar la distribución de frecuencias en las razas actuales es posible distinguir
un grupo compuesto por las poblaciones 6480. 6484, 6476, 6185 y 6167, en donde el alelo
154 es el más frecuente con valores que oscilan entre 0,63 y 0,71, y a las poblaciones
6473, 6482 y 6313, cada una de ellas diferenciada con respecto a las demás. En las dos
últimas, la variante 154 tiene una frecuencia de 0,42 y 0,21 respectivamente, mientras que
ésta asciende a 0,97 para 6473.
Este patrón de variación concuerda con la afinidad entre ejemplares actuales y las
poblaciones 6480, 6484, 6476, 6485, 6167 y 6473, previamente sugen‘da en base a los
resultados del Iocus phi127.
75
l1."2.“I3."n‘f’I5."n°I°x7."u°°9°u‘ï"
a....AA....,¡,....,A,,,Á,,A.....Á.....A..ÁV..,..,,A......AV....A.|..,A|.,..¡,A......
Ahb1“TTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCGCCCCTCTCCCTCTCTCTCTCT- ---- --- ---TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1MTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCACCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCT-«--- ----TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1üTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCGCCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCT- ----TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1flTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCTCCCCTCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTCT--TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1üTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCGCCCCTCTCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCT-TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1üTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCTCCCCTCTCCCTCCCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTTCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCCAhb1“TTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCGCCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCT-- --- --TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCC
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ZmpAhb1“TTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCACCCCTCTCCCCCCCTCTCTCTCTCT- --- ---TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCC
meJhb1MTTGTCTTTCTTCCTCCACAAGCAGCGAAATCCAATCTAGAAGCGCCCCTCTCCCTCTTTCTCTCTCTCT---- ---TCGCCGTCCGAAGCTCCGCACCC
IWoI1?I1?lñol1?I1T
Ahb1“CAATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAATAhb1mCAATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAATAhb1üCAATCTAATCGACACCTCGCCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAATAhh1üCAATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAATAhb1üCAATCTAATCGACACCTCGCCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAATAhb1ü-AATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAAT
Ahb1“CAATCTAATCGACACCTCGCCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAAT
lnd.40c1 .... .... .......Ind.40c2 ...... ......lnd.38c1e... .............lnd.38c2....... .... ...........lnd.38c3..... ....lnd.38c4............ ......c.. lnd.38ca......................ÍI.Í.II.Í.I.I..p.....ÍI..I...ÍÍIZ..I.IÍ
Z.m.p.Alelo154CAATCTAATCGACACCTCACCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAAT
Z.m.m.Aleio154CAATCTAATCGACACCTCGCCGAGATGGGCCGCAAGTTCTTCGTCGGTGGCAACTGGAAAT
Figura8.Locusphi029.Secuencianucleotídicadelasvariantesalélicaspresentesenejemplaresactualesyarqueológicos.Lassecuenciascorrespondientesalosclones(c)obtenidosdeejemplaresarqueológicosseencuentranseñaladasengris.Z.m.p.:Zeamayssspparvíglumis;Z.m.m.: Zeamaysssp.Mexicana.
Resultados
R1.2.3. Locus Phi059
El análisis de la única secuencia recuperada para el Iocus phi059 evidenció la
presencia de la variante 157 en los ejemplares arqueológicos. La coexistencia de otro
alelo en la muestra no puede ser descartada, dado que los datos fueron obtenidos a partir
del método de secuenciación directa y no del análisis de clones, como en los casosanteriores.
La variante 157 encontrada en el marlo 54 resultó idéntica a las halladas en las
poblaciones actuales 6476 (Amarillo Chico) y 6473 (Altiplano), con una divergencia
promedio del 0,5% con respecto a los alelos correspondientes a la linea M0117 y a las
poblaciones 6480 (Amarillo Grande), 6484 (Amarillo chico) y 6482 (Orgullo Cuarentón)
(Figura 5f). Del mismo modo, la divergencia con respecto a la variante 157 descripta en
Zea mays ssp. huehuetenangensis fue similar a lo observado para los ejemplares
actuales (95,6%).
Siguiendo la misma aproximación detallada anteriormente, el análisis de las
frecuencias alélicas permite discriminar dos grupos entre las poblaciones del NOA, con la
población 6313 de la raza Pisingallo ocupando una posición intermedia. Por un lado. la
raza Orgullo Cuarentón se caracteriza por una baja frecuencia del alelo 157 (0,13) y una
alta proporción del alelo 148 (0,76), seguida por Pisingallo en donde la frecuencias son de
0,22 y 0,60. respectivamente. Estos valores son significativamente distintos a los hallados
en las poblaciones restantes con frecuencias que varían entre 0,35 y 0,63 para la variante
157 y entre 0,35 y 0,56 para la variante 148. Al igual que en los loci anteriores, la mayor
frecuencia del alelo 157 en las razas típicamente andinas sugiere una mayor afinidad entre
los ejemplares arqueológicos y estas últimas.
R1.2.4. Afinidades entre e'em lares ar ueol icos razas actuales
El razonamiento seguido en los análisis precedentes para el establecimiento de
afinidades entre ejemplares arqueológicos y razas actuales es similar a Ia empleada en el
método de asignación propuesto por Paetkau y col. (1995). Según el mismo, la
probabilidad de pertenencia de un individuo de origen desconocido a una población
determinada estará dada por la probabilidad de encontrar en ella un individuo con igual
genotipo multilocus. Asumiendo independencia entre Ioci y ajuste a las proporciones de
Hardy-Weinberg, esta probabilidad no es más que el producto de las frecuencias
genotipicas esperadas para cada locus.
77
Dado que los individuos arqueológicos 38, 40 y 54 pudieron ser tipificados para dos
de los tres Ioci estudiados, se calcularon las probabilidades de hallar los genotipos
correspondientes (phi127112n12-phi029154ns4y phi127112,112-phio5915msy)en cada una de
las poblaciones actuales (Tabla 8).
Tabla 8. Probabilidad de ocurrencia de los genotipos encontrados en
ejemplares arqueológicos de maíz en poblaciones actuales del NOAsegún el
método de Paetkau et. al. (1995).
Genotipo Población
6473* 6476* 6482 6480* 6484l» 6167* 6313 6485*
Phi127112mz 0.941 0,292 0,203 0,608 0,792 0,8464 0,105 1
pm'029154,154 0,945 0,502 0,174 0,391 0,422 0,460 0,046 0,405
Phi059157,157 0,174 0,120 0,016 0,212 0,391 0,187 0,048 0,213
Phi127112h12-Phi02915ms,4 0,889 0,146 0,035 0,238 0,335 0,390 0,008 0,404
pnl-127"wrpmosgüm, 0,163 0,035 0,003 0,129 0,309 0,155 0,000 0,213
'Poblaciones tentativamente asignadas al Complejo Andino.
En concordancia con lo obtenido en el análisis individual de cada Iocus, la
probabilidad de ocurrencia de los genotipos correspondientes a los ejemplares 38, 40 y 54
es mayor para las poblaciones que pertenecerían al Complejo Andino, mientras que resulta
muy baja para 6482 y 6313.
R2. ESTRUCTURA POBLACIONAL
R2.1. Equilibrio de Hardy-Weinberg
De acuerdo con lo esperado para especies de fecundación cruzada, las poblaciones
6473, 6167, 6485, 6484 y 6313 exhibieron un patrón general de ajuste a las proporciones
de Hardy-Weinberg, evidenciado tanto por el análisis de locus individuales como por las
estimas globales de los índices F¡s(Tabla 9).
Por su parte, los valores de F.s positivos y significativos obtenidos para las
poblaciones 6480, 6476 y 6482 indican un exceso de homocigotas con respecto a lo
esperado bajo la hipótesis de unión al azar de gametas. Lo mismo surge del análisis de
Iocus individuales, en donde todas las desviaciones fueron halladas al considerar la
hipótesis alternativa de defecto de heterocigotas (Tabla 9). Por el contrario. al estudiar el
78
Resultados
ajuste tomando como hipótesis alternativa el exceso de heterocigotas, no se observaron
desviaciones significativas en ninguna de las poblaciones ni Iocianalizados.
Tabla 9. Ajuste a las propociones de Hardy-Weinberg. Las casillas sombreadas corresponden alos Ioci en donde se observó ajuste a lo esperado bajo la hipótesis de unión al azar de gametasuna vez realizada la corrección de Bonferroni (Test U; H1=defecto de heterocigotas).
Población Liga-s
n p p p p p b b b b b b b b b b b Fisc h h h h h n n n n n n n n n n n g
:1, ¡b ¡(“J / I I I I / l / I I I Ig 9 9 9 9 05 3 6 2 5 2 1 1 g 1 g 1 g 1 g g g b
7 9 7 9 9 7 1 0 2 2 0 1 8 7 3 5 a0 6 1 0 8 7 8 6 3 6 2 I0 5 8 9 7 0 2 6 2 0
6473 m m m m m 0,0956167 0,0806485 m 0,1306480 m 0.189*6484 m 0,1 156476 0,134"6313 0,1006482 0220*
m= locus monomórfico. *p< 0,05. Significación establecida mediante el método de permutaciones.
Los resultados presentados en la Tabla 9 ponen de manifiesto cierta heterogeneidad
en el comportamiento de los Ioci, aún en poblaciones con un patrón general de ajuste a las
proporciones de equilibrio. Esto puede deberse a errores de muestreo, fallas
experimentales, errores de tipificación,o bien, a la existencia de alelos nulos.
De encontrarse en frecuencias apreciables, los alelos nulos pueden ser detectados
a través de la ausencia total de producto de amplificación en los individuos homocigotas.
Sin embargo, este criterio es de dificilaplicación dado que puede confundirse con cualquier
otra falla de índole experimental. Por ello, sólo se consideran homicigotas nulos a los
individuos que presentan ausencia de producto en un único Iocus, siendo su genotipo
fácilmente registrable para el resto de los locí. De acuerdo con dichas pautas, ninguno de
los marcadores empleados en este estudio mostró indiciosde presencia de alelos nulos.
Por otro lado, la heterogeneidad observada también puede explicarse sin tener que
recurrir a distorsiones experimentales. En presencia de bajos niveles de endogamia,
aquellos marcadores con mayor número de alelos resultarán más sensibles a la hora de
detectar las desviaciones con respecto a la panmixia. En este sentido, si bien las
diferencias en el número promedio de alelos por Iocus no fueron estadísticamente
significativas,es interesante destacar que las poblaciones en donde se observó exceso de
79
homocigotas (6476, 6480 y 6482) presentaron los valores más altos para este índice (Tabla
5).
R2.2. Diferenclación genética
El análisis de la estructura poblacional utilizando marcadores microsatélites
presenta dos alternativas: a) estimar los niveles de diferenciación mediante el índice de
fijación FSTde Wright (1965; 1978), asumiendo un modelo de alelos infinitos; y b) estimar
los niveles de diferenciación mediante el indice R51 de Slatkin (SLATKIN1995), asumiendo
un modelo stepwise o de mutación de a pasos. La elección entre uno u otro de ellos
dependerá de las caracteristicas de los loci involucrados y de la contribución relativa de
mutación, migración y den‘vaen el proceso de divergencia.
Los resultados presentados en el análisis de datos de secuencia de los alelos
microsatélites mostraron que los Iocí phi121. phi059. nc135, phi037. phi069, phi127 y
phi029 no exhiben un patrón de variación compatible con el SMM, lo cual invalida la
utilizacióndel estadístico RSTpara este conjunto de marcadores.
En el caso de bnlg1165 y bnlg1700, las evidencias provenientes del análisis de
secuencias concuerdan con lo esperado según el modelo de mutación de a pasos,
mientras que en los loci bnlg1018, bnlg1209, bnlg1287, bnlg1070, bnlg1182, bnlg1866,
bnlg1732, bnlg1360 y bnng52. el ajuste al modelo SMM fue demostrado por Vigouroux y
col. (2002) a través de pruebas de progenie. En esta situación, la aplicación de Pm como
medida de diferenciación es. en teoría. adecuada. Sin embargo, la utilización de este
estadístico sólo se justifica cuando las diferencias en los tamaños alélicos aportan
información acerca del grado de divergencia entre poblaciones. De no cumplirse esto
último, FSTcontinúa siendo el estimador de preferencia por presentar menor varianza
(HARDYet al. 2003).
A fin de seleccionar el estadístico más apropiado, se evaluó la incidencia de los
tamaños alélicos en la diferenciación poblacional (Ho: FST=RST;H1=FsT>Rsr) mediante el
test de perrnutaciones desarrollado por Hardy y col. (2003) (ver Materiales y Métodos,
sección M2.3.5.1.). Dado que el patrón de variación observado para los Ioci bnlg1700 y
bnlg1165. ajusta tanto al modelo SMM como al modelo de dos fases, ó TPM (DIRIENZOet
al. 1994). en una primera etapa sólo se incluyeron en el análisis los Iocíestrictamente SMM
(9 IOCI),incorporando luego los dos potencialmente SMM (11 locr).
En ninguna de las estimas globales consideradas se hallaron diferencias
significativas entre los valores de FSTy RST(Tabla 10), lo cual indica que, en general, los
procesos mutacionales, y por ende. las diferencias en el tamaño de los alelos, no han
80
contribuido a la diferenciación. No obstante, al estudiar separadamente cada Iocus. la
hipótesis nula fue rechazada para tres de los once marcadores (bnlg1866, bnlg1360 y
an9252), evidenciando cierta heterogeneidad en el comportamiento de los Ioci que dan
lugar a las estimas globales (Tabla 10).
Tabla 10. F31vs. R31.Diferencias en el tamaño ale-"co y su contribución a la
diferenciación poblacional. pRST:promedio de los RSTobtenidos a partir del test de
perrnutaciones de tamaños alélicos (HARDYet al. 2003).
Rm PRsr (l-c- 95%) P(H1=Rsr >Fsr)
Global 9 LOCÍ 0,2309 0,1633 (0,0874-0,2455) 0,0529
Global 11 LOCÍ 0,2310 0,1587 (0,08345-0,2490 0,0559
bli/91018 0,3266 0,2323 (0,0350-0,4661) 0,1968
bnlg1209 0,0467 0,1326 (00169-033021) 0.8901
bli/91287 0,0578 0,1097 (0,0156-0,2250) 0,7542
bnlg1070 0,0063 0,1186 (0,0013-0,2935) 0,9670
bli/91182 0,3256 0,2781 (0,0027-0,4790) 0,4326
bnlg1866 0,3198 0,0911 (00.2811) 0,0130.
DFI/91732 0,0050 0,0567 (00.1794) 0,9131
bnlg1360 0,2751 0,1017 (0,0022-0.2379) 0,0080"
bil/9252 0,2454 0.1826 (0,0339-0,3805) 0,2298
bil/91700 0,2937 0,1711 (0,0321-0,3373) 0,0919
bil/91165 0,1861 0,0730 (0,0016-0,1595) 0,0060"
'p<0.05; "p<0,01
En conclusión, el estadístico RST no constituye un estimador adecuado para el
análisis de la diferenciación entre las poblaciones incluidas en el presente estudio. Este
hecho oonvalida el análisis conjunto de los 18 Ioci mediante el estadístico F57,a pesar de
las discrepancias observadas en los patrones mutacionales. Asimismo, dado que las
diferencias en el tamaño de los alelos no resultan informativas, la utilizacióndel estadistico
(óp)2 (GOLDSTEINet al. 1995) como medida de la distancia genética entre poblaciones es,
por consiguiente. inapropiada.
81
Como paso previo al cálculo de los índices F31y con el propósito de determinar su
significación, se utilizó el test exacto de Fisher para analizar la homogeneidad de la
distribuciónde frecuencias génicas entre poblaciones.
Las diferencias entre las frecuencias alélicas resultaron altamente significativas
para todos los pares de poblaciones. No obstante, al efectuar eI análisis discriminando la
contribución de cada Iocus a la diferenciación total, se observó un marcado nivel de
variación entre las diferentes comparaciones de a pares (Tabla 11). Mientras que para el
par de poblaciones 6313-6473 el 94% de los locí variables (16/17) mostraron diferencias
significativas en su composición génica, en el caso de los pares 6167-6485 y 6485-6480
esta cifra se redujo a tan sólo 6% (1/17). Si bien el significado de esta variación no es
evidente, una explicación posible es la existencia de heterogeneidad en el poder
discriminante de los marcadores estudiados. Asi, aquellos con poder más alto serán
capaces de detectar diferenciación,aún cuando esta sea muy baja e imperceptible para losdemás Ioci.
Uno de los factores potencialmente involucrados con la capacidad de discriminación
es el número de alelos. En efecto, el único Iocus en el cual se observó diferenciación
significativa para los pares 6167-6485 y 6485-6480 fue bnlg1360, cuyo número de alelos
es el más alto entre todos los marcadores estudiados.
Dado que las diferencias en las frecuencias alélicas resultaron estadísticamente
significativas para todos los pares de poblaciones comparados, los índices FST
correspondientes fueron considerados significativamente distintos de cero (Tabla 11).
Asimismo, estos resultados fueron confirmados a través de la significación de los indices
mediante permutaciones.
EI análisis de la estructura poblacional reveló que la variación entre poblaciones
constituye el 14.6% de la variación total. Los valores de diferenciación más altos
corresponden a los pares que incluyen a la población 6473 de la raza Altiplano (F51:
0,1686-0,3659), en tanto que los más bajos provienen de las comparaciones entre las
poblaciones 6480, 6485, 6484 y 6167, pertenecientes a las razas Amarillochico, Amarillo
grande, Blanco y Altiplano (FST:0,0263-0,048) (Tabla 11).
La diferenciación promedio entre la raza Pisingallo (6313) y el conjunto de
poblaciones integrantes del Complejo Andino (6476, 6480, 6484, 6167,6473, 6485) fue de
0,230, mientras que Ia diferenciación promedio entre estas últimas y la población
correspondiente a la raza Orgullo Cuarentón (6482) fue de 0,148. Asimismo, la
diferenciación entre las poblaciones de Pisingallo y Orgullo Cuarentón estudiadas resultó
de 0,1675.
82
Resultados
Por último, al analizar la relación entre el grado de diferenciación genética (Fsï) y
distancias geográficas mediante el test de Mantel no se observó asociación alguna entre
ambas variables (ver Tabla 14 para detalle de distancias geográficas entre pares de
poblaciones).
Tabla 11. Diferenciación génica entre poblaciones del NOA. Las casillas sombreadascorresponden a los loci en donde se observaron diferencias significativas en las frecuenciasalélicas de los pares de poblaciones considerados. T.C.S.= total de comparaciones condiferencias significativas tras la corrección de Bonferroni.
Poblaciones FST I Locuscomparadas Numero de Alelos
global
n p p p p p b b b b b b b b b b b T.c h h h h h n n n n n n n n n n n C.
:1), l I I I / l I I l I I S.536252393332‘1’32337 9 7 9 9 7 1 0 2 2 0 1 8 7 3 5
0 6 1 0 8 7 8 6 3 6 20 5 8 9 7 0 2 6 2 0
6 7 5 5 5 8 10 13 13 8 8 22 12 16 5 31 9
6473-6167 0,1686" 86473-6485 0,1998” 126473-6480 0.2239” 136473-6484 0,1980" - 96473-6476 0,2303" 136473-6313 0.3659" 166473-6482 0,2944" 1461 67-6485 0,0381 ** 16167-6480 0.0467" 46167-6484 0,0380” 46167-6476 0,0778" 46167-6313 0,2279” 146167-6482 0.1332" 126485-6480 0,0263“ 16485-6484 0,0408” 36485-6476 0,0718" 56485-6313 0,1956" 136485-6482 0,1 164" 116480-6484 0.0480" 76480-6476 0.0627" 86480-6313 0.1951" 146480-6482 0,1157“ 126484-6476 0,0955" 76484-631 3 0,2407” 156484-6482 0,1533" 146476-631 3 0,1599" 116476-6482 0,0748” 76313-6482 0,1673“ 13
T.C.S. 14 17 10 13 3 12 20 17 23 16 13 23 13 21 8 2-5 17'p < 0,05; **p<o,o1.
83
R3. RELACIONES INTRA E INTER REGIONALES
R3.1. El Noroeste argentino
El retículo de NJ resultante del análisis de agrupamíento no permite reconocer un
patrón claro de asociación entre ninguna de las poblaciones analizadas, siendo la
característica más distintiva el alto grado de diferenciación exhibido por las poblaciones
6313 (Pisingallo) y 6473 (Altiplano) (Figura 9).
La partición que presenta mayor apoyo (94,7%) divide al retículo en dos grupos: el
primero conformado por 6313, 6482 y 6476; y el segundo, integrado por 6480, 6485, 6484,
6167 y 6473.
Si bien la ausencia de raíz para el árbol considerado impide la delimitación de
grupos monofiléticos, la disposición en el retículo de las dos poblaciones de Amarillo chico
no es compatible con la monofiliade la raza, cualquiera sea el enraizamiento propuesto. En
el caso de Altiplano, en cambio, las dos poblaciones analizadas podrían llegar a constituir
un grupo monofilético, aunque con un valor de apoyo de ramas inferioral 70%.
R32. El Noroeste argentino y su inserción en el continente americano
Como se mencionó previamente, la incorporación de las razas de maiz del NOA al
marco provisto por las investigaciones de Matsuoka y col. (2002b) (ver introducción,
sección l3.2; Materiales y Métodos, sección M242.) debió ser llevada a cabo a través del
análisis de genotipos multilocus individuales, los cuales fueron definidos en base a los 10
loci SSR comparables entre ambos sets de datos. La metodologia convencional, basada
en el uso de las frecuencias alélicas poblacionales, no pudo ser aplicada debido a las
características del muestreo realizado por dichos autores (1 a 2 individuos por localidad).
6473
6313
Figura 9. Árbol de Neighbor-joining obtenido en base a la distancia genética de Neientrepares de poblaciones. Los números sobre las ramas indican los valores de bootstrapping(1000 pseudoréplicas). 6473, 6167: raza Altiplano;6484, 6476: raza Amarillochico; 6480: raza
Amarillogrande; 6485: raza Blanco; 6482: raza OrgulloCuarentón; 6313: raza Pisingallo.
R3.2.1. Reconstrucción en base a métodos fenéticos
Como aproximación inicialal análisis multilocus, se construyó un árbol de Neighbor
joining incluyendo únicamente a los individuos del NOA (N=136) y considerando el número
total de Ioci (18).
La Figura 10 muestra el árbol sin raíz resultante, enraizado arbitrariamente a fin de
facilitar la visualización de los distintos grupos. En términos generales, los agrupamientos
obtenidos no reflejan la pertenencia de los individuosa sus respectivas poblaciones, siendo
6313 (Pisingallo) y, en menor medida. 6473 (Altiplano) las únicas excepciones. Todos los
individuos de la raza Pisingallo se encuentran contenidos dentro del mismo grupo, mientras
que sólo uno de los integrantes de 6473 aparece mezclado con un conjunto de terminales
pertenecientes a 6167 (Altiplano).Las poblaciones restantes presentan un patrón disperso,
sin observarse ninguna asociación prevaleciente.
Las medidas de apoyo de ramas resultaron bajas en todos los casos e inferiores al
50%. una situación que ha sido frecuentemente descripta al utilizar individuos como
terminales (ESTOUPet al. 1995; ROSENBERGet al. 2001).
Con el propósito de determinar si el uso conjunto de marcadores con diferentes
patrones mutacionales podia haber afectado la reconstrucción obtenida. el procedimiento
se repitió incluyendo sólo los Ioci cuya dinámica es consistente con el modelo de
mutación de a pasos (9 loci ), o bien, sólo los Ioci que no ajustan estrictamente al modelo
(9 Iocr).En ambos casos, el patrón obtenido resultó similar al hallado para el total de loci.
La aparente falta de resolución hallada puede ser interpretada como una limitación
del método de distancia para representar las relaciones entre individuosy su pertenencia a
diferentes niveles jerárquicos. No obstante, esta estrategia ha sido eficiente en la
diferenciación de poblaciones humanas, especies de peces y en la identificaciónde linajes
intraespecifícos de insectos (BOWCOCKet al. 1994; ESTOUPet al. 1995; ROQUESet al. 1999).
Por lo tanto, la inconsistencia de los agrupamientos con la delimitación poblacional también
puede contemplarse como una consecuencia de los bajos niveles de diferenciación entre
las poblaciones en estudio.
Al considerar en forma conjunta las poblaciones del NOA y los individuos
correspondientes a las restantes razas de América estudiadas por Matsuoka y col. (2002b)
(N=329), nuevamente se observó una preponderancia de agrupamientos mixtos,
conformados por individuos provenientes de distintas poblaciones o regiones (Figura 11).
Las regiones fueron definidas por Matsuoka y col. (2002b) en base a las áreas de
procedencia de cada una de las razas, estableciendo las siguientes categorías: Caribe
86
Resultados
(Car), Este y Centro de Estados Unidos (ECEU); Sudoeste de los Estados Unidos (SOEU);
Guatemala y Sur de México (GuaSM), Tierras altas de México (TAMex),Tierras Bajas del
Norte y Oeste de México (TBNOMex); Complejo Andino (CA); y Otros Sudamericanos
(OSA).
En concordancia con lo hallado en el análisis de las razas del NOA, los individuos
de la raza Pisingallo (6313) mantuvieron su cohesión, asociándose a un grupo compuesto
principalmente por representantes de las razas nativas de Estados Unidos. Del mismo
modo, todos los individuos de la población 6473 (Altiplano),con excepción de uno de ellos,
siguieron conformando un único grupo que presentó asociación con un conjunto de
individuos del NOAy del Complejo Andino, pertenecientes a diferentes razas.
Figura 10. Árbol de Neighbor-joining generado a partir de las distancias basadas en el
número de alelos compartidos (DAc)entre pares de individuos del NOA,utilizando 18 Ioci
SSR. El reticulo original fue enraizado arbitrariamente a fin de facilitar la visualización de los
grupos. Los valores de bootstrap resultaron inferiores al 50% en todos los casos. La
designación de las terminales representa el número de individuo y su población de origen
según se indica en la leyenda.
88
6473 - Altiplano
6167 - Altiplano
6476 - Amarillo chico
6484 - Amarillo chico
6480 - Amarillo grande
6485 - Blanco
6482 - Orgullo Cuarentón
6313 - Pisingallo
Figura 11. Árbol de Neighbor-jolning generado a partir de las distancias basadas en el
número de alelos compartidos (DAC)entre pares de individuos del NOAy del continente
americano, utilizando 10 loci SSR. El reticqu original fue enraizado arbitrariamente a fin de
facilitar la visualización de los grupos. Los valores de bootstrap resultaron inferiores al 50% en
todos los casos. La designación de las terminales representa el número de individuo y su
población o región de origen. Car: Caribe; ECEU: Este y Centro de Estados Unidos; GuaSM:
Guatemala y Sur de México; TAMex: Tierras altas de México; TBNOMex: Tienas Bajas del
Norte y Oeste de México; NOMex: Norte de México; SOEU: Sudoeste de los Estados Unidos;
OSA: Otras Sudamericanos; CA: Complejo Andino.
90
I6473I6167-6476I6484-6480-6465I6462I6313-Matsuokaycol.
AltiplanoAltiplanoAmarillochicoAmarillochicoAmarillograndeBlancoOrgulloCuarentónPlslngallozoozb
TireTire
Figura11
J,
TAMex-G TBNOMex-11 TAMex-T TBNOMex-Z TAMex-19 {>7—82'TBNOMex-1
/18;?
¡-TBNOMeX-17 ‘-TBNOMex-1O
GuaSM-3 TBNOMex-S
R3.2.2. Reconstrucción en base al método bayesiano
La primera etapa del análisis consistió en determinar el patrón de estructuración
considerando únicamente los individuos del NOA y los 18 Ioci microsatélites tipificados en
este estudio. Se analizaron todos los individuos en forma conjunta, sin dar información
acerca de su población de origen, ni del número total de poblaciones involucradas.
El número de unidades panmlcticas o “poblaciones” (K) no pudo ser establecido
en forma inequívoca por observarse en forma concomitante al incremento de K, un
constante incremento en la probabilidad de los datos, expresada como Ln (D/K), aún
cuando se obtenían patrones de estructuración triviales de acuerdo con los lineamientos
para la elección de K establecidos por Pritchard y col. (2000) (Tabla 12) (para detalle de los
lineamientos, ver Materiales y Métodos, sección M2.4.2.2.). En dichas instancias, la
documentación del software STRUCTURE sugiere considerar el valor más pequeño de K
que conserve la mayor estructura posible.
Utilizando este criterio, y mediante el seguimiento de la distribución de los individuos
en los diferentes grupos a lo largo de las sucesivas particiones, el número de poblaciones
obtenido fue K=6 . Para K > 6, diferentes repeticiones de un mismo K mostraron distintos
patrones de asignación de individuos,de modo tal que en cada una de ellas el nuevo grupo
quedaba conformado por un conjunto aleatorio de individuos, sin observarse estructura
real.
Un comportamiento similar fue observado al estudiar separadamente los nueve Ioci
con ajuste al modelo SMM y los nueve Ioci con patrón mutacional diferente del modelo
de a pasos. Cabe destacar que en este último grupo, el valor óptimo de K pudo ser
identificado en base al parámetro Ln (D/K),ya que el mismo alcanza una meseta para K=6,
mostrando tan sólo ligeras fluctuaciones para Ksuperiores (Tabla 12).
En la Figura 12 se muestra la representación gráfica de las particiones obtenidas
para los sucesivos valores de K utilizando los tres sets de datos (Total de loci, Ioci SMM,
Ioci no SMM). En todos los análisis que se presentan a continuación, la pertenencia de los
individuos a una población (K) se determinó fijando un valor arbitrario del 60%. Esto es,
aquellos individuos en cuyo genoma la contribución de cualquiera de las poblaciones
ideales identificadas por el método superara el 60% eran considerados integrantes de lamisma.
Para K=2, la muestra queda dividida en un grupo integrado por 6473 (Altiplano),
6480 (Amarillo Grande), 6484 (Amarillo chico), 6485 (Blanco) y 6167 (Altiplano), y otro
compuesto por 6482 (Orgullo Cuarentón) y 6313 (Pisingallo). La población 6476 (Amarillo
92
chico) muestra una condición mixta con individuos asignados a uno u otro conjunto. Al
pasar a K=3. la población 6313 se diferencia del resto; y lo mismo sucede con 6473
para K=4 y con 6482 para K=5.
Tabla 12. Estimación del número de poblaciones mediante el método Bayesiano para losindividuos del NOA. Ln (D/K)=logaritmo natural de la probabilidad de los datos dado K.
K Total de Loci Loci SMM Loci No SMM
Ln (D/K) Ln (D/K) Ln (D/K)
2 -6798,1 -4182.8 -2624,92 -6798,2 4182.9 -2625,22 —6798,4 -4182,4 -2625,83 -6571,2 -4029.8 -2625.83 -6563.0 4033.4 -2573,63 -6563,0 -4033,0 -2574J54 -6328,7 -3871,0 -2574.54 -6329,6 -3869.1 -2492,34 -6329,6 -3870,3 -2491,75 -6199.1 -3792,8 -2461,35 -6196.8 -3792,1 -2461,35 -6197,4 -3791.8 -2460.46 -6129,9 -3738,5 -2447.46 -6132,3 -3740,9 -2448.26 -6132,3 -3740,6 -2445.87 -6078.1 -3711.1 -2446.27 -6074.7 -3709.4 -2449,17 -6075,6 -3709.2 -2448,38 -6026.3 -3709,2 -2435.18 -6029.2 -3665.7 -2445.6
8 -60_30.8 -3671.6 -2435f,1
Alcanzado K=6, los resultados permiten identificar cinco entidades: 1) 6473; 2)
6476; 3) 6482; 4) 6313 y 5) 6484, 6480, 6485, 6167. A diferencia de lo que ocurre en los
cuatro primeros grupos, en donde la mayor parte de los individuos es asignado a su
conjunto de pertenencia con valores cercanos al 100%, los integrantes del grupo 6480
6484-6485-6167 se presentan como compuestos por la contribución mayoritaria de dos
“poblaciones ideales". La interpretación biológica del patrón obtenido puede no resultar
evidente. Sin embargo, teniendo en cuenta el comportamiento observado para K < 6. es
posible inferir entre ellos una mayor afinidad que con respecto a los provenientes de las
demás poblaciones, dando sustento a su inclusióndentro de la misma entidad.
Tres puntos interesantes se destacan del análisis precedente. En primer lugar, las
entidades obtenidas coinciden con la delimitaciónde poblaciones realizada a priorien base
a la localidad de origen. De hecho, al estudiar independientemente cada población
“geográfica” mediante el método bayesiano, no se encontraron evidencias de estructura
para ninguna de ellas.
93
18Loci9LociSMM9LoclNoSMM
K=4 K=5
Í ALJ
K=8Figura12.AnillnlndolaestructurapoblnelonlldeInrundalNOAmodlantoolmétodobnynlano.Cadalíneavenlcalrepresentaaunlndlvlduo.Los coloresIndlcanlacontrlbuclóndecadaunadelaspoblacloneslnferldasenbasealmétodobayeslano(K)enlaconstltuclóndelosgenomaslndlvldualee.Las líneasnegrasconsignanlosIímltesentrelaspoblacionespreviamentedefinidasenbasealossltlosdecolecclón.1:6473;2:6476;3:6482;4:6480:5:6484;e: 6167:7:6313:8:6485.
En segundo lugar, tanto el análisis de los loci SMM como el de los Ioci no SMM,
arrojaron resultados semejantes a los obtenidos con el total de locí (Figura 12). No
obstante, probablemente debido a su mayor variabilidad, el patrón de estructuración
observado para los primeros (Ioci SMM) resultó mucho más claro y aproximadamente
idéntico al del conjunto total. Este hecho avala la utilización de un set reducido de Ioci,
integrado por 9 SMM y 1 no SMM, es decir, sólo aquellos compartidos con el trabajo de
Matsuoka y col. (2002b), para el análisis de las poblaciones del NOA en el contexto de las
razas del continente americano.
Por último. el esquema de fragmentación obtenido concuerda con lo observado en
el árbol de NJ construido a partir de las distancias genéticas de Nei (Figura 9), agrupando
por un lado a 6473, 6484, 6167, 6485 y 6480, y por el otro a 6482 y 6313, mientras que
6476 muestra una constitución intermedia (Figura 12). Este hecho pone de manifiesto la
utilidaddel método bayesiano para la inferencia de relaciones, aún cuando sólo se dispone
de los genotipos individuales.
Según los resultados de Matsuoka y col. (2002b), la aplicación del método
bayesiano al análisis de 99 Ioci microsatélites en razas de maíz del continente americano
dio lugar a la discriminación de tres grupos: 1) razas nativas de Estados Unidos; 2) razas
nativas del Complejo Andino; 3) razas nativas de Méxicoy resto de Sudamérica.
Previo a la integración de los datos correspondientes a las poblaciones del NOAy
con el objeto de verificar la consistencia de los ganos definidos frente a la reducción del
número de marcadores. se repitió el análisis de las razas descriptas por los mencionados
autores, considerando únicamente aquellos loci comparables entre ambos conjuntos de
datos (N=10 loco. Al evaluar distintos valores de K, considerando un rango similar al
utilizado para los 99 Ioci (K = 2-5), solamente pudo diferenciarse el grupo correspondiente
a las razas de Estados Unidos (ECEU; SOEU), en tanto que no fue posible identificar a los
individuos pertenecientes al Complejo Andino (CA).
La incorporación al análisis de los individuos del NOA permitió detectar un patrón de
estructuración más definido. Dado que la identificación del valor óptimo de K fue
nuevamente dificultosa siguiendo el criterio probabillstico (Tabla 13), la interpretación de
los resultados se centró principalmente en Ia información obtenida a partir del patrón de
fragmentación generado por los sucesivos incrementos de K(Figura 13).
95
Tabla 13. Estimación del número de poblaciones mediante el método bayesiano para losindividuos del NOA y otras razas de América". Ln (D/K)= logaritmo natural de laprobabilidad de los datos dado K.
K 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5
(D/K) -13087 43087 43088 42639 -12640 42640 42462 -12472 -12459 -12274 -12271 -12278
'Datos tomados de Matsuoka et al.(2002b).
Las poblaciones del NOA 6473, 6480, 6484, 6485 y 6167 integran un grupo que
incluye, además, al 80% de los individuos asignados a la categoría Complejo Andino (CA)
por Matuoka y col (2002b). Asimismo, 4 individuos del conjunto Otros Sudamericanos
(OSA) presentan porcentajes de pertenencia a este grupo superiores al 70%, sin hallarse
ninguna caracteristica particular (raza, altitud, localidad de muestreo) a la cual pudiera
atribuirse este hecho.
Para valores de K entre tres y cuatro, Ia población 6313 (Pisingallo) se diferencia
del resto de las poblaciones del NOA, conformando un agrupamiento que también
incorpora a gran parte de los individuos pertenecientes a las razas nativas de los Estados
Unidos, previamente clasificados en los grupos Este y Centro de EEUU (ECEU) y
Sudoeste de EEUU (SOEU). Para K=5, los individuos de Pisingallo se escinden, pasando a
formar parte de un nuevo conjunto cuya representación en el resto de los grupos definidos
a priori.ya sean regiones o poblaciones, es generalmente baja o nula.
A partir de K=3. es posible advertir la diferenciación de 6482 (Orgullo Cuarentón)
con respecto a las restantes razas del NOA. Para K=4 y K=5, aparece un nuevo grupo
constituido principalmente por los individuos de 6482 y un grupo de ejemplares de la zona
del Caribe (Car).
La comparación entre el esquema de relaciones obtenido a partir del método de
distancias y los resultados del análisis bayesiano, parece indicar una mayor sensibilidad
de este último método para Ia identificación de grupos con características genéticas
similares. Esto es, mientras que el único patrón aparente en el árbol de NJ fue la
asociación entre Pisingallo y las razas nativas de Estados Unidos (Figura 11), la afinidad
entre ciertas razas del NOA y los integrantes del Complejo Andino, como asi también, la
afinidad de Orgullo Cuarentón con el germoplasma del Can'be. no pudo ser detectada poresta vía.
96
H 1,2 T43! ¡4 llS 1,5 17
Figura 13.Análisis de la estructura poblacional de las razas del NOAy otras razas de Américamediante el método bayesiano. Cada línea verticalrepresenta a un individuo.Loscolores indicanla
contribución de cada una de las poblaciones identificadas en la constitución de los genomas
individuales. Las líneas negras consignan los límites entre poblaciones. K=número de poblaciones
inferidas en base al método bayesiano. 1: Caribe (Car); 2: Este y Centro de Estados Unidos (ECEU);
3: Guatemala y Sur de México (GuaSM); 4: Tierras altas de México (TAMex);5: Tierras Bajas del Norte
y Oeste de México (TBNOMex);6: Norte de México (NOMex); 7: Sudoeste de los Estados Unidos
(SOEU); 8: Otros Sudamericanos (OSA); 9: Complejo Andino (CA); 10: 6473; 11:6476; 12: 6482; 13;
6480; 14: 6484; 15: 6167; 16; 6313; 17: 6485.
R4. ASOCIACIÓN ENTRE VARIABLES GENÉTICAS, CITOGENÉTICAS Y ALTITUD
Siete de las ocho poblaciones incluidas en el presente estudio forman parte del
gradiente altitudinal descripto por Rosato y col. (1998) para 16 poblaciones del NOA (ver
Introducción. sección l4.4.3; Materiales y Métodos, secciones M1.1. y M2.5.), en las cuales
el número medio de cromosomas B por individuo(É ) se correlaciona positivamente con la
altitud. Teniendo en cuenta únicamente las poblaciones aqui estudiadas, la asociación
positiva entre altitud y número medio de cromosomas B por individuo fue nuevamente
verificada através de un análisis de correlación simple no paramétrico (rs=0.75 ; p< 0.05).
R4.1.Correlación entre frecuencias alelicas y número medio de Bs por individuo
La existencia de asociación positiva entre Ia frecuencia de una variante alélica dada
y el número medio de Bs por individuo puede ser interpretada como consecuencia del
desequilibrio de Iigamiento entre el alelo en cuestión y el / los genotipos responsables de
la alta tasa de transmisión de los cromosomas supemumeran'os en la población en estudio.
Por otro lado, dicha asociación también puede presentarse si, al igual que sucede oon los
cromosomas B, la frecuencia del alelo considerado varía en relación con la altitud.
El análisis de correlación mediante el índice de Spean'nan no permitió detectar
asociación alguna entre frecuencias alélicas y É . Asimismo, tampoco se hallaron
asociaciones significativas entre frecuencias alélicas y altitud. En todos los casos el nivel
de significación fue ajustado de acuerdo con la corrección de Bonferroni para
comparaciones múltiples (a’=0.0003, 183 comparaciones).
R42. Diferenciacióngenética y gradientes altitudinales
Los patrones de variación clinal pueden originarse como consecuencia de procesos
demográficos, o bien, ser producto de fenómenos selectivos. Una forma de discernir entre
ambas posibilidades consiste en estudiar los patrones de estructuración resultantes del
análisis de marcadores neutros. como lo son los Iocimicrosatélites.
Con el objeto de establecer la relación entre la composición genética de las
poblaciones y las diferencias cromosómicas observadas. se utilizó el test de Mantel
(RAYMOND8. ROUSSET1995) a fin de determinar Ia existencia de asociación entre: a)
distancia geográfica y diferencia en el número medio de cromosomas B por individuo; b)
diferenciación genética y diferencia en el número medio de cromosomas B por individuo;
c) diferenciación genética y distancia altitudinal.
98
Para los Iocí microsatélites, el grado de diferenciación genética entre poblaciones
fue estimado a través del índices de fijación F51de Wright (WRIGHT1965; WRIGHT1978).
En la Tabla 14 se presentan los valores de FSTpara cada par de poblaciones. asl como la
distancia geográfica, distancia altitudinal
poblaciones.
y el módulo de la diferencia de E entre
A lo largo de una transecta altitudinal. la distancia geográfica se encuentra siempre
positivamente oorrelacionada con la distancia altitudinal. Sin embargo, las poblaciones aquí
analizadas no se distribuyen estrictamente sobre una transecta, razón por la cual es
necesario evaluar
independientemente de la relación entre distancias geográficas y diferencia de É .
relación entre distancias altitudinales y diferencia de
Tabla 14. Diferenciación genética, distancia geográfica, distancia altitudinaly diferencias en el número promedio de Bs por individuo entre laspoblaciones pertenecientes al gradiente altitudinal descripto por Rosato ycol. ‘19982.
Poblaciones
6167-64856167-64806167-64846167-64766167-63136167-64826485-64806485-64846485-64766485-6313
6476-6482631 3-6482
FST Distancia Distancia Diferencias en el númeroammdmar Geográfica medio de cromosomas B
(m) (Km) por individuo“
0,0381" 330 151 0,5010.0467" 580 172 0.3020.0380" 990 184 1.0900.0778" 1310 220 1,0390.2279“ 1400 649 0.6090.1332" 2090 429 1.1720.0263" 250 22.3 0.1990.0408“ 660 32,4 1,5910.0718" 980 67,4 1,5400.1956" 1070 509 1,1100.1164" 1760 282 1,6730.0480" 410 13,2 1.3920.0527" 730 48.4 1.3410.1951" 820 491 0,9110,1157" 1510 265 1,4740.0955" 320 35,1 0,0510.2407" 410 477 0.4810.1533" 1100 253 0.0820.1599" 90 440 0.4300.0748" 780 218 0,1330,1673" 690 240 0,563
aLosvalores presentados corresponden al módulo de las diferencias. " p< 0,01
É
99
En el caso de hallar asociaciones significativas en ambas comparaciones, la
relación entre diferencia de É y cada una de las distancias debe ser examinada
nuevamente a través de un análisis de correlación parcial o test de Mantel parcial.
Mientras que la correlación positiva y significativa entre distancia altitudinal y
diferencia de É fue nuevamente corroborada. esta vez mediante el test de Mantel. los
resultados del análisis de correlación entre matrices revelaron ausencia de asociación
entre distancia geográfica y diferencia de É . Este hecho permite descartar la incidencia de
la autocorrelación espacial como factor explicativo de Ia asociación entre altitud y número
promedio de B por individuo.
Del mismo modo, no se encontró asociación alguna entre diferencia de É y
diferenciación genética, como asi tampoco, entre diferenciación genética y distancia
altitudinal, indicando que el grado de similitud genética entre un par dado de poblaciones
es independiente de su similitud en el contenido de cromosomas B y de la distancia
altitudinal entre ellas.
DISCUSIÓN
FÏgïi¿i _2‘,
“Vi-"Mí:
Raza Altiplano
D1. DIVERSIDAD GENETICA EN LAS RAZAS DE MAÍZDEL NOA: IMPLICANCIAS
PARA LA CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA
La producción de maíz es una de las actividades económicas más importantes de
nuestro país. La República Argentina disputa con China el segundo puesto en el ranking de
exportadores mundiales, precedida únicamente por Estados Unidos, quien encabeza la
lista con una participación entre cuatro y cinco veces supen’ora la de ambos países.
La gran mayoría de los híbridos ofrecidos por las empresas semilleras
multinacionales, cultivados a su vez por gran parte de los productores locales. han sido
desarrollados sobre una depauperada base genética, a partir del reciclaje de un reducido
número de llneas de elite. entre las que se encuentran representantes de dos de los más
importantes grupos heteróticos de EE.UU., BSSS (Iowa Synthetic StiffSta/k) y Non-BSSS
(Non- Iowa Synthetic Stiff Sta/k) (TALLER8. BERNARDO2004).
La restringida amplitud genética del germoplasma comercial de maíz limita las
posibilidades de selección a largo plazo, como asl también la capacidad de reacción frente
a condiciones de estrés biótico y abiótioo. Desde hace más de una década, las
investigaciones realizadas en las áreas de mejoramiento y conservación de recursos han
puesto de manifiesto la importancia de la incorporación de nuevas fuentes de diversidad.
tales como razas nativas y sus variedades derivadas. como estrategia para compensar la
pérdida de variabilidad y como fuente de alelos originales potencialmente útiles desde el
punto de vista agronómico (GOODMAN1990; HOISINGTONet al. 1999; WARBURTONet al.
2002; TARTERet al. 2003; TALLER& BERNARDO2004). En la práctica, sin embargo, sólo seis
de las más de 300 razas nativas del continente americano se encuentran actualmente
representadas en los cultivos comerciales de los Estados Unidos. y solamente una de ellas
es de uso vigente (TARTERet al. 2003).
La escasa utilización en los programas de mejoramiento de los más de 50.000
accessions disponibles en los bancos de semillas se debe. principalmente. a las
deficiencias en la evaluación y documentación de sus caracteristicas agronómicas y
genéticas (HOISINGTONet al. 1999). Paralelamente, mientras que la caracterización
molecular de un gran número de líneas endocriadas ha sido extensamente documentada
(MUMM& DUDLEY1994; SMITH 1997; SENIOR et al. 1998; MATSUOKAet al. 20023; LlU et al.
2003), el relevamiento de la diversidad contenida en el germoplasma tropical y subtropical
es aún incompleto (REIFet al. 2004).
En la República Argentina el número de razas nativas descriptas hasta el momento
alcanza un total de 56, 34 de las cuales corresponden a la región Noroeste del pals (NOA)
102
(CAMARAHERNANDEZ8. MIANTEALZOGARAY1997). Algunas de ellas han sido incluidas en
estudios citogenéticos y moleculares a gran escala, en su mayor parte vinculados con los
materiales autóctonos de América Latina (MCCLINTOCKet al. 1981; SANCHEZG. et al. 2000;
MATSUOKAet al. 20023). En todos ellos, el número de individuos analizados por localidad
ha sido muy bajo, mientras que los registros de estudios regionales o poblacionales
exhaustivos son prácticamente inexistentes.
La cuantificación y descripción de la variabilidad genética de los materiales
autóctonos de Ia República Argentina es un requisito indispensable para su integración en
futuros planes de mejoramiento. La disponibilidad de información proveniente del análisis
de loci SSR en razas nativas de maíz procedentes de todo el rango de distribución en el
continente americano (MATSUOKAet al. 2002b). como asi también del relevamiento de la
variabilidad microsatélite en un amplio espectro de lineas endocriadas (MATSUOKAet al.
20023; LIUet al. 2003), permite comparar los resultados obtenidos en el presente trabajo
de tesis. integrándolos en diferentes niveles de análisis. Los resultados de Matsuoka y col.
(2002b) proveen un marco de referencia para la cuantificación de los niveles de variabilidad
observados en las razas nativas del NOAen el contexto de las razas de América, en tanto
que los datos correspondientes a las lineas permiten establecer una medida de la
potencialidad del germoplasma autóctono en futuros planes de mejoramiento.
A pesar de su condición marginal con respecto a las áreas centrales de la
distribución, las razas nativas aqui estudiadas mostraron altos niveles de variación,
exhibiendo, además, un total de 15 alelos cuya presencia no ha sido registrada
previamente para ninguna otra zona de América del Sur.
La diversidad contenida en las seis razas del NOA analizadas es del 63% de lo
encontrado en el conjunto de razas de América y del 78% de Io hallado para las lineas
(Figura 4). Los porcentajes presentados provienen de la comparación de las estimas de
diversidad calculadas únicamente en base a los Iocicompartidos entre el presente trabajo y
los estudios de Matsuoka y col. (2002b) y Liu y col. (2003) (N=10). No obstante, al incluir
en el cálculo el total de loci analizados (N=18), los niveles de diversidad de las razas del
NOA disminuyeron notablemente con respecto a lo encontrado en las líneas y razas de
América. El seguimiento de los trabajos de variabilidad microsatélite en líneas endocriadas
provee un indicio acerca del origen de esta aparente inconsistencia. Mientras que las
primeras contribuciones coinciden en informar un número promedio de alelos por locus de
entre 5 y 7 (SENIOR et al. 1998; MATSUOKAet al. 2002a; WARBURTONet al. 2002), en el
trabajo de Liu y col. (2003) el mismo parámetro asciende a 20,9. Si bien es cierto que el
número de líneas analizadas en este último caso es mayor que en los anteriores, la
pn'ncipalfuente de discrepancia reside en el conjunto de marcadores utilizados. Este hecho
103
pone en evidencia la marcada heterogeneidad en los niveles de variación de los diferentes
Ioci SSR e insta a tomar con cautela las estimas de diversidad provenientes de distintos
conjuntos de loci microsatélites.
La presencia de alelos compartidos entre las razas del NOA y líneas endocriadas
(6/131), y su ausencia en las razas nativas descriptas por Matsuoka y col. (2002b), puede
derivar de la incorporación reciente de germoplasma comercial por parte de los
cultivadores locales, o bien, ser una evidencia del uso de variedades y/o razas
provenientes del Sur de Sudamérica en la generación de las líneas.
Los patrones de distribución de la variabilidad observados en las razas nativas del
NOA parecen apoyar este últimoescenario. Dos de los seis alelos compartidos entre las
líneas y razas del NOA, el alelo 140 del locus bnlg1182 y el alelo 177 del Iocus bnlg1360
(nomenclatura según esta tesis), se encuentran en sólo una de las 260 líneas comparadas
(F6 y CML322, respectivamente), haciendo poco probable su incorporación al
germoplasma nativo a través de materiales comerciales. Estas observaciones son
compatibles con el incierto origen de algunas lineas, surgidas tras una compleja sucesión
de cruzamientos entre múltiples variedades de polinización libre cuya identidad no ha sido
debidamente documentada.
Por otro lado, los tres alelos exclusivos encontrados en las razas del NOAtampoco
pueden ser explicados por el aporte de variedades comerciales, ya sea en tiempos
recientes como durante los últimos 50 años, dado que las 260 líneas comparadas
comprenden tanto aquellas de importancia agronómica en Ia actualidad, como otras que
han sido relevantes en el desarrollo históricode las mismas y que actualmente han entrado
en desuso (LIUet al. 2003).
Liu y col. (2003) interpretaron el gran número de alelos exclusivos hallados en las
lineas (556/2039, 99 Iocr)como consecuencia de la alta tasa de mutación que caracteriza a
los loci microsatélites de maiz (7,7x10'4 —5,1x10'5)(VIGOURouxet al. 2002). Sin embargo,
dos de estos alelos fueron también hallados en las razas del NOA.Teniendo en cuenta el
reducido número de Ioci comparables entre ambos conjuntos de datos (N=10), es de
esperar que al considerar un mayor número de Ioci y/o razas, el número de alelos
exclusivos de las lineas se vea disminuido. Por lo tanto, es posible que la gran proporción
de alelos exclusivos no sea el resultado de una alta tasa de mutación, sino que refleje, en
cambio, la falta de caracterización de las razas nativas involucradas en el origen de laslíneas.
104
Discusión
La ampliación de la base genética de los programas de mejoramiento a través de la
incorporación de razas nativas ha sido un argumento frecuentemente empleado, aunque
raras veces sustentado con datos concretos. Recientemente, Liuy col.(2003) compararon
el número de alelos presentes en 260 líneas con el número de alelos esperado si éstas
representaran una muestra aleatoria de las razas nativas descriptas por Matsuoka y col.
(2002b). Los resultados del análisis revelaron un déficit en el número de alelos observados
en relación con las predicciones teóricas. ya que las líneas representan sólo el 80 por
ciento de la diversidad presente en las razas. La presencia de alelos exclusivos en las
poblaciones del NOA indica que los niveles de variación contenidos en las razas nativas
son superiores a lo inicialmente supuesto por Liu y col. (2003); hecho que evidencia la
naturaleza aún fragmentaria de la caracterización genética de las razas nativas de maíz,
especialmente en las latitudes más extremas de la distribución.
A pesar de su potencialidad. Ia incorporación de germoplasma tropical o
semitropical en los híbridos comerciales ha sido resistida debido a las dificultades de
adaptación a climas templados. Pese a ello, experimentos de campo han demostrado el
buen desempeño y productividad alcanzado por líneas derivadas de accessions tropicales
provenientes de América Latina, previamente insensibilizadas a Ia duración del fotoperíodo
mediante su cruzamiento con líneas adaptadas a climas templados (TARTERet al. 2003).
Del mismo modo, Lewis y Goodman (2003) obtuvieron resultados similares al analizar el
rendimiento, humedad del grano y resistencia al vuelco en los híbridos resultantes del
cruzamiento entre Ia línea templada N0262A y diversas lineas 100% tropicales con
capacidad de adaptación a climas templados.
Considerando la ubicación latitudinal y las caracteristicas climáticas de los sitios de
cultivo de las razas del NOA aquí estudiadas, particularmente en las áreas de mayor
altitud, su adaptabilidad a las condiciones de cultivo en zonas templadas podría resultar
eventualmente mayor a la de los materiales tropicales y subtropicales empleados hasta elmomento.
Antes de abordar la discusión de los aspectos poblacionales de las razas
analizadas, es necesario esclarecer algunos términos. Las denominadas “poblaciones”de
maíz pueden originarse artificialmente como parte de Ia conservación en bancos de
germoplasma, o bien, corresponder a las parcelas de cultivo tradicional que integran las
actividades agrícolas regionales de diversos paises de América Latina. En ambos casos, la
dinámica resultante se encuentra fuertemente influenciada por la actividad humana. No
obstante, mientras que las primeras tienen como objetivo principal la conservación de la
105
Discusión
variabilidad,las segundas se perpetúan debido a las necesidades de subsistencia de suscultivadores.
Las entidades conservadas en el CIMMYT(Centro Internacional de Mejoramiento de
Maíz y Trigo) bajo el nombre de "poblaciones" corresponden a diferentes mezclas de
complejos raciales coleccionados en la década del '60. Reif y col. (2004) estudiaron 23
poblaciones pertenecientes al CIMMYT,agrupándolas en cuatro categorias de acuerdo al
origen del germoplasma involucrado en la generación de cada una de ellas: Tropical (7
poblaciones), Semi-tropical de maduración intermedia (7 poblaciones), Semi-tropical de
maduración temprana (5 poblaciones) y Templado (4 poblaciones). A nivel regional, el
número de alelos encontrados en el NOA(A:10,2)es superior a Io hallado en cualquiera de
las mencionadas categorías. Asimismo, al considerar individualmente cada población, las
razas nativas analizadas en el presente estudio resultaron más variables que las 23
poblaciones del CIMMYT,con excepción de la población 6473 de la raza Altiplano, en
donde los niveles de variación fueron más reducidos. La menor variabilidad de 6473
concuerda con su condición marginal, ya que la misma se encuentra en un extremo del
área de distribución de los cultivos y a 3.600 m de altura.
A diferencia de lo observado para el número de alelos, la heterocigosis promedio
esperada fue similar tanto a nivel poblacional como regional (He: 0,45-0,66). Io cual sugiere
que el número de alelos en frecuencias significativas es el mismo en las poblaciones del
CIMMYTy razas del NOA, y que, en estas últimas, el número de alelos aumenta a
expensas de variantes en baja frecuencia.
Pressoir y Berthaud (2004) describieron los niveles de diversidad genética en
poblaciones locales de razas nativas de maíces blancos del Valle de Oaxaca, México. De
acuerdo con lo esperado para poblaciones correspondientes a las áreas centrales de la
distribución, los valores de heterocigosis esperada (He: 0,65-0,72) fueron levemente
superiores a lo encontrado en el presente estudio (Tabla 5).
Por último,cabe destacar que a pesar de tratarse de una especie domesticada, los
niveles de heterocigosis detectados en las poblaciones de maiz del NOA resultaron
similares a lo hallado en la recopilación de 104 estudios correspondientes a poblaciones
naturales de diversas especies de plantas (H920,61:l:0,21)(NYBOM2004)
En síntesis, los resultados presentados en este trabajo de tesis demuestran que, a
pesar de representar sólo una fracción de los materiales autóctonos de la República
Argentina, las razas nativas aquí descriptas constituyen una importante fuente de
diversidad para ampliar la base genética de los programas de mejoramiento. En particular,
su capacidad de adaptación a condiciones extremas de aridez, temperatura y altitud podria
106
resultar de suma importancia para la identificación de genes de tolerancia a sequía, frio yradiación ultravioleta.
Dz. MICROSATÉLITES Y ESTUDIOS EVOLUTIVOS
Los marcadores microsatélites se han convertido en la metodología preferida de
gran parte de los estudios evolutivos y poblacionales realizados en nuestros días. Su alto
grado de polimorfismo, facilidad de interpretación y naturaleza neutra han llevado a
utilizarlos en un amplio rango de organismos y problemáticas, incluyendo análisis de
paternidad, identificaciónforense, estimas de flujo génico y diversidad genética.
Los estadísticos desarrollados para el análisis de loci microsatélites. como por
ejemplo el índice de diferenciación poblacional RST(SLATKIN1995) y la medida de distancia
genética ópz (GOLDSTEINet al. 1995). asumen que los mecanismos mutacionales que dan
origen a la variabilidad observada siguen un modelo de mutación de a pasos (SMM)
(KIMURA8. OHTA1978). A pesar de que la utilización de estas medidas es una práctica
frecuente en los estudios poblacionales, son escasos los trabajos que se han ocupado de
verificar el ajuste al modelo SMM,especialmente en plantas.
En este sentido, el estado del conocimiento actual aún presenta algunos
interrogantes: ¿son todos los IociSSR susceptibles de ser analizados a través del modelo
de mutación de a pasos? En vistas de las mayores proporciones de homoplasia generadas
por este modo de evolución, ¿es más conveniente utilizar aquellos Ioci que ajusten al
modelo de alelos infinitos cuando se desea comparar entidades con mayor divergencia?
¿De qué modo influye la gran variabilidad en el comportamiento de los Ioci en Ia detección
de patrones a nivel del genoma como un todo? En los párrafos subsiguientes se discutirán
los aportes generados por el presente trabajo de tesis en relación con cada uno de estos
puntos.
Los marcadores SSR incluidos en este estudio pueden ser divididos en tres
categorías: I) aquellos cuyo ajuste al modelo de mutación de a pasos fue confirmado a
través de un análisis de progenie (bn/91018, bnlg1209, bnlg1287, bnlg1070, bnlg1182,
bnlg1866, bnlg1732, bnlg1360, bnng52) (VIGOUROUXet al. 2002); II) aquellos cuyo patrón
mutacional fue inferido en base al análisis de distribución de tamaños alélicos (phi029,
phi059, phi121, phi127) (MATSUOKAet al. 2002a); Ill) aquellos cuyo modo de evolución no
habia sido determinado con anterioridad al presente estudio (nc135, phi037, phí069,
bnlg1700, bnlg1 165).
107
Discusión
Los alelos correspondientes a los 9 Ioci que integran los grupos ll y lll fueron
secuenciados a fin de establecer su modo de evolución y seleccionar el estadístico más
adecuado para el análisis poblacional. El análisis de los datos de secuencia reveló la
ausencia de ajuste al modelo SMMen 7 de los 9 loci examinados, como asl también una
alta incidencia de inserciones, deleciones y sustituciones en las regiones flanqueantes al
motivo de repetición (Figura 5). Si bien los 7 marcadores en cuestión podrian considerarse
casos excepcionales dentro del universo de los Ioci SSR de maíz, la concomitante falta de
ajuste en 46 de los 48 Ioci estudiados por Matsuoka y col. (2002a) parece indicar que las
desviaciones con respecto al modelo de evolución de a pasos son mucho más abundantes
que lo generalmente supuesto. En favor de esto último, diversos autores han señalado la
ocurrencia de fenómenos semejantes tanto en otros grupos de plantas (SALTONSTALL
2003; ADAMSet al. 2004; HALEet al. 2004) como en animales (ANGERS& BERNATCHEZ1997;
ORTI et al. 1997; COLSON& GOLDSTEIN1999).
Los patrones mutacionales encontrados en el grupo ll mostraron ciertas
discrepancias con respecto a lo inicialmente inferido por Matsuoka y col. (20023). El Iocus
phi121 ilustra el caso más evidente. Mientras que los tamaños alélicos hallados coinciden
con lo esperado para un focus SMM,el motivo microsatélite fue de difícil identificación en la
secuencia nucleotldica, presentando tan sólo dos a cuatro repeticiones contiguas (Figura
5a). Del mismo modo. la distribución de tamaños alélicos del Iocus phi059 es compatible
con un patrón mixto en donde las diferencias residen tanto en la región microsatélite
propiamente dicha, como en las regiones flanqueantes. Sin embargo, la mayoria de las
diferencias entre alelos se ubican en las zonas contiguas al motivo de repetición, según lo
demuestra el análisis de secuencias (Figura 5f). En este último caso, al igual que en los
Ioci phi127 y phi029, las discordancias observadas no influyen sobre la elección de los
estadísticos a emplear en el análisis poblacional, ya que ambos estudios coinciden en un
patrón no-SMM. Por el contrario. ejemplos como el del Ioci phi121 evidencian las
limitaciones del análisis de distribución de tamaños alélicos como herramienta para la
identificación de loci SMM.
La interrupción de un motivo microsatélite a causa de mutaciones puntuales,
inserciones o deleciones, tiene como consecuencia una reducción de los niveles de
polimorfismo debido a una menor probabilidad de “slippage” o "deslizamiento" de la enzima
ADN polimerasa (ESTOUP& CORNUET1999). Un argumento similar permite explicar la
correlación positiva observada entre la longitud de la zona de repetición y la tasa de
mutación (ESTOUP& CORNUET1999), lo cual se traduce en una menor variabilidad de
aquellos Ioci cuyos alelos poseen un bajo número de repeticiones.
108
Discusión
En efecto, la baja variabilidad hallada para el Iocus phi121 coincide con un motivo
de repetición interrumpido por dos mutaciones puntuales que, a su vez, restringen la
extensión de las repeticiones contiguas a un máximo de cuatro unidades (Figura 5a).
El tamaño de la unidad de repetición es también un factor determinante de los
niveles de variación, estando la tasa de mutación inversamente relacionada con el número
de bases que integran el motivo microsatélite (CHAKRABORTYet al. 1997; ESTOUP &
CORNUET1999). En humanos, la tasa de mutación de los loci SSR con unidades de
repetición constituidas por 2 pb es entre 1.5 y 2 veces mayor que la de los motivos de 3 y
4 pb no relacionados con enfermedades (CHAKRABORTYet al. 1997). En líneas generales,
los loci microsatélites aquí estudiados presentan un comportamiento semejante a lo
descripto en humanos, con un número de alelos mucho mayor en los loci dinucleotldicos
(Tabla 4, Tabla 11).
Una de las consecuencias del modelo SMM,o de sus generalizaciones derivadas,
es el surgimiento de variantes idénticas en estado pero no idénticas por descendencia, es
decir, la existencia de convergencia en el tamaño alélico.
A pesar de su evidente falta de ajuste al modelo SMM, los loci phi121, nc135.
phi037, phi069, phi029, phi059 y phi127 no pueden considerarse exentos de los efectos de
la homoplasia, dado que Ia gran abundancia de sustituciones, inserciones y deleciones en
las zonas flanqueantes a Ia región microsatélite también puede producir el surgimiento
independiente de alelos de igual tamaño.
El Iocus phi059 permite examinar en detalle Ia influencia de los fenómenos de
convergencia en los patrones de variación observados, debido a que se dispone de la
secuencia de más de un representante por variante alélica. El único ejemplo claro de
convergencia surge de Ia comparación del alelo 152 proveniente de la raza 6482 con el
correspondiente a la linea Tzi10, en donde ambas variantes alcanzan igual tamaño merced
a dos eventos de inserción independientes (Figura 5f).
En la mayoria de los casos, sin embargo, las diferencias entre las secuencias de los
alelos de igual longitud provenientes de diferentes poblaciones, lineas, subespecies y
especies de Zea, consistieron en un número variable de sustituciones puntuales en las
regiones contiguas al motivo microsatélite (Figura 5f). Estas sustituciones confirman la
coexistencia de diferentes secuencias nucleotidicas dentro de cada una de las categorias
alélicas definidas en base a la longitud de los electromorfos. No obstante, la información
disponible no permite determinar si se trata de un proceso de divergencia a partir de un
antecesor común de igual tamaño o de un caso de convergencia. En la Figura 14 se
esquematizan los dos posibles escenarios para explicar la variación observada. De
109
Discusión
acuerdo con la primera hipótesis, todas las variantes de igual longitud compartirían un
antecesor común, conformando un grupo monofilético.Según la segunda hipótesis, los
AldoL-Pob.A
Figura 14. Hipótesis de relación entre variantes de secuencia de alelos de igual longitud. lui L:longitud en pares de bases; Ü Si : sitio polimórficocorrespondiente a la posición i, O Sj: sitio polimórficocorrespondiente a Iaposiciónj. Loscolores indicanloscambios de estado de carácter.
alelos de igual longitud no necesariamente comparten un antecesor común, es decir, el
surgimiento de variantes de igual tamaño se produjo independientemente al menos dos
veces, como es el caso del alelo 152 del locus phi059.
EI impacto de cada una de las situaciones planteadas sobre las estimas de
diferenciación poblacional es potencialmente distinto. Mientras que en el primer caso el
tamaño alélico conserva parte de la señal fllogenética, en el segundo, esta señal puede
llegar a desaparecer por completo. La discriminación entre ambas hipótesis requiere de la
evaluación de los alelos en un contexto fllogenético. En ausencia de esta información, la
contribución relativa de uno u otro proceso y su efecto sobre el conjunto de Ioci aquí
analizados sólo puede inferirsede manera especulativa en base a las caracteristicas de loslociconsiderados.
Bajo el modelo SMM, la tasa de mutación que da lugar a nuevos alelos es varios
órdenes de magnitud más alta que la de las mutaciones puntuales en la región
flanqueante, por lo tanto, la convergencia en el tamaño alélico es más probable que la
convergencia en el patrón de sustitución nucleotídica (hipótesis 2). Un ejemplo de ello es el
estudio de la variación del locus microsatélite Ots-2 en el salmón Oncorhynchus
tshawytscha (BLANKENSHIPet al. 2002) . En esta especie las secuencias contiguas al motivo
de repetición definen cinco haplotipos, dentro de los cuales se distribuyen la mayoría de lostamaños alélicos encontrados.
110
Discusión
Los Iocino-SMM,en cambio, abarcan un amplio espectro de situaciones, resultando
muy dificil hacer un balance entre la probabilidad de cambio en la longitud del alelo, a
causa de inserciones y deleciones, y la ocurrencia de mutaciones puntuales.
En las poblaciones de maíz estudiadas, los locí que resultaron compatibles con el
modelo SMMde acuerdo con el análisis de secuencia (bn/91700 y bnlg1650) no mostraron
variabilidad alguna en las regiones flanqueantes al motivode repetición, indicando una baja
incidencia de homoplasia, o al menos de homoplasia detectable sensu Estoup y col.
(2002). Por su parte, la heterogeneidad de los patrones de variación observados en los loci
no-SMM y la falta de un contexto fllogenétioo apropiado, no permiten sacar conclusiones
acerca de la incidencia de la homoplasia en cada uno de ellos.
Teniendo en cuenta la información proveniente de las pruebas de progenie, los
datos correspondientes a las secuencias nucleotldicas obtenidas en esta tesis, y los
niveles de variación observados para cada uno de los Ioci, es posible distinguir dos grupos
de marcadores dentro del conjunto de loci analizados. Por un lado, los Iocide la serie bnlg,
compuestos únicamente por motivos de repetición de 2 pb, presentan un alto grado de
polimorfismo y ajustan al modelo SMM. Por el otro, tanto los marcadores de la serie phi
como el de la serie nc, con motivos de repetición de entre 2 y 5 pb, muestran niveles de
variación más bajos y ausencia de ajuste al modelo SMM.
Si bien es cierto que el número de Ioci analizados en esta tesis puede no ser
representativo de cada una de las series, el alto grado de polimorfismode Ia serie bnlg fue
previamente verificado en la evaluación de los 99 Ioci estudiados por Matsuoka y col.
(2002b) y Liuy col. (2003). Asimismo, como se mencionara anteriormente, el análisis de 46
Ioci de la serie phi mostró también que sólo dos eran compatibles con el modelo SMM,
siendo uno de ellos el Iocus phi121 (MATSUOKAet al. 2002a). El patrón de variación
observado por Matsuoka y col. (2002a) llevó a proponer la denominación lRR (lndel Rich
Regions, del inglés regiones ricas en inserciones y deleciones) para este tipo de
marcadores, resaltando asi el origen de las diferencias con respecto a los loci SSR
convencionales. A pesar de ello, gran parte de estos marcadores siguen siendo
ampliamente utilizados en la caracterización de líneas y poblaciones de maíz (VVARBURTON
et al. 2002; REIF et al. 2004; SANTACRUZ-VARELAet al. 2004).
Independientemente de la identidad de las series, es evidente que existe una gran
heterogeneidad entre los IociSSR y que la aplicación de los estadísticos desarrollados bajo
los supuestos del modelo de mutación de a pasos no siempre está justificada.La inclusión simultánea de ambas clases de Ioci microsatélites en estudios
poblacionales, como es el caso del presente trabajo de tesis, plantea la necesidad de
111
considerar ciertos aspectos. Para los Ioci no-SMM, las únicas herramientas de análisis
disponibles son las medidas de diferenciación y distancia que sólo tienen en cuenta Ia
identidad de los alelos (índice de fijación FST,distancia genética de Nei o Ds). Los Ioci
SMM,en cambio. requieren de la elección entre las medidas mencionadas y aquellas que
incorporan, además, la información del tamaño alélico (R51, óuz). Cuando la tasa de
mutación es baja, o bien cuando el tiempo de divergencia entre las entidades consideradas
es corto. ambos tipos de estimas convergen en un mismo valor (HARDYet al. 2003). En
esta situación. tanto los loci no-SMM corno los SMM pueden ser reunidos en un mismo
análisis considerando exclusivamente la identidad de los alelos. De hecho. aún cuando
todos los marcadores evolucionen siguiendo el modelo de mutación de a pasos, las
medidas FSTy Ds resultan más indicadas por presentar menor varianza (BALLOUX8. LUGON
MOULIN2002; HARDYet al. 2003).
Por el contrario. cuando la tasa de mutación es alta, o el tiempo de divergencia es
mayor. FSTy Dstenderán a subestimar las diferencias en los loci SMM, con lo cual no será
posible analizar las dos clases de locidentro del mismo marco teórico.
La prueba propuesta por Hardy y col.(2003) evalúa la contribución de los procesos
mutacionales en la diferenciación poblacional a través de la comparación de los indices RST
y FST.permitiendo establecer así, cuáles son los estadísticos más apropiados para el
análisis de los datos en estudio (para más detalles ver Materiales y Métodos, sección
M2.3.5.1.). El análisis de los Ioci SMM correspondientes a las poblaciones de maíz del
NOA reveló la ausencia de diferencias significativas entre las estimas globales de ambos
parámetros (Tabla 10), indicando que, en general, las diferencias en el tamaño de los
alelos no constituyen una medida del grado de divergencia entre las poblaciones. Estos
resultados avalan el análisis conjunto de los 18 Iocitipificados, a pesar de las discrepancias
detectadas en los patrones mutacionales subyacentes.
Las evidencias presentadas en los párrafos precedentes permiten arribar a tres
conclusiones principales: 1) no todos los Ioci SSR de maiz evolucionan de acuerdo con el
modelo SMM;2) la falta de ajuste al modelo SMM no garantiza la ausencia de fenómenos
de convergencia, y por ende. tampoco asegura la mayor idoneidad de los Ioci no-SMM
para comparaciones interespecíficas; 3) el análisis conjunto de Ioci SMM y no-SMM puede
distorsionar las medidas de diferenciación y distancia genética, a menos que se verifique
una baja incidencia de los procesos mutacionales en la divergencia de las poblacionesconsideradas.
En resumen. los resultados obtenidos dan cuenta del gran número de factores
involucrados en la variación de los marcadores microsatélites y ponen de manifiesto la
112
Discusión
importancia de una exhaustiva evaluación y selección de los mismos como paso previo a
su incorporación en estudios poblacionales.
Ds. DISTRIBUCIÓN DE LA VARIABILIDADGENÉTICA
D3.1.Estructura genética intrapoblaclonal
En las especies vegetales, el sistema de fecundación es uno de los factores de
mayor influencia sobre la estructura genética de las poblaciones. Distintos niveles de
autofecundación pueden dan lugar a patrones endogámicos. alterando las proporciones
genotlpicas esperadas bajo Ia hipótesis de panmixia.
El maiz es una especie diclino-monoica de fecundación cruzada y polinización
anemófila. Las inflorescencias masculinas coronan la planta en el ápice del tallo y
generalmente maduran en forma más temprana que las femeninas, ubicadas en el ápice
de los primordios de las ramas laterales. En concordancia con lo esperado para
organismos de fecundación cruzada, cinco de las ocho poblaciones analizadas mostraron
un patrón general de ajuste a las proporciones de Hardy-Weinberg (Tabla 9). Por el
contran'o, las poblaciones 6476. 6482 y 6480 evidenciaron un exceso de homocigotas (FIS:
0,134-0,220).
Diversos argumentos han sido utilizados para explicar el exceso de homocigotas en
especies fundamentalmente alógamas: errores experimentales, agrupamiento espacial de
individuos, selección y apareamiento preferencial.
Reif y ool. (2004) analizaron la variabilidad microsatélite en 23 poblaciones
artificiales conservadas en el CIMMYT,encontrando en todas ellas una alta proporción de
loci que mostraban un exceso significativode homocigotas (14-40%), aún bajo un diseño
experimental especialmente concebido para asegurar Ia unión al azar de gametas. Estos
desvlos fueron interpretados como consecuencia de errores experimentales relacionados
con la tipificación del los Ioci SSR. Sin embargo, dichos errores dificilmente explican los
resultados similares obtenidos mediante RFLPs (DUBREUIL8. CHARCOSSET1998) y
marcadores isoenzimátioos (KAHLERet al. 1986)
Dubreuil y Charcosset (1998) sugirieron que las diferencias en el tiempo de
maduración de inflorescencias masculinas y femeninas podrian llevar a un apareamiento
preferencial regido por la reproducción entre plantas de igual tiempo de floración. Según
esta hipótesis, sólo aquellos Ioci directamente relacionados con el periodo de floración, o
113
Discusión
muy próximamente ligados a ellos, presentarán desviaciones con respecto a la panmixia,
generando un patrón heterogéneo entre los locianalizados.
Pressoir y Berthaud (2004) estudiaron poblaciones de maíz mantenidas por
cultivadores locales del Valle de Oaxaca, México, utilizando marcadores SSR. La mayor
parte de las poblaciones mostraron un exceso de homocigotas, exhibiendo, además,
diferencias significativas en los índices F.s obtenidos a partir de los diferentes Iocí. En
congruencia con lo esperado según la hipótesis de apareamiento preferencial, las
poblaciones con mayores desvíos presentaron una correlación negativa entre el grado de
parentesco y la divergencia promedio en el tiempo de floración. Del mismo modo, los tres
loci SSR cuyo índice F.s fue significativamente más alto, phi011, phi024 y phi452693,
resultaron estar ubicados en las proximidades de tres genes involucrados en la floración,
dwarfB. ¡ndetenninate1 y dwarf9 (COLASANTIet al. 1998; GALE& Devos 1998; THORNSBERRY
et al. 2001).
En las poblaciones del NOA para las cuales los FISglobales resultaron significativos.
la heterogeneidad observada en el comportamiento de los Ioci es consistente con los
efectos del apareamiento preferencial, y no así con un posible efecto de subestructuración
que debería afectar al genoma en su conjunto. De hecho, los dos Ioci responsables de los
desvíos en la población 6476 de la raza Amarillochico, phi037 y bnlg1700, se encuentran
en las mismas regiones cromosómicas que phi011 y phi024, respectivamente. Según el
mapa de ligamiento Pioneer Composite 1999 1 (www.maizegdb.org), la distancia entre
phi011 y dwarf8 es de aproximadamente 11 cM (centimorgans), mientras que la distancia
con respecto a indetenninate1 es de cerca de 14 cM. Notablemente, el locus phi037 está
localizado a tan sólo 7 cM de ¡ndeterminate1. aunque a una distancia de casi 40 cM con
relación a dwarf8.
Por su parte, phi024, está ubicado en una región del cromosoma cinco considerada
sínténica de la zona dwarfB-¡ndeterminate1 y a cerca de 34 cM de dwarf9, una posible
duplicación de dwarf8. AI igual que en el caso anterior, la distancia del Iocus bnlg1700 con
respecto a este gen (19 cM)es también menor que la del marcador analizado por Pressoir
y Berthaud (2004).
En las poblaciones 6482 (Orgullo Cuarentón) y 6480 (Amarillo Grande), los Ioci
involucrados en los desvíos no parecen presentar asociación con ninguno de los genes de
floración identificados hasta el momento. con excepción del Iocus phi037 en la población6482.
Además de los fenómenos biológicos, existen otras causas que pueden explicar la
heterogeneidad en el comportamiento de los Iocí. Los altos niveles de polimorfismo que
caracterizan a los loci microsatélites resultan en una mayor sensibilidad de las pruebas
114
utilizadas para medir el ajuste a las proporciones de Hardy-Weinberg. No obstante, la
significación estadistica no siempre está acompañada de un significado biológico (HEDRICK
1999). Así, los Ioci con mayor número de alelos serán capaces de detectar desviaciones
que no serán perceptibles al analizar marcadores menos variables. El exceso de
homocigotas observado en los Ioci bnlg1070 y bnlg1360 probablemente refleje una
situación de esta naturaleza dado el alto número de alelos presentes en cada uno de ellos
(Tabla 9, Tabla 11).
03.2. leerenclación genética entre poblaciones
Antes de abordar el análisis de la diferenciación poblacional, cabe destacar algunos
aspectos que confirman la idoneidad del indice F51como estima de diferenciación. Por un
lado, la baja incidencia de los procesos mutacionales en la divergencia de las poblaciones
del NOA, sugerida por Ia ausencia de diferencias significativas entre los valores globales
de R31y F51 calculados a partir de los Ioci SMM (Tabla 9), es consistente con el on'gen
reciente del maiz domesticado (ca. 10.000 AP) y su aún más reciente introducción en
América del Sur (ca. 2.000-5.000 AP). Asimismo, la presencia en la zonas centrales de la
distribución de la mayor parte de los alelos descriptos (Tablas A1-A18 del Apéndice),
parece indicar que este patrón no sólo se verifica en el NOA,sino que también se extiende
a todo el rango de distribución de las razas nativas.
El maíz, al igual que otras especies domesticadas, constituye un caso particular en
donde la dinámica de las poblaciones se encuentra inexorablemente vinculada a la
actividad humana. Sin embargo, el movimiento de polen y semillas sigue siendo un factor
determinante de la estructura genética de las poblaciones. Como se mencionara
anteriormente, la polinización es anemófila, siendo la capacidad máxima de propagación
del orden de los 30 m en dirección del viento (JAROSZet al. 2003). La dispersión de
cariópsides, en cambio, puede alcanzar distancias prácticamente ilimitadas, ya que se
produce fundamentalmente a través del intercambio entre los cultivadores.
Como se señalara previamente, el grado de diferenciación entre las poblaciones de
razas nativas del NOA fue estimado a través del índice F31de Wright (1965). El alto grado
de polimorfismo de los Ioci SSR conduce a la disminución del máximo alcanzable por el
indice F37 (HEDRICK1999; BALLOUX& LUGON-MOULIN2002). Debido a ello, los estudios
realizados en otros grupos de plantas constituyen una herramienta sumamente valiosa
para la evaluación de los resultados obtenidos en esta tesis.
115
Discusión
Los niveles de diferenciación detectados a través del análisis de Ioci SSR en
especies autógomas mostraron un valor promedio de FST=0,48 (CHAUVETet al. 2004;
NYBOM2004). Por el contrario, los niveles de estructuración observados en los trabajos de
variabilidad microsatélite correspondientes a distintas especies arbóreas y herbáceas de
fecundación cruzada resultaron muy inferiores, con rangos de FSTentre 0,008 y 0,076
(MUIRet al. 2004; VIARDet al. 2004 HEUERTZet al. 2004; NYBOM2004). En concordancia
con estas diferencias, el reciente relevamiento de los niveles de diferenciación obtenidos
para poblaciones oo-especlficas de especies vegetales utilizando marcadores SSR dio
como resultado un F51promedio de 0,26t0,17 (NYBOM2004).
En el maiz, el único registro documentado de la distribución de la variabilidad de Iocí
microsatélites en poblaciones locales de razas nativas es el ya mencionado estudio de
Pressoir y Berthaud (2004). Las poblaciones analizadas por estos autores pertenecen al
mismo complejo racial, incluyendo diversos maices de grano blanco, y ocupan un área de
aproximadamente 100 Km. Las estimas de FST obtenidas a partir de 11 Ioci SSR
mostraron que la mayor parte de la variabilidad distribuida entre poblaciones derivaba de la
comparación entre parcelas de un mismo poblado (F57:0,011), mientras que tan sólo una
pequeña fracción oonespondía a la diferenciación entre localidades (FST:0,003).
A diferencia de lo hallado en las poblaciones del valle de Oaxaca, el componente de
variación inter-poblacional correspondiente al NOA alcanzó un valor de 14,6%. Factores
económicos y culturales relacionados con la dinámica de intercambio regional podrlan
considerarse suficientes para explicar la mayor diferenciación observada en las
poblaciones del NOA. No obstante, Ia inclusión de poblaciones correspondientes a distintos
complejos raciales podria constituir, asimismo, una fuente adicional de divergencia.
En base a las evidencias citogenéticas, morfológicas e históricas disponibles, las
poblaciones del NOAincluidas en este estudio pueden ser tentativamente asignadas a tres
grupos raciales diferentes (CAMARA HERNANDEZ & MIANTE ALZOGARAY, com. pers.;
MCCLINTOCKet al. 1981; ROSATO1997). Éstos son: a) los maices del Complejo Andino,
definido por McCIintock y col. (1981) de acuerdo con el número y posición de bandas
heterocromáticas o knobs (poblaciones 6473, 6167, 6476, 6484, 6480, 6485); b) los
maices correspondientes a las denominadas razas “incipientes”, surgidos como
consecuencia de Ia incorporación de germoplasma comercial en los materiales autóctonos
(población 6482); c) los maices reventadores o popcoms (población 6313).
En concordancia con las afinidades propuestas, el patrón de estructuración obtenido
permite distinguir, a su vez, tres grupos principales. El primero está compuesto por las
poblaciones 6484, 6480, 6485 y 6167, pertenecientes a las razas Amarillochico, Amarillo
grande, Blanco y Altiplano (FST:0,0263-0,048), incluyendo también a la algo más
116
diferenciada población de Altiplano 6473 (F37: 0,1686-0,2303) (Tabla 11). Si bien los
niveles de diferenciación exhibidos por Ia población 6473 en las comparaciones de a pares
pueden llevar a poner en duda su inclusión dentro de este grupo, el análisis de la
distribución alélica reveló que los variantes halladas en 6473 conforman un subconjunto de
lo encontrado en 6167, 6484, 6476, 6480 y 6485. Por otro lado, los valores de FST
obtenidos son compatibles con lo esperado para poblaciones marginales, fuertemente
influidas por los efectos de la den'va. De este modo, los reducidos niveles de variabilidad y
los relativamente altos niveles de diferenciación encontrados en 6473 concuerdan con la
condición marginal de esta población, previamente sugerida por Rosato y col. (1998) en
base a su localización geográfica.
Por su parte. los dos grupos restantes están integrados por un único representante:
la población 6482 de la raza Orgullo Cuarentón. con niveles de diferenciación intermedios
con respecto al primer grupo; y la población 6313 de la raza Pisingallo, que presenta los
valores de FSTmás altos en todas las comparaciones de a pares (Tabla 11).
Los índices FST pueden ser interpretados como una medida del flujo génico entre
poblaciones que han alcanzado el equilibrio entre migración y deriva bajo un modelo isla
continente, o bien, como una medida del tiempo de divergencia entre poblaciones
totalmente aisladas (NlELSEN& SLATKIN2000). En la práctica, sin embargo, los métodos
convencionales no permiten determinar hasta qué punto las similitudes genéticas
observadas son consecuencia del flujo génico actual, o si por el contrario reflejan una
asociación histórica entre las poblaciones consideradas. La gran coincidencia entre los
niveles de diferenciación obtenidos y el origen racial de las poblaciones estudiadas sugiere
que la asociación histórica entre ellas es un factor determinante de la estructura
poblacional hallada.
117
Discusión
D4. LAS RAZAS DEL NOA Y su RELACIÓNCON LOS COMPLEJOS RACIALES DE
AMÉRICA
Las relaciones evolutivas entre las razas de maiz han sido establecidas
fundamentalmente en base a las características morfológicas y origen geográfico de las
mismas (para una revisión exhaustiva ver GOODMAN& BROWN1988). Desde el punto de
vista genético, uno de los primeros estudios en intentar establecer grupos naturales fue el
análisis de la composición cromosómica de las razas de América desarrollado por
McClintock y col. (1981). Posteriormente, diversos marcadores moleculares han sido
aplicados a la caracterización de las razas con el objetivo principal de cuantificar la
variabilidad genética, abordando sólo tangencialmente los aspectos relacionados con lasafinidades entre ellas.
Uno de los principales problemas para la interpretación de la información existente
es el enfoque regional, y en cierta medida fragmentario, de la mayor parte de los estudios
genéticos. Sumado a ello, las comparaciones entre regiones se ven distorsionadas por la
falta de homogeneidad en la nomenclatura de las razas, como así también en el concepto
de raza utilizado por los especialistas de cada pals (GOODMAN& McK. BIRD1977). Asi,
mientras que la diversidad genética de las razas de México (DOEBLEYet al. 1985b),
Guatemala (BRETTINGet al. 1990), o Sudoeste de los EE.UU. (DOEBLEYet al. 1983b), por
citar algunos ejemplos, ha sido descripta en detalle, la integración de dichos datos no ha
ido más allá de referencias parciales entre los distintos trabajos. Como excepción a esto
último, las contribuciones realizadas por McClintocky col. (1981) y Matsuoka y col. (2002b)
resultan especialmente valiosas, dado que comprenden la totalidad del espectro de loscultivos autóctonos de maíz.
A pesar de las limitaciones mencionadas, algunos complejos raciales emergen
consistentemente a partir de los estudios morfológicos, citogenéticos y moleculares. En
particular, una de las entidades más frecuentemente reconocidas es el denominado
Complejo Andino (MCCLINTOCKet al. 1981) o Complejo Andino Central (GOODMAN& McK.
BIRD1977). Sus integrantes incluyen a la mayor parte de las razas andinas, principalmente
aquellas correspondientes a las regiones de altura que se extienden desde Ecuador hasta
Chile, y se caracterizan por poseer mazorcas más pequeñas y redondeadas, con granos
elipsoidales y coloreados de tipo harinoso (GOODMAN& McK. BIRD 1977). La raza
Pisingallo, o Písinkalla, también se encuentra asociada a regiones andinas de altura. Sin
embargo, su pertenencia al complejo no parece estar avalada por ninguno de los
caracteres utilizados en la delimitación del mismo, siendo habitualmente incluida dentro de
118
los maíces “reventadores” o popcoms del Sur de América (GOODMAN& McK. BIRD1977;
SANTACRUZ-VARELAet al. 2004).
Como ya se mencionara en las secciones precedentes, cuatro de las razas
analizadas en el presente estudio. Altiplano (6473), Amarillo Grande (6484), Amarillo chico
(6476. 6480) y Blanco (6485), pueden ser tentativamente asignadas al Complejo Andino en
base a sus características morfológicas (Cámara Hernández y Miante Alzogaray,
com.pers.) y citogenéticas (ROSATo1997). La población de Pisingallo (6313) puede ser
considerada parte del grupo de los reventadores de América del Sur. mientras que Orgullo
Cuarentón (6482) constituye una de las llamadas razas “incipientes”,surgida a partir de la
incorporación de germoplasma comercial a los materiales autóctonos.
Las relaciones obtenidas a partir del árbol de NJ construido considerando
únicamente las razas del NOA(Figura 9) son consistentes con los grupos propuestos, con
la posible excepción de 6476, que se asocia a 6482 y 6313 en la partición con mayor
soporte. Pese a no contradecir las afinidades sugeridas, los resultados de este análisis
son insuficientes para establecer el vinculo entre cada uno de los grupos y los
correspondientes complejos raciales.
El análisis conjunto de los individuos del NOA con los datos correspondientes a las
razas del continente americano (MATSUOKAet al. 2002b) permitió confirmar Ia pertenencia
de las poblaciones 6476. 6473, 6484. 6480 y 6485 al Complejo Andino (Figura 13). Este
patrón solamente pudo ser detectado a través del metodo bayesiano, y no así mediante
las reconstrucciones generadas en base a los métodos convencionales de distancia y
agrupamiento (Figura 11). Una situación similar se presentó al considerar la raza Orgullo
Cuarentón (6482), cuya afinidad con el germoplasma del Caribe sólo se manifiesta en el
análisis bayesiano (Figura 13). Un resultado particularmente sorprendente es la asociación
de los individuos de la población de la raza Pisingallo del NOA (6313) con el conjunto de
razas nativas originarias de EE.UU. A diferencia de los casos anteriores. esta relación fue
puesta en evidencia tanto por el análisis de distancia (Figura 11) como por el método
bayesiano (Figura 13).
De este modo, mientras que la inclusión de las razas Altiplano, Amarillo grande,
Aman'llo chico y Blanco dentro del Complejo Andino coincide con Io esperado, las
asociaciones observadas para Orgullo Cuarentón y Pisingallo resultan algo más difícilesde
interpretar.
Eventos relativamente recientes vinculados con los procesos de intercambio
agronómico y comercial permiten dar cuenta de Ia relación observada entre Orgullo
Cuarentón y las razas del Caribe. Por un lado, la raza caribeña Cuban Flintes considerada
producto de la introducción en Cuba de germoplasma argentino a principios del siglo XX
119
Discusión
(Hathaway (1957) citado en GOODMAN& BROWN 1988). Considerando Ia naturaleza
incipiente de la raza Orgullo Cuarentón, el patrón de asociación resultante del análisis
bayesiano podría ser fácilmente explicado asumiendo Ia existencia de algún tipo de
relación entre las variedades comerciales involucradas en el origen de dicha raza y las
introducidas en Cuba entre 1910 y 1930. Pese a ser tentadora, esta hipótesis no parece
ser apoyada por los resultados de Bretting, Goodman y Stuber (1987b). Según estos
autores, el análisis de Ia variabilidad enzimática de los materiales del Caribe, reveló un alto
grado de similitud entre todas las razas de la región, incluyendo a Cuban Flint, y la
ausencia de un vínculo evidente con un conjunto de maíces argentinos pertencientes al
grupo de los Catetos.
Por otra parte, Ia intervención en el surgimiento de Orgullo Cuarentón de algunas de
las variedades de maíz dentado antiguamente cultivadas en el cinturón maicero de EE.UU.,
muchas de ellas fuertemente influenciadas por la contribución de germoplasma del Caribe
(GOODMAN8. McK. BIRD 1977; GOODMAN& BROWN 1988), no puede ser descartada,
teniendo en cuenta que el origen de esta raza se remonta aproximadamente a la década
del '60 (CAMARAHERNANDEZ& MlANTEALZOGARAY,com. pers.).
Con respecto a la raza Pisingallo, Santacruz-Varela y col. (2004) describieronrecientemente las relaciones entre los maíces reventadores de América del Norte en base
a caracteres morfológicos, alelos isoenzimáticos y alelos microsatélites. El análisis incluyó,
además, diversas razas reventadoras de América del Sur, entre las que se cuentan las 4
entidades de origen argentino Pisingallo, Perlita, Periita Mediano y el renombrado
Argentine Pop. El árbol de NJ obtenido por dichos autores agrupó a las tres últimas con los
maíces reventadores de las tierras bajas de la región guaranltica (Argentina, Brasil y
Paraguay), conformando un cluster notablemente alejado de la raza Pisingallo, la cual
quedó incluida dentro del grupo de los maíces de ápice aguzado o “puntiagudos” (pointed)
junto con otros maíces latinoamericanos (Palomero Toluqueño, Canguil, Confite
Puntiagudo y Pisinkalla de Bolivia)y dos representantes de América del Norte (White Rice
Pop y Acoma Pueblo).
La morfología de las cariópsides y la distribución de frecuencias alélicas
correspondientes a los Iociphi127, phi121 y phi029 sugieren que la población de Pisingallo
(6313) analizada en el presente estudio también puede ser asignada al grupo de maíces
reventadores de ápice aguzado. Lamentablemente, los análisis de agmpamiento no
permiten confirmar la asignación propuesta debido a la escasa representación de los
maíces reventadores en el conjunto de datos utilizados para Ia comparación de las
poblaciones del NOAcon el resto de las razas del continente americano.
120
Discusión
Otro punto interesante del trabajo de Santacruz-Varela y col. (2004) es la afinidad
genética encontrada entre las razas reventadoras de ápice aguzado de América Latina
(LatinAmerican Pointed Popcom) y aquellas del mismo tipo, pero procedentes de América
del Norte (North American Pointed Rice Popcom), así como la estrecha relación entre
ambas y el conjunto denominado Norteamericano Temprano (North American Eariy), que
comprende a los primeros accessions de maíces reventadores ingresadas en los bancos
de germoplasma de EEUU. Por otro lado, la inclusión de las razas Tama Flint y Fairfax
Brown dentro del mismo cluster que los reventadores tempranos es particularmente
notable, ya que ninguna de ellas es de tipo popcom. Tama Flint representa a los maíces
cómeos y harinosos de Norteamérica (Northern Flints and Flours), mientras que Fairfax
Brown corresponde al complejo racial del Sudoeste de los EEUU (SANTACRUZ-VARELAet al.
2004). En forma análoga, la población 6313. el único maiz reventador incluido en este
trabajo, exhibe una clara asociación con dos grupos de razas nativas originarias de
EE.UU.: a) la categoría ECEU (Este y Centro de EE.UU.), fundamentalmente conformada
por los maíces cómeos y harinosos de Norteamérica; y b) la categoria SOEU (Sudoeste
de EE.UU.), en donde la mayor parte de sus integrantes pertenecen al complejo racial
Sudoeste (Figuras 11 y 13).
Las evidencias morfológicas, genéticas y arqueológicas disponibles (ver referencias
en SANTACRUZ-VARELAet al. 2004) permiten atribuir las similitudes entre los maíces
reventadores de ápice aguzado de todo el continente a la dispersión hacia el Norte y Sur
de América de una variante ancestral común proveniente de México en tiempos muy
anteriores a la conquista. Según McCIintock (1981), el germoplasma de tipo Pisingallo
habría sido introducido en América del Sur posteriormente al establecimiento del Complejo
Andino. pudiendo derivar tanto de las razas presentes en la zona central de México como
de otras con características similares procedentes de Guatemala. Otros autores, sin
embargo. han sugerido que los maíces reventadores de América del Sur habrían surgido
recientemente a partir de germoplasma originario de Paraguay, o bien, que habrian sido
desarrollados a fines de 1920 en las proximidades de la ciudad de Kansas, EE.UU., y
luego introducidos en el sur del continente (GOODMANa. MCK. BIRD1977).
Las marcadas discrepancias entre las cronologías propuestas, probablemente
reflejen la coexistencia de maíces reventadores de diferentes origenes en América del Sur.
Como ejemplo de ello, dos grupos visiblemente distintos pueden ser diferenciados entre los
maíces reventadores de la República Argentina. Un grupo más antiguo, típicamente
andino. relacionado con los maíces de la zona central de Méxicoy representado por la raza
Pisingallo; y otro aparentemente más reciente. asociado a las tierras bajas de la planicie
121
Discusión
mesopotámicO-chaqueña y representado por Argentine pop y las razas Perla y PerlitaMediano.
El patrón de distribución hallado es singulannente concordante con lo propuesto por
Horovitz (1935), quien sugirió que los maíces del Noroeste y de Ia planicie mesopotámico
chaqueña provendrían de dos centros de origen diferentes. coincidentes, a su vez, con la
regiones ando-peruana y austrO-brasileña de agricultura pre-hispánica.
DS. ADN ANTIGUO: UNA HERRAMIENTA PARA EL SEGUIMIENTO TEMPORAL DE
LOS PATRONES DE VARIACIÓN GENETICA
La preservación de ácidos nucleicos en restos fósiles, arqueológicos y ejemplares
de museo provee una herramienta única para la observación directa de la composición
genética de los organismos y poblaciones del pasado. Pese a su gran potencialidad, la
recuperación y amplificaciónde ADNa partir de este tipo de ejemplares presenta enormes
desafíos metodológicos debido a las pequeñas cantidades de ADN conservado en los
mismos, a su naturaleza básicamente fragmentaria y a las altas probabilidades de
contaminación (POINAR2003).
Desde sus comienzos en la década del '80, y tras el entusiasmo inicial ante la
perspectiva de obtener información genética a partir de ejemplares con millones de años
de antigüedad, una serie de estudios de gran repercusión, pero dudosa veracidad. llevaron
a cuestionar los resultados de esta nueva disciplina. Asi, la recuperación de una porción
del gen RbcL a partir un fósil de compresión del género Magnolia de entre 17 y 20 millones
de años de antigüedad, o la amplificación de un fragmento de ADNmitooondrial a partir de
restos de dinosaurio, resultaron ser. finalmente, contaminantes (ver COOPER8. WAYNE
1998; WAYNEet al. 1999). Las evidencias surgidas a partir de estudios empln'cos acerca de
la tasa de degradación de ácidos nucleicos sugieren que la conservación del ADN es
sumamente improbable una vez pasada la barrera de los 100.000 años (LINDAHL1993;
Hoss et al. 1996). Sin embargo, la reciente recuperación de ADN vegetal a partir de
sedimentos congelados de ca. 400.000 años parece indicar que los plazos de
preservación son aún superiores a Io inicialmente supuesto (WILLERSLEVet al. 2003).
La definición de un conjunto de estrictos criterios de autenticidad (COOPER&
POINAR2000; POINAR2003), cuya aplicación se ha convertido en una condición sine qua
non de las investigaciones en ADN antiguo (ADNa). ha contribuido a restablecer la
credibilidad de la disciplina, otorgándole nuevo impulso.
122
Discusión
En las plantas, el número de estudios realizados en el campo del ADNa es
notablemente inferior a lo descripto en animales y humanos. A pesar de la gran
disponibilidad de especimenes fósiles y subfósiles —restos de madera, hojas, espinas y
granos de polen- la recuperación de ácidos nucleioos sólo ha sido posible en una pequeña
fracción de los materiales examinados (PARDUCOI& PETIT2004). Los estudios de mayor
trascendencia han sido llevados a cabo utilizando la secuencia de cloroplasto
correspondiente al gen RbcL y han estado principalmente vinculados con la caracterización
de la flora asociada a restos sedimentan'os de diferente antigüedad (WILLERSLEVet al.
2003), o con la reconstrucción de los hábitos alimenticios de humanos y animales a través
de la identificación de los restos vegetales presentes en coprolitos de distinto origen
(POINARet al. 2001; HOFRElTERet al. 2003).
A pesar de su mayor facilidadde recuperación debido a estar presentes en múltiples
copias, la baja tasa de sustitución que caracteriza a los marcadores plastldicos no permite
estudiar las diferencias temporales ni individuales a nivel poblacional. Frente a esto último,
todos los estudios de ADNa relacionados con plantas domesticadas han debido recurrir a
regiones más variables, demostrando la factibilidadde recuperación de regiones nucleares
tanto en maíz (GOLOUBINOFFet al. 1993; ROLLOet al. 1994; JAENICKE-DESPRÉSet al. 2003;
OLIVEIRAFREITASet al. 2003) como en tn'go, vid y otros cultivos (O'DONOGHUEet al. 1996;
ALLABYet al. 1997; BROWNet al. 1998; SCHLUMBAUMet al. 1998; MANENet al. 2003).
Los marcadores microsatélites empleados en este trabajo presentan un alto grado
de polimorfismo, lo cual permite examinar la diversidad genética en ejemplares
arqueológicos considerando únicamente la longitud de los fragmentos y sin tener que
recurrir al estudio de cambios puntuales en la secuencia nucleotídica. Este hecho Ofrece
una ventaja evidente al considerar las alteraciones químicas sufridas por los ácidos
nucleioos durante el proceso de conservación y que generalmente redundan en cambios
mutacionales difíciles de distinguir de aquellos con significado evolutivo. Estudios
realizados en humanos han sugerido que los Ioci SSR dinucleótidicos pueden presentar
problemas de inconsistencia en la tipificación de ejemplares arqueológicos debido a Ia
generación de moléculas quiméricas surgidas por el aparemiento de fragmentos de ADN
cuya amplificación quedó interrumpida en la región repetitiva (RAMOSet al. 1995; CULJKOVIC
et al. 2003). Sin embargo, ninguno de los Ioci incluidos en el presente estudio mostró
evidencias de este tipo de fenómeno. Por un lado. los marcadores utilizados no son
dinucleotidicos y la porción repetitiva es proporcionalmente pequeña con respecto a la
longitud total del fragmento. Asimismo, la metodologia utilizada por Ramos y col. (1995) no
se ajusta a los procedimientos necesarios para el análisis de ADN antiguo, IO cual
permitiría identificar a las moléculas quiméricas.
123
Discusión
05.1. Criterios de Autentlcldad
Como se mencionó en Ia sección precedente, un aspecto fundamental en cualquier
trabajo de ADNantiguo es la verificaciónde los criterios de autenticidad. Pese a ello, tal
como lo señalaran Parducci y Petit (2004), no siempre es posible satisfacer las exigencias
impuestas por cada una de las diez reglas estipuladas por Cooper y Poinar (COOPER&
POINAR2000; POINAR2003). En el presente estudio, de acuerdo con los tres primeros
criterios, las extracciones de ADNa partir de ejemplares arqueológicos fueron realizadas
en un recinto fisicamente aislado de las actividades de rutina. las amplificaciones
fueron validadas a través de los controles apropiados y la identidad de las secuencias fue
verificada a través del análisis de clones (ver Materiales y Métodos, secciones M2.1.2.2.
—M2.1.2.5.). Del mismo modo, los productos de amplificación obtenidos mostraron un
comportamiento molecular compatiblecon lo esperado para muestras arqueológicas, en
donde la probabilidad de amplificación se encuentra inversamente relacionada con la
longitud de los fragmentos (Tabla 6). El cn'ten'ode reproduclbilldad pudo ser corroborado
a través de rondas independientes de amplificación a partir de un mismo extracto de ADNo
de extractos independientes de un mismo individuo. En cuanto a Ia denominada
coherencia fiiogenétlca (phyiogeneticsense), las secuencias obtenidas mostraron altos
niveles de similitudcon las correspondientes a ejemplares actuales de maiz (Figuras 7 y 8).
Con relación a esto último, cabe destacar que las instalaciones en donde se realizaron
todos los procedimientos de extracción y caracterización de ADNa nunca fueron utilizadas
para el análisis de ejemplares actuales de malz, lo cual permite descartar la contaminacióncon materiales actuales como causa de los altos niveles de similitudobservados. Por otro
lado, la recuperación de secuencias correspondientes a retrotransposones de maíz (Tabla
7) confirma la presencia de ácidos nucleicos endógenos en los ejemplares arqueológicos
estudiados. La supervivencia de ácidos nucleicos en un conjunto de restos
asociados también pudo ser ccnstatada, particularmente, en el caso del locus phi127, en
donde lograron tipificarse entre dos y cinco ejemplares por sitio (Tabla 6).
Las evidencias presentadas claramente avalan la autenticidad de los resultados
obtenidos en el presente estudio, siendo tan sólo tres los criterios incumplidos (replicación
Independiente por otro grupo de investigación, cuantificación a través de PCR en
tiempo real y caracterización bioquímica, determinación de la cantidad, composición y
grado de deterioro de aminoácidos y otros residuos en las muestras arqueológicas).
124
05.2. Conservación de ácidos nucleicos en ejemplares arqueológicos del NOA
Los sitios arqueológicos generalmente albergan restos vegetales intactos o,
parcialmente modificados como consecuencia de la desecación o carbonización. Los
depósitos con mayor potencial para la recuperación de ácidos nucleicos son aquellos de
zonas árticas, cuevas de altura, y otros entornos fríos y áridos con caracteristicas similares
(WAYNEet al. 1999), como es el caso de los sitios del NOA que forman parte de este
trabajo (Tabla 2).
La tasa de éxito en la recuperación y amplificación de ADN que caracteriza a los
estudios de ADNa es muy inferiora lo observado en los ejemplares actuales, a lo cual se
suma el reducido número de muestras con las que habitualmente se cuenta. En especies
cultivadas, el número de ejemplares arqueológicos analizados por los estudios
desarrollados hasta la fecha. raramente excede los 10-15 individuos. llegando a alcanzar
cantidades algo superiores en el análisis de semillas. En la mayoría de los casos, resulta
dificilestablecer Ia tasa de éxito debido a que los resultados negativos son pocas veces
informados y, además, gran parte de los ejemplares son analizados en pool. Uno de los
escasos ejemplos disponibles es el estudio llevado a cabo por Brown y col. (1998) en
semillas de trigo carbonizado provenientes de un sitio griego de 3.000 años de antigüedad.
De las 90 semillas examinadas por estos autores. sólo cinco mostraron los productos de
amplificación esperados, correspondientes a 245 pb. de los genes de gluteninas de alto
peso molecular (HMW-High Molecular Weight glutenins). Un resultado poco sorprendente.
considerando que los fragmentos de ADNrecuperados a partir de los ejemplares de este
sitio tienen en promedio entre 50 y 70 pb (ALLABYet al. 1997).
En el presente trabajo, la presencia de ácidos nucleicos de origen endógeno pudo
ser verificada en 9 de las 57 muestras analizadas (15,8%). una cifra tres veces superior a
lo descripto por Brown y col. (1998). Diversos factores -diferencias en la longitud de los
fragmentos amplificados, diferencias en la antigüedad y ambientes de conservación de las
muestras- pueden explicar la superioridad observada; sin embargo, el estado de
carbonización de los ejemplares griegos, es sin duda. una de las diferencias más
significativas.
O'Donoghue y col. (1996) analizaron la conservación de llpidos y ácidos nucleicos
en un conjunto de semillas momificadas de rábano de 1.450-1.600 años de antigüedad,
recuperadas en el sitio egipcio Qasr Ibrim. La región correspondiente a la unidad de
repetición de un satélite alfoide (149 pb) pudo ser amplificada en 11 ejemplares
arqueológicos. El excelente estado de preservación de los llpidos extraídos de este
material llevó a proponer que el microambiente de las semillas momificadas retrasa la
degradación de las biomóleculas seminales. En este contexto, resulta notable que de los 9
125
Discusión
ejemplares tipificados en este estudio para el locus phi127, 5 corresponden a cariópsides,
al igual que los dos únicos ejemplares que lograron ser tipificados para el locus phi029.
Recientemente, Manen y col. (2003) estudiaron seis colecciones de Vitisvinifera de
distinta antigüedad. logrando recuperar y amplificar ácidos nucleicos a partir de dos
ejemplares conservados en condiciones de anegamiento (ca. 2.500 AP) y de un ejemplar
carbonizado (ca. 1.800 AP). Este trabajo es particularmente interesante ya que ha sido el
primero, y único publicado hasta el momento, en utilizar marcadores SSR en ejemplares
arqueológicos. Las amplificaciones estuvieron dirigidas a cinco regiones microsatélites de
entre 150 y 200 pb. De manera similar a lo observado para las muestras del NOA (Tabla
6), no todos los Ioci pudieron ser amplificados en los diferentes individuos. El ejemplar más
reciente mostró productos de amplificación para los cinco marcadores, mientras que los
dos restantes sólo lo hicieron para dos de ellos.
En lo que respecta a maiz, el primer trabajo en incluir una cantidad significativa de
especimenes arqueológicos fue el llevado a cabo por Oliveira Freitas y col. (2003), quienes
amplificaron un fragmento de 330 pb correspondientes al gen Adh2, a partir de 11
ejemplares procedentes de Brasil. cuya antigüedad comprende un periodo de entre 500 y
1.000 años. Por su parte, Jaenicke-Després y col. (2003) estudiaron 11 ejemplares de
entre 700 y 4.000 años de antigüedad hallados en diversos sitios de Méxicoy del Sudoeste
de EE.UU., pudiendo amplificar en todos ellos tres regiones correspondientes a distintas
porciones de los genes tb1 (107 pb), pbf (72 pb), y su1 (109 pb). El número de ejemplares
examinados en ambos casos, es marcadamente inferior al número total de muestras
examinadas en el presente trabajo (N=57).Sin embargo, la tasa de éxito es aparentemente
mucho mayor. Teniendo en cuenta que los dos estudios mencionados presentan una tasa
de éxito del 100%, un hecho muy poco probable para ejemplares arqueológicos. las
discrepancias observadas posiblemente se deban a la falta de registro de los intentosfallidos.
Los procesos de modificación post-modem constituyen un aspecto clave de los
estudios de ADN antiguo. Por lo tanto, si bien las sustituciones puntuales no son el centro
de interés del presente trabajo. los datos obtenidos a partir del análisis de clones proveen
una fuente adicional de información acerca de los niveles de degradación de los ácidos
nucleicos recuperados.
Dos tipos de alteraciones parecen afectar más frecuentemente el ADN de los
ejemplares arqueológicos: 1) procesos de hidrólisis que resultan en la deaminación de
bases. pérdida de purinas o pirimidinasa través dela ruptura de los enlaces N-glicosldicos;
126
Discusión
2) procesos oxidativos promovidos por la acción directa de agentes ionizantes, como la
radiación y los radicales libres (Hoss et al. 1996).
La deaminación de la citosina es la modificación predominante en los extractos de
ADNobtenidos a partir de ejemplares arqueológicos, dando como resultado la conversión
de citosina a uracilo (HOFREITERet al. 2001). En concordancia con estas observaciones.
11/ 24 sustituciones observadas en los clones correspondientes al Iocus phi127 resultaron
ser transiciones de tipo C/G-T/A, al igual que 19/26 identificadas para el Iocus phi029.
Considerando únicamente sustituciones únicas o singletons, descontando asl aquellas
sustituciones con posible significado evolutivo, 9/21 fueron transiciones de tipo C/G-T/A en
el Iocus phi127, mientras que esta proporción ascendió a 12/18 en el Iocus phi029 (Figuras
7 y 8). Esto sugiere que la mayor parte de las sustituciones observadas serian producto de
las alteraciones del ADN molde como consecuencia de la degradación y no
incorporaciones erróneas de la Taq polimerasa o de la maquinaria de replicación
bacteriana. ya que en este ultimo caso todas las sustituciones deberian encontrarse
igualmente representadas.
En el Iocus phi127, las dos sustituciones potencialmente informativas, las posiciones
88 y 96 del alineamiento, son también transiciones de tipo C/G-T/A(Figura 7), lo cual pone
en duda su interpretación desde el punto de vista evolutivo. Si bien es cierto que en el
individuo51 cinco de los seis clones estudiados presentaron una "T"en lugar de una “C”en
la posición 88. mientras que 4/6 presentaron una "A"en lugar de una "G"en la posición 96,
este patrón también es esperable en aquellos casos en que las moléculas de partida de la
amplificaciónsean muy pocas, oon lo cual las mismas modificaciones se verán trasladadas
a todos los productos (HOFREITERet al. 2001). En este sentido. cabe destacar que el
individuo 51 es el más antiguo de los especimenes estudiados, y probablemente, la
cantidad de ADNrecuperado en este caso haya sido menor. Sin embargo, resulta llamativo
que 4/6 clones presenten simultáneamente "T"y “A”en los dos sitios considerados, y que
lo mismo suceda en los clones lnd.22-c1 e lnd.39-c4. Teniendo en cuenta que la posición
96 es también polimórficaen los alelos actuales, los resultados obtenidos parecen ser más
compatibles oon la existencia de polimorfismos nucleotldicos en los sitios 88 y 96 del alelo
112. Por el contrario. al considerar el sesgo introducido por las modificaciones post-mortem
en la reconstrucción de las secuencias, las sustituciones observadas en el individuo40, en
donde la única base representada en las posiciones variables es la “T’. son consistentes
con una alta incidencia de procesos de deaminación en las citosinas.
El hecho que la mayor parte de las sustituciones observadas en el resto de los
ejemplares analizados sólo estuvieran presentes en un único clon es compatible oon la
existencia de un número considerable de moléculas en el comienzo de la amplificación. De
127
este modo. cada clon representa una molécula inicialdiferente, facilitando la discriminación
entre las sustituciones producto del estado de deten'oro del ADN y aquellas con significadoevolutivo.
Por último, los patrones de sustitución obtenidos son congruentes con lo esperado
para los ácidos nucleicos provenientes de ejemplares arqueológicos, sumando así unanueva evidencia en favor de la autenticidad de las secuencias halladas.
05.3. Inferencias poblacionales
Una de las facetas más interesantes de los estudios de ADNa es el análisis de los
cambios en la estructura genética de las poblaciones a través del tiempo. Una de las
primeras y más importantes contribuciones en este campo ha sido el estudio de los
haplotipos mitocondn‘alesobtenidos a partir de 380 representantes actuales y 96 huesos
subfósiles de la especie de pingüinos Pygoscelis ade/ie (LAMBERTet al. 2002). Este último
trabajo, al igual que otros similares, aunque de menor escala, realizados en osos pardos
(BARNESet al. 2002) y roedores subterráneos (HADLYet al. 2003). pone de manifiesto la
necesidad de contar con un marco de referencia adecuado para la interpretación de los
datos obtenidos a partir de los ejemplares “antiguos”, sean éstos fósiles, subfósiles o
arqueológicos.
En el presente estudio, la tipificación de los Ioci phi127, phi029 y phi059 en 147
individuosactuales pertenecientes a diversas razas nativas de maiz del NOA proporciona
el contexto necesario para la integración de los ejemplares arqueológicos. De acuerdo con
el método de asignación de Paetkau y col. (1995), e independientemente de su sitio de
origen. todos los especimenes arqueológicos tipificados a través de los mencionados
marcadores microsatélites presentaron una mayor afinidad con las poblaciones
correspondientes a las razas del Complejo Andino que con las razas Pisingallo u Orgullo
Cuarentón (Tabla 8). La ausencia de relación con la raza Orgullo Cuarentón resulta
esperable ya que, como se indicara previamente. esta entidad es de origen reciente. La
ausencia de relación con la raza Pisingallo es, en cambio, más intrigante, especialmente,
teniendo en cuenta que el ejemplar 20 del sitio Lorohuasi perteneceria a la raza Pisingallo
según sus caracteristicas morfológicas (Tabla 6).
Algunos autores han considerado que los métodos de asignación son en realidad
más útiles para refutar la pertenencia de un determinado individuoa una población dada y
no asi para establecer inequivocamente su origen. ya que siempre existe la posibilidad de
no haber incluido la “verdadera” población de origen en el muestreo realizado (CORNUETet
al. 1999). En las poblaciones del NOA analizadas, la raza Pisingallo se encuentra
128
Discusión
representada por una única población, con lo cual no es posible descartar la existencia de
otras poblaciones de esta raza cuyas frecuencias alélicas en los Ioci considerados sean
distintas a Io obtenido para 6313. No obstante, la ya señalada similitud entre las
frecuencias de esta última población y las del grupo de malces reventadores de punta
aguzada descripto por Santacruz-Varela y col. (2004) (ver sección D4) sugiere que las
frecuencias halladas podrian considerarse representativas de dicho grupo. Cabe recordar
entonces al otro conjunto de malces reventadores que actualmente se encuentran en la
República Argentina: los de la llanura mesopotámico-chaqueña. Si bien la antigüedad de
estos últimosen la zona está sujeta a discusión, la presencia en los sitios de Catamarca de
materiales provenientes de otras áreas podria contribuir a explicar las discrepancias
observadas entre la morfología y composición genética del individuo20.
Por otro lado. uno de los supuestos subyacentes a las asignaciones propuestas es
la retención de señal filogenética en las frecuencias alélicas observadas en las poblaciones
actuales. Es decir. se asume que la distribución actual de frecuencias aún refleja la
pertenencia de las poblaciones a un determinado gano histórico, y que las diferencias
génicas observadas son, principalmente, consecuencia de las distintas relaciones de
ancestralidad y no de la acción independiente de fuerzas evolutivas, como migración,
selección y deriva. El patrón de asociación observado en los análisis de agrupamiento
(Figura 13), al igual que el análisis de la diferenciación genética entre poblaciones
presentado en la sección 03.2, apoyan la validez de este supuesto.
Los restos arqueológicos de cultivos y animales domesticados. o en vías de
domesticación, constituyen indicadores clave para el estudio del proceso de producción y
distribución de alimentos en las sociedades del pasado. Schlumbaum y col. (1998)
encontraron que el trigo tetraploide ya era cultivado en los Alpes Suizos en una etapa muy
anterior a lo previamente supuesto. demostrando asi la utilidad del ADNa para detectar la
introducciónde nuevos cultivos o variedades en las prácticas agricolas locales.
Los tres Ioci analizados en los ejemplares arqueológicos aqul estudiados -phi059.
phi127 y phi029- mostraron una única variante alélica que es. a su vez. la más frecuente
en poblaciones actuales correspondientes a las razas AmarilloChico (6476, 6484), Amarillo
Grande (6480), Blanco (6485) y Altiplano (6167. 6473) (Tabla 6, Tablas A5, A6 y A7).
La gran uniformidad observada resulta particularmente llamativa considerando que
los sitios arqueológicos estudiados corresponden a diversos contextos socio-históricos del
desarrollo cultural -agro-pastoril local (Punta Colorada), estatal (Lorohuasi) e hispano
indígena (Tebenquiche)- y que las muestras analizadas fueron recuperadas tanto en
entornos domésticos como funerarios, con los distintos usos y carga simbólica que ello
129
Discusión
implica (Tabla 2). Por otro lado. las caracteristicas climáticas de los sitios son también
diferentes. El valle de Abaucán (Lorohuasi, Punta Colorada) dispone de sectores en ladera,
aptos para el cultivoatemporal o con escasa necesidad de riego artificial,mientras que en
la Puna (Tebenquiche) estos recursos son inexistentes. La falta de diferenciación hallada
puede derivar de la ausencia total de variación entre y dentro de las poblaciones que
dieron origen a los ejemplares arqueológicos, o bien de una estructura genética similar a la
de las poblaciones actuales 6476, 6484, 6480, 6485, 6167 y 6473, en donde prevalecen
las variantes alélicas halladas en los ejemplares arqueológicos, sin observarse diferencias
significativas entre sus frecuencias. Así, la probabilidad de extraer el alelo más frecuente
tomando un alelo al azar de la población es elevada e igual en todas ellas. De aceptar Ia
segunda posibilidad, la homogeneidad genética evidenciada es consistente con la
existencia de un flujo génico significativo, posiblemente asociado a la actividad humana,
entre las diversas razas de maiz cultivadas en el pasado. Una suposición que encuentra
sustento en los altos niveles de intercambio intra e inter-regional descriptos para el NOA
desde etapas muy tempranas (CASTROR. & TARRAGÓ1992; ALBECK2000; HOCSMANet al.
2004)
En conclusión, los resultados obtenidos no sólo han demostrado la factibilidad de la
extracción y análisis de ácidos nucleicos provenientes de ejemplares arqueológicos del
Noroeste Argentino. sino que además ofrecen interesantes perspectivas para
investigaciones futuras acerca de los patrones de dispersión del maíz en América del Sur y
para el seguimiento temporal de la dinámica de intercambio entre los sistemas agrarios de
tierras bajas y altas. La utilización de las técnicas de ADN antiguo en investigaciones
multidisciplinarias permitirá incorporar una nueva dimensión a los estudios arqueológicos y
evolutivos, redundando en una mejor caracterización y conservación del patrimonio
arqueológico de la República Argentina.
DG. CROMOSOMAS SUPERNUMERARIOS Y GRADIENTES ALTITUDINALES
La presencia y significado del mantenimiento de los cromosomas B en poblaciones
naturales ha sido objeto de estudio en numerosos grupos de organismos desde hace más
de 50 años (BLACKWOOD1956; JONES & REES 1982; CARLSON 1986; PORTER & RAYBURN
1990; CARLSON& ROSEMAN1992; JONES 1995).
Las diferencias poblacionales en el número y frecuencia de cromosomas B pueden
derivar de factores selectivos (tolerancia ecológica de los portadores en relación con la
permisividad del ambiente), factores históricos, factores de transmisión (diferencias en la
130
intensidad de las fuerzas de acumulación) y factores aleatorios (deriva) (CAMACHOet al.
2000)
Como se mencionara previamente, las razas nativas de maiz del NOA presentan
polimorfismos para el número de cromosomas B. contenido de heterocromatina (número
de bandas knob) y contenido de ADN. La frecuencia poblacional de cromosomas B y el
número medio de cromosomas B por individuo (É ) muestran una correlación positiva con
Ia altura, mientras que el contenido de heterocromatina disminuye a medida que aumenta
la altitud (ROSATO1997; ROSAToet al. 1998). Los patrones de variación clinal observados
fueron interpretados por Rosato y col. (1998) como consecuencia de la acción de fuerzas
selectivas tendientes a mantener un nucleotipo óptimo.
El significado adaptativo de muchos de los gradientes latitudinales y altitudinales
descriptos en la literatura ha sido verificado tanto para caracteres morfológicos como
moleculares (BERRYa KREITMAN1993; HUEYet al. 2000; VAN'TLANDet al. 2000; GOCKELet
al. 2001; STORZ 2002; STORZ & DUBACH2004). Sin embargo, los gradientes también
pueden originarse como consecuencia de procesos demográficos. Esto es. gracias a la
interacción entre den'va y flujo génico restringido, o merced al contacto secundario entre
dos poblaciones históricamente aisladas y previamente diferenciadas con relación al
carácter en cuestión. Bajo la hipótesis adaptativa, sólo aquellos caracteres o locí bajo
selección mostrarán un patrón de variación clinal. sin modificar por ello las frecuencias de
otros Ioci polimórficos neutros, no ligados. Los procesos demográficos. en cambio,
afectarán a todos los Iocidel genoma de igual manera.
Una aproximación frecuentemente utilizada para discriminar entre escenarios
adaptativos y demográficos es la comparación entre los patrones de diferenciación
observados para el carácter supuestamente sujeto a selección y los correspondientes a
marcadores neutros. En el presente estudio, el análisis de la variabilidad microsatélite en 7
poblaciones pertenecientes al gradiente altitudinal de cromosomas B permite poner a
prueba el significado adaptativo de la variación citogenética observada.
Si el gradiente altitudinal descripto para las poblaciones del NOA fuera
consecuencia de procesos demográficos, el grado de diferenciación genética entre
poblaciones, estimado a partir de los marcadores neutros (F51)(Tabla 14), deberia mostrar
un patrón similar al exhibido por la variable inicialmente vinculada al gradiente, en este
caso, el número medio de cromosomas B por individuo. Es decir, a mayor distancia
altitudinal entre las poblaciones consideradas. mayor deberá ser la diferencia de É . y la
diferenciación genética entre ellas. Visto de otro modo. se espera que exista una
asociación positiva entre las diferencias de É y la distancia genética entre poblaciones.
como asl también entre distancias genéticas y distancias altitudinales. Sin embargo,
131
Discusión
ninguna de las dos asociaciones resultó significativa al ser evaluada mediante el test de
Mantel (ver Resultados, sección R4.2.). y, en concordancia con esto último, ninguna de las
variantes alélicas de los Ioci microsatélites mostró un patrón de variación clinal con la altura
(ver Resultados, sección R4.1.). Estos resultados permiten descartar las hipótesis
demográficas para explicar el mantenimiento del gradiente, apoyando asi su significado
adaptativo.
Las explicaciones adaptativas se toman más convincentes cuando: a) el patrón de
variación clinal se verifica en diferentes áreas de la distribución; b) otros rasgos
funcionalmente semejantes varían concomitantemente; c) los patrones intra e
interespecificos son similares (JONAS& GEBER1999). En las razas nativas de maíz, el
estudio de las asociaciones entre cromosomas B y altitud ha arrojado resultados
contradictorios. Mientras que Bretting y Goodman (1989) hallaron una correlación negativa
al examinar 300 poblaciones de América Central. las investigaciones de Porter y Raybum
(1990) en 12 poblaciones de Arizona no detectaron asociación alguna entre cromosomas B
y altitud. AI mismo tiempo, los ya citados resultados de Rosato (1997) demostraron la
existencia de una asociación positiva entre ambas variables en 16 poblaciones del NOA.A
pesar de estas inconsistencias, la recurrente correlación negativa entre altitud y presencia
de bandas heterocromáticas o knobs (MANGELSDORF& CAMERON1942; LONGLEY& KATO-Y
1965; BENNE'IT1976; BRETTINGet al. 1987b; ROSATOet al. 1998), una característica que
puede ser considerada “funcionalmentesemejante" a los cromosomas B desde el punto de
vista citológico. constituye un argumento a favor de la hipótesis selectiva para el
mantenimiento del gradiente altitudinal descripto en las poblaciones del NOA aqui
analizadas.
Un gran número de investigaciones han puesto de manifiesto la naturaleza
parasitica o “egoista” de la mayor parte de los cromosomas supemumerarios estudiados
hasta el momento en una amplia gama de organismos (ver referencias en JONES& HOUBEN
2003). A diferencia del modelo heterótico, en donde los cromosomas supemumerarios se
mantienen gracias a ser selectivamente beneficiosos para el portador, el modelo parasitico
asume que la presencia de los cromosomas B en las poblaciones naturales es promovida
únicamente a través de sus propios mecanismos de acumulación e impulso (CAMACHOet
al. 1997). La abundancia de las evidencias en favor del modelo parasitico parece ser dificil
de conciliar con los resultados del presente trabajo. Sin embargo, la mayor frecuencia de
los cromosomas B en las poblaciones de altura del NOA no necesariamente implica la
existencia de efectos ventajosos directamente relacionados con los cromosomas B, sino
que también puede ser interpretada como un producto indirecto de la selección sobre otros
132
rasgos. Las evidencias disponibles en relación con ambas posibilidades se discuten acontinuación.
Algunos de los efectos registrados corno consecuencia de la presencia de
cromosomas B han resultado directamente atribuibles a los genes contenidos en los
mismos. Tal es el caso de el gen de resistencia a la roya descripto en Avena sativa y de la
resistencia a antibióticos en el hongo Nectn'a haematococca (CAMACHOet al. 2000). Los
cromosomas B de maíz tienen una composición básicamente repetitiva y comparten la
mayor parte de su secuencia con los autosomas (PEACOCKet al. 1981; CHENG& LIN2003;
CHENG& LIN2004). Sólo tres secuencias específicas han sido identificadas hasta el
momento, siendo todas ellas de tipo repetitivo. La secuencia descripta por Alfenito y
Birchler (1993), conocida como pZmBs, se localiza cerca del centrómero del cromosoma B
y muestra cierta similitud con las regiones neocentroméricas de los cromosomas del
complemento regular. Por su parte, Stark y col. (1996) encontraron una región rica en
secuencias A-T que no muestra señal de hibridación al utilizar ADN genómico total de
individuos sin Bs en experimentos de hibridación ¡n situ, pero cuya ubicación no ha sido
determinada con precisión. Más recientemente, Cheng y Lin (2003) hallaron una unidad de
repetición de aproximadamente 350 pb que pudo ser localizada en el knob centromén'co
del cromosoma B y a lo largo de casi un tercio del brazo largo. Si bien la caracterización
de los cromosomas B de maiz es aún incompleta, su naturaleza fundamentalmente
repetitiva y Ia ausencia de regiones codificantes específicas hacen poco probable que la
aptitud de los individuos portadores de cromosomas supemumerarios pueda verse
incrementada a expensas de los genes contenidos en ellos.
La presencia fisica de los cromosomas B ha sido relacionada con diversos
fenómenos genéticos y cromosómicos. En el saltamontes Eyprepocnemis plorans, Riera y
col. (2004) observaron que la presencia de cromosomas B era acompañada de un
incremento en la frecuencia de quiasmas y en la tasa de recombinación de los
cromosomas autosómicos. Efectos similiares han sido registrados para los cromosomas B
de malz (HANSON1969). Según Rhoades y Dempsey (1972). la heterocromatina de los Bs
de maiz promueve la recombinación en los A, posiblemente debido a su replicación tardía
que alarga la profase meiótica y aumenta las posibilidades de recombinación.
Además del incremento en la recombinación, otras consecuencias citológicas
parecen derivar de la presencia de cromosomas B. Chiavarino y col. (2000) estudiaron la
no disyunción y formación de micronúcleos en la última división mitótica de las células del
tapete en individuos con 1B y OBs pertenecientes a lineas de maiz de alta y baja
transmisión femenina de cromosomas B y encontraron que la presencia de cromosomas B
133
Discusión
provoca inestabilidad en los autosomas de ambas lineas, aunque con mayor severidad en
las líneas de baja transmisión. Sorprendentemente, al estudiar Ia viabilidad del polen para
las mismas lineas, ésta fue reducida en las lineas de alta transmisión y no asl en las de
baja (GONZALEZ-SANCHEZet al. 2004).
Por otro lado. Rhoades y Dempsey (1972) demostraron que la presencia de dos, o
más, cromosomas B conduce a la eliminación de porciones heterocromáticas autosómicas
en las células de la aleurona de maiz. De acuerdo con el mecanismo propuesto por estos
autores, los Bs retrasarlan la replicación de la heterocromatina de los knobs durante la
segunda división mitótica del grano de polen, produciendo la ruptura de ciertas porciones
cromosómicas y dando lugar a la formación de células espennáticas con cromosomas
incompletos. Asimismo, Ia presencia de Bs y la presencia de knobs serian requisitos
necesarios pero no suficientes para que se produzca la perdida de heterocromatina. lo cual
coincide con las diferencias en la estabilidad autosómica de las líneas de alta y baja
transmisión femenina observadas por Chiavarino y col. (2000). En este contexto. la
correlación negativa entre altitud y contenido de heterocromatina observada en las
poblaciones del NOAestudiadas por Rosato (1997) adquiere nueva relevancia en relación
con el gradiente de cromosomas B aquí estudiado. Grandes proporciones de
heterocromatina tienden a incrementar la duración del ciclo celular y se ha propuesto que
su presencia estaría negativamente seleccionada en condiciones de altura, en donde la
época favorable para el desarrollo del cultivo es muy corta y se requiere de una rápida
proliferación celular (PRYORet al. 1980; REEVESet al. 1998; BUCKLERet al. 1999). Si bien la
existencia de una interacción entre contenido de heterocromatina y cromosomas B como
causa del mantenimiento del gradiente aquí estudiado es especulativa, ya que la
asociación entre heterocromatina y cromosomas B no ha podido ser establecida para el
conjunto de poblaciones incluidas en este trabajo, no es posible descartar que la presencia
de los cromosomas B en las poblaciones de altura esté siendo seleccionada a favor debidoa su efecto sobre la cantidad de heterocromatina.
Por último, como fue señalado anteriormente. el aumento del número medio de
cromosomas B por individuoen las poblaciones de altura también podría producirse como
consecuencia indirecta de la selección sobre otros rasgos. En el maiz. la tasa de
transmisión está controlada por genes ubicados en el complemento regular. La tasa
masculina es gobernada por un único gen pro-B con dos estados alélicos, mB-TRh (del
inglés male B Transmission Rate high) y mB-TR-l (del inglés male B Transmission Rate
low) (CHIAVARINOet al. 2001), mientras que la tasa femenina estaria determinada por al
menos un gen, cuya variante de baja transmisión es dominante y promueve Ia pérdida de
134
Discusión
los cromosomas B (genes anti-B) cuando éstos se encuentran en dosis única (GONZALEZ
SANCHEZet al. 2003). Una posible explicación para eI establecimiento del gradiente es que
alguno de los grupos de genes de transmisión. ya sea genes pro-B o anti-B, se encuentren
ligados a otros genes que estén siendo blanco de la selección, con lo cual sus frecuencias
en las poblaciones tienden a aumentar o disminuir con la altitud, respectivamente, llevando
a un incremento del número promedio de Bs por individuo en las poblaciones de mayoraltura.
Los ejemplos citados ponen de manifiesto la diversidad de factores potencialmente
involucrados con las ventajas selectivas de los cromosomas supemumerarios. No
obstante, las evidencias disponibles son aún insuficientes para determinar cuál de ellos es
responsable de la formación y mantenimiento del gradiente altitudinal analizado en el
presente trabajo.
Los resultados aqui obtenidos confirman la naturaleza adaptativa del gradiente
altitudinal de cromosomas B observado en las poblaciones del NOA. Sin embargo, esto no
implica que Ia evolución de los cromosomas B de maiz deba ser encuadrada bajo el
modelo heterótico. La relación entre Bs y autosomas puede ser considerada un caso
particular de co-evolución huésped-parásito (FRANK2000). El comportamiento parasltico de
los Bs es mediado por los mecanismos de acumulación y conducción meiótica. Si la
acumulación de cromosomas B produce efectos deletéreos, el genoma huésped tenderá a
desarrollar estrategias de defensa que le permitan neutralizar la acumulación de los
cromosomas supemumerarios. Como resultado, aquellos cromosomas B capaces de
generar nuevas annas para superar el "ataque" del huésped persistirán en las poblaciones.
En una concepción similar, el modelo no equilibrado de evolución a largo plazo de los
cromosomas B (CAMACHOet al. 1997; CAMACHOet al. 2000) propone que la existencia de
un conflicto permanente entre partes del genoma con intereses distintos lleva al
establecimiento de una relación fluctuante, en donde la naturaleza de los Bs puede
cambiar de parasítica a neutra. llegando a convertirse en ligeramente beneficiosa.
dependiendo de la etapa del proceso en la que se encuentre. Por lo tanto. la participación
de fuerzas selectivas en el mantenimiento del gradiente altitudinal de las poblaciones del
NOA no estaria indicando un significado adaptativo para los cromosomas B de maiz a Io
largo de todo el rango de distribución del cultivo, sino que más bien constituye una
manifestación local de Ia compleja interacción entre cromosomas B y autosomas.
135
Conclusiones
Conclusiones
l. La variabilidad de los Ioci microsatélites tiene origen en numerosos procesos cuya
dinámica debe ser evaluada antes de su incorporaciónen estudios poblacionales.
II. Las razas nativas del NOA constituyen una importante fuente de diversidad para
ampliarla base genética de los programas de mejoramiento.
lll. Distintos grupos raciales contribuyen a la riqueza del germoplasma de la región. La
constitución genética de las razas Altiplano, Amarillo chico, Amarillo grande y Blanco
permite asignarlas al Complejo Andino, mientras que las razas Pisingallo y Orgullo
Cuarentón pertenecen a los malces reventadores y a las razas incipientes.
respectivamente.
IV. Los ejemplares arqueológicos estudiados son más afines a las razas del Complejo
Andino que a las razas Pisingallo y Orgullo Cuarentón.
V. La gran homogeneidad genética observada en los ejemplares arqueológicos es
consistente con la existencia de un flujo génico significativo. posiblemente asociado a la
actividad humana, entre las diversas razas de malz cultivadas en el pasado.
VI. El gradiente altitudinal de cromosomas B descripto para las poblaciones del NOAes
mantenido gracias a la acción de fuerzas selectivas. Las evidencias disponibles son aún
insuficientes para determinar la generalidad de este fenómeno en relación con el valor
adaptativo de los cromosomas B de maiz a lo largo de toda la distribución del cultivo.
Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto la gran riqueza genética,
morfológica y cromosómica de las razas nativas de Ia República Argentina. La
caracterización de un mayor número de ejemplares arqueológicos y actuales,
especialmente en la región mesopotámico-chaqueña, región cuyo relevamiento es
prácticamente inexistente. será de fundamental importancia para la búsqueda de alelos
agronómicamente valiosos y para poner a prueba las hipótesis relacionadas con la
introducción y dispersión del maíz en América del Sur.
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150
PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓNDE ADN
Dellaporta y col. (1983) modificado
Pulven'zar 200 a 300 mg de maten'al vegetal fresco en aire liquido.
Transferir a tubo eppendorf conteniendo 500 pl de bufl'erde extracción (100 mMTn's, 50
mM EDTA, 500 m M CINa) y 35 pl de SDS 20% (p/v).
Incubar durante 10 min. a 65 °C con agitación.
Agregar 175 pl de Acetato de Potasio 5 M pH 5.2.
Precipitar en hielo durante 20 min.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min.
Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo limpio.Agregar 1 volumen de Fenol
CIorofonno-Isoamíllco (25:24z1). Mezclar suavemente por inversión.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min.
Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
Agregar 1/10 volumen de Acetato de Sodio pH 5.2 y 2 volúmenes de Etanol
Dejar precipitar a -20 °C durante 2-3 horas.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.
Descartar el sobrenadante y agregar 1 ml de Etanol 70% para el lavado.
Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min. y repetir el lavado.
Descartar el sobrenadante y dejar secar.
Resuspender en 100 pl de HZOestéril o buffer TE (0,01M Tris, 1 mM EDTA pH 8).
Agregar 2 pl de RNAsa (10mg/ml) e incubar a 37 °C durante una hora.Conservar a -20 °C.
Yang y col. (1998) modificado
El protocolo descripto a continuación requiere del uso de los reactivos y columnas de
purificación provistas por el QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen).
Pulverizar 200 a 300 mg del material a estudiar de manera apropiada según suscaracterísticas.
151
Transferir a un tubo conteniendo 1 mL de buffer de extracción (0,5 M EDTA pH 8, 0,5%
SDS) previamente calentado a 55 °C.
lncubar con agitación a a 55 °C durante 4-6 horas.
Centrifugar a 2.000 g durante 5 min.
Tomar 500 ul de sobrenadante y transferir a un tubo conteniendo 5 volúmenes (2.5 ml)
de buffer QIAquick PB.
Mezclar suavemente con vortex. No invertir.
Agregar 500 ul de muestra a la columna y centrifugar a 12.800 g durante 1 min. No usar
volúmenes mayores de muestra para evitar derrames. Descartar el líquidoeluido .
Repetir hasta haber transferido todo el volumen (3 ml).
Lavar agregando 600 ul de buffer QIAquick PE y centrifugar por 1 min. Descartar el
llquido eluido.
Agregar a la columna 100 ul de buffer QIAquick EB y centrifugar a 12.800 g durante 1
min recogiendo en un tubo eppendorf limpio.
Conservar el extracto a -20 °C
SOLUCIONES
Electroforesis de geles de agarosa
Buffer TAE 50X
Tris 242 gEDTA pH 8 0.25 M 25 mIÁcido Acético Glacíal 57,1 mlHZOdestilada hasta 1000 ml
Bufferde siembra
Glicerol 3 mIH20 destilada 7 mlAzul de Bromofenol pta. de espátula
Electroforesls de geles de pollacrllamlda
Buffer TBE 10X
Tris 108 gÁcido Bórico 55 gEDTA 9.3 gH20 destilada hasta 1000 ml
152
Solución stock Acrilamida-Bisacrilamida 19:1 30%
Acrilamida 285 gBis-acrilamida 15 gHZOdestilada hasta 1000 ml
Filtrary conservar a 4 °C
Mezcla para geles desnaturalizantes 6%
TBE 10X 10 mlAcrilamida-Bisacrilamida 30% 20 mlUrea 48 gTEMED (diamina de N.N.N.N'-Tetrametiletileno) 80 ulPersulfato de Amonio 25% p/v 80 plHZObi-destilada hasta 100 ml
Mezcla para geles nativos 10%
TBE 10X 2,5 mlAcrilamida-Bisacn'lamida 30% 8,4 mlTEMED (diamina de N.N,N,N’-Tetrametiletileno) 30 ulPersulfato de Amonio 10% p/v 175 plH20 bi-destiiada hasta 25 mi
Bufferde siembra
Formamida 950 plAzul de Bromofenol 1 mgXylene Cyanol 1 mgEDTA 0,5 M pH 8 20 ulHZOdestilada hasta 1000 ul
SECUENCIACIÓN
Protocolo de precipitación con isopropanol
Sobre 5 pl de muestra proveniente dela reacción de secuenciación
Agregar 20 ul de Isopropanol 75%.
lncubar en oscuridad a temperatura ambiente durante 45-60 min.
Centn'fugar a 13.000 rpm durante 20 min.
153
Descartar el sobrenadante y agregar 250 ul de isopropanol 75%. Mezclar porinversión.
Centn'fugar a 13.000 rpm durante 10 min.
Descartar el sobrenadante. Asegurarse de que Ia remoción haya sido completa. De
ser necesario oentrifugarbrevemente y tornar con pipeta el volumen restante.
Secar al vacío durante 5 min o durante 30 min. bajo campana.
Conservar a —20°C.
FRECUENCIAS ALÉLICAS
A continuación se presentan las frecuencias alélicas correspondientes a los Ioci
microsatélites analizados en el presente estudio (Tablas A1-A18). Se incluyen, además, las
equivalencias alélicas con lo descripto por otros autores para lineas y razas nativas del
continente americano. Los datos de las lineas fueron compilados a partir de Liu y col.
(2003), Matsuoka y col. (2002a) o tomados de la Maize Data Base (MDB)de acuerdo con
la disponibilidadpara cada Iocus, según se indica en las tablas adjuntas.
La categoría Otras razas de América hace referencia a las razas nativas descriptas
por Matsuoka y col. (2002a; 2002b). En aquellos casos en donde fue posible, la
informaciónfue desglosada siguiendo el esquema de divisióngeográfica propuesto por losautores.
La nomenclatura de los alelos se mantuvo de acuerdo con los trabajos originales. El
tamaño de la muestra (N)corresponde al número de alelos estudiados.
155
RazasNOA
TablaA1-Locush/121
Alelos
—
6473Altiplano N=36 6167Altiplano N=28 6485Blanco N=26 6480Aman'lloGrande N=50 6464Amarillochico N=40 6476Amarillochico N=24 6313Pisingallo N=32 6482OrgulloCuarenton N=48 Línea.Matouokaet.al N=202 OtrasrazasdeAmérlca N=48
17899 48
TablaA2-Locusnc135 RazasNOA 6473Altiplano N=40 6167Altiplano N=26 6485Blanco N=26 6480AmarilloGrande N=50 6484Aman'llochico N=40 6476Aman'llochico N=24 6313Pislngallo N=28 6482OrgulloCuarenton N=48 LineasMDB N=186 OtrasrazasdeAmórlca
112 11255
115 115 115 115 115 115
120 120 120 120
122
G167Ahiplano N=23 6485Blanco N=22 6480AmarilloGrande N=48 6484Amadllochico N=40 6476Amarillochico N=28 6313Pisingallo N=26 6482OrgulloCuarenton N=46 LlneasLluetal. N=439 OtrasrmsdeAmérico N=372 Caribe 10 CentroyEstedeEE.UU. 56 GuatemalaySurdeMexico 66 Tlen'asAhesMexico 38 OesteyNonedeMéxico 24 NortedeMexico 10 SudoestedeEEUU. 32 ComplejoAndino 38OtrosSudamericanos
98
133
111
128 128 128 135136
1135136
11130 130
44130
24130
13130
5130
27137 113 137 127 137
3137
9137
28137
44
1391414544 139141
160180 139
2139
30139141 139141
117
60
156 1G
156 156 156 161 147 161 161 161 161 161 161 161
158
165166
11
160 160 16010
167
168
692167168169 BID 167 ‘_67
7
2
168169
1
2
173
4
172173
3172
3'24 173
3
1175
8175177
2037
2157
TablaA4Locusphí069 RazasNOA
Alelns
4
6473Altiplano N=32 6167Alliplano N=28 6485Blanco N=26 6480AmarilloGrande N=50 6484Amarillochico N=40 6476Amarillochico N=24 6313Pisingallo N=20 6482OrgulloCuarentón185 N=463 LíneasMDB N=188 Otrasrazasde América
191
9191
3191 191 191 191 191 191 197
203
TablaA5-Locushi127 RazasNOA
Alalos
L
6473Alliplano N=34 6476Aman'llochico N=24 6482OrgulloCuarenton N=48 6480Aman‘llogrande N=50 6484Aman'llochico N=38 6167Altiplano N=26 6313Pisingallo N=32 6485Blanco N=26 LíneasMatsuokaelal. N=192 Otrasraza.deAmérlcn N=48
11233
112 11222
11239
112 112 11220
124
1
120124
19
12423
12411
124 12413
114120124 114120124
126 126
128
TablaA6-LocusphIOZQI'ablaA7-Locush/059
AlelosAlelos
4‘r
RazasNOARazasNOA 6473Altiplano1481546473Altiplano148157 N=36135N=362115 6476Aman'llochico1481501541566476Amarillochico148154157161 N=2442171N=2612392 6482OrgulloCuarenton1481501541586482OrgulloCuarenton148152154157161 N=48207201N=46352162 6480AmarilloGrande1481541566480Amarillogrande148157161 N=4816302N=5023234 6484Amarillochico1481541606484Amarillochico148157161 N=4013261N=4014251 6167Aniplano1481541536167Altiplano148157161 N=288191N=2811124 6313Plslngallo14a1541531626313Plsingano146157161 N=2876213N=321976 6485Blanco14a1541596485Blanco14a157161 N=2211141N=2612122 LíneasMatsuokaetal148150151152154156161L'HOIIMHÏSUOkaeï-al117145152154157161 n=2022a136253225N=2022102228113
Otrasrazasdo
otm'm'd°""é"°'150151152154156172Amédca148152157 N=421341K11N=4814133
TablaA8ALocusbnl1165 RmsNOA
Alelos I
TablaA9—Locusan1700 RazasNOA
Alelos
L
6473Altiplano N=34 6476Amarillo chico N724 6482Orgullo Cuaremon N=48 6480Amarillo Grande N=50 6484Amarillo chico N=38 6167Altiplano N=28 6313Pislngallo N=30 6485Blanco N=26 Líneas
15115315510519
149151153155163165
395112
145147149151153155161
3416922
149151153155157159161
781113434149151153155157163
6216932149151153155157159
1410913149151153155157
111809149151153155157159161
3274226
OtrasrmsdeAmérlca
6473Altiplano N=34 6476Amarillo chico N=24 6482Orgullo Cuarenton N=46 6480Amarillo Grande N=50 6484Amarillochico
N=38 6167Anlplano N=28 6313Pisingallo N=32 6485Blanco204 N=241 Lineas
206 206
208
10208
12
210 21011
210 210 210
212 212 212
214 214 214 214 214 214
8216
27216 216 216
10216 216
14216
7218 218 218 215 218 218
OtrasrazasdeAmórlca
TablaA10-Locusbli/91015 RazasNOA
Alelos
6473Altiplano N=30 6476Amarillochico N=26 6482OrgulloCuarenton N=42 6480AmarilloGrande N=50 6484Arnan'llochlco N=36 6167Altiplano N=26 6313Plslngallo LlneasLiuelal. N=516 Otra.rmsdoAmérlca N=378 Caribe N=12 CentroyEstedeEE.UU. N=46 GuatemalaySurdeMéxico N=64 TierrasAltasdeMéxico N=42 OesteyNortedeMéxloo N=22 NonedeMéxico N=12 SudoestedeEEUU. N=44 ComplejoAndino N=38 OirosSudamericanos N=98
11811
118 124125532
122124 122124
124 124 124 124 124
126
124126114
124126
222126
5126
8126
1126
8
1301325616
13252
132
132 132 132
134136138
896
13413613B
610998
13831
134136138
2
111
136138
710138
13413613B
3
110
139
134 134 134 13424
13425
134
16134 134 140 140 103 14o
a14o
2414o
36
136 136 136 136 136 136 136
1142
80142 142
3142
1142
17
140
138 138
140
1
144146
69
148
4
158162
152154156158160162164166168172173174175176177
832233101023212212
144146148150152154156158160162164166
115144
1144146
64
11 150
1
148
213a2425
162166
11
158160162164166
21224
152154156158
2121
156
161
192
6473Altiplano N=22 6476Amarillochico N=20 6482OrgulloCuarenton N=44 6480AmarilloGrande N=42 6464Arnan'llochlco N=38 6167Altiplano N=28 6313Plslngallo N=30 6485Blanco N=24 LíneasLluetal N=460 OtrasrazasdeAmérlca N=378 Can'be N=12 EsteyCentrodaEE.UU. N=44 GuatemalaySurdeMéxloo N=66 TierrasAltasdeMéxlco N=42 OesteyNortedaMéxico N=24 NonedeMéxico N=12 SudoesïedeEEUU. N=40 ComplejoAndlno N=40 OtrosSudamericanos N=98
166168
168
166 166
166 166 166 166 172 17218
172 172 172 172
168 17416
17420
172 172 17881
178 178 178 178
174 174
176
178 178 173 184 126
18628
18836
189190
118
183184
141
184 184 184 184 184 184 184 184
9186
26
188 188
B188
190
9190 190 190 190
192 192
200 200 200
202 202
206
210162
6473Alllplano N=28 6476Aman'llochlco N=25 6482OrgulloCuarenlon N=48 6480AmarilloGrande N=50 6484Amarillochloo N=40 6167Altiplano N=26 6313Pisingallo LlnaaoLluetal. N=520 OtrasrazasdoAmérica N=382 Caribe N=12 EsteyCentrodeEE.UU. N=48 GuatemalaySurdeMéxico N=64 Tien-asAltasdeMéxico N=42 OesteyNongdeMéxico N=28 NortedeMéxico N=12 SudoestedeEE.UU. N=42 ComplejoAndino N=40 OtrosSudamericanos N=98
150 150151 150 150
152 152
143 148 146 148 148 15-4 15413
154 154
150 150 150 150 150 150 150 15011
156 175 156 156 156 156
157
154 15418
15410
15410
154 160 160 16017
156 156 156 156 156 156 162 162 162 162 162 162
158 158 158 164 164 164
166
168
170
163
172
'lablaA13-Locusbnl1070
Alelos
l
RazasNOA 6473Altlp|ano212222235242254 N=34122245 6476Amarillochlco212228230232237242246250252256 N=262242311236 6482OrgulloCuarenton212222226232233235237240244246248252264 N=4414411281212422 6480AmarilloGrande212228235237240242244246250252258260 N=48921133341867 6484Amañllochico212235248252254258 N=361523619 6167Altiplano212232237240250252254256260 N=28374132431 6313Pislngallo212232235237239240242252 N=3218191282 6485Blanco212232235237239242244246248250252254256 N=242212132511121 Línea.Liuetal.220229230232234236239240241242244246248250252254255256258260262264266267268273275277 N=514372101011121409621782318269521106326235462 0"“m“d"“"6"”22022623023223423623823924o24124224424624a25o252254256258260251262264266267 N=3824419262a9812134254322136624119122511 Caribe23o234239242260 N=1213161 EsteyCemrodeEE.UU.22023924224424624a250254258260262264 N=46122192a171111 GuatemalaySurdeMexico22022623023223423623a23924o24224624a250252254256260267 N=6616141221215142216311 TierrasAnasdeMexico22024o246248250252254255 N=42613661131112 OesteyNonedeMéxico22o24124224624a252254266275 N=24412412622
270271272273275279281287
2222112
NonedeMéxico N=12 SudoestedeEE.UU. N=44 ComplejoAndino N=38
220 220
238244246248254
14213 239244246248250252254
264114210
244246248250252254
12114432
256
1256258260
733
238239240242244246248250252254256258260261262270271272273
62464885391273111121
01m5Sudamericanos220230232 N=97931
164
6473Altiplano N=32 6476Amarillochlco N=24 6482OrgulloCuarenton N=46 6480AmarilloGranda N=50 6484Amarillochico N=4O 6167Altiplano N=28 6313Plslngallo Línea.Llua!al N=458 OtrasrazasdoAmérica N=372 Caribe N=12 EstayCentrodaEE.UU. N=42 GuatemalaySurdeMéxico N=64 Tlen'asAltasdeMéxico N=42 OesteyNortedeMéxlco N=22 NonedaMéxlco N=12 SudoasiedeEE.UU. N42 ComplejoAndlno N=40 OtrosSudamericanos N=98
S'SNS" 81
12 3835
‘96100
100
1
102104106
22272102104106
869104106
106
102104
35
10213
10812
108
9108
5
114
6
118120122123
218
10
110112114116118120122
4110
4
4112 112 112
24116
1
114 114116
7118
2113 118 118
1
3120
116118120
2
1
2
2122
1
126
126128130132
2212
124126128
3124
1124
1126
1
1128
1
4132
2132
136 136
136 140144
22 165
¡ablaA15-Locus[Jn/91666 RazasNOA
Alelos
6473Altiplano N=28 6476Amarillochlco N=24 6482OrgulloCuarenton N=42 6480Aman'lloGrande N=46 6484Amarillochlco N=40 6167Altiplano N=26 6313Plsingallo N=32 6485Blanco N=24 Línea.Liuetal N=516 OtrasrazasdeAmérch N=386 Caribe N=12 EsteyCentrodeEE.UU.N=48 GuatemalaySurdeMexico N=66 TienesAltasdeMexico N=42 OesteyNonedeMéxicoN=24 NortedeMexlco N=12 SudoestedeEEUU. N=44 ComplejoAndino N=40 OtrosSudamericanos N=98
106 111 111 111
103111
108 113 11310
113 113 113 113 113
2110 110 110 110 110 115 115 115 115 115 115 115
4112 112 117 117
27117 117 117 117 117 117 117 117
5
11412
119 127 11942
119 119 119 119 119 119 119
3116 116 121 121
20121
123
120
122
6124 124
126 131 131
133 133
130
132 137
6134 134 134 134 134 139 139
136 136 141 141
2143
147
151
TablaA16Locusbnl1732 RazasNOA
J
Alelos
6473Altiplano N=22 6476Amarillochico N=24 6482OrgulloCuarenton N=44 6480AmarilloGrande N=44 6484Amarillochico N=40 6167Altiplano N=28 6313Plsingallo N=30 6485Blanco "¿21‘ LíneasLiuetal. N=514 OtrasrazasdeAmérlca N=378 Caribe N=6 EasteyCentrodeEE.UU. N=44 GuatemalaySurdeMéxico N=66 TierrasAltasdeMéxico N=44 OesteyNonedeMéxicoN=24 NortedeMéxico N=12 SudoestedeEEUU. N=40 ComplejoAndino N=40 OtrosSudamericanos N=98
100 100 100 233 100 100 100 100 100 100 100 100
102 102 142 102 10218
104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104 104
105 105
106 10612
106 106 106 106 106 106
108 108 108 108
110 110 110 110 110 110 110 110 110
112 112 112 112
114 114 114
116
167
TablaA17-Locusbnl1360 Raza.NOA
Alelos
4L
6473Altiplano N=26 6476Amarillo chloo N=26 6482Orgullo Cuaranlon N=46 6480Amarillo Grande N=46 6484Amarillo chico N=40 6167Altiplano N=28 6313Pisingallo N=32 6485Blanco N=24 leaa Liuelal N=50417 Olmorazasdo América98 N=38214 Caribe N=12 EstayCentrodeEEUU.98 N=484 GuatemahySur DeMéxico N=64 TierrasAllas DeMéxico N=42 OaslayNorte DeMéxico N=22
98103
107109111112113115117119120121123125126127129131133135136137139141143145147149151153155157159161163165169171173
13816111516176166985553242
109
111
2 11 112
1
109111
21109
23109111
31109111
23109
1
113115117119120
230264828383512
115
1115117119
110
113115117119
31322113115117119
144
113115117
342
1 1
117
7117
6117
1117
11911
119
4119 119 119
4
121123125127
4112 123125129
121123125127129
12421121
10121123125129
4234
127
1
121125
21
123125126127129131133135
22
113713
121
4121
4123
2125 125
2
121123125
112
1232073010 11812181014127135
21 129
1
127129131133135
21333127129131133135
43322
131133135
211
136137139141143145147
137139141143
135137139141
1113 137141143147
1122
131133135
211
139141143
231
133137139141145
11411 135
2 137139141143147
653211
131133137147
1153
151
3
149151
11
151
5153155
43153155
53153155
24153
2
159
157159
610159
1
137139141143145147149151153155157159161163165
16828475741222021282422 T
143145151153
2211
151
3824351
155
2
141143145147149151153155157159
1154341
149
121222
147151
2
153155
111
163
1
167 167
177
173179
165
2171175177179189
22222
179181183
322
183
TablaA17-Locusbnl1360 Otrasrazasde América(Cant)
Alelos
___
NonedeMéxico109 N=121 Sudoestede EE.UU.98 N=447 ComplejoAndino N=40 Otros Sudamericanos N=9898
117119121
111
115117119121
2511 117119
524
113115117119120121123125
113641244
127129135
122
131135
11
125126127129131133135
131332
127129131133135
64612
141
137139143
241
141143
32
137139141143145147
223363313
147
2147149151157159161163
2144133
151153155157163
11131151153155159161
32
165169171173179181
223112
6473Altiplano
N-28
6476Amarillochico N=22 6482OrgulloCuerenton N=40 6480AmarilloGrande N=50 6484Amarillochico N=40 6167Altiplano N=28 6313Plslngello N=28 6485Blanco N=26 LinealLluetal. N=41O OtrasrazasdeAmérlca
152
N=3801 Caribe N=12 EsteyCentrodeEE.UU. N=48 GuatemalaySurdeMexico N=64 TienesAllesdeMexico N=40 Oes‘leyNonedeMéxico N=24 NortedeMéxico N=12 SudoestedeEE.UU. N=44 ComplejoAndlno N=40 OtrosSudamericanos N=96
154 15411
150 156 156 156 156 156 156 156 156 156
152 152 152 152 152 152 152 158 153 158 158 158
156 156 156 156
163
1158 158
25158 158 158
166 166 166 166
167
162 168 168
170 170 170 170
172 172 172
170
ContrastesdeStudent-Newman-Keuls(ZAR1984)
DIVERSIDADGENÉTICA
6473vs.6476 6473vs.6482 6473vs.6485 6473vs6313 6473vs6480 6473vs.6167 6473vs.6484TablaA19.RiuezaAlélica(R.)
Dif.rangos
884.5
E.S.
176.974574 154.929016 132.883408 110.837719 88.7918915 66.7457864 44.6989933
(l
4,99789307 5.51220179 5.85851924 6.06742907 7.07834904 8.10538057 12.0136934
3.633 3.314 2.772
TablaA20.HeterociosisH.) 6473vs.6476 6473vs.6482 6473vs.6485 6473vs.6313 6473vs.6480 6473vs.6484 6473vs.6167
Dif.rangos
872.5842
770.5 660.5 616.5529 529
E.S.
176.9745744
154.929016
132.8834075 110,837719288.79189152 66.74578638 44.69899328
q
4.930086724 5.434746968
5.79831609
5.959162681 6.943201563 7.92559393911.83471844
0. CDNLD‘DVÜN
2.772
Análisisdeejemplaresarqueológicos
EnIatablaacontinuaciónsepresentanlosresultadosdelanálisisdeejemplaresarqueológicos.
TablaA21.Éxitodeamplificaciónysecuenciasobtenidasapartirdeejemplaresarqueológicos.N.Amp.:Númerodeamplificacionesoonfragmentos deltamañoesperado.Nro.declones:Númerodeclonesoonlasecuenciaindicadasobreeltotaldeclonesanalizados.S.d.:secuenciasobtenidaspor secuenciacióndirectadelosproductosdeamplificación.Lasréplicasdeextraccióndeunmismoindividuoseindicanconunaletraimprentamayúscula.
Phi127Phi029Phi059
MuestraSitioNro.TamañodeSecuenciasOtrasNro.TamañodeSecuenciasOtrasNro.TamañodeSecuenciasOtras
Amp.losmicrosatsecuenciasAmp.losMicrosatsecuenciasAmp.losMicrosatSecuencias.
fragmentos_4—»ñ_fragmentosfragmentosampüficadosNro.s.d.Nro.s.d. amplmcadosNro.s.d.Nro.s.d.amplificadosNro.s.d.Nro.s.d
ClonesClonesClonesClonesClonesClones
—_
1Punta0'''''0'''''
Colorada Batungasta Batungasta Lorohuasi Lorohuasi
120-2640/800/80150-2110/1512/15
1500
Tebenquiche
m IDOvamohhh
155
00
1500001 150001
O00
7D155000 8TebenquicheBB 9TebenquicheQB
O
O
C
O
O(0N
180
C)
O
O
O
10Tebenquiche
OOOOOVFFFOOOOFN
O
O
O
OtID
O‘‘
OOFONONNOOOONF
13Punta
Colorada _
13B11100
1100/16O9/160130-1550000
‘_
O
O
O
2300/3O2/30
14Punta
Colorada
14B0 -----0 --_-_Á15Punta1130O9/93125-1500001
colorada
15Bo---—.-o--‘
v
l
l
l
l
I
O
130-1500/1707/170
a
u
l
I
l
O O OOOOOOOFFOOOOOO F0100 C
TablaA21.ÉxitodeamIificaciónsecuenciasobtenidasaartirdee'emlaresarueolóisos.Cont.)
Phi127Phi029Phi059
MuestraSitioNro.TamañodeSecuenciasOtrasNro‘Tamañ"deSecuenciasOtrasNro.TamañodeSecuenciasOtras
Amp.losmicrosatsecuenciasAmp.losMicrosatsecuenciasAmp.losMicrosatSecuencias.
fragmentosfragmentosNdNd"aglfïf‘ienaosNdNd
..ro.s. .ro.s. .ampicaosro.s. .ro.s.
amphficadosamphficadosClonesClonesClonesClones
Nro.s.d.Nro.sÏClonesClones
16Balungasta---- 17Batungasta18Batungasta19Batungast20Lorohuasi110-1255/39 21Lorohuasi
0
1100/1300/130_
22Lorohuasi1102/530 23Lorohuasi 24Lorohuasi 25Tebenquiche258 26Tebenquiche268
130-2110/9O9/9O
130 15500O1
28Tebenquiche288 31Lorohuasi 32Lorohuasi 33Lorohuasi34Lorohuasi35Lorohuasi 36Lorohuasi37Morocho
1101300 1101300 1100 1100 110
110/120
000000000000
000000
38Morocho110/1200/13 39Chaucha1105/18
000000F00
000000000
0
IOID1
40Chaucha
u
n
l
I
l
000000000000001-0000001-00"000
0000°F00000F0N0N00FFPFCONNFO
1101/5
41Chaucha
0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0
27Tebenquiche0 ---
0 O 0 0 1 1 1 1 1 1 2 1 1 9
173
TablaA21.Éxitodeamplificaciónysecuenciasobtenidasapartirdeejemplaresarqueológicos.(Cont.)
Phí127
Phi029
Phi059
MuestraSitio
42Pisingallo
3Pisingallo
44Pisingallo
A45‘ïisingano_
46Pisingallo47Pisingallo
Nro.TamañodeSecuenciasAmp.
los
microsat
fragmentosamplificados
0 0 0 1_
‘ 110/120''
Nro.
Clones
s.d.Nro.sÏdÏ
Otras
secuencias Clones
NmTamañodeSecuenCÍaSAmp_losMicrosal
fragmentosNdNd
'ro.s_,I'O.S..
amplificadosClonesClones
Otras
secuencias
_4_8_PisingalloÑ
51NEW
Colorada
52 53
colorada
__54_1AI€tïeïdíiEEE
55Tebenquiche56 57Tebenquiche
Tebenouiche
O 1 '2 0 2
110 110
«110
1i‘ow
5/5‘
1
0
9/11 8/26
0
0 [2
1
15o
Nro.TamañodeSecuenciasAmp.
los
fragmentosamplificadosNro.
Clones
Microsat
s.d.
Otras
Secuencias.
Nro.s.dClones
1
l
ÍO ioioio
156-306 153390
161
0 94 A
0 00“A"‘711
O1
0
10/170