Divergencia de la permeabilidad intestinal y mucosa inmunolgico expresin

gnica en dos condiciones asociadas al gluten: la enfermedad celaca y la

sensibilidad al gluten

Abstracto

Fondo La enfermedad celiaca (EC) es una enteropata autoinmune desencadenada por la ingestin de gluten. Las personas sensibles al gluten (GS) no pueden tolerar el gluten y pueden desarrollar sntomas gastrointestinales similares a las de CD, pero el cuadro clnico general es generalmente menos grave y no se acompaa de la concurrencia de autoanticuerpos transglutaminasa tisular o comorbilidades autoinmunes. Mediante el estudio y la comparacin de la expresin de la mucosa de los genes asociados con la funcin de la barrera intestinal, as como la inmunidad innata y adaptativa en CD en comparacin con GS, hemos tratado de comprender mejor las similitudes y diferencias entre estos dos trastornos gluten asociada.

Mtodos CD, GS y, individuos sin gluten tolerante sanos se inscribieron en este estudio. La permeabilidad intestinal se evalu usando una sonda de lactulosa y manitol, y las muestras de biopsia de la mucosa se recogieron para estudiar la expresin de genes implicados en la funcin de barrera y la inmunidad.

Resultados A diferencia de CD, GS no se asocia con aumento de la permeabilidad intestinal. De hecho, esto se redujo significativamente en GS en comparacin con los controles ( P = 0,0308), en paralelo con el aumento significativamente la expresin de claudina (CLDN) 4 ( P = 0,0286). Relativa a los controles, los marcadores de inmunidad adaptativa interleucina (IL) -6 ( P = 0,0124) e IL-21 ( P = 0,0572) se expresaron en niveles ms altos en CD, pero no en GS, mientras que la expresin del receptor Toll-like marcador de la inmunidad innata (TLR) 2 se increment en GS, pero no en CD (P = 0,0295). Por ltimo, la expresin del marcador de clulas FOXP3 T-regulador se redujo significativamente en GS respecto a los controles ( P = 0,0325) y los pacientes con EC ( P = 0,0293).

Conclusiones Este estudio muestra que los dos trastornos gluten asociada, CD y GS, diferentes entidades clnicas, y contribuye a la caracterizacin de GS como una condicin asociada a la activacin inducida por el gluten prevalente de respuestas innatas, en lugar de adaptacin, inmunes en ausencia de cambios detectables en la funcin de barrera de la mucosa.

Fondo

El gluten es el componente de protena estructural del trigo granos, centeno y cebada, que son la base para una variedad de productos de harinas de trigo y derivados de alimentos consumidos en todo el mundo. Posiblemente, la introduccin de granos que contienen gluten, que se produjo hace unos 10.000 aos con la llegada de la agricultura, representaba un "error de la

evolucin" que cre las condiciones para las enfermedades humanas relacionadas con la exposicin al gluten, el ms conocido de los cuales estn mediadas por el sistema inmune adaptativo: alergia al trigo y la enfermedad celaca (EC). En ambas condiciones, la reaccin al gluten est mediada por la activacin de clulas T en la mucosa gastrointestinal. Sin embargo, en la alergia al trigo, es la reticulacin de la inmunoglobulina E (IgE) por secuencias de

repeticin en pptidos de gluten (por ejemplo, Ser-Gln-Gln-Gln (Gln) Pro-Pro-Phe) que desencadena la liberacin de mediadores qumicos, tales como histamina, desde los basfilos y mastocitos[ 1 ]. En contraste, CD, que afecta aproximadamente al 1% de la poblacin general, es un trastorno autoinmune, como anunciado por la apreciacin de los marcadores serolgicos especficos, transglutaminasa anti tejido (tTG) autoanticuerpos sricos ms notablemente, por la enteropata autoinmune que caracteriza a esta condicin y por comorbilidades autoinmunes. Adems de CD y alergia al trigo, hay casos de reacciones de gluten en la que estn implicados mecanismos ni alrgicas ni autoinmunes. Estos se definen generalmente como la sensibilidad al gluten (GS)[ 2 - 5 ]. Algunas personas que sufren de angustia cuando el consumo de productos que contienen gluten y muestran mejoras cuando se sigue una dieta libre de gluten pueden tener GS en lugar de CD. GS pacientes no pueden tolerar el gluten y desarrollar una reaccin adversa al consumo de gluten que normalmente, y de manera diferente desde el CD, no conduce a dao del intestino delgado. Mientras que los sntomas gastrointestinales en GS pueden parecerse a los asociados con CD, el cuadro clnico general suele ser menos grave y no se acompaa de la concurrencia de autoanticuerpos tTG o enfermedad autoinmune. Por lo general, el diagnstico se hace por exclusin, y una dieta de eliminacin y "desafo abierto" (es decir, la reintroduccin supervisado de los alimentos que contienen gluten) se utilizan con mayor frecuencia para evaluar si la salud del paciente mejora con la eliminacin o reduccin de gluten de la dieta. Un nmero de in vitro estudios han confirmado la citotoxicidad de antgeno principal de gluten, gliadina. La gliadina ha actividad aglutinante, reduce el contenido de F-actina, inhibe el crecimiento celular, induce la apoptosis, altera el equilibrio redox y

causa una reorganizacin del citoesqueleto a travs de la va de la zonulina y la prdida de la unin estrecha (TJ) competencia en la mucosa gastrointestinal[ 6 - 9 ]. La diversidad de condiciones inducidas por el gluten est en lnea con la idea de que el sistema inmunolgico reacciona y ofertas con el factor ambiental desencadenante, la gliadina, de maneras distintas. En el presente estudio, hemos tratado de obtener conocimiento inicial sobre la funcin de barrera intestinal y la respuesta inmune al gluten en pacientes con GS.En concreto, se mostraron interesados en entender en qu medida las vas inmune innata y adaptativa se activan en la SG en comparacin con el CD. Para alcanzar estos objetivos, nos fijamos en la expresin de la mucosa de los genes asociados con la funcin de barrera intestinal y parmetros inmunes conocidas o implcitas ser regulados de manera aberrante en CD. Los resultados proporcionan la primera documentacin actualizada de genes y las vas posiblemente implicados en la patognesis de la GS, y, al mismo tiempo, contribuyen a mejorar nuestra comprensin de los procesos que conducen a CD y otros fenmenos autoinmunes.

Mtodos

Definicin de GS

Pacientes GS se definen como aquellos

pacientes en los que (diabetes tipo 1,

enfermedades inflamatorias del intestino y

CD, la alergia al trigo y otras enfermedades

clnicamente superpuestasHelicobacter

pylori infeccin) se han descartado y cuyos

sntomas fueron provocados por la

exposicin al gluten y aliviado por la retirada

del gluten. Todos los pacientes incluidos

fueron sometidos a una estimulacin con

gluten realizado por aproximadamente 4

meses bajo la supervisin clnica. Al final del

desafo, los pacientes fueron sometidos a

pruebas serolgicas de deteccin de CD,

antgeno leucocitario humano (HLA) DQ2 /

DQ8 escribir y una endoscopia digestiva alta

con biopsia duodenal. Una vez que se

realizaron las endoscopias, los pacientes se

vuelven a colocar en una dieta libre de

gluten y sus sntomas controlados a travs

del tiempo. GS se consideraron los pacientes

con serologa negativa autoanticuerpos

(anticuerpos antiendomisio inmunoglobulina

A (IgA-EMA) y tTG-IgA), la mucosa normal

(Marsh etapa 0) o aumento de los linfocitos

intraepiteliales (Marsh etapa 1) y la mejora

de los sntomas a los pocos das de la

aplicacin de la dieta. Para evitar cualquier

posible sesgo de seleccin y para demostrar

que estos pacientes son diferentes de los

pacientes con EC, hemos elegido para

inscribir a todos los pacientes el

cumplimiento de la definicin descrita

anteriormente de la sensibilidad al gluten.

Sujetos

Se obtuvo el consentimiento de todos los

sujetos inscritos despus se explic la

naturaleza de la investigacin y de acuerdo

con el protocolo aprobado por la Junta de

Revisin Institucional de la Universidad de

Npoles. Un total de 26 GS pacientes

diagnosticados segn los criterios antes

mencionados se inscribieron. En

comparacin, 42 pacientes con EC activa

fueron reclutados de acuerdo con los

criterios modificados 2004 de la Sociedad

Europea de Gastroenterologa Peditrica,

Hepatologa y Nutricin (ESPGHAN)[ 10 ]. Por

ltimo, 39 sujetos de control fueron

matriculados entre individuos sometidos a

endoscopia digestiva alta para la

dispepsia. Limitamos nuestro grupo control a

los individuos que tenan exclusivamente

sntomas disppticos y sin inflamacin

subyacente como lo demuestra la tasa de

sedimentacin de eritrocitos normales, la

protena C reactiva y la evaluacin

mucoprotena. Estos sujetos no tienen CD o

GS y se denomina en lo sucesivo como

controles disppticos (DC).

Asunto caractersticas se resumen en la

Tabla 1 . Para cada conjunto de

experimentos, un subgrupo representativo

de CD, GS y DC se analizaron sobre la base

del consentimiento de los sujetos para

participar en la totalidad o parte de los

estudios propuestos y sobre acuerdos de

transferencia de material entre las

instituciones que participan en este

proyecto. Al menos seis biopsias duodenales

fueron recogidos para la evaluacin

histolgica y la expresin gnica. No se

observ ningn sesgo de seleccin basado en

el sexo, la edad o tipo de sntomas.

Determinacin de la permeabilidad

intestinal

In vivo la permeabilidad se determin por

medio de la lactulosa / manitol (LA / MA) de

prueba como se describi

previamente[ 11 ]. La deteccin y la medicin

de las dos sondas de azcar en la orina se

realiz por cromatografa de intercambio

aninico de alto rendimiento acoplada con

deteccin amperomtrica pulsada, que

permite la cuantificacin directa de los

hidratos de carbono no derivados en un

modelo de Dionex DX-500 con un bucle de

muestra de GP40 y mdulo de bomba de

gradiente de 50 l. Las muestras se cargaron

en CarboPac PA-100 columnas de guardia y

se eluy con un gradiente de NaOH-NaAc

(Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.).

Tabla 1

Caractersticas clnicas y de laboratorio del estudio de sujetos

Histologa e inmunohistoqumica de

biopsias yeyunales

Serial secciones (4 m) se prepararon a partir,

biopsias incluidas en parafina fijado en

formol duodenales. Las muestras de biopsia

se organizaron por la histologa de acuerdo a

la clasificacin de Marsh [ 12 , 13 ]. La

inmunotincin para identificar los linfocitos

intraepiteliales (IEL) se realiz como se

describe en otra parte[ 14 ]. Secciones fijadas

con acetona (5 micras) se tieron con

anticuerpos monoclonales para CD3 (1: 200;

Dako, Miln, Italia) y receptor de clulas T

(TCR) (1:50; Thermo Scientific, Rockford,

IL, EE.UU.), utilizando el protocolo de

peroxidasa-antiperoxidasa. Las secciones

fueron finalmente se tieron con

hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, EE.UU.). Densidad de IEL se

calcul como el porcentaje de los enterocitos

(ECs). Todas las diapositivas fueron

analizadas por dos observadores que

desconocan estos procedimientos.

Determinacin de la expresin gnica de la

mucosa

Intestinal la expresin gnica se midi

mediante reaccin en cadena de la

polimerasa en tiempo real (qPCR) ensayo

cuantitativo como se describi

previamente [ 15 ]. Biopsias intestinales

pequeos de sujetos participantes fueron

homogeneizados y el ARN total fue extrado

por medio de reactivo Trizol (Invitrogen,

Grand Island, NY, EE.UU.). Los cebadores y

sondas para qPCR de transcripciones

especficas y de la 18S genes como un control

de limpieza fueron adquiridos de Applied

Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). qPCR se

realiz utilizando el protocolo TaqMan y el

Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR

System. Las condiciones de amplificacin

fueron las siguientes: 50 C durante 2

minutos y 95 C durante 10 minutos,

seguido de 50 ciclos a 95 C durante 15

segundos y 60 C durante 1 minuto. Los

datos se calcularon como el cambio en el

ciclo umbral ( CT ) del gen de inters

para 18S y se expresan como porcentajes

de 18S (es decir, 2 -CT 100).

El anlisis estadstico

Se analizaron todos los datos y se

representan utilizando la versin 5.0 del

software Prisma (GraphPad Software, La

Jolla, CA, EE.UU.). La mayor parte de las

variables examinadas en este estudio

parecan estar dispuestos en una distribucin

no normal, sesgada positivamente, por lo

que la estadstica paramtrica

convencionales engaosa. Por lo tanto, los

datos son descritos por las medianas y

rangos intercuartil (IQRs), y el grado de

variabilidad entre los grupos se determin

utilizando el algoritmo no paramtrico de

Kruskal-Wallis. A dos colas de Mann-

Whitney U test fue utilizado (UTH) para las

comparaciones por pares. El nivel de

significacin se fij en P

particular, fue significativamente mayor en

los pacientes con EC en comparacin con los

pacientes SG ( P = 0,0138; UTH). Una

diferencia similar entre los pacientes con EC

y DC slo aproximada significacin ( P =

0,0950). Curiosamente, la relacin / MA LA

en pacientes GS tambin se redujo

significativamente en relacin con DC ( P =

0,0308) (Figura1 ).

Figura 1:

Reduccin de la permeabilidad intestinal en (GS) de los pacientes sensibles al gluten . La permeabilidad del

intestino delgado se probaron mediante la medicin de la cantidad urinaria acumulada 5-horas de lactulosa

(LA) (porcentaje de ingerido), manitol (MA) y la relacin-LA-a MA como se describe en (ver Mtodos). Cajas

representan las medianas y rangos intercuartil, con bigotes representan el rango de determinaciones

independientes en 13 GS pacientes, 11 celacos enfermedad (CD) de los pacientes, y 14 controles disppticos

(DC) (ver seccin permeabilidad intestinal del texto, pginas 8-9) . * P

Expresin del intestino delgado de

protenas TJ

Para entender si los cambios en la

permeabilidad intestinal observada en CD y

GS estn asociados con la expresin alterada

de genes que codifican para componentes

clave TJ, la expresin de claudins (CLDN),

protena TJ (TJP) -1 (tambin conocido como

zonula occludens-1) y ocludina (OCLN) se

determin en tejidos intestinales obtenidas

por endoscopia digestiva alta. Las biopsias se

procesaron inmediatamente para la

extraccin de ARNm, y los niveles de

transcripcin de los

genes CLDN1 , CLDN2 , CLDN3 , CLDN4 , TJP1

y OCLN se midieron por qPCR. Como se

muestra en la figura2 , CLDN4 se expres en

niveles significativamente ms altos en GS

que en CD ( P = 0,0286), mientras que una

diferencia similar con DC casi alcanz

significacin ( P = 0,0565).Niveles similares

de CLDN4 se detectaron en las biopsias de

DC y CD ( P = 0,7279; no

significativo). Asimismo, no se observaron

diferencias significativas entre los tres grupos

en los niveles de mRNA de CLDN1 o CLDN2 o

los otros genes relacionados con TJ-

examinados (no mostrados). Aunque esto

podra ser debido al limitado nmero de

casos estudiados, es poco probable que la

inclusin de una muestra ms amplia podra

compensar el alto nivel de variabilidad y

asimetra encontrado dentro de cada grupo.

Figura 2:

La expresin relativa de unin estrecha (TJ) -relacionados genes en la mucosa de los pacientes sensibles al

gluten (GS) frente a los pacientes con enfermedad celaca (EC) . La expresin de los genes indicados

codifican para componentes del complejo TJ se midi por ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa

cuantitativa de ARN extrado de muestras pequeas bioptic intestinales (ver Mtodos). Cajas representan la

mediana (relacin intercuartil), y los bigotes representan el rango de los niveles de ARN relativos, expresados

como un porcentaje de un 18S limpieza de genes en 24 pacientes GS, 31 pacientes con EC y 24 controles

disppticos. * P

Linfocitos intraepiteliales

Los pacientes GS reclutados en este estudio

no presentaron fenmenos autoinmunes

pertinentes y serologa autoinmune

(Tabla 1 ). Adems, en este grupo de

pacientes, no detectamos una asociacin

clara con el haplotipo complejo mayor de

histocompatibilidad (MHC), tan ampliamente

documentado en pacientes con EC. Estos

hallazgos clnicos nos llevaron a plantear la

hiptesis de que el sistema inmune

adaptativo puede no ser tan crticamente

involucradas en GS como en el CD (o en la

alergia al trigo). Para fundamentar este

argumento, nuestros criterios de valoracin

incluidos los marcadores de la respuesta

inmune adaptativa e innatas en la mucosa

del intestino delgado de estos temas. En una

primera serie de observaciones, se compar

el nmero de LIE en GS frente a los pacientes

con EC. Como se inform recientemente por

nuestro grupo[ 15 ], la histologa revel una

normal a ligeramente inflamada mucosa

(Marsh etapa 0 o 1) en pacientes GS,

mientras que todos los pacientes con EC

mostraron atrofia vellosa parcial o subtotal

con hiperplasia de las criptas de acuerdo con

los criterios ESPGHAN[ 10 ]. Los resultados

de inmunohistoqumica CD3 se resumen en

la figura3 . El nmero de CD3 + IELs variaron

considerablemente entre los tres grupos

(P

La expresin de la mucosa de citocinas

relacionadas con la inmunidad adaptativa

Un nmero de estudios han documentado el

aumento gluten-dependiente en la expresin

sistmica y de la mucosa de citoquinas

asociada con las respuestas de adaptacin

Th1 y Th17 en CD [ 16 - 19 ]. Recientemente

hemos demostrado que la firma de

citoquinas Th17, IL-17A, se expresa en

niveles significativamente ms altos en la

mucosa intestinal de pacientes con EC pero

no GS pacientes[ 15 ]. Tambin hemos

demostrado que la gliadina induce

monocitos circulantes para producir la

citoquina-Th17 activo, IL-23, un efecto

mediado por la expresin concomitante de

IL-1 y IL-6[ 17 , 20 ]. Para extender estas

observaciones y para definir an ms el

papel de la inmunidad adaptativa en GS,

mRNA extrado a partir de pequeas biopsias

del intestino delgado fue sometida a qPCR

para la expresin de la pleiotrpica, Th17

activador de citoquina interleuquina (IL) -6,

la citocina Th1 interfern (IFN) -, e IL-21,

una citocina Th1 involucrado tanto en la

diferenciacin de las clulas Th17 y en el

mantenimiento de las respuestas Th1 en

curso[ 21].

Como se muestra en la figura 4 , los

pacientes de CD como un grupo expresaron

mayores niveles de transcripciones de IL-6

(IL6), IFN- ( IFNg ) y IL-21 (IL21) en relacin

con DC. Sin embargo, debido a un alto grado

de variabilidad entre los donantes CD y

debido a un efecto de subgrupos ya

documentado en nuestro informe anterior

sobre IL-17A[ 15 ], slo la diferencia en la

expresin de IL-6 fue estadsticamente

significativa ( P = 0,0124), mientras que las

diferencias en IFNg los niveles de

transcripcin y IL21 aproximadas

significacin ( P = 0,0700 y P = 0,0572,

respectivamente). Los niveles de IL6, IFNG , y

transcripciones de IL21 en muestras de

pacientes GS no difirieron significativamente

de los de DC o CD, a excepcin de una

reduccin significativa en IFNg niveles

relativos de CD ( P = 0,0222). IFNG era el

nico gen de citoquina probado que

mostraron un importante grado de

variabilidad entre los tres grupos ( P

Expresin del intestino delgado de los

receptores tipo Toll

Se ha informado de que la expresin de Toll-

like receptor 1 ( TLR1 ), TLR2 y TLR4 se

incrementa en la mucosa del intestino

delgado de pacientes con EC, apoyando la

idea de que los fenmenos inmune innato

puede preceder a y / o acompaar a la

progresin de la CD y otras condiciones

autoinmunes[ 22 - 24 ]. Para evaluar

preliminarmente la participacin de la

inmunidad innata en GS, comparamos la

expresin de estas molculas en biopsias

frescas de los tres grupos de estudio. Como

se ilustra en la figura5 , la expresin

de TLR1 y TLR2 , pero no TLR4 , mRNA fue

mayor en los pacientes con EC que en DC,

pero ninguna de estas diferencias alcanzaron

significacin. En contraste, en relacin a DC,

los pacientes con GS present niveles

significativamente ms altos

de TLR2 transcripciones ( P = 0,0295),

mientras que los niveles de transcripcin

de TLR1 y TLR4 en GS fueron generalmente

mayores sin alcanzar significacin ( P =

0,0932 y P = 0,1274, respectivamente).

Figura 5:

El aumento de los niveles de transcritos para los receptores de reconocimiento de patrones en la mucosa

de pacientes sensibles al gluten (GS), pero los pacientes con enfermedad no celaca (CD). La expresin de

los genes indicados codifican para receptores Toll-like TLR1, TLR2 y TLR4 se midi por ensayo de reaccin en

cadena de la polimerasa cuantitativa (ver Mtodos). Cajas representan la mediana (rango intercuartil) y

bigotes representan el rango de los niveles de ARN relativos a un 18S limpieza de genes en 8 GS, 12 CD y 5

controles disppticos (DC). * P

niveles de expresin tanto de FOXP3 y TGFB1

en pacientes con EC no difieren

significativamente de los de CC ( P = 0,8868

y P = 0,1535, respectivamente). En cuanto a

TGFB1, no parece haber una tendencia hacia

menores, en lugar de ms alta, niveles de

expresin en pacientes con EC

(Figura6 ). Este fenmeno fue ms acentuado

en los pacientes GS, en los que la expresin

de FOXP3 y TGFB1 fue, significativamente

para FOXP3, reducido con respecto al DC

( P = 0,0325 y P = 0,0710,

respectivamente). Reduccin de FOXP3 en

GS represent una variacin significativa

entre los grupos ( P

sntomas similares a los CD, pero con

serologa negativa CD y la histopatologa.Al

igual que en el CD, estos pacientes, aqu y en

otros lugares a que se refiere como GS[ 15 ],

la experiencia de dificultad al comer

productos que contengan gluten y muestran

una mejora cuando se sigue una dieta sin

gluten. A diferencia de los CD, sin embargo,

en GS las reacciones adversas que se

desarrollan mientras que el consumo de

gluten no son seguidos por la aparicin de

autoanticuerpos y por la persistencia de

daos en el intestino delgado. Los sntomas

en GS pueden parecerse a algunos de los

sntomas gastrointestinales que se asocian

con el CD o alergia al trigo, pero las pruebas

diagnsticas objetivas para esta condicin se

encuentran actualmente desaparecidos. Por

lo tanto, un diagnstico de GS se hace

comnmente por exclusin.

En s misma, la ausencia de autoanticuerpos

y lesiones intestinales no descarta la

toxicidad intrnseca de gluten, cuya ingesta,

incluso en individuos no-CD, se ha asociado

con el dao a otros tejidos, rganos y

sistemas adems el intestino [ 6 , 30 , 31 ]. En

el presente estudio, hemos tratado de

identificar funcionales, morfolgicas y

parmetros inmunolgicos para ayudar a

diferenciar GS de CD y comprender de forma

preliminar su fisiopatologa. Presentamos

aqu por primera vez pruebas de las

respuestas de la mucosa intestinal

diferenciales al gluten en estas dos

condiciones.

Hemos demostrado que una normal a la

histologa leve en GS es paralela a una

funcin de barrera conservado. De hecho, la

permeabilidad intestinal pequea, cuando se

prueba con una sonda de azcar doble LA /

MA, fue significativamente menor en GS que

en los pacientes de CD o incluso

DC. Aumento de la permeabilidad intestinal

se piensa que es un cambio biolgico

temprana que precede a la aparicin de

varias enfermedades autoinmunes[ 32 -

34 ]. La prdida de la funcin de barrera

intestinal trae consigo un pasaje aberrante

continua de antgenos a travs del epitelio

intestinal. Esto puede causar un cambio de la

tolerancia a la inmunidad, por lo tanto, lo

que representa un aumento del riesgo de

enfermedades autoinmunes y alrgicas en

individuos cuyo otro gentica determinantes,

MHC y no-MHC, dan lugar a no apropiado

procesamiento y presentacin de

antgenos. En el epitelio intestinal, la

permeabilidad paracelular est regulada por

protenas TJ intercelulares. Como se muestra

recientemente, Cldns son componentes

integrales TJ que son crticos para el

mantenimiento de adhesin clula-clula en

monocapas epiteliales [ 35 -37 ]. El balance

global de especies CLDN expresado en un

tipo de clula ayuda especial, para definir las

caractersticas de su TJ. Por ejemplo, CLDN1

y CLDN4 se postulan a disminuir, mientras

que CLDN2 se postula para aumentar TJ

dependiente de la permeabilidad[ 35 ]. En

lnea con esta nocin, y con la apreciacin de

la reduccin de la permeabilidad intestinal

pequea en pacientes GS, hemos

demostrado aqu que la mucosa GS expresa

niveles significativamente ms altos de las

transcripciones de CLDN4 relativa a CD o

DC. En contraste, otros CLDN genes y otros

genes asociados con la funcin TJ medido en

este estudio no parecen expresarse de

manera diferente en el GS o CD mucosa en

comparacin con los controles. En conjunto,

estos resultados sugieren que las

caractersticas clnicas y serolgicas

diferentes entre los pacientes GS y CD estn

asociados con marcadas diferencias en la

funcin de barrera de la mucosa y con

aparentes diferencias en la expresin

de CLDN4 , que codifica para un componente

crtico TJ[ 38 ]. Se requieren ms estudios

para comparar la distribucin y montaje de

esta y otras protenas TJ en estas

condiciones.

Los pacientes con GS no presentan

autoinmune significativos o comorbilidades

alrgicas, y, como tambin hemos mostrado

aqu, la serologa para autoanticuerpos

comunes, incluyendo anti-tTG IgA, es

negativo. Curiosamente, AGA IgA e IgG

fueron positivos en casi el 50% de los

casos. De manera similar, ms altos que los

ttulos esperados de los OPA, los signos y

sntomas asociados con la sensibilidad al

gluten no-CD, tambin se han reportado para

la esquizofrenia[ 39 ] y los trastornos del

espectro autista[ 40 ]. Mientras que en CD

hay una fuerte asociacin gentica con la

clase II MHC haplotipo, con

aproximadamente 95% de los pacientes

portadores de HLA-DQ2 y el restante 5% en

libros HLA-DQ8 , hemos demostrado que

slo alrededor del 50% de los pacientes con

GS carry HLA -DQ2 y / o HLA-DQ8 , un

porcentaje ligeramente ms alta que en la

poblacin general. Esto sugiere una

reduccin del nivel de implicacin de la

respuesta inmune adaptativa MHC-

dependientes de GS respecto a CD. Adems,

hemos demostrado que la mucosa GS

contiene nmeros de CD3 aument + IELs, a

pesar de que estos nmeros fueron

significativamente inferiores a los de los

pacientes con EC activos en el contexto de la

arquitectura de las vellosidades

relativamente conservadas, que

corresponden a los 0 y 1 etapas de la

clasificacin de Marsh. Esto est en

consonancia con una participacin ms

limitada del sistema inmune adaptativo en

GS y puede explicar por qu esta condicin

no se acompaa de fenmenos autoinmunes

significativos.

En CD, una respuesta adaptativa se ha

demostrado que ser desencadenada por los

pptidos del gluten tTG-desamidadas unidos

a DQ2 o DQ8. Esto implica el reclutamiento y

la activacin de la mucosa Th1 y Th17 clones

y la produccin de citoquinas Th1 y Th17-

asociado, a saber, IFN- y la IL-17A, que

contribuyen a perturbar la funcin de

barrera y el inicio de dao tisular[ 16 , 18 -

21 ,41 ]. En un informe anterior, se

demostr que las transcripciones de IL-17A

se expresan en niveles significativamente

ms altos en la mucosa del intestino delgado

de al menos un subgrupo de pacientes con

EC, pero no en pacientes GS[ 15 ]. En este

estudio, hemos ampliado este hallazgo y

demostrar que la firma de citoquinas Th1,

IFN-, tambin se expresa en niveles

significativamente ms bajos en la mucosa

GS frente a CD. Adems, en CD, pero no en

GS, se observ una mejora de forma

significativa la expresin de IL-6, una

citoquina pleiotrpica que es conocido por

promover la diferenciacin y funcin de las

clulas Th17, as como una tendencia similar

en la expresin de IL-21, coherente con su

papel establecido en la patofisiologa de las

clulas Th1 y Th17.

Estos resultados podran indicar que GS es

una condicin inflamatoria principalmente

apoyado por mecanismos inmunes

innatas. Entre estos, TLRs representan una

familia de evolutivamente conservados

receptores capaces de detectar la invasin

microbiana a travs de reconocimiento de

patrones y mediar una respuesta

inflamatoria rpida que puede o no puede

progresar en una respuesta adaptativa

dependiente de antgeno. Diferentes

combinaciones de los TLR se expresan en

clulas hematopoyticas y clulas no

hematopoyticas tales como clulas

epiteliales intestinales[ 42 - 44 ]. En este

estudio, hemos observado que la pequea

expresin intestino de TLR2, y en menor

medida TLR1 pero no TLR4, se incrementa en

pacientes GS. En la ausencia de marcadores

de la inmunidad adaptativa, como hemos

visto, esto sugiere un papel predominante

del sistema inmune innato en la patognesis

de la GS.

En conjunto, estos resultados apoyan la idea

de que la participacin frecuente de innata

frente a vas inmunitarias adaptativas puede

ayudar a explicar las diferencias clnicas y

serolgicas en GS frente a los pacientes con

EC. Reduccin de la funcin de las clulas

Treg, y especficamente de las clulas Treg

"adaptativo", se ha propuesto para tener en

cuenta la prdida de la homeostasis inmune

y el desarrollo de respuestas autoinmunes en

CD y condiciones relacionadas[ 26 ]. Se

podra inferir, entonces, que Treg podra

prevenir eficazmente la progresin de esta

respuesta en pacientes GS. Una expresin de

la mucosa significativamente reducida del

marcador distintivo Treg, FOXP3, como se

aprecia en pacientes GS en este estudio, por

lo tanto, es sorprendente y contrario a la

intuicin, a la luz de estas

consideraciones. Sin embargo, al menos tan

sorprendente, en varios estudios FOXP3 y

otras molculas expresadas-Treg, tales como

TGFB1, se han encontrado para ser

upregulated en la sangre perifrica y la

mucosa intestinal de los pacientes con

condiciones de CD y relacionados, por

ejemplo, la diabetes tipo

1[ 28 , 45 ].Hallazgos anlogos han sido

reportados en otras condiciones asociadas

con la amplia participacin de la inmunidad

adaptativa, tales como la alergia y el asma,

dando lugar a la especulacin de que una

expansin y / o la movilizacin

compensatorio de Treg pueden tener lugar

de forma concomitante con la acumulacin

de una respuesta efectora

adaptativo[ 46 ]. Paradjicamente, entonces,

si esta suposicin es cierta, una expresin

reducida de marcadores Treg en GS podra

interpretarse en el contexto de una

activacin general reducida de adaptacin

relativa inmunidad a CD. Aunque obviamente

se necesitan ms estudios para dilucidar esta

cuestin, una mejor comprensin de la

funcin de Treg en CD y afecciones

relacionadas ayudar a caracterizar el posible

papel patognico de la reduccin de la

activacin y / o contratacin de Treg en GS.

Conclusiones

Los resultados de este estudio sugieren que

la CD y GS son entidades clnicas distintas

causadas por diferentes respuestas de la

mucosa intestinal al gluten. CD resulta de un

complejo, y an por determinar, interaccin

de aumento de la permeabilidad intestinal,

dao de la mucosa, los factores ambientales,

adems de gluten, y la predisposicin

gentica, que implica tanto MHC y genes no-

MHC. Las lesiones intestinales tpicos en CD

se piensa que es mediado por las rutas

efectoras inmunes innatas y

adaptativas. Nuestros hallazgos sugieren

que, de una manera diferente, GS se asocia

con la activacin frecuente de una respuesta

inmune innata. Aunque los mecanismos

responsables de la prdida de la funcin de

barrera intestinal en CD se han delineado en

parte, todava no se entienden

completamente los factores responsables de

la prdida de la tolerancia al gluten y el

desarrollo de autoinmunidad en esta

condicin. Creemos que este estudio podra

contribuir a la caracterizacin clnica de GS

como una condicin asociada a la activacin

inducida por el gluten prevalente de la

inmunidad innata en ausencia de cambios

detectables en la funcin barrera de la

mucosa, y que proporciona pistas adicionales

a la definicin del complejo gluten inducida

por los cambios en la regulacin TJ y

procesos inmunolgicos subyacentes

patognesis de CD. Doble ciego, controlados

con placebo son necesarios para consolidar

an ms la definicin de los pacientes GS y la

bsqueda de biomarcadores especficos para

un diagnstico adecuado.

Abreviaturas

AGA: anticuerpos anti-gliadina; CD:

enfermedad celaca; CLDN: claudina; DC:

controles de dispepsia; CE:

enterocito; Anticuerpos antiendomisio;:

EMA FOXP3: P3 cuadro forkhead; GS: la

sensibilidad al gluten; IEL: linfocitos

intraepiteliales; IFN: interfern; IL:

interleucina; LA: lactulosa;MA:

manitol; MHC: complejo mayor de

histocompatibilidad; OCLN: oclusin; PCR:

reaccin en cadena de la polimerasa; TGF:

factor de crecimiento transformante; Th: T

auxiliares; TJ: unin estrecha; TLR:

receptores Toll-like; Treg: las clulas T

reguladoras; tTG: la transglutaminasa tisular.

Conflicto de intereses

AF es accionista del ALBA Therapeutics

(Baltimore, MD, EE.UU.). AS, KML, VC, MC,

MTG, MD, RS, GM, CT, AP, MIR, PE, FF, MC,

GR y LDM no tienen intereses en

competencia para declarar.

Autores de las contribuciones

AS, GM y AF concibe el estudio. AF apoy el

estudio. AS, KML, VC, MTG, GM, MC, LDM y

AF contribuyeron al diseo del estudio. AS y

KL llevan a cabo la mayor parte de los

estudios de gentica molecular. MC llev a

cabo el ensayo molecular de las vas de los

receptores de tipo Toll.MD, CT y GR

participaron en los estudios de alineamiento

de secuencias. RS y FF llevado a cabo

ensayos de inmunohistoqumica; MIR y PE

participaron en el reclutamiento de los

pacientes y llevaron a cabo los

procedimientos de endoscopia. AS, KML, VC

y AF estaban involucrados en el anlisis e

interpretacin de los datos. AS, KML, VC, GM

y AF redact el manuscrito. AS, KML, VC, MD,

CT, MC, GR, LDM y AF revisado crticamente

el manuscrito. Todos los autores dieron su

aprobacin final de la versin del manuscrito

que se publicar.