UNIVERSIDAD TECNLOGICA DE TECMAC

Divisin de Biotecnolgica

DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO

Grupo: 4QBT3

Elaborado por:

Castaeda Navarro MonserratProfesora:

Beni Camacho Prez

INTRODUCCIN

El diseo y la optimizacin de medios de cultivo es una tarea cotidiana en microbiologa. Sin embargo, el concepto formal de optimizacin esta vagamente definido entre los microbilogos y, la mayora de las veces, los mtodos para hacerlo estn mal empleados. La aparente razn que explica esta situacin es que el diseo y la optimizacin de medios de cultivo son procesos matemticos que requieren de un conocimiento mnimo de los mtodos estadsticos. (Valderrama, 1997).

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.

Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg;

b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro;

c) Factores de crecimiento, que estn constituidos generalmente por componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en: 1) medios sintticos o medios qumicamente definidos,

2) medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable.

DISEO

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos. (Ertola, 2012).

Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del CO2 como las algas y algunas bacterias, y los heterotrficos que necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencial est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El O2 es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolismo energtico. En la ausencia del O2, el NO3 o SO4 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el CO2 a CH4 para obtener energa. Otros protistas obtienen su energa, en condiciones anaerobias por reaccin de xido-reduccin realizadas sobre compuestos orgnicos.

Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.

Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tambin son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-asprtico para su incorporacin a la pared de las clulas. En algunos casos se requieren tambin pptidos de histidina.

Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de PO4 H y SO4 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.

Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del primero est unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K acta como coenzima y probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El in Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y acta como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. (Garca, 2004)

Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras:

a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn.

b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I.

En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidos cualitativamente. A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente est presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de stos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc. En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos especficos del proceso considerado. (Mateos, 2014)

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la clula. Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos cuya concentracin es modificada por quelacin, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminocidos, hidroxicidos, hidrxidos, y los aniones PO4 y CO3-2.

Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya que existe una gran variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.

En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , RO , que son los ms importantes.

Los componentes empleados en las industrias de fermentacin son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composicin qumica. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentacin, se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Las materias primas ms importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrgeno.

Las fuentes de carbono pueden ser:

1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn, dextrina;

2) Alcoholes como el glicerol y manitol;

3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.

Son muy importantes tambin por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilera, alpechn y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente tiles para procesos de produccin de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, tambin contienen muchas impurezas que impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos. Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco o las sales de amonio. Las orgnicas estn representadas por varios productos, como ser:

1) Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por hidrlisis cida o enzimtica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales, pescado, casena, gelatina, harina de soja, algodn, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena de polipptidos. Aparte de su funcin como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y suministran tambin algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.

2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de la misma.

3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autlisis o plasmlisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.

4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada

5) "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz tiene mucha importancia por su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de varios antibiticos y enzimas.

Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompaar a las distintas materias primas utilizadas. La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. Por el conocimiento de la estequiometra de crecimiento y de formacin del producto, es posible formular adecuadamente un medio. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentacin:

Fuente de C + fuente de N + O2 + minerales + nutrientes especficos biomasa + productos + CO2 + H2O.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:

1) No existencia de informacin respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.

2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.

3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que pueden causar inhibicin del crecimiento.

4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formacin del producto.

5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo Erlenmeyer agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida. Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el mtodo resulta poco prctico. Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentracin de un componente dependa de los niveles de los otros, o sea, se produzca interaccin entre componentes. Se puede mejorar mucho la optimizacin en batch empleando tcnicas estadsticas o utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado por un slo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudindose conocer por lo tanto el efecto que su variacin ejerce sobre el cultivo al mantenerse los dems componentes constantes.

Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:

a) por destruccin total de microorganismos;

b) Por muerte o inactivacin;

c) Por eliminacin con medio fsicos.

Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o Erlenmeyer. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo.

La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento, seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso de las autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala grande el equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado bajo presin, y la presin requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre tambin en el caso de los autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Despus de la esterilizacin se mantienen las condiciones aspticas, haciendo pasar vapor por las vlvulas y sellos. La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases y lquidos.

REFERENCIAS

Valderrama O. Jos; (1997) Informacin Tecnolgica, Centro de Informacin Tecnolgica, Chile.

Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone; (2012) Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico de la OEA

Garca Garibay Mariano; (2004) Biotecnologa alimentaria; Editorial Limusa, Mxico.

Dr. Pedro F. Mateos; (2014) Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad de Farmacia.