discriminación por morfometría geométrica de once especies

371

Biomdica 2008;28:371-85 Diferenciacin morfomtrica de Anopheles

ARTCULO ORIGINAL

Discriminacin por morfometra geomtrica de once especiesde Anopheles (Nyssorhynchus) presentes en Colombia

David Alonso Calle1, Martha Luca Quiones2, Holmes Francisco Erazo3, Nicols Jaramillo11 Grupo de Chagas, Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia2 Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, Bogot, D.C. Colombia3 Departamento Administrativo de Salud de Putumayo, Mocoa, Colombia

El trabajo fue realizado en el Laboratorio de Chagas de la Universidad de Antioquia.Introduccin. Es importante determinar las especies de Anopheles pertenecientes alsubgnero Nyssorhynchus, dado que all se encuentran los vectores principales de malaria enColombia.Objetivo. Utilizar la morfometra geomtrica para evaluar la variacin morfomtrica de onceespecies del subgnero Nyssorhynchus, presentes en Colombia y la capacidad de diferenciarlas hembras.Materiales y mtodos. Los especmenes fueron obtenidos de mosquitos silvestres, series eisofamilias de hembras recolectadas en cebos humanos protegidos y fueron identificados entodos sus estadios asociados usando las claves convencionales. A partir de fotografas digitalesdel ala derecha de 336 ejemplares de las 11 especies se seleccionaron 12 puntos anatmicos.Los puntos se convirtieron en coordenadas, las cuales se procesaron mediante el anlisisgeneralizado de Procrustes. Se obtuvieron variables de tamao y conformacin, las cualesfueron analizadas mediante estadsticas univariadas y multivariadas.Resultados. Las tcnicas de morfometra geomtrica demuestran que la divisin en seccionesdel subgnero Nyssorrhynchus no se correlaciona con la conformacin de las alas ydemostraron que slo con 12 puntos anatmicos se logra diferenciar en sus respectivasespecies el 97% de los especmenes de la seccin Argyritarsis y el 86% de la seccin Albimanusdel subgnero Nyssorhynchus, de forma cuantitativa y sin ambigedades. Adems, sesepararon los individuos de tres especies que habitan en simpatra en el Putumayo, difcilesde discriminar en el estadio de adulto hembra.Conclusin. La mayora de especies de Anopheles (Nyssorhynchus) presentes en Colombiase pueden diferenciar al utilizar la morfometra geomtrica como herramienta de apoyo a lasclaves convencionales.Palabras clave: Anopheles/anatoma e histologa, clasificacin, vectores de enfermedades,malaria, Colombia.Differentiation by geometric morphometrics among 11 Anopheles (Nyssorhynchus) inColombia.Introduction. The correct identification of the Anopheles species of the subgenus Nyssorhynchusis important because this subgenus includes the main malaria vectors in Colombia. Thisinformation is necessary for focusing a malaria control program.Objective. Geometric morphometrics were used to evaluate morphometric variation of 11 speciesof subgenus Nyssorhynchus present in Colombia and to distinguish females of each species.Materials and methods. The specimens were obtained from series and family broods fromfemales collected with protected human hosts as attractants. The field collected specimens andtheir progeny were identified at each of the associated stages by conventional keys. For somespecies, wild females were used. Landmarks were selected on wings from digital pictures from336 individuals, and digitized with coordinates. The coordinate matrix was processed bygeneralized Procrustes analysis which generated size and shape variables, free of non-biological variation. Size and shape variables were analyzed by univariate and multivariatestatistics.

Biomdica 2008;28:371-85

372

Biomdica 2008;28:371-85Calle DA, Quiones ML, Erazo HF, Jaramillo N

Correspondencia:Nicols Jaramillo, Calle 62 N 52-59, sexto piso, Sede deInvestigacin Universitaria (SIU), Universidad de Antioquia,Medelln, Colombia.Telfono: (574) 219 6521; fax: (574) 219 [email protected]: 11/12/07; aceptado:13/05/08

Results. The subdivision of subgenus Nyssorhynchus in sections is not correlated with wingshape. Discriminant analyses correctly classified 97% of females in the section Albimanus and86% in the section Argyritarsis. In addition, these methodologies allowed the correct identificationof 3 sympatric species from Putumayo which have been difficult to identify in the adult femalestage.Conclusion. The geometric morphometrics were demonstrated to be a very useful tool as anadjunct to taxonomy of females the use of this method is recommended in studies of the subgenusNyssorhynchus in Colombia.Keywords: Systematics, Nyssorhynchus, Section Argyritarsis, Section Albimanus, geometricmorphometrics, malaria vectors.

La malaria humana constituye la principal causade morbilidad y mortalidad en los pases tropicales,donde, aproximadamente, 2 x 109 de personasestn expuestas a contraer la enfermedad (1).Anualmente se reportan a escala mundial entre300 y 500 millones de casos (1).En su mayora, los vectores en esta reginpertenecen al subgnero Nyssorhynchus, y losprincipales son: Anopheles (Nyssorhynchus) darlingiRoot, A. (Nys.) albimanus Wiedemann y A. (Nys.)nuneztovari Gabaldn (2), aunque los estudiosrecientes han sealado otras especies de estesubgnero como posibles transmisores de laenfermedad (3). Es importante diferenciar lasespecies vectoras de aqullas que no tienen unpapel importante en la transmisin con el fin dedirigir adecuadamente las medidas de controlacordes a su comportamiento, biologa, respuestaa la presin de insecticidas y otras caractersticasque son propias de cada especie.Las claves existentes para la determinacintaxonmica de las hembras de las especies delsubgnero Nyssorhynchus (4-7) no permiten unacorrecta determinacin taxonmica entre algunasespecies y esto es un problema cuando slo esposible tener acceso a las hembras y stas seencuentran en simpatra. Tal es el caso de lasespecies de A. (Nys.) nuneztovari y A. (Nys.)rangeli Gabaldn, Cova Garca & Lpez, o A.(Nys.) oswaldoi (Peryassu), A. (Nys.) benarrochi

B y A. (Nys.) strodei Root (2,8). Tales dificultadesse deben, principalmente, a que estas especiespresentan una alta variabilidad fenotpica en loscaracteres morfolgicos utilizados en las clavesy a la presencia de nuevas especies sin describir.Otras metodologas utilizadas para diferenciarhembras del subgnero Nyssorhynchus son laidentificacin por cromosomas politnicos (9,10),por isoenzimas (11,12) y por tcnicas de genticamolecular (13,14). Todas ellas contribuyen aesclarecer la identidad de los mosquitosAnopheles pero presentan el inconveniente denecesitar equipos y reactivos costosos, tiempo yexperiencia para la interpretacin de los datos,por lo cual son poco prcticas para su utilizacinen las actividades de rutina de los programas decontrol de malaria a nivel local. Por esta razn,se hace necesario explorar otras alternativas queen menos tiempo y con menos costos permitan,con un alto grado de confianza, asignar losespecmenes capturados en el campo a suespecie correspondiente.La morfometra geomtrica capta la mayorcantidad de informacin biolgica en un menornmero de variables tomadas sobre la estructuraanatmica que se va a estudiar, lo cual resulta enun mayor poder estadstico para evaluar visual yanalticamente las diferencias de conformacinde las estructuras biolgicas (15). Esta tcnicaha demostrado su utilidad para resolver problemastaxonmicos (16-18), logrando discriminar losintegrantes de una especie en particular de otrosque no lo son. Adems, puede ser empleada paraasignar un individuo desconocido a su grupo oespecie ms probable (19,20).Calle et al. (21), Delgado y Rubio-Palis (22) y Rubio-Palis (23,24) utilizan morfometra tradicional

373


(aplicacin de anlisis estadsticos univariados ymultivariados a matrices de distancias entrepuntos anatmicos) para identificar con buenosresultados algunas especies de Anopheles delsubgnero Nyssorhynchus presentes en Colombiay Venezuela. Sin embargo, la morfometra tradicionaltiene menor poder estadstico que la geomtricadebido a que no logra, entre otras cosas, preservarla informacin espacial de los puntos anatmicosa travs de los anlisis (15). En Diptera lamorfometra geomtrica se ha utilizado paraestudiar la variabilidad de las cepas de laboratoriode Aedes aegypti y la influencia de la densidadlarvaria y las diferentes dietas sobre la arquitecturade las alas de esta misma especie (25,26); perono conocemos de trabajos publicados en esteorden con la intencin de apoyar la taxonoma.El propsito de este trabajo fue el de utilizar lamorfometra geomtrica para identificar lasespecies de hembras de Anopheles del subgneroNyssorhynchus presentes en cinco departamentosdel norte, sur, centro y occidente de Colombia, locual es representativo del rea de distribucin delsubgnero en el pas.Materiales y mtodosRecoleccin y taxonoma de AnophelesEl estudio morfomtrico se hizo con 336mosquitos hembras pertenecientes a 11 especiesdel subgnero Nyssorhynchus, tres correspon-dientes a la seccin Argyritarsis y ocho a laseccin Albimanus.Los especmenes capturados cuando "aterrizaban"sobre el cebo humano protegido o las hembrasrecin emergidas procedentes de series oisofamilias (22,23) se identificaron usando lasclaves morfolgicas disponibles (2,5,6).Las especies identificadas a partir de hembrassilvestres recolectadas en el municipio deCceres, departamento de Antioquia (07 34 58N; 75 21 07 W) fueron: A. triannulatus Neiva yPinto (30 especmenes), A. marajoara Galvao yDamasceno (30 especmenes) y A. nuneztovari(30 especmenes). En el municipio de Santa Marta,departamento de Magdalena (11 15 30 N; 7333 38 W) se captur A. aquasalis Curry (30especmenes); en Leticia, departamento de

Amazonas (04 12 55 N; 69 56 26 W), a A.darlingi (33 especmenes), y en Nuqu,departamento de Choc (05 42 45 N; 77 1615 W), a A. albimanus (30 especmenes).A partir de series e isofamilias de hembrascapturadas en Puerto Ass, departamento dePutumayo (00 30 57 N; 76 29 42 W) seobtuvieron hembras de: A. braziliensis Chagas (30especmenes), A. oswaldoi (30 especmenes), A.benarrochi B (33 especmenes), A. strodei (33especmenes) y A. rangeli (30 especmenes).Las especies A. nuneztovari, A oswaldoi y A.benarrochi B fueron confirmadas por PCR-RFLP(Polymerase Chain ReactionRestrictionFragment Length Polymorphism) del marcador deADNr ITS-2 (27).Todas las alas examinadas se encuentran en lacoleccin entomolgica del Grupo de Chagas dela Universidad de Antioquia. Las exuvias de larvasy pupas, al igual que el ADN, se encuentran en ellaboratorio del PECET de la Universidad deAntioquia.Seleccin de puntos anatmicosSe retir el ala derecha de todos los especmenesdesde la unin de la porcin basal articulada altrax. Se mont en una lmina de vidrioportaobjetos y se fij con un cubreobjetosrecubriendo sus lados con pegante. Posteriormente,se tomaron fotografas con una cmara digitalNikon Coolpix 990 adaptada a un microscopioestereoscpico Nikon modelo SMZ-800.Sobre las imgenes de las alas se seleccionarondoce puntos entre los lmites de las manchasbasales y subcostales y las intersecciones de lasvenas Cu 1 y 2 con el borde distal del ala. Estospuntos permitieron capturar la configuracingeomtrica de cada ala (figura 1).Morfometra geomtricaLos puntos anatmicos seleccionados seconvirtieron en coordenadas en un planobidimensional mediante la ayuda del programatpsDig (28). La matriz de coordenadas, querepresentaba las configuraciones geomtricas delas alas, se proces usando el anlisis generalizadode Procrustes (15,29,30).

374


El procedimiento matemtico del anlisisgeneralizado de Procrustes se resume en trespasos iterativos: 1) las configuraciones se ajustana un tamao nico; 2) las configuracionesajustadas se trasladan unas sobre otras de talmodo que coincidan sus centros de gravedad(centroides), y 3) se rotan hasta minimizar lasdistancias entre los puntos correspondientes,utilizando el criterio matemtico de los cuadradosmnimos. Cada vez que se ejecutan estos trespasos se calcula una configuracin geomtricade referencia que, progresivamente, se vaprecisando con cada iteracin. Al final del anlisisgeneralizado de Procrustes, se obtienen variablesque incorporan las desviaciones de cadaconfiguracin respecto a la de referencia. Estasvariables son libres de la variacin que no esbiolgica y no se ven afectadas por los cambiosde tamao, posicin y orientacin de lasconfiguraciones en el espacio. Por lo tanto,contienen toda la informacin de la conformacindel ala y se pueden utilizar para comparar lasespecies mediante anlisis estadsticosmultivariados.El ajuste a un tamao nico (paso 1) se efectadividiendo todas las configuraciones por una

Figura 1. Puntos anatmicos. Localizacin de los puntos anatmicos tomados en el ala de los mosquitos hembra, (1) iniciode la mancha basal oscura (BD), (2) inicio de la mancha humeral clara (HP), (3) inicio de la mancha humeral oscura (HD), (4)inicio de la mancha subcostal oscura (SCD), (5) inicio de la mancha subcostal clara (SCP), (6) inicio de la mancha preapicaloscura (PD), (7) inicio de la mancha preapical clara (PP), (8) finalizacin de la mancha apical clara (AP), (9) interseccin dela vena R3 y el borde distal del ala, (10) interseccin entre la vena Cu 1 y el borde distal del ala, (11) interseccin entre la venaCu 2 y el borde distal del ala y (12) interseccin entre la vena plical y la vena cubital. La nomenclatura usada fue la propuestapor Faran en 1980 (3).

variable de tamao. sta se obtiene antes delanlisis generalizado de Procrustes al calcular laraz cuadrada de la suma de las distancias,elevadas al cuadrado, desde cada puntoanatmico al centroide. Por tal motivo se ledenomina tamao-centroide y es un estimativoisomtrico de la variacin de tamao de lasmuestras.

Los anlisis se efectuaron con la ayuda de losprogramas computacionales MOGwin (19) ytpsRelw (31).Anlisis del tamao y la conformacinEl tamao-centroide de cada especie fue utilizadopara hacer las comparaciones de tamao,mediante la prueba ANOVA. Los datos seanalizaron utilizando el programa computacionalJMP (32).Las variables de conformacin se utilizaron pararealizar anlisis discriminante. Las distancias deMahalanobis, calculadas durante el anlisisdiscriminante, se asociaron a la probabilidad deconocer qu tan alejada est cada conformacinindividual de la media de su especie o de la otraespecie, lo que permite, de esta manera, haceruna reclasificacin.

375


Finalmente, se utilizaron 1.000 permutacionespara probar la hiptesis nula de que las distanciasde Mahalanobis entre las especies y poblacioneseran producto del azar. La solidez de estareclasificacin se valor con el estadstico kappa,el cual estima la concordancia entre dosclasificaciones, la dada por el anlisis y unacompletamente aleatoria. La interpretacin delvalor estadstico fue sugerida por Landis y Koch(33). Las distancias de Mahalanobis tambin seutilizaron para evaluar las similitudes morfomtricaspor medio de la construccin de dendrogramasusando el mtodo de neighbor joining.Para el anlisis discriminante, el clculo de lasdistancias de Mahalanobis, su verificacinestadstica y la construccin de los dendrogramasse utilizaron los programas JMP (32), PADwin yel mdulo neighbor del programa Phylip incluidoen el PADwin (20).La alometra se evalu mediante anlisisunivariado de regresin lineal. Como variabledependiente se utiliz el primer factor cannico,calculado en el anlisis discriminante, el cualrepresenta la mayor porcin de la variacin deconformacin derivada del anlisis generalizadode Procrustes. El tamao-centroide se utilizcomo variable independiente de tamao. Losvalores significativos de regresin sealan unefecto del tamao sobre la conformacin(alometra). El coeficiente de determinacin (R2)indica la porcin de variacin total que es explicadapor el modelo. La porcin de la variacin total queno se ajusta al modelo indica la variacin deconformacin que no es el resultado colateral delcrecimiento.Los anlisis fueron hechos con ayuda delprograma computacional JMP (32).Visualizacin de las diferencias deconformacinSe utiliz el programa computacional tpsReg (34)para obtener una representacin visual de cadauna de las conformaciones anatmicas promediode cada especie. stas se observaron comodeformaciones de rejil las respecto a laconfiguracin promedio total (configuracin dereferencia) (32).

ResultadosSubgnero NyssorhynchusEl anlisis discriminante mostr que laconformacin de las alas de las hembras delsubgnero Nyssorhynchus es diferente entre lasespecies (lambda de Wilks= 0,0013; gl: 230 y2813; F: 12,92; P=9,53 x 10125). La proyeccinde los individuos sobre los dos primeros factorescannicos, claramente diferencian a: A.nuneztovari, A. rangeli, A. darlingi, A. triannulatusy A. braziliensis, mientras que las otras cincoespecies comparten reas entre ellas y es msdifcil distinguirlas individualmente (figura 2).El anlisis de conglomerado (cluster) realizadomediante neighbor joining arroj cuatro grandesconglomerados de acuerdo con la conformacinde las alas de las hembras (figura 3). El primerconglomerado estuvo conformado por A.

Figura 2. Distribucin de 11 especies de Anopheles(Nyssorhynchus) correspondiente a su conformacin delala. Proyeccin de los individuos de cada especie sobre lasvariables cannicas 1(CV-1) y 2 (CV-2) derivadas del anlisisdiscriminante de la variacin de conformacin. Los polgonosdelimitan reas que agrupan a todos los individuos de unamisma especie proyectados sobre el espacio multivariadode la conformacin del ala. (a) A. darlingi; (b) A. braziliensis;(c) A., triannulatus; (d) A. marajoara; (e) A. nuneztovari; (f)A. albimanus; (g) A. aquasalis; (h) A. strodei; (i) A.benarrochi; (j) A. oswaldoi; (k) A. rangeli.

376


triannulatus, A. braziliensis y A. darlingi; el segundo,slo por A. albimanus; el tercero, por A. rangeli,A. nuneztovari y A. aquasalis, y el cuarto, por A.strodei, A. oswaldoi, A. benarrochi B y A.marajoara (figura 3).Las distancias de Mahalanobis calculadas entrecada par de especies fueron todas significativasal hacer la evaluacin de la hiptesis nula mediante1.000 permutaciones.Para examinar en mayor detalle la variacinmorfomtrica entre las especies se examinaronpor separado los integrantes de las seccionesArgyritarsis y Albimanus.Seccin ArgyritarsisSe encontraron diferencias significativas en eltamao entre las tres especies de la seccinArgyritarsis (F=38,21; R2 =0,45; gl: 91; P=9,69 x1013). La especie ms pequea fue A. braziliensisy la ms grande, A. darlingi (figura 4A).El anlisis discriminante demostr que laconformacin de las alas de las hembras de la

seccin Argyritarsis es diferente entre las especies(lambda de Wilks=0,052; gl=40 y 142; F=11,90;P=1,64x 1027) (figura 4B).Las distancias de Mahalanobis demostraron quelas conformaciones de cada especie sontotalmente diferentes, y las permutacionesconfirmaron que el resultado no fue producto delazar (P

377


braziliensis y A. marajoara se observ el movimientoinverso, lo cual provoca un estrechamiento delala (figura 4C).El anlisis de regresin lineal fue significativo(F=18; R2=0,16; gl=92; P=0,0016), lo cual indicaque la relacin entre el tamao y la conformacines significativa. El 16% de la variacin del modelose puede explicar por la relacin entre el tamaoy la conformacin.

Seccin AlbimanusHubo diferencia de tamao entre las especies(F=59,6; R2=0,63; gl=181; P=2,84x1048), y A.triannulatus se destac como la especie mspequea, mientras que A. oswaldoi y A. rangelifueron las ms grandes (figura 5A).El anlisis discriminante demostr que A. rangeliy A. triannulatus se encontraban muy separadasde las otras seis especies (figura 5B). El

Figura 4. Representacin grfica de la diferenciacin de las especies de la seccin Argyritarsis. A. Las cajas esquemticasresumen grficamente la distribucin de los individuos de cada especie de acuerdo con el tamao. Cada caja muestra lamediana como la lnea que atraviesa la mitad de la caja y los cuartiles 25 y 75 a los extremos. Los percentiles 10 y 90 semuestran como lneas sobre las cajas y debajo de ellas. B. Proyeccin de los individuos de cada especie sobre las variablescannicas 1 (CV-1) y 2 (CV-2) derivadas del anlisis discriminante de la variacin de conformacin. Los polgonos delimitanreas que agrupan a todos los individuos de una misma especie proyectados sobre el espacio multivariado de la conformacindel ala. A. braziliensis (), A. darlingi ( ) y A. marajoara (). C. La deformacin de las rejillas permite visualizar el desplaza-miento de la conformacin del ala respecto a la configuracin consenso de las especies de la seccin Argyritarsis. (a) A.darlingi, (b) A. marajoara. Las flechas indican la magnitud y el sentido de desplazamiento de los puntos anatmicos.

378


MANOVA fue estadsticamente significativo(lambda de Wilks=0,99; gl=14 y 140; P=9,22 x10186). Las distancias de Mahalanobis demostraronque las conformaciones de cada especie sondiferentes, y las permutaciones confirmaron queel resultado no fue producto del azar (P

379


Figura 5. Representacin grfica de la diferenciacin de las especies de la seccin Albimanus. A. Las cajas esquemticasresumen grficamente la distribucin de los individuos de cada especie de acuerdo con el tamao. A. albimanus (ALB), A.aquasalis (AQU), A. benarrochi B (BEN), A. braziliensis (BRA), A. darlingi (DAR), A. marajoara (MAR), A. nuneztovari(NUN), A. oswaldoi (OSW), A. rangeli (RAN), A. strodei (STR) y A. triannulatus (TRI). B. Distribucin de las especies a lolargo de las variables cannicas 1 (CV-1) y 2 (CV-2), derivadas del anlisis discriminante de la variacin de conformacin.(a) A. triannulatus, (b) A. nuneztovari, (c) A. rangeli, (d) A. albimanus, (e) A. benarrochi B, (f) A. oswaldoi, (g) A. strodei,(h) A. aquasalis.C. La deformacin de las rejillas permite visualizar el desplazamiento promedio de la conformacin del alade (a) A. triannulatus y (b) A. rangeli respecto a la configuracin consenso de las especies del subgrupo Oswaldoi. Lasflechas indican la magnitud y el sentido de desplazamiento de los puntos anatmicos.

pudo visualizar las diferencias de conformacinalar entre las especies.A partir de las distancias de Mahalanobis sedemuestra que las 11 especies recolectadas enlas diferentes regiones de Colombia son distintasy que estos resultados no son productos del azar.Adems, aunque algunos individuos compartenreas de interseccin entre varias especies, loscentroides (medias multivariadas de la conformacin)de cada entidad permiten diferenciar las especies

claramente. Se demuestra as la importancia dela conformacin del ala para separar las especiesdel subgnero Nyssorhynchus.El dendrograma obtenido a partir de las distanciasde Mahalanobis del subgnero Nyssorhynchus(figura 3) muestra las relaciones de similitudmorfomtrica entre las especies. El dendrogramano coincide con las divisiones establecidas ensecciones, ni tampoco coincide exactamente conlas agrupaciones filogenticas propuestas por

380


Figura 6. Representacin grfica de la diferenciacin de las especies de difcil discriminacin. A. Las cajas esquemticasresumen grficamente la distribucin de los individuos de cada especie de acuerdo con el tamao. B. Proyeccin de losindividuos de cada especie sobre las variables cannicas 1 (CV-1) y 2 (CV-2) derivadas del anlisis discriminante de lavariacin de conformacin. A. benarrochi B (), A. strodei ( ) y A. oswaldoi (). C. La deformacin de las rejillas permitevisualizar el desplazamiento de la conformacin del ala de (a) A. benarrochi B y (b) A. strodei respecto a la configuracinconsenso de las tres especies. Las flechas indican la magnitud y el sentido de desplazamiento de los puntos anatmicos.

Cuadro 1. Porcentajes de reclasificacin correcta de las especies de la seccin Albimanus. Los porcentajes de reclasificacincorrecta se muestran en negrilla en la diagonal. Los valores fuera de la diagonal sealan las reclasificaciones incorrectas.La reclasificacin result de las distancias de Mahalanobis obtenidas durante el anlisis discriminante de las conformacionespromedio de las alas.

Especies

ALB AQU BEN NUN OSW RAN STR TRI

Especie predicha ALB 84% 3.3% 3.3% 3%AQU 87% 6.5% 3.3% 6%BEN 6.5% 70% 3.3% 14% 6%NUN 3.0% 7% 90% 3%OSW 6.5% 3% 10% 77% 6%RAN 100%STR 3% 10% 85%TRI 100%

A. albimanus (ALB), A. aquasalis (AQU), A. benarrochi B (BEN), A. nuneztovari (NUN), A. oswaldoi (OSW), A. rangeli(RAN), A. strodei (STR), A. triannulatus (TRI).

381


Faran y Linthicum (5). Sin embargo, algunasrelaciones fenticas propuestas desde laconformacin de las alas muestran correlacin conla hiptesis filogentica (5), como es el casopara A. oswaldoi, A. strodei, A. albimanus, A.nuneztovari y su especie hermana A. rangeli.La posicin de A. aquasalis cercano a A.nuneztovari y A. rangeli no es la esperada; esaespecie se encuentra en una rama aparte, segnFaran (2). Sin embargo, en algunos casos haycorrespondencia entre la similitud morfomtricade estas especies y las relaciones estre especiesmedidas por diferentes marcadores moleculares.Tal es el caso de A. aquasalis y A. nuneztovaricuya cercana en rboles reconciliados exhibe unafortaleza (medida por bootstrap) de 76% al utilizarlos marcadores ribosmicos ADNr (18S y 28S) ymitocondriales ADNm (COI y COII) (35). Estaposicin tambin coincide con la obtenida en latopologa de los rboles creados por medio de losalgoritmos de mxima parsimonia y mximaverosimilitud con soporte de bootstrap del 100%,a partir de la informacin obtenida de losmarcadores ribosmicos ITS 2 y mitocondrialesCOII (35).La posicin de A. triannulatus tampoco concuerdadesde la divisin nominal de las secciones, aunquesu cercana a A. darlingi es viable teniendo encuenta caractersticas morfolgicas del adultohembra como las escamas en el mesanepmerosuperior y las manchas basal y subcostal claraen el ala (2). La relacin morfomtrica esrespaldada en el rbol construido a partir de lainformacin de isoenzimas de cinco especies delsubgnero Nyssorhynchus usando el algoritmo deUPGMA (36).La cercana de A. oswaldoi con A. benarrochi Bno se puede comparar en otros rboles debido aque esta ltima especie se reconoci reciente-mente (27). Su cercana se debe a que son muysimilares morfolgicamente, lo que impide suseparacin en el estadio de adulto hembra. Msadelante se analiza en mayor detalle las relacionesmorfomtricas entre estas especies.La presencia de A. marajoara no concuerda conlo reportado por Faran (2) debido a que l separalas especies en dos secciones por la presencia o

ausencia de un anillo en el tarsmero posteriorcinco. La posicin de esta especie cercana a lasintegrantes de la seccin Albimanus coincide conel resultado de Sallum et al. (37), quienesutilizaron caracteres morfolgicos de cincoespecies de la seccin Albimanus y cuatro de laArgyritarsis.Entrando en el anlisis morfomtrico de la seccinArgyritarsis, observamos que el tamao puedereflejar diferencias taxonmicas entre lasespecies. Sin embargo, tambin puede ser elresultado de la combinacin gentica particularheredada de los padres y del crecimiento individual(factores maternos y efectos ambientales durantela ontogenia). Dado que las especies de estaseccin no proceden de lugares donde habitan ensimpatra, es necesario evaluar otras poblacionespara corroborar que este atributo biolgico semantiene a travs de su distribucin en el pas yque puede ser empleado como un carcterdiscriminante.Al seguir la clave de Faran y Linthicum (5), lashembras de A. darlingi presentan caractersticasmorfolgicas que permiten su diferenciacin delas otras especies de la seccin Argyritarsis. Sinembargo, A. braziliensis slo se diferencia de A.marajoara en la presencia o ausencia de tufos enel segundo segmento abdominal y la coloracinde las escamas en el octavo segmentoabdominal. La presencia de tufos requiere unmanejo cuidadoso de los especmenes para noperderlos y la coloracin de las escamas, blancao amarilla, depende de la fuente de luz, de laapreciacin visual y la experiencia del taxnomo.Otras caractersticas como la proporcin del reabasal oscura del tarsmero posterior 2, la manchay el nmero de manchas en la vena R3 del ala semencionan en la clave para Anopheles deColombia de Gonzlez y Carrejo (38); sin embargo,tales caractersticas se superponen entre estasdos especies.Por otro lado, por medio del anlisis morfomtricode la conformacin del ala, se logr reclasificaren el 97% los especmenes de cada especie(cuadro 1), lo que demuestra una estupendacorrelacin entre los resultados obtenidos por lasclaves existentes y la morfometra geomtrica.

382


Al visualizar la conformacin promedio del ala delas especies (figura 4C), se observaron alasanchas en A. darlingi, y angostas en A.braziliensis y A. marajoara debido al movimientohacia el interior del punto 11 (interseccin entre lavena Cu 2 y el borde distal del ala). Al saber queen la alometra slo el 16% del tamao es aportadoa la conformacin, se deduce que la mayor porcinde las diferencias (84%) son propias de laspoblaciones, lo cual refleja probablemente susacervos genticos diferentes.Con respecto a la seccin Albimanus, A.triannulatus exhibi las alas ms pequeas. Esteresultado concuerda con otros reportes (2,38) quesugieren que el tamao de las alas puede serutilizado como apoyo taxonmico para diferenciarlade las especies de la seccin. Adems, dentrode la clasificacin nominal del subgneroNyssorhynchus la separa como el subgrupoTriannulatus, debido, entre otros, a diferencias,en el estadio de hembra, con un parche conspicuode escamas blancas o plateadas en el mesane-pmero superior y escasa presencia de escamasblancas en el cuarto palpmero. Separacin queconcuerda con el hecho de que esta especiepresent una conformacin de ala muy diferentede las otras siete especies (figura 5C), ubicndosedistante de todas en el espacio de los factorescannicos creado por la conformacin del ala.Igualmente, al visualizar la conformacin promediose observ la deformacin ms extrema respectoa la de referencia, con un acercamiento en lospuntos de las manchas basal oscura y subcostalclara; las cuales tambin son tiles para sudiscriminacin al utilizar las claves existentes.A. albimanus se ubica dentro de la seccin comoel grupo Albimanus (2,38), porque tres caracteresmorfolgicos en el adulto hembra permitensepararlo de las otras especies: el palpmerocuatro completamente negro, la ausencia de tufosen el segmento abdominal dos y el quintotarsmero anterior totalmente oscuro. El anlisisdiscriminante de la conformacin de las alas logrreclasificar el 84% de sus especimenes, lo quedemuestra su utilidad para determinar una hembraque haya perdido los caracteres morfolgicos msimportantes (cuadro 1). Aunque su discriminacinno es tan clara en la grfica de dispersin (figura

5B), en la cual parece mezclarse con A. rangeli,A. strodei y A. aquasalis, es importante anotarque la proyeccin de los individuos sobre los dosprimeros factores cannicos representan el 75%de la variacin de conformacin, mientras que ladiscriminacin del 84% se obtuvo con el 100%de las variables de conformacin.Con A. aquasalis ocurre una situacin similar; enColombia no se le tiene por una especie importanteen la transmisin de malaria, a excepcin dealgunas reas en el departamento de La Guajira.Sin embargo, es considerada el vector principalde malaria en Venezuela. Morfolgicamente sediferencia de las otras especies del grupoOswaldoi por poseer una mancha basal oscuraen el tarsmero posterior dos de 0,4 a 0,55 lalongitud del segmento. Pero las manchascaractersticas del ala son muy similares a las deA. nuneztovari, uno de los vectores msimportantes en Colombia, lo cual puede llevar aidentificaciones errneas en ausencia de las patasposteriores. El anlisis discriminante de laconformacin del ala separ completamente estasdos especies y logr reclasificar correctamente aA. aquasalis en el 87%, mientras que a A.nuneztovari en el 90% (cuadro 1), con lo que sedemuestra de nuevo la utilidad de la morfometrageomtrica para apoyar la taxonoma.Por su parte, la conformacin del ala de A. rangeli,fue la otra ms diferente dentro de la seccinAlbimanus, representada por la separacin de lospuntos que constituyen la mancha subcostalclara, lo cual concuerda con la importancia de estecarcter morfolgico para diferenciar esta especiede otras de la seccin. La posicin de A. rangeli,separada del grupo Oswaldoi debido a suconformacin del ala, no concuerda con lopropuesto por Faran (2), quien usa lascaractersticas morfolgicas de la larva, pupa yadulto para asignar esta especie dentro del grupomencionado. Sin embargo, si slo se tuvieran encuenta las medidas del ala (mancha subcostalclara mayor de 0,5), A. rangeli se diferenciaraclaramente de las dems del grupo, excepto conalgunas hembras de A. nuneztovari morfotipo II.La dificultad para diferenciar A. rangeli de A.nuneztovari ocurre frecuentemente con los

383


individuos del morfotipo II de A. nuneztovari, elcual posee una proporcin de 1,8 a 3,0 en lamancha humeral clara con respecto a la manchabasal oscura de la vena subcostal del ala (22)mientras que en A. rangeli mide de 1,8 a 3,5. Porlo tanto, es necesario usar la quetotaxia del cuartoestadio larvario, de la pupa o de la genitaliamasculina para diferenciar correctamente estasdos especies (2).En este trabajo el anlisis discriminante de laconformacin del ala de las hembras permitidiferenciar A. rangeli de A. nuneztovari, y selograron porcentajes de reclasificacin del 84% yel 90%, respectivamente (cuadro 1). Se demuestracon estos resultados el potencial de la morfometrageomtrica para discriminar estas dos especiesque pertenecen a un grupo hermano y cuyashembras poseen caractersticas morfolgicas tansimilares que al ser cuantificadas por los mtodostradicionales no permiten diferenciarlas. Sinembargo, se necesita contar con poblaciones quehabiten en simpatra para corroborar estaafirmacin.La alometra demostr que para estas cincoespecies slo el 19% del tamao es aportado a laconformacin, de donde se deduce que la mayorporcin de las diferencias (81%) son propias delas poblaciones, lo cual probablemente es reflejode sus acervos genticos diferentes.Dentro del grupo Oswaldoi, las hembras de A.benarrochi B halladas en el departamento delPutumayo, Colombia, presentan caractersticasmorfolgicas que comparten en muchos casoscon A. oswaldoi (27).En este trabajo se demuestra que el tamao delala de estas dos especies y de A. strodei permitesepararlas claramente (figura 6A), carcter quese podra utilizar como apoyo a las clavesmorfolgicas que se puedan proponer paradiferenciarlas. La separacin de estas tresespecies tambin estuvo apoyada por laconformacin del ala, la cual demostr que A.oswaldoi y A. benarrochi B eran ms parecidosentre s, representados por alas anchas, ydiferentes de A. strodei la cual tiene alas msangostas (figura 6C). El anlisis discriminante dela conformacin del ala separ, sin lugar a dudas,

ambas especies (figura 6B) y logr reclasificarcorrectamente el 87% de las hembras de A.benarrochi B y el 90% de las de A. oswaldoi.Hasta la fecha, las hembras de A. oswaldoi y A.benarrochi B slo se pueden separar sinambigedades por tcnicas de biologa molecular,usando PCR-RFLP del ITS-2 (27). A pesar de queesta metodologa separa ambas especies en el100%, la necesidad de conservar los ejemplaresen slica-gel y los altos costos de procesamientodificultan su aplicacin a gran escala.Por otro lado, A. benarrochi B no se puede diferenciarde A. strodei porque la proporcin de la manchabasal oscura del tarsmero posterior dos conrelacin a la longitud del segmento se superponeentre ellas (0,170,32 y 0,250,35, respectiva-mente). En el ala, la proporcin de la mancha clarahumeral de la vena subcostal con respecto a lamancha basal oscura no permite diferenciar lashembras de las especies mencionadas debido aque, de nuevo, hay superposicin: 1,73,3 paraA. benarrochi B y 2,04,0 para A. strodei. Igualsucede con la mancha subcostal clara con relacina la subcostal oscura, la cual presenta unaproporcin de 0,10,5 para A. benarrochi B y de0,250,5 para A. strodei. Al utilizar la morfometrageomtrica, el anlisis discriminante de laconformacin del ala logr de nuevo separarambas especies (figura 6B) y logr reclasificarcorrectamente las hembras de A. benarrochi Ben el 87% y las de A. strodei en el 90%.Debido a que estas tres especies habitan ensimpatra y al hecho de que la conformacin es lavariable que ms pesa en su discriminacin (elefecto alomtrico fue de slo el 27%) es muyprobable que sus diferencias sean el reflejo decaractersticas genticas y no el resultado deinteracciones con el medio ambiente o dediferenciacin geogrfica.En conclusin, la morfometra geomtrica logrdistinguir las hembras de 11 especies delsubgnero Nyssorhynchus presentes en Colombiautilizando slo la informacin contenida en laconformacin del ala. Estos resultados permitenproponer la utilizacin de los puntos anatmicosseleccionados en este trabajo para procesarlosmediante el algoritmo generalizado de Procrustes,

384


de tal manera que se apoye de manera slida eltrabajo taxonmico con las especies delsubgnero Nyssorhynchus.

AgradecimientosPor su colaboracin en la captura de losAnopheles, agradecemos a Rafael Burbano yElicer Gualguan del Departamento Administrativode Salud Putumayo (DASALUD). A WilliamGalarza director de DASALUD por la colaboracincon el personal de campo. A Ivn Daro Vlez,director del Programa de Estudio y Control deEnfermedades Tropicales (PECET) de laUniversidad de Antioquia. En especial a ManuelaHerrera y Lorena Orjuela por su enormecolaboracin en la consecucin de especmenes.Este artculo esta dedicado a nuestros amigosEdison Correa, Carlos Andrs Prez y MarcosPrez, a quienes su devocin en la captura demosquitos les cost la vida.

Conflicto de intersLos autores declaramos que no existe un posibleconflicto de intereses en este manuscrito.

FinanciacinEste estudio fue financiado por el Comit para elDesarrollo de la Investigacin (CODI), Universidadde Antioquia, cdigo CPT 0214.

Referencias1. World Health Organization. Malaria. Fact Sheet N

94. Geneve: WHO; 2007. [Consultado: marzo de 2008].Disponible en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/index.html.

2. Olano VA, Brochero LH, Saenz R, Quiones ML,Molina JA. Mapas preliminares de la distribucin deespecies de Anopheles vectores de malaria enColombia. Biomdica. 2001;21:402-8.

3. Quiones ML, Ruiz F, Calle DA, Harbach RE, ErazoHF, Linton YM. Incrimination of Anopheles(Nyssorhynchus) rangeli and An. (Nys.) oswaldoi asnatural vectors of Plasmodium vivax in SouthernColombia. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006;101:617-23.

4. Faran ME. Mosquito studies (Diptera: Culicidae).XXXIV. A revisions of the Albimanus Section of thesubgenus Nyssorhynchus of Anopheles. Contrib AmEntomol Inst. 1980;15:1-215.

5. Faran ME, Linthicum KJ. A Handbook of the speciesof Anopheles (Nyssorhynchus) (Diptera: Culicidae).Mosq Syst. 1981;13:1-81.

6. Linthicum KJ. A revision of the Argyritarsis Section ofthe subgenus Nyssorhynchus of Anopheles (Diptera:Culicidae). Mosq Syst. 1988;20:99-271.

7. Surez MF, Quiones M, Fleming GA, Robayo M.Gua introductoria a la morfologa de Anopheles y clavepara determinacin de las principales especies deColombia. Bogot, D.C.: Ministerio de Salud; 1988.

8. Quiones ML, Harbach RE, Calle DA, Ruiz F, ErazoHF. Variante morfolgica de Anopheles benarrochi(Diptera: Culicidae) en Putumayo, Colombia.Biomdica. 2001;21:351-9.

9. Frizzi G. Salivary gland chromosomes of Anopheles.Nature. 1947;160:226-8.

10. Frizzi G. Etude cytogenetique d Anophelesmaculipennis en Italie. Bull World Health Organ.1953;9:335-44.

11. Miles SJ. A biochemical key to adult members of theAnopheles gambiae group of species (Diptera:Culicidae). J Med Entomol. 1979;15:297-9.

12. Foley DH, Bryan JH. Electrophoretic keys to identifymembers of the Anopheles punctulatus complex ofvector mosquitoes in Papua New Guinea. Med VetEntomol. 1993;7:49-53.

13. Wilkerson RC, Parsons TJ, Klein TA, Gaffigan TV,Bergo E, Consolim J. Diagnosis by random amplifiedpolymorphic DNA polymerase chain reaction of fourcryptic species related to Anopheles albitarsis fromParaguay, Argentina and Brazil. J Med Entomol. 1995;32:697-704.

14. Marelli MT, Malafronte RS, Florez-Mendoza C,Lourenco- de- Oliveira R, Kloetzel JK, Marinotti O.Sequence analysis of the second internal transcribedspacer of ribosomal DNA in Anopheles oswaldoi(Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 1999;36:679-84.

15. Rohlf FJ, Marcus LF. A revolution in morphometrics.Trends Ecol Evol. 1993;8:129-32.

16. Matias A, De la Riva JX, Torrez M, Dujardin JP.Rhodnius robustus in Bolivia identified by its wings.Mem Inst Oswaldo Cruz. 2001;96:947-50.

17. Villegas J, Feliciangeli MD, Dujardin JP. Wing shapedivergence between Rhodnius prolixus from Cojedes(Venezuela) and Rhodnius robustus from Mrida(Venezuela). Infect Genet Evol. 2002;2:121-8.

18. Gumiel L, Catala S, Noireau F, Rojas de Arias,Garcia A, Dujardin JP. Wing geometry in Triatomainfestans (Klug) and T. melanosoma Martinez, Olmedo& Carcavallo (Hemiptera:Reduvidae). Syst Entomol2003;28:173-9.

19. Dujardin JP. MOGwin (Software for GeneralizedProcrustes Analysis). Institut de Recherches pour leDveloppement. 2004. [Consultado: marzo de 2008].Disponible en: http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/mog/index.html

385


20. Dujardin JP. PADwin (Software for DiscriminantAnalysis). Institut de Recherches pour leDveloppement. 2004. [Consultado: marzo de 2008].Disponible en: http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/pad/

21. Calle DA, Quiones ML, Erazo H, Jaramillo O.Morphometric discrimination of females of five speciesof Anopheles of the subgenus Nyssorhynchus fromSouthern and Northwest Colombia. Mem Inst OswaldoCruz. 2002;97:1191-5.

22. Delgado N, Rubio-Palis Y. Identification of Anopheles(Nyssorhynchus) (Diptera: Culicidae) occurring inWestern Venezuela. Mosq Syst. 1993;25:222-30.

23. Rubio-Palis Y. Caracterizacin morfomtrica de pobla-ciones de Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi del surde Venezuela. Bol Entomol Venez. 1998;13: 141-72.

24. Rubio-Palis Y . Anopheles (Nyssorhynchus) deVenezuela: taxonoma, bionoma, ecologa eimportancia mdica. Maracay: Escuela de Malariologay Saneamiento Ambiental; 2000. p. 120.

25. Jirakanjanakit N, Dujardin JP. Discrimination of Aedesaegypti (Diptera: Culicidae) laboratory lines based onwing geometry. Southeast Asian J Trop Med PublicHealth. 2005;36:858-61.

26. Jirakanjanakit N, Leemingsawat S, ThongrungkiatS, Apiwathnasor C, Singhaniyom S, Bellec C, et al.Influence of larval density or food variation on thegeometry of the wing of Aedes (Stegomyia) aegypti.Trop Med Int Health. 2007;12:1354-60.

27. Ruiz F, Quiones ML, Erazo H, Calle DA, Alzate FA,Linton YM. Molecular differentiation of Anopheles(Nyssorhynchus) benarrochi and A. (N.) oswaldoi fromSouthern Colombia. Mem Inst Oswaldo Cruz.2005;100:155-60.

28. Rohlf J. tpsDig, version 1.04. Stony Brook, NY:Department of Ecology and Evolution, State Universityof New York at Stony Brook; 2004. [Consultado: marzode 2008]. Disponible en: http://life.bio.sunysb.edu/morph.

29. Rohlf FJ, Slice DE. Extensions of the Procrustesmethod for the optimal superimposition of landmarks.Syst Zool. 1990;39:40-59.

30. Bookstein FL. Morphometrics tools for landmark data:Geometry and biology. Cambridge: CambridgeUniversity Press; 1991.p.435.

31. Rohlf J. tpsRelw, version 1.39. Stony Brook, NY:Department of Ecology and Evolution, State Universityof New York at Stony Brook; 2004. [Consultado: marzode 2008]. Disponible en: http://life.bio.sunysb.edu/morph.

32. SAS Institute Inc. JMP Statistisc and GraphicsGuide, version 3.1. Cary, NC: SAS Institute Inc;1999.p.592.

33. Landis JR, Koch GG. The measurement of observeragreement for categorical data. Biometrics.1977;33:159-74.

34. Rohlf, J. tpsRegr, version 1.28. Stony Brook, NY:Department of Ecology and Evolution, State Universityof New York at Stony Brook; 2003. [Consultado: marzode 2008]. Disponible en: http://life.bio.sunysb.edu/morph.

35. Sallum M, Schultz T, Foster P, Arostein K, Wirtz R,Wilkerson C. Phylogeny of Anophelinae (Diptera:Culicidae) based of nuclear, ribosomal andmitochondrial DNA secuences. Syst Entomol. 2002;27:361-82.

36. dos Santos JM, Maia J de F, Tadei WP, RodrguezGA. Isoenzymatic Variability among five Anophelesspecies belonging to the Nyssorhynchus and Anophelessubgenera of the Amazon region, Brazil. Mem InstOswaldo Cruz. 2003;98:247-53.

37. Sallum MA, Bergo ES, Flores DC, Forattini OP.Systematic Studies on Anopheles galvaoi Causey,Deane & Deane from the Subgenus NysssorhynchusBlanchard (Diptera: Culicidae). Mem Inst OswaldoCruz. 2000;97:1177-89.

38. Gonzales R, Carrejo N. Introduccin al estudiotaxonmico de Anopheles de Colombia Claves y notasde distribucin. Cali: Editorial Litocencoa; 2007. p. 237.

discriminación por morfometría geométrica de once especies

Documents