Avances en el screening de Dioxinas y PCBs en productos de la pesca

Dr. Gerardo Fernández MartínezU id d d Té i C áfi SAIUnidad de Técnicas Cromatográficas - SAI

ESQUEMA

¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs¿A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativosMetodologías generales. ¿Son todas iguales?Requisitos de un laboratorio de analisis de PCDD/F y

PCBPCBsEsquema de una metodología de confirmaciónNuevas metodologías: ¿ Dónde podemos actuar?Nuevas metodologías: ¿ Dónde podemos actuar?Nuevos métodos de preparación de muestrasNuevos métodos de determinaciónNuevos métodos de determinaciónConclusiones

¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs

OCl Cl1 28

910

Cl Cl1 28

9

Cl 7 3 Cl 7 3OCl Cl45

67 3 OCl Cl4

56

7 3

2,3,7,8 Tetraclorodibenzo-p-diossina 2,3,7,8 Tetraclorodibenzofurano

¿Qué queremos medir? Dioxinas furanos y PCBs¿Qué queremos medir? Dioxinas, furanos y PCBs

2,3,7,82,3,7,8--TCDFTCDF CBCB--77771,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDFPeCDF

2,3,4,7,82,3,4,7,8--PeCDFPeCDF

1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDFHxCDF

1 2 3 6 7 81 2 3 6 7 8 H CDFH CDF

CBCB--8181

CBCB--126126

CBCB--1691691,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDFHxCDF

2,3,4,6,7,82,3,4,6,7,8--HxCDFHxCDF

1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDFHxCDF

1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDFHpCDF

CBCB--123123

CBCB--118118

CBCB--114114, ,3, ,6, ,8, ,3, ,6, ,8 pCpC

1,2,3,4,7,8,91,2,3,4,7,8,9--HpCDFHpCDF

OCDFOCDF

2,3,7,82,3,7,8--TCDDTCDD

CBCB--105105

CBCB--167167

CBCB--156156

1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDDPeCDD

1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDDHxCDD

1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDDHxCDD

CBCB--157157

CBCB--189189

1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDDHxCDD

1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDDHpCDD

OCDDOCDD

TEFTEFTEFTEF

2,3,7,82,3,7,8--TCDFTCDF 0,10,1

1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDFPeCDF 0,050,05

2 3 4 7 82 3 4 7 8--PeCDFPeCDF 0 50 5

TEFTEF

CBCB--7777 0,00010,0001

CBCB--8181 0,00010,00012,3,4,7,82,3,4,7,8--PeCDFPeCDF 0,50,5

1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1

1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1

2,3,4,6,7,82,3,4,6,7,8--HxCDFHxCDF 0,10,1

CBCB--126126 0,10,1

CBCB--169169 0,010,01

CBCB--123123 0,00010,0001

N1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDFHxCDF 0,10,1

1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDFHpCDF 0,010,01

1,2,3,4,7,8,91,2,3,4,7,8,9--HpCDFHpCDF 0,010,01

CBCB--118118 0,00010,0001

CBCB--114114 0,00050,0005

CBCB--105105 0,00010,0001

CBCB 167167 0 000010 00001Σ Ci x TEFiTEQ =N

OCDFOCDF 0,00010,0001

2,3,7,82,3,7,8--TCDDTCDD 11

1,2,3,7,81,2,3,7,8--PeCDDPeCDD 11

1 2 3 4 7 81 2 3 4 7 8 H CDDH CDD 0 10 1

CBCB--167167 0,000010,00001

CBCB--156156 0,00050,0005

CBCB--157157 0,00050,0005

CBCB--189189 0 00010 0001

Σ i iQ1,2,3,4,7,81,2,3,4,7,8--HxCDDHxCDD 0,10,1

1,2,3,6,7,81,2,3,6,7,8--HxCDDHxCDD 0,10,1

1,2,3,7,8,91,2,3,7,8,9--HxCDDHxCDD 0,10,1

1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8--HpCDDHpCDD 0,010,01

CBCB 189189 0,00010,0001

1,2,3,4,6,7,81,2,3,4,6,7,8 HpCDDHpCDD 0,010,01

OCDDOCDD 0,00010,0001

¿A que nivel tenemos que medir? Aspectos legislativos

Sustancias tóxicas a niveles muy bajos (pg/g)Necesidad de métodos altamente selectivos y sensiblesNecesidad de métodos altamente selectivos y sensiblesEn alimentación el nivel a medir viene dado por la

normativa.normativa.Alimentación animal: Orden PRE/1809/2006Alimentación humana: Reglamento (CE) Nº 1881/2006g ( ) /

MetodologíasMetodologías

Método de referencia GCMétodo de referencia GC--HRMSHRMS Métodos US EPA 1613 y Métodos US EPA 1613 y 16681668EIEI--SIM modoSIM modo

Resolución 10.000 (10%valle)Resolución 10.000 (10%valle)

16681668European Standard Method European Standard Method EN 1948EN 1948--1/2/3 1/2/3

TécnicasTécnicas alternativasalternativas y y complementariascomplementarias

MétodosMétodos químicosquímicos:: GCGC--Ion trap MS/MSIon trap MS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF

MétodosMétodos de de bioensayobioensayo:: DRDR--CaluxCalux assayassayyy yy

Reglamento (CE) Nº 1883/2006

Requisitos que deben cumplir los laboratoriosRequisitos que deben cumplir los laboratorios

Requisitos de aceptación de los procedimientosRequisitos de aceptación de los procedimientosanáliticos

Reglamento (CE) Nº 1883/2006

Requisitos que deben cumplir los laboratorios

- Los laboratorios deben demostrar la eficacia del método

- Límite de cuantificación 1/5 del nivel considerado/

- Medidas internas de control de calidad

- Participación den ejercicios interlaboratoriosp j

- Sistemas de gestión de calidad. Acreditación

Reglamento (CE) Nº 1883/2006

Requisitos de aceptación de los procedimientosálitianáliticos

- Sensibilidad adecuada y límites de detección bajos. Orden dejpg

- Selectividad elevada (especificidad). Distinción de losi ó tó i d l tó iisómeros tóxicos de los no tóxicos

- Elevada exactitud y precisión

Cl ifi ió d l ét d fi ió ib d- Clasificación de los métodos en confirmación y cribado

MetodologíasMetodologías

Método de referencia GCMétodo de referencia GC--HRMSHRMS Métodos US EPA 1613 y Métodos US EPA 1613 y 16681668é odo de e e e c a GCé odo de e e e c a GC SS

EIEI--SIM modoSIM modoResolución 10.000 (10%valle)Resolución 10.000 (10%valle)

16681668European Standard Method European Standard Method EN 1948EN 1948--1/2/3 1/2/3

Técnicas alternativas y complementariasTécnicas alternativas y complementarias

Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion trap MS/MSIon trap MS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF

Métodos de bioensayo:Métodos de bioensayo: DRDR--Calux assayCalux assayyy yy

Métodos de confirmaciónMétodos de confirmación

Ventajas- Elevada sensibilidad compatible con la normativa

Elevada selectividad y especificidad- Elevada selectividad y especificidad- Minimización de falsos positivos y negativos- Una vez implantada la metodología. Elevada robusted

InconvenientesElevada inversión- Elevada inversión

- Alta cualificación del personal- Alto mantenimiento- mayor tiempo de análisis?mayor tiempo de análisis?

Métodos de cribadoMétodos de cribado

Ventajas- Menor coste

Menor cualificación del personal- Menor cualificación del personal- Herramienta útil para el cribado de negativos

InconvenientesLimitada sensibilidad no siempre compatible con la normativabaja selectividad y especificidad- baja selectividad y especificidad

- Elevado número de falsos positivos- Buenos resultados dependientes del estado de instrumental- No necesariamente mayor rapidezNo necesariamente mayor rapidez

Reglamento (CE) Nº 1883/2006

Requisitos de los métodos de confirmación

- Utilización de patrones marcados isotópicamente

- Realización de controles de recuperación

- Verificación de la correcta separación cromatográfica decongéneres e interferencias

- Realización de la determinación conforme a método EPA 1613o similar

PCDDs/Fs y PCBs/ yProductos de la pesca

Muestra

PCDDF y PCB LCS

Extracción soxhlet

Clean-up automático

Ataque ácido

Clean up automático

Concentración

PCDDF y PCB ISS

HRGC-HRMS

PCDDs/Fs y PCBs/ yPreparación de muestras y Extracción

soxhletsoxhlet

HOMOGEINIZACIÓN Y EXTRACCIÓN TOLUENOPatrones 13C12

PREPARACIÓN DE MUESTRA

8 HORAS BÜCHI 811 Reposo 3 horas

PCDDs/Fs y PCBs/ yMuestras grasas: Ataque ácido

Disolución en hexanoCambio de disolventetolueno-hexano

Ataque con ácido sulfúrico2 X 100 mL

tolueno hexano

2 X 100 mL

Concentración

Clean-up

PCDDs/Fs y PCBs/ y“CLEAN UP”

Eluato en hexanoFMS

Sílice multicapa

12 mLFMS

POWER-PREP

pAlúmina básicaCarbón px-21

HexanoDCM/Hexano 2%DCM/Hexano 50%

A OEt/T l 50%AcOEt/Tolueno 50%Tolueno

l Frac. DCM/HexanoMono-ortho PCBs

Frac. ToluenoNon-ortho PCBs

PCDD/Fs

PCDDs/Fs y PCBsPCDDs/Fs y PCBsANÁLISIS INSTRUMENTAL

THERMO FINNIGANTHERMO FINNIGANMAT 95 XP

Extracto a sequedad F l

Extracto a sequedad F l Frac. tolueno

EPA1613-ISS

Frac. tolueno y DCM/Hex

EPA1668-ISSEPA1613 ISS+

nonano

HRGC:DB5-MS

EPA1668 ISS+

nonano

HRGC:RTX 2330HRGC:DB5 MS60 m x 0,25 mm

x 0,1 um

HRGC:RTX 233060 m x 0,25 mm x

0,1 um

HRGC: MID R= 10000

HRGC: MID R= 10000

SCREENING:?Donde podemos actuar?

TIEMPO

COSTE

METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENING

Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion Ion traptrap MS/MSMS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGC GCGC GC ECDECDGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC--TOFTOF

Preparación de muestra

Métodos de bioensayo:Métodos de bioensayo: DRDR--CaluxCalux assayassayMétodos ELISAMétodos ELISA

METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENINGRequisitos de los métodos de screening

- Debe ser lo suficientemente selectivos y sensibles en los niveles ymatrices legislados.

- Es necesario disponer y proporcionar información de los falsospositivos y negativos en una amplia serie de datos.

- El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%El porcentaje de falsos negativos debe ser inferior al 1%

- El porcentaje de falsos positivos debe ser lo suficientemente bajopara resultar útil

- Deberán confirmarse mediante HRGC/HRMS todos los positivos y almenos entre un 2-10% de las muestras negativas

- Según la estrategia de análisis del Reglamento (CE) 1883/2006Según la estrategia de análisis del Reglamento (CE) 1883/2006deberían confirmarse muestras cuyo EQT > 25% del limite

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: Bioensayo

Método Calux: Chemical Activated LUciferase gene eXpression.g

PCDD, PCDF y PCB se unen a un receptor intracelular, conocido como receptos aril hidrocarburos (Ah). La unión al receptor Ah es seguido por el transporte del complejo PHAH-Ah complejo al núcleo de la célula y la posterior unión a secuencias específicas en el ADN.

E t i ífi d ADN d i l t d tEstas secuencias específicas de ADN se denominan elementos de respuesta (ER). La unión del complejo químico a los receptores de la RE activa la expresión de genes asociados a RE. El impacto toxicológico de las sustancias químicas se inicia con el cambio observado en la expresiónsustancias químicas se inicia con el cambio observado en la expresión génica.

En términos finales se mide la actividad luminiscente de la enzima luciferasaEn términos finales se mide la actividad luminiscente de la enzima luciferasa formando complejo con la luciferina por descarboxilacion oxidativa.

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: 1. Toma de muestra

2. Extracción de la muestra

3. Clean-up: Silica, Alúmina, Florisil

4. Cultivo celular

5. Crecimiento celular

6. Exposición de las células a extractos

de muestra.

7. Adición de luciferina y cuantificación de la

actividad luminiscente de la luciferasa

8. Comparacion de curva de calibrado y

expresión de resultados : CALUX-EQT

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: ejemplo

Aceite vegetal fabricación de piensos.30 muestras. pBuena correlacion con HRGC-HRMS

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo DR-Calux: ejemplo Aceite de pescado

2011/23856 07/27/2011 04:04:52 PM 2011/23856J037

RT: 22.00 - 24.00 SM : 9G

60

80

100

Abun

danc

e

23.2322.11

22.2422.2222.35

NL: 3 .13E3m/z= 321.7936-321.9936 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07

EQT CALUX 3 25 /22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9

Time (min)

0

20

40

Rel

ativ

e

22 .9722.74

22.47 23.30 23.6523.4023.06

RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B

60

80

100

bund

ance

22 .10 23.22

22.23

22 36

NL: 2 .29E3m/z= 319.7965-319.9965 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07

EQT CALUX= 3.25 pg/gEQT HRGC-HRMS= 0.64 pg/g

22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)

0

20

40

Rel

ativ

e Ab 22.36

22.9622.47 22.7323.6522.8422.63 23.4223.05 23.49 23.7023.51 23.75 23.84 23.94

RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B

60

80

100

ndan

ce

22 .96 NL: 5.71E5m/z= 331.8300-332.0300 F: + c EI SIM ms [ 303.40-364.48] M S 20110727C07

22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)

0

20

40

60

Rel

ativ

e Ab

un

23.40

23.56 23.6523.25 23.73 23.80 23.88 23.9122.3222.2822.21 22.44 22.59 22.72 22.7622.07

RT: 22.00 - 24.00 SM : 9B

80

100

ance

22 .96 NL:7.06E5m/z= 333.8339-334.0339 M S

22.0 22.1 22.2 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 22.9 23.0 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9Time (min)

0

20

40

60

Rel

ativ

e Ab

unda

23 .40

23.6123.5823.13 23.22 23.9623.82 23.8822.3722.34 22.8222.1322.11 22.6322.28 22.5422.42 22.73

20110727C07

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoMétodo ELISA: Enzime-Linked Inmunosorbent Assay

- Las dioxinas presentes en la muestra compitenpor el antígeno de recubrimiento (hapteno 2 3por el antígeno de recubrimiento (hapteno 2, 3,7 – Tricloro 8 – carboxi – dibenzo dioxina) porlos sitios activos en anticuerpos inmovilizados

- Después de un lavado los compuestos nounidos son eliminados

L ió d di i i-La concentración de dioxinas es inversamenteproporcional al color producido

- La obtención del EQT se realiza porLa obtención del EQT se realiza porcomparación con una curva de calibración enEQT

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: Bioensayo

)E t ió )ExtracciónClean-up

ELISAObtención de EQT

METODOS DE SCREENING: BioensayoMETODOS DE SCREENING: BioensayoCaracterísticas

- Elevada rapidez Placas de 96 platos simultaneos- Elevada rapidez. Placas de 96 platos simultaneos

- Menor necesidad de purificación. Aunque los resultados pueden ser

fuertemente dependientes del mismofuertemente dependientes del mismo

- Elevada sensibilidad. Uso de reducido tamaño de muestra

- Estudio directo de la toxicidad de la muestra

- Coste reducido. Sobre un 50-60% del método de confirmación

- Selectividad comprometida. Depende del perfil de contaminación.

Posibilidad de falsos positivos

- No siempre se utilizan con rigor

- No proporcionan perfil de congéneres. Difícil saber el origen de al

contaminación

METODOS DE SCREENINGMETODOS DE SCREENING

Métodos químicos:Métodos químicos: GCGC--Ion Ion traptrap MS/MSMS/MSGCGC--TQ MS/MSTQ MS/MSGCxGCGCxGC--µECDµECDGCxGCGCxGC TOFTOF

Preparación de muestra GCxGCGCxGC--TOFTOFmuestra

ExtracciónPurificación

AutomatizaciónAutomatización

METODOS DE SCREENING: QuímicosMETODOS DE SCREENING: QuímicosExtracción: PLE (pressurized liquid extraction)

1. Extracción con

disolventes a elevadas

temperaturas y presiones

2. Uso de disolventes de

muy diferente polaridad y

en poco volumen

Extracción soxhlet4 muestras 8-12 h

Extracción PLE12 muestras 2 h

3. Permite incluir una etapa

de purificación dentro de

la extracción

METODOS DE SCREENING: QuímicosMETODOS DE SCREENING: QuímicosExtracción: PLE (pressurized liquid extraction)

Solución total: extracción – purificación - concentración5 muestras: 4 h a falta del análisis5 muestras: 2 dias. Resultados finalesProblema: Coste elevado

METODOS DE SCREENING: QuímicosQExtracción: MSPD (Matrix Solid Phase Disperssion)

1. Matriz disgregada con unagente dispersante

2. Extracción estática ydinámica con eldisolvente adecuado

3. Permite incluir una etapade purificación y eluciónd i t f ide interferencias.

4. Uso combinado dediferentes adsorbentes:biobeads silica alúmina

SIN INSTRUMENTAL

biobeads, silica, alúmina,carbon .

5. Dificultad para un clean-up fino de las sustanciasS S U

FACIL PARA CUALUIERLABORATORIO

up fino de las sustanciasplanas: necesidad de otraetapa

METODOS DE SCREENING: QuímicosQExtracción: MSPD (Matrix Solid Phase Disperssion)

Una posible aplicación: Diseño de un kit basado en QuEChErs

Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe

Extracción y purificacióngruesa: grasas

Aislamiento de PCBs y DIOX

SIN INSTRUMENTAL

Clean-up final

MIPsS S UFACIL PARA CUALUIERLABORATORIO

MEPS

METODOS DE SCREENING: QuímicosQPURIFICACION: Polímeros de Impresión Molecular

- Preparación de un polímero altamente entrecruzadop pen presencia del analito (plantilla) para el cual se deseael reconocimiento selectivo.- Se pone inicialmente en contacto el analito con unmonómero adecuado con el fin de formar un complejop jde pre-polimerización.- Posteriormente se le añade el entrecruzante, eliniciador y el disolvente en el que se lleva a cabo lapolimerización (porogen).p (p g )- Una vez obtenido el polímero, se extrae el analitoplantilla, liberando los sitios de reconocimientoespecífico.- La plantilla puede ser el propio analito (posiblesp p p p (pproblemas de fondo) o moléculas de estructura similar.- Se pueden preparar estructuras solo para TCDD(como representante de EQT) o todos los congéneres.- Necesario calibrar para cada matriz.p

METODOS DE SCREENING: QuímicosQPURIFICACION: MicroExtraction by Packed Sorbent

METODOS DE SCREENING: QuímicosQANALISIS

C t d dC t d dGCGC--Ion Ion traptrap MS/MS:MS/MS:

-- Coste moderadoCoste moderado-- Sensibilidad aceptableSensibilidad aceptable-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Resolución bajaResolución baja-- Robustez bajaRobustez bajajj

-- Coste medioCoste medioSensibilidad buenaSensibilidad buena

GCGC--Triple Triple cuadrupolocuadrupoloMS/MS:MS/MS:

-- Sensibilidad buenaSensibilidad buena-- Selectividad moderadaSelectividad moderada-- Resolución 0.7 Resolución 0.7 amuamu-- Robustez altaRobustez alta-- rapidez elevadarapidez elevada

CONCLUSIONES

11 Los métodos deLos métodos de screeningscreening resultan un herramienta útil para laresultan un herramienta útil para la1.1. Los métodos de Los métodos de screeningscreening resultan un herramienta útil para la resultan un herramienta útil para la obtención de manera rápida y asequible de un gran numero de obtención de manera rápida y asequible de un gran numero de datos sobre los niveles de dioxinas y datos sobre los niveles de dioxinas y PCBs.PCBs. Son muy útiles en las Son muy útiles en las crisiscrisiscrisis.crisis.

2.2. De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo De manera rutinaria deben de ser usados con responsabilidad. Lo mejor son programas combinados con HRGCmejor son programas combinados con HRGC--HRMS.HRMS.

3.3. Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el Deben investigarse a fondo y validarse par cada matriz. Conocer el perfil de congéneres y evitar falsos negativos y positivos.perfil de congéneres y evitar falsos negativos y positivos.

44 M h d l l t d l ét d dM h d l l t d l ét d d ii ii4.4. Muchos de los elementos de los métodos de Muchos de los elementos de los métodos de screeningscreening sirven para sirven para hacer también mas rápidos los métodos de confirmación.hacer también mas rápidos los métodos de confirmación.

5.5. Además de las metodologías, es necesaria la inversión en personal Además de las metodologías, es necesaria la inversión en personal g , pg , pcualificado cualificado

AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS

PERSONAL DE LA UTCMUCHASPERSONAL DE LA UTC

CONSUELO LÓPEZ BOLAÑOPAULA MARTÍNEZ TOJEIRO

MUCHAS GRACIAS PORPAULA MARTÍNEZ TOJEIRO

CRISTINA MONTOIORO PEREIROVERONICA FERNANDEZ-VILLARRENAGA

GRACIAS POR SU ATENCIÓNSU ATENCIÓN