10Fotosíntesis: Luz y doroplastos

Figura 10-1 Fotosíntesis y respiración: Relaciones energéticas contrastantes.En esencia, la fotosíntesis es el único mecanismo de en trada de energía para la biosfera. Las únicas excepcio nes se presentan en bacterias quimiosintéticas, que obtienen energía oxidando sustratos inorgánicos como iones ferroso y azufre disueltos de la corteza terrestre,o al oxidar H 2 S que se libera en la actividad volcáni ca. Además, las chimeneas térmicas del fondo marino Inyectan energía en forma de calor a estos sistemas bio lógicos. Debido a su importancia para la vida, se dedi carán tres capítulos a la fotosíntesis.

Como reacciones de oxidación que producen la ' energía de la que depende la vida, en la fotosíntesis par- . licipan oxidación y reducción. El proceso global es una oxidación de agua (eliminación de electrones con libe ración de 02 como subproducto) y una reducción de C02 para formar compuestos orgánicos tales como carbohidratos. (El inverso de este proceso —la combus- !. tión u oxidación de gasolina o carbohidratos de la ma dera para formar CO? y H 20— es un proceso espontáneo que libera energía.) El proceso oxidativo de la respiración, similar y también controlado con efi ciencia, mantiene vivos a todos los organismos (véase el Cap. 13). Durante los procesos de combustión y res - piración se extraen electrones de los compuestos car bonados y se les hace circular cuesta abajo (en un sentido energético), después de lo cual se combinan, junto con iones H + , con un fuerte aceptor de

electro nes, 0 2 , para formar moléculas estables de H 20. Vista í de este modo, la fotosíntesis utiliza energía luminosa |r para llevar electrones “cuesta arriba”, retirándolos del agua hacia un aceptor de electrones más débil, el C0 2 . En la Fig. 10-1 se resumen estas relaciones. En el pre sente capítulo se considera el aparato colector de luz | de los vegetales —la membrana tilacoidal de los i» doroplastos— y la manera en que éste efectúa el trans- porte de electrones “cuesta arriba”.

10.1 Resumen Histórico de las Primeras Investigaciones Sobre la FotosíntesisAntes del siglo xvm, los científicos pensaban que los vegetales obtenían todos sus componentes del suelo. En 1727, Stephen Hales sugirió que parte de su nutri mento provenía de la atmósfera y que la luz participa ba de alguna manera en este proceso. Entonces aún no se sabía que el aire contiene diferentes elementos en estado gaseoso.

En 1771 Joseph Priestly, un clérigo y químico inglés, sugirió la participación del 02 (aunque no se sabía que este “aire desflogistado”, como él lo llamó, estaba for mado por moléculas) cuando descubrió que las plan tas verdes eran capaces de renovar el aire “viciado" por la respiración de los animales. Posteriormente un mé

dico holandés, Jan Ingenhousz, demostró que la luz era necesaria para esta purificación del aire. Descubrió que las plantas también producían “aire viciado" en la os curidad. De modo sorprendente (para nosotros) esto lo llevó a recomendar sacar las plantas de las casas du rante la noche, ¡para evitar la posibilidad de que los ocu pantes se intoxicaran! Gest (1988) revisa éste y otros experimentos pioneros realizados a principios del si glo xvm por Stephen Hales.

En 1782, Jean Senebier demostró que la presencia del gas nocivo que producen animales y plantas en la oscuridad (C0 2 ) estimulaba la producción de “aire pu rificado” (O,) en presencia de luz. Así, ya por esta fe cha se había demostrado la participación de dos gases en la fotosíntesis. Los trabajos de Lavoisier y otros hi cieron patente que estos gases eran en realidad C0 2 y 0 2 . N. T. de Saussure propuso la participación del agua cuando, en 1804, efectuó las primeras cuantifica- ciones de la fotosíntesis. Descubrió que las plantas ga naban más peso seco durante la fotosíntesis del que podía explicar la diferencia entre el peso del C0 2 ab sorbido y el peso del 0 2 liberado. Correctamente, atri buyó la diferencia a la captación de H 20. También se dio cuenta de que durante la fotosíntesis se intercam biaban volúmenes más o menos iguales de C 02 y 02 .

La naturaleza del otro producto químico de la foto síntesis —materia orgánica— fue demostrada por Julius Sachs en 1864, cuando observó el crecimiento de gra nos de almidón (granos amiláceos) en cloroplastos ilu minados. El almidón se detectaba sólo en áreas de la hoja expuestas a la luz. Se demostró entonces que la reacción general de la fotosíntesis era la siguiente:

En esta reacción, (CII 20)„ es una manera abreviada de representar al almidón u otros carbohidratos median te una fórmula empírica. El almidón es el producto fo- tosintético más abundante en el mundo formado por los cloroplastos.Cuando se compara la Reacción 10.2 con la 10.1, puede apreciarse una analogía entre las funciones de

Otro descubrimiento importante fue el de C. B. van Niel, quien a principios de la década de 1930 hizo no tar la similitud entre el proceso fotosintético general en las plantas verdes y el de ciertas bacterias. Se sabía que diversas bacterias reducían el CO¿ utilizando la energía luminosa y una fuente de electrones distinta del agua. Algunas de estas bacterias utilizan ácidos orgáni cos tales como ácido acético o succínico como fuen tes de electrones, mientras que aquéllas a las que van Niel prestó especial atención utilizan H 2 S y depositan azufre como subproducto. Se pensó que la ecuación fotosintética general para estas bacterias era la siguiente:H 2 S y 11,0. y entre las de O, y azufre. Esto sugirió a I van Niel que el 0 2 liberado por las plantas provenía I del agua, no del C0 2 . Esta idea fue apoyada hacia fi- I nales de la década de 1930 en Inglaterra por Robin Hill I y R. Scarisbrick, quienes con su trabajo demostraron I que cloroplastos aislados, y fragmentos de estos mis- I mos, son capaces de liberar ()_> en presencia de luz si I se les proporciona un aceptor conveniente para los I electrones que se extraen del II 20. Los primeros acep- I tores de electrones proporcionados a los cloroplastos I fueron ciertas sales férricas (Fe 3 *), las cuales se redu- I cían a la forma ferrosa (Fe-*). Este rompimiento del I agua inducido por luz (fotolisis), en ausencia de fijación I de C0 2 , vino a ser conocido como reacción de Hill. Los I trabajos de Hill y Scarisbrick demostraron que, al me- I nos para algunas de las reacciones de la fotosíntesis, no I se necesita de toda la célula, y que la liberación de 0¡ I inducida por la luz no se encuentra indefectiblemente I unida a la reducción de CO_>.

Evidencia más convincente de que el 0 2 liberado I proviene del H 2 0 llegó en 1941 con el trabajo de Sa- I muel Rubén y Martin Kamen (véase la revisión históri-1 ca de Kamen, 1989). Proporcionaron al alga verde ■ Chlorella H¿0 con l 80, un isótopo pesado no radiac-B tivo del oxígeno que se puede detectar con un espeo I trómetro de masa. El 0 2 c¡ue se libera en la fotosíntesis I se encontraba marcado con l 80, en sustento de la hi-K pótesis de Niel. Por razones técnicas, los experimen-B tos de Rubén no podían probar que el 0 2 procedía por E completo del H 20, pero investigación subsecuente deH Alan Stemler y Richard Radmer (1975) parece propor-B cionar dicha prueba. De este modo, es necesario mo-Mj dificar la ecuación resumida para la fotosíntesis que se ■ da en la Reacción 10.1 a fin de incluir dos moléculasB de H 2 0 como reactivos:

En 1951 se descubrió que un constituyente natural d los vegetales —una coenzima que contiene vitamina (niacina o nicotinamida) y que se denomina fosfato di dinucleótido de nicotinamida y adenina (se abrevi NADP + )— también era capaz de funcionar como rea< tivo de Hill al aceptar electrones del agua en reaccic nes que ocurren en membranas aisladas de tilacoideo en cloroplastos fracturados. Este descubrimientoe¡ timuló una vez más la investigación de la fotosíntesis como ya se sabía que la forma reducida del NADP* NADPH, era capaz de transferir electrones a varios com puestos vegetales, resultó correcto suponer que su fun ción normal en los cloroplastos es reducir el C0 2 . P« consiguiente, una de las dos funciones eserzcialesá la luz en la fotosíntesis es impulsar a los electrom provenientes del H20 para reducir el NADP' l NADPH, la otra función es proporcionar energíarala formación de A TP a partir de ADP y P/', como fK describe enseguida.

Figura 10-2 Cloroplasto de una hoja de avena. S, estroma;SL, tilacoide estromático; G, grana; SG, grano de almidón; CW, pared celular. (Cortesía de P. Hanchey-Bauer.)1 La conversión de ADP y P/' a ATP en los cloropjas- tos se descubrió en el laboratorio de Daniel Arnon en paUniversity of California, campus Bcrkclcy, en 195-i ¡ 00cual se revisa en Arnon, 1984). Antes de esto, el úni femccanisnio importante que se conocía para la for- pnción de ATP era la respiración, en especial aquellas reacciones a las que se conoce como fosforilación oxi- dativa (véase el Cap. 13) y que se realizan en las mito- ¿COndrias. Arnon descubrió que el ATP se sintetiza en j^doroplastos aislados sólo en presencia de luz; esto vi se!» a ser conocido como fosforilación fotosintética, o fo- |Hfcsforilación. Este proceso de formación de ATP BiBediante fotofosforilación puede resumirse de la ma- ¡íoera siguiente:K La fotofosforilación en los cloroplastos es la causa |«que en las hojas se realice mucho más formación de ÍATP durante la luz del día que fotofosforilación en las BCtocondrias de las mismas hojas, por lo que es clara- Sncntc de gran importancia cuantitativa. Sin embargo, Kneccsario advertir que la ecuación resumida para la Kíosíntesis (Reacción 10.3) nada dice acerca de com- ■pestos como ATP, NADPH o NADP 1 . La razón es BHkc, una vez que se forman ATP y NADPH, la energía pe ambas se utiliza en el proceso de la reducción de HUj y en la síntesis de carbohidratos, donde de nue- Ek liberan ADP, P i y NADP + . Así, ADP y P/ se con- ■Krten rápidamente en ATP mediante la energía Hfillnosa, mientras que el ATP se degrada con la mis- ■rapidez cuando la fotosíntesis se efectúa a un ritmo ■justante. En el Cap. 11 se estudia la forma en que se Hlzan las moléculas de ATP y NADPH para ayudar a RfrCOa, y en lo que resta de este capítulo nos ocu- Bbnos de las membranas tilacoidales de los cloroplas- Hfde cómo capturan la energía luminosa y la utilizan B* formar ATP y NADPH.

■<2 Cloroplastos: Estructuras ■pigmentos fotosintéticos■pcuentran cloroplastos de muchos tamaños y for jen diversos tipos de vegetales (Kirk y Tilney- Kfett, 1978; Possingham, 1980; Wellburn, 1987). Di- H-doroplastos surgen de diminutos protoplastidios Btfdios inmaduros, pequeños y casi incoloros, con ■Í 0 ninguna membrana interna). Casi siempre, los ■pplastidios se derivan sólo de óvulos sin fecundar; H^ermo no contribuye con nada. Los protoplasti- ■Ncdividen a medida que se desarrolla el embrión, ■jfjcnen en cloroplastos al formarse tallos y hojas. Bbroplastos jóvenes también se dividen de mane ra activa, en especial cuando el órgano que los contie ne se expone a la luz, por lo que cada célula de una hoja madura muchas veces contiene unos pocos cien tos de cloroplastos. La mayoría de los cloroplastos se aprecian con facilidad al microscopio óptico, pero su estructura fina sólo pudo develarse por microscopía electrónica.

Suponiendo que los organismos pueden segregarse de manera lógica en cinco reinos, los cloroplastos se presentan en casi todos los miembros del reino Plan- tae y en ciertas algas, o miembros semejantes a éstas, del reino Protista. Las únicas excepciones que se co nocen son ciertas angiospermas parásitas e incoloras. Las cianobacterias y otras bacterias fotosintéticas del rei no Monera carecen de cloroplastos, pero poseen pig mentos fotosintéticos embebidos en membranas especializadas, como lo están los cloroplastos. No se presentan cloroplastos en los reinos Ammalia y Fungi (hongos). Aquí se discutirán sólo los cloroplastos típi cos de plantas vasculares, briofitas y numerosas algas verdes del reino Plantae.

En la Fig. 10-2 se muestra la estructura de un cloro plasto de una hoja de avena. Cada cloroplasto está ro deado por un sistema de doble membrana o envoltura que controla el tránsito de moléculas hacia dentro y fue ra. En el interior del cloroplasto se encuentra el mate rial amorfo, gelatinoso y rico en enzimas llamado estroma, el cual contiene enzimas que convierten el C0 2 en carbohidratos, en especial almidón. Embebi dos por todo ¿1 estroma están los tilacoides (del griego tilakos, “saco” o "bolsita”) que contienen pigmentos y en los cuales se utiliza la energía de la luz para oxidar H 2 0 y formar ATP y NADPH, ricos en energía, nece sarios a su vez para que el estroma convierta el CO ¿ en carbohidratos. En ciertas porciones del cloroplasto se

localizan pilas de tilacoides a las que se conoce como grana (cada pila o saco individual es un granum o ele mento de grana). La región en que un tilacoide está en contacto con otro se denomina región apresada. Como se explicará más adelante, estas regiones del tilacoide efectúan fotorreacciones un poco diferentes de las que se realizan en las regiones tilacoidales sin apresar y en los tilacoides estromáticos, pues ambos se encuentran en contacto directo con el estroma. Los tilacoides estro máticos son tilacoides más alargados que conectan un elemento de grana con otro y se extienden por todo el estroma. Muchas veces llegan a formar parte de unoo más grana, situación en la que, en los puntos de con tacto, no hay distinción obvia entre ellos y los tilacoi des del grana. La Fig. 10-3 es una interpretación tri dimensional de la relación entre los tilacoides estro máticos y los del grana. Nótese que hay una cavidad, comúnmente denominada luz o lumen, entre las dos membranas de cada tilacoide. Esta luz está llena de agua y sales disueltas y tiene una función especial en la fo tosíntesis.

Los pigmentos presentes en las membranas tilacoi dales consisten sobre todo en dos tipos de clorofilas (verdes), clorofila a y clorofila b. También se presentan pigmentos amarillo-naranja que se clasifican como ca- rotenoides. Hay dos tipos de carotenoides: Los carote nos, que son hidrocarbonados puros, y las xantofilas, que contienen oxígeno. Ciertos carotenoides (en especial violaxantina, una xantofila) también se presentan en la envoltura del cloroplasto, dándole un color amari llento, mientras que las clorofilas no se presentan enlas envolturas. En la Fig. lO-.a se muestran las estruct ras de las clorofilas <7 y /?. así como de algunos carot noides. En la mayoría de los vegetales, incluyendo 13 algas verdes, el fi-c<.vote>io y la xantofiJa luteína son losl carotenoides que más abundan en los tilacoides.

Figura 10-3 Interpretación tridimensional de la disposición de las membranas internas en el cloroplasto, con énfasis en la relación entre tilacoides estromáticos y del grana. <Redi- bujado de un originai de T. E. Weir.)

La microscopía decir '■nica no proporciona informa ción acerca de cómo se disponen clorofilas y carote! noides en ios r i¡.icr<idc?. pero otras técnicas muestra! que todas las clorofilas, y la mayoría o todos los caro tenoides, están embebidos en ios tilacoides y se encuen tran unidos por enlaces no covalentes a moléculas de proteína. En conjunto, los pigmentos del cloroplasto representan cerca de la mitad del contenido lipídico en" las membranas tilacoidales, mientras que la otra mitad está compuesta sobre todo por galactolípidos con pe queñas cantidades de fosfolípidos (véanse las estructu~r ras en la Fig. 7-13). La cantidad ele esteróles es escasa’o nula, en contraste con lo que se observa en otras membranas vegetales. Los galactolípidos y fosfolípidos conforman una bicapa típica de las membranas que seT describen en los Caps. 1 y 7. Las porciones de ácidos^ grasos de los lípidos tilacoidales son ricas en ácido li- nolénico (con tres enlaces dobles) y ácido iinoleico (con» dos enlaces dobles). Estos ácidos grasos insaturados ha-fj cen que las membranas tilacoidales sean inusualmente fluidas, por lo que algunos compuestos que se locali zan en su interior adquieren gran movilidad.

En los cloroplastos también se presentan DNA, RNA, ribosomas y, por supuesto, diversas enzimas. Todas es tas moléculas se localizan sobre todo en el estroma.F donde se efectúan tanto transcripción como traducción (véase el Apéndice C). El DNA del cloroplasto (el geno- ma) existe en la forma de 50 o más círculos de dobles * cadenas superarrolladas por plastidio. Al parecer, mu chos de los genes de plastidio codifican todas las mo léculas de RNA de transferencia (unas 30) y RNA ribostómico (cuatro) que los plastidios utilizan en la tra ducción. Hay unos 85 genes más que codifican proteí- ! ñas que participan en transcripción, traducción y fotosíntesis, pero la mayoría de las proteínas que se lo E calizan en los plastidios son codificadas por genes del núcleo (Steinback et al., 1985; Murphy y Thompson, 1988).

10.3 Algunas nociones de Absorción de la luz por los VegetalesPara averiguar cómo es que la luz induce la fotosínte sis, es necesario aprender algo acerca de sus propieda des. En primer lugar, la luz tiene características de partícula y de onda. La luz representa sólo la porción de la energía radiante con longitudes de onda visibles para el ojo humano (aproximadamente 390 a 760 na- nómetros, nm). Esta es una región muy angosta del es pectro electromagnético.

f ¡Se hace referencia a la naturaleza particulada de la npcuando se declara que tiene la forma de cuantos o ^ ¿sudes: paquetes discretos de energía, cada uno aso- Hldoa una longitud de onda específica. La energía de Rada fotón es inversamente proporcional a la longitud BÉonda, por lo que las longitudes de onda del azul y [¡(Moleta tienen fotones más energéticos que las longi- Hdesdel rojo y el anaranjado, más largas. Antes, a un ríW(6.02 x 10 2J ) de fotones se le conocía como eins- tein, pero en la actualidad el término einstein está en desuso debido a que el mol es una unidad SI y el eins tein no lo es. En el Apéndice B se discuten aspectos cuantitativos, y de otros tipos en relación con la luz.

Un principio fundamental de la absorción de la luz, que a menudo se conoce como ley de Stark Einstein, es que cualquier molécula sólo puede absorber un fotón a la vez, y que este fotón causa la excitación de sólo un electrón. Electrones de valencia (de enlace) especí

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ficos en orbitales que tienen un estado fundamental (ba sal) estable son los que casi siempre resultan excitados; cada uno de estos electrones puede ser alejado de su estado basal respecto al núcleo (con carga positiva) una distancia que corresponde a una energía exactamente igual a la energía del fotón que se absorbió (Fig. 10-5). Una molécula de pigmento en esta situación está en un estado excitado, y es esta energía de excitación la que se utiliza en la fotosíntesis.

Las clorofilas y otros pigmentos pueden permane cer en estado de excitación sólo por periodos muy cor tos, casi siempre de una mil millonésima de segundo (uji nanosegundo) o aún menos. Como se muestra en la Fig. 10-5, lá energía de excitación se puede perder en su totalidad por la liberación de calor que se pre senta cuando el electrón regresa a su estado basal. Esto es justo lo que en este momento ocurre con los elec trones en la tinta de estas palabras. Lina segunda forma en que algunos pigmentos — incluyendo la clorofila— pue den perder energía tic excitación es por una combinación de fluorescencia y pérdida de calor. (La fluorescencia es Li producción de luz que acompaña a la rápida disminución en la energía ele los electrones que se encuentran en esta do excitado.) La fluorescencia de la clorofila sólo produ ce luz de color rojo oscuro cuya longitud de onda puede

Figura 10-5 Modelo simplificado para explicar cómo se cede la energía luminosa que Incide en una molécula de clorofila. Nótese que la excitación que producen las luces roja o azul conduce al mismo nivel energético final (que a menudo se denomina primer singlete excitado). A partir de este punto, la energía puede perderse por decaimiento de regreso al estado basal (pérdida de calor o fluorescencia de luz roja), o puede transferirse a un pigmento adyacente, por resonancia inductiva. Cada vez, el pigmento transfiere su energía de excitación a un pigmento adyacente, y el electrón excitado del primer pigmento regresa al estado basal.verse con facilidad cuando se ilumina una solución I '» tantc concentrada de c lorofila a o /), o una mezcla t :iif! mentor de cloroplasto. en especial con radiaciones azuío ultravioleta. Hn la hoja, la fluorescencia es débil porque la energía de excitación se utiliza en la fotosíntesis La Fig. 10-5 ayuda a explicar por qué, en térn-mios energéticos, la luz azul siempre es menos eficiente que la luz roja en la fotosíntesis. Después de ser exc do por un fotón azul, el electrón de una clorofila sie )re pierde con extrema rapidez su contenido energético al liberar calor, lo cual lo sitúa en un nivel energético ne- ñor; este nivel se alcanza con luz roja de menor a-. gía sin dicha pérdida de calor, cuando se absorbed fotón rojo. Desde este nivel inferior, pueden presen tarse ya sea pérdida adicional de calor, fluoresc co fotosíntesis. ___

Para la fotosíntesis se requiere que la energía délo electrones excitados de varios pigmentos se tran ":t a un pigmento colector de energía, un centro de V. aon. Más adelante se explicará que hay dos tipos decei tros de reacción en los tilacoides, ambos consist pn te en moléculas de clorofila a que son especiales pi es tar asociadas con proteínas particulares y otros ruffl ponentes de la membrana. En la Fig. 10-5 se ilustrad hecho de que la energía en un pigmento que ha doexcitado puede transferirse a un pigmento adyac __________ te, y de éste a otro pigmento más y así hasta que, por últ¡ mo, la energía llega al centro de reacción. Existe di versas teorías para explicar la emigración de la er gía dentro de un grupo de moléculas de pigmento aclya- centes entre sí, la más popular de las cuales establea que la energía emigra por transferencia de un ex jn 1 mediante resonancia inductiva. No se discutirá est«-r £0 ría, pero debe enfatizarse que la excitación de cualquie ra de las muchas moléculas de pigmento en un tila ide posibilita una colecta momentánea de la energía mi nosa que hay en el centro de reacción de una clorofila!

Las hojas de la mayoría de las especies absorbe ¡lí del 90% de las longitudes de onda del violeta ye zii que inciden en ellas, y un porcentaje casi tan elevad de las correspondientes al rojo y el anaranjado (vhs la Fig. 4-14). Casi toda esta absorción la realizan le >l| mentos del cloroplasto. En los tilacoides, cada rotá es capaz de excitar un electrón de un carotenoide o un clorofila. Las clorofilas son verdes debido a que £ oben de manera poco eficiente las longitudes de ___________ t

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del verde, de modo que las reflejan o transmiten. 5 puede utilizar un espectrofotómetro para medir'* ib sorbancia relativa de diversas longitudes de onda n nosas por un pigmento purificado. Una gráfica efíqtl esta absorción se representa como una función del longitud de onda se conoce como espectro de abst 4 Un excitón es la combinación de un electrón y un hueco d‘ gía en un semiconductor que lia sido excitado; el hueco aci tonces como si fuera una carga positiva, y atrae al electrón. (N. de

fijura 10-6 (a) Espectros de absorcion de las clorofilas a y »disueltas en éter dietílico. El coeficiente de absortividad i^uese utilizó aquí es igual a la absorbancia (densidad ópti- SjUdeuna solución con concentración de 1 g/L en una ■ida (trayecto óptico) de 1 cm. (Tomado de Zscheile y ■mar, 1941.) (b) Espectros de absorción del ^-caroteno en huno y de la luteína (una xantofila) en etanol. El coefi- de absortividad que se utilizó es el mismo que en la 10-6a. (Datos de Zscheile ef a/., 1942.)

Figura 10-7 Espectros de acción de 22 especies de plantas cultivadas. (Tomado de McCree, 1972.)Mía Fig. 10-6a se muestran los espectros de absorción ■tías clorofilas a y b. Dichos espectros revelan que,■ F Uro, se absorbe muy poco de la luz verde y verde ■Brilla de 500 y 600 mn, y que ambas clorofilas ab- núrbcn intensamente las longitudes de violeta, azul, ana- pojado y rojo.■la mayoría de los carotenoides (tanto /3-caroteno co- Bjxantofilas) de los tilacoides transfieren de manera ^tiente su energía de excitación a los mismos centros atracción que las clorofilas, por lo que también con- Hbuyen a la fotosíntesis (Siefermann-Harms, 1985, H)7). En la Fig. IO-6b se muestran los espectros de ab sorción del /^-caroteno y la luteína (una xantofila). ¡n vitro

estos pigmentos sólo absorben longitudes de on da violeta y azul. Reflejan y transmiten los colores ver de, amarillo, anaranjado y rojo, combinación que, para nosotros, aparece como amarillo. Los carotenoides, aparte de funcionar como pigmentos colectores de luz que contribuyen a la fotosíntesis, protegen a las clorofilas contra la destrucción oxidativa por el O, cuando los niveles de irradiando, son elevados (véase el tema de la solarización, Secc. 12.3).

Cuando se comparan los efectos de diferentes lon gitudes de onda sobre la tasa fotosintética, asegurán dose de que no se agrega demasiada energía de cualquier longitud de onda (en cuyo caso el proceso se saturaría), se obtiene un espectro de acción. Los es pectros de acción de la fotosíntesis y otros procesos fotobiológicos ayudan a identificar al pigmento impli cado, ya que estos espectros con frecuencia coinciden estrechamente con el espectro de absorción de cual quier pigmento participante. Para que la luz sea efecti va, debe absorberse. Las tasas fotosintéticas relativas para varias especies de dicotiledóneas herbáceas y pas - tos pueden graficarse como función de la longitud de onda que incide en determinada unidad de área foliar (Fig. 10-7). Inada (1976) obtuvo resultados similares. To das las especies presentan un pico principal en la re gión correspondiente al rojo, así como un pico menor distintivo en la región del azul; ambos picos resultan de la absorción de luz por clorofilas y carotenoides .2 En árboles deciduos se presentan resultados similares. Sin embargo, las coniferas muestran una respuesta me-- Se obtienen espedios tic acción un t:mio diferentes, con picos me ñores en l.i región (.leí azul. cuando los timos se grafican como función tic la energía que hay en cada longitud de onda que se aplica, listo se debe a que, si bien im fotón azul que es absorbido por un pigmento lotosintcticamcntc activo es tan eficaz como cualquier otro fotón, contiene más energía que otros, y más de esta energía se pierde en forma de calor. Por consiguiente, la luz azul puede ser igual de eficaz que la roja, en la fotosíntesis, pero nunca tan eficiente, lái muchas algas, los pigmentos llamados fieobilinas y carotenoides (las ficoeritriñas, rojas, o las ficocianinas. azules) absorben luz. originando actividad fotosintética. Kl espectro de acción de estas algas es muy distinto del de las plantas con semilla ñor a la luz azul porque sus agujas cerosas reflejan más la luz azul y debido a que contienen elevadas cantida des de carotenoides, algunos de los cuales absorben la luz azul pero no transfieren la energía a las clorofilas para que éstas realicen la fotosíntesis (Clark y Lister, 1975). En particular, el abeto azul y el abeto verdeazul de Colorado fotosintetizan poco con luz azul o violeta.

Comparada con el espectro de absorción de carote noides y clorofilas purificadas, la acción de la luz ver de y la amarilla para inducir fotosíntesis en plantas con semilla, y la absorción de estas longitudes de onda por las hojas, es sorprendentemente elevada. Por otra par te, al parecer carotenoides y clorofilas son los únicos pigmentos que absorben estas longitudes de onda. La razón principal de que los espectros de acción sean su periores a los de absorción para las longitudes de onda correspondientes al amarillo y el verde es que, si bien la probabilidad de que cualquiera de estas longitudes de onda sea absorbida es pequeña, aquellas longitudes de onda que no se absorben se reflejan de manera re petida en la compleja red de células fotosintéticas, de cloroplasto a cloroplasto. Con cada reflexión se absor be un pequeño porcentaje adicional de estas longitu des de onda hasta que, por último, la mayoría de las hojas absorben la mitad o más y se induce la fotosínte sis. Esta reflexión interna no se presenta en la celda (o cuveta de un espectrofotómetro que contenga clorofi la disuelta, por lo cual la absorbancia de las longitudes de onda correspondientes al verde es muy baja (Fig. 10-6a). Además, la absorción in vitro que realizan es tos pigmentos en un solvente orgánico ocurre a longi tudes ele onda más cortas que cuando se hallan en los tilacoides del cloroplasto.

En las hojas vivas, la absorción de los carotenoides se desplaza de la porción azul del espectro hacia la ver de; cierta cantidad de actividad fotosintética en la por ción verde, a alrededor de los 500 nm, se debe a la absorción que realizan carotenoides activos. Ambos ti pos de clorofilas presentan sólo desplazamientos pe queños in vivo en la región azul, pero la clorofila a muestra varios desplazamientos en la región del rojo. La asociación de clorofila a con las proteínas de los ti lacoides produce picos de actividad adicionales en la región del rojo. Nos interesan dos de estos picos me nores, los que se presentan alrededor de los 680 y de los 700 nm, ya que se originan de moléculas de cloro fila a situadas en ambientes químicos especiales y que actúan como pigmentos de centros de reacción. Estos pigmentos se abrevian P680 y P700. Su funcionamien to se estudiará con mayor detalle en la Secc. 10.5.10.4 Efecto Emerson: Fotosistemas CooperativosEn la década de 1950, Robert Emerson, en la Univer- sity of Illinois, se interesó en la razón por la cual la luzroja con longitudes de onda mayores de 690 nm es tan ineficiente para inducir actividad fotosintética (Fig.™ 10-7), aun cuando gran parte de ella es absorbida potB la clorofila a in vivo. Su equipo de investigación des cubrió que, si se proporciona luz de longitud de ond] más corta al mismo tiempo que las longitudes del rojo! más largas, la fotosíntesis era aún más rápida que la su ® ma de las tasas individuales que resultan de aplicar po separado cualquiera de ambos colores. A este sinergisTf mo o intensificación se le denominó efecto Emerson | Es como si las longitudes de onda largas del rojo fue sen de utilidad a las longitudes de onda más cortas, viceversa. Ahora se sabe que en la fotosíntesis coope-1 ran dos grupos separados de pigmentos o fotosistema. y que las longitudes de onda largas son absorbidas selo por un fotosistema, el fotosistema I (FS I). El segundo - ] fotosistema, el fotosistema II (FS II), absorbe longitudes I de onda menores de 690 nm; para que se presente un fotosíntesis máxima, las longitudes de onda que absot-i ben ambos sistemas deben trabajar a la par. De hecho, I normalmente los dos fotosistemas cooperan para prc piciar la fotosíntesis a todas las longitudes menores d 690 nm, lo que incluye al rojo, anaranjado, amarillo, I verde, azul y violeta, ya que ambos fotosistemas absor 1 ben dichas longitudes. La importancia del trabajo d' Emerson es que sugirió la presencia de dos fotosiste- | mas distintos. Sin embargo, fueron R. Hill y F. Bendall I (1960) quienes propusieron por vez primera y con cía ridad cómo pueden cooperar dos fotosistemas, pro-» puesta que después fue enriquecida por el trabajo I extensivo de L. N. M. Duysens y colaboradores en lo:

Países Bajos. (Véase el ensayo de Govindjee, Participa ción de la clorofila a en la fotosíntesis, en este capítu-1 lo.) En la Reacción 10.5 se resume cómo FS I y FS I’ I utilizan la energía luminosa para oxidar H 2 0 y trans ferir cooperativamente los dos electrones disponibles d de ésta al NADP + , formando así NADPH:

10.5 Los Cuatro Grandes Complejos de TilacoidesCuando se separan los tilacoides de cloroplastos aisla dos y se les trata con los detergentes suaves adecuado: y algunas otras soluciones, se pueden disolver cuatro grandes complejos de proteínas. Estos complejos pue den purificarse por ultracentrifugación, gracias a que tienen densidades diferentes. Después, sus proteínas- pueden ser separadas en diversas subunidades de poli- péptidos mediante electroforesis en gel de poliacrila mida (véase la Secc. 9.2) si las proteínas primero se calientan en un detergente denominado dodecil sulfa- lo de sodio (SDS). Este tratamiento con SDS causa la desnaturalización de las proteínas al romper los puen tes de hidrógeno y enlaces iónicos que normalmente , mantienen unidos a los polipéptidos. Los geles de po- liacrilamida que se utilizan para separar a los polipépti- ; dos que se obtienen por tratamiento con SDS se co ren como geles de SDS. En estos gales, los gran- i des polipéptidos se mueven con relativa lentitud y per- ; manecen cerca de la porción superior del gel, mientras í que los polipéptidos más pequeños se mueven cada vez ? mis hacia el ánodo, en la parte inferior del gel. En la i Fig. 10-8 se muestra la separación de varios polipépti- | dos provenientes del fotosistema l mediante esta po- |'derosa técnica. Utilizando ultracentrifugación y geles i de SDS, se ha logrado separar la mayoría de los poli-1 péptidos de los cuatro grandes complejos de proteínas, if se han determinado sus pesos moleculares (en kilo- ‘ daltons, kDa). En la mayoría de los casos se han deter- í'minado las secuencias parciales de aminoácidos en los ¿■polipéptidos, las cuales se han comparado con secuen- itiasde bases en los genes del núcleo o del cloroplasto; pseproceso ha permitido identificar los genes que co- Nifican estos polipéptidos.L Se describirá primero el complejo del fotosistema II Mcbido a que participa de manera más directa en la oxi- |éición del agua, hecho que inicia el transporte de elec trones en la fotosíntesis. (Son revisiones útiles sobre

■ura 10-8 Separación de polipéptidos FS I de hojas de üada (Hordeum vulgare L.) mediante electroforesis en gel ■Fpoliacrilarnida y SDS. Se utilizaron dos geles distintos #Ay B, los cuales hicieron migrar a los polipéptidos de ■ñera diferente. Nótese que los polipéptidos pequeños ■ren más lejos, de arriba hacia abajo, según sus pesos ■Aculares (en kDa). Los polipéptidos se tiñeron con coío- •^íe azul brillante de Coomassie. (Cortesía de Henrik V. Btieller; véase también Scheller et al., 1989.)estructura, función y localización de los cuatro com plejos en los tilacoidcs las de Glazer y Melis, 1987; Bar- ber, 1987a, 1987b; Irrgang et al.. 1988; Ranger, 1988; Chitnis y Thornber, 1988; Reilly y Nelson, 1988; Mat- too et al., 1989; Mardner y Barber, 1989; Lagoutte y Mathis, 1989; Govindjee y Coleman, 1990; Ghnotakis y Yocum, 1990; y Scheller y Móller, 1990.)Fotosistema II (FS II)Este fotosistema consta de un complejo central de seis polipéptidos-integráles (intrínsecos) conectados entre sí de manera no covalente, y contiene al centro de reac ción P680. Todos estos polipéptidos son codificados por el genoma del cloroplasto. Dos de tales polipépti dos, con pesos moleculares cercanos a 33 kDa y 31 kDa, se conocen como DI y D 2, respectivamente, y se unen de manera directa con el P680 y ciertas quinonas ne cesarias para la oxidación del agua. (Se utiliza la termi nología D porque DI y D2 se tiñen de manera difusa cuando se les separa en geles de SDS.) Asociados al com plejo central del FS II y la interfaz lumen-

membrana se encuentran también tres polipéptidos extrínsecos (pe riféricos) codificados por genes del núcleo; se piensa que estos polipéptidos ayudan en la incorporación de Ca ¿ + y Cl _ , los cuales son esenciales ambos para la fo tolisis del agua. Además de estos polipéptidos, el com plejo central contiene unas 40 moléculas de clorofila a, varias moléculas de ^-caroteno, algunos lípidos de membrana (sobre todo galactolípidos), cuatro iones manganeso, un ion hierro unido de manera covalente, uno o más Ca~ + , varios iones Cl _ , dos moléculas de plastoquinona y dos de feofitina. Las plastoquinonas son quinonas especiales localizadas en los plastidios; como se explica más adelante, llevan dos electrones del FSII al fotosistema I, y también transportan H + del estro- ma hacia la luz (lumen) de los tilacoides. La feofitina es una molécula de clorofila a modificada en la que dos átomos H han reemplazado al Mg 2+ central. En la ac tualidad se acepta que la mayor parte del FS II se pre senta sólo en las regiones apresadas del grana tilacoidal (véase la Fig. 10-3)- En regiones no apresadas del gra na, así como en los tilacoides del estroma, el FS II par ticipa mucho menos.

El P680 situado en el complejo central del FS II re cibe energía luminosa por resonancia inductiva de un total aproximado de 2 50 moléculas de clorofila a y b (presentes en cantidades más o menos iguales) y de nu merosas xantofilas. Estos pigmentos se presentan en el complejo del FS II para captura de luz, muchas veces de nominado LHCII (de light harresting complex II). Ca da pigmento está asociado con una proteína integral, unas 10 clorofilas y dos o tres xantofilas por cada mo lécula de proteína. Su función es actuar como sistema colector (como “antena”), absorbiendo luz y pasando la energía del excitón al P680. Es probable que todaslas proteínas que conforman al LHCII sean codificadas par DNA nuclear y sintetizadas en loyjüxxsomas del ci toplasma, por lo que cada proteína debe transportarse hacia el interim del ciórpplasTO.y de los tilacoides, (co mo se describe en la Secc. 7^11 y sejjevisa en Smee- kens 1990). La función general del ES II 'és utilizar energía luminosa para reducir plastoquinona (* abre via PQ) oxidada a su forma completamente reducida (PQH2) utilizando los electrones del agua.

Debido a que se necesitan dos mel&ulas de H>0 (cuatro electrones) pata tfeducir cada .£ 0^ (véase la Reacción l<r3), y conroSe requieren dos fotones para oxidSt cada molécula de H 20, la función del FS II pue de resumirse'.cómo sigue: bido a la probable presencia de una quinona, ol ffiLáue incrementa el número de moléculas PQhI ticipantes y duplica la cantidad de H + que se tr re hacia la luz tilacoidal. No se discutirá el ciclo Q» pueden hallarse-evidencias dqifsu funcionamientos cloroplastos poj¡ ejemplo-en Hope y Matthews( e ideas acerca de su función general en bacteria sintéticas, mitocondrias y cloroplasto|en Malkin(ll Vi»^ c (í£ 88) y Marder y Barber (1989). Supon de maneja conservadora y en favor de la simpli c|ue el ciclo Q no es operante y que en cambios« zan las dos moléculas de FQFU provenientes dell puecjjj imponerse el siguiente'resumen para el f namiento del complejo cit b 6-f, donde PC repr una plastocianina |¿bn cóbre oxidado o reducidl

Resulta útil mostrar los flíifcen ambos lados de la ecua ción ,gM que (como se explica más adelante) la oxlílfa-*** ción del agua da por resultados la liberación de II 4 en la luz del til^oide, y la rujfjkicción requiere del H + que se ¿orna del lado opuesto (Jlstroma) del ti I acó i de.Complejo Citocromo b6-citocromo fEste complejo, que se abieviajcit b6-f, consta de cua tro diferentes polipéptidos integrales, tres de los cua les contienen: hierro, que se reduce)® Fe^" y después je oxida para quedar otra vez coñí^Fe -11 durante el flujo de electrones. L-os primeros d<S3*£on el cit (también denominado;«/ \*l:i citocromo /(defrons. hoja). Cada citocroiViO contiene hierro en un gru- .pq^hem prostético. El tercero ejSíunátproteína con dos átomos de hierro no hem, en la que cada uno de los dos átomos de hferr&_está unido a dos átomos de azu fre no proteínicosjyiá dos átomos de azufre de residuos cisteína de la protéína. Esta proteína es una ferrosulfo proteína (una proteína 2Fe-2S), una de las muchas que participan en el transporte de electrones fotosintético. El cuarto polipéptido, el componente IV, carece de hie rro y<áe,desc.ono£o su función. El gen para el polipép tido, ]2Fe-2S estáifcn el núcleo, mientras que los genes para los litros tres se encuentran eti el cloroplasto.

El complejo cit b(,-f existe en concentraciones apro ximadamente iguales en lés tilacoides cstromáticos y del grana. Su función principales pasar' losfclectroncs del FS II al FS I. Eskyllo rfc'alizat^xidando PQHi-v rc- duciendfjjuna proteína pequeña y de gran movilidad, ls ( cual contienamj¿Éfe y se conoce como / ñastoemni- na. También da lugari al transporte de electrones del estroma a-la luz tila’óoidal, lo que además ayuda a la se paración de electrones y prfftones del H 2 0 iniciada por el FS II. La cstequiometría de la.^reacciones parcia- le^catalizadas por este complejo resulta poco clara, de-

Fotosistema I (FS I)Este fotAsistema absorbe ja energía luminosa de ra independiente del FS II, pero mnticne un cotí •BStral separable que recibe electrDncs.Qriginal! temados del Fl¿© p^réTOffnplqo central del FS te fotosistema ha sidFteng de revisiones de La¡ y Mathis (1989), Evans y Brcdenkamp (1990) y 11er y Móller (1990). El complejo central del FSI «bada contiene I 1 diferentes

polipéptidos^cuyoi ño varúCde 1.5 a 82 kDa (Fig. 10-8; véas^ también! 11er y Móller, 1990); seis son codificados por los nucleares y dito por los del cloroplasto. ProbabB te existe uno de cada polipéptido por cada cení reacción P700. Lis dos polipéptidos mayores/! de 82 kDaBpda uno) se denominan la y Ib porqij similares, va que sus genes son reconocidos coi rolo operón en el genoma del cló‘róplasto y qi ; cuentran unidos muy estrechamente en los tilac! (quizá para formar una proteína het,¿rodimérica}j dos polipéptidos-stgunen al centro de reacción] y, junto con otro polipéptido, también se uncí unas 50 a 100 moléculas de clorofila a, algia carotenosíy tres portadores de electrones que q a transportar electrones hacia el NADP + .

Los portadores de electrones asociados a lospi tidos I.re Ib en el complejo central, con frecuend nominados A (1 , A, y X, en la actualidad se idenj tentativamente de la siguiente manera: A ( l es uri lécula de clorofila a, A 1 es jupbablemente otrotí quinona llamada filoquinona ¿vitamina K¡) y X| grupo con hierro y azufre similar al del compll b 6-f, excepto que X tiene un centro 4Fe-4S en lúa centro 2Fe,-;2S del complejo b^lf. Otros dosgrupl hierro y azufre, cada uno con un'centro 4Fe-4S| cuentran unidos a un polipéptido de 9 kDa que. tifica como una**banda en la Fig. 10-8. Todos]i-centros Fe-S son capaces de tomar (vía un Fe í + ) y Fíansferir (vía Fe 2H ) un solo electrón a la vez, aun [■ cuando haya hasta cuatro hierros presentes. El complejo ¡ cmtral del FS I recibe, por resonancia inductiva, la ener- [r pa luminosa proveniente de unas 100 moléculas de cio- f (ofilaa y b (en una proporción aproximada de 4:1) que I «encuentran unidas a proteínas codificadas por el nú- fe tico en un sistema colector de luz, formado por pig- Bi-fccntos colectores que rodean al complejo central. Este BJMema colector o de captura se denomina LHCI.

R El fotosistema I se localiza exclusivamente en tila- I'íúides estromáticos y regiones no apresadas del grana t'-qoedan hacia el estroma. Trabaja como sistema depen-I ííente de luz para oxidar la plastocianina reducida y 1'íSinsferir los electrones hacia una forma soluble de la Rpmosulfoproteína que se conoce como ferredoxina,I íi ferredoxina es una proteína de bajo peso molecular Ruese presenta en forma de proteína periférica unida ■Hjbilmente a los tilacoides, del lado del estroma. Con- íiJHieun conglomerado de proteínas 2Fe-2S, pero cap- ■y transfiere un solo electrón a la vez cuando uno de Bfitt hierros se reduce a Fe 2+ y después se oxida a Fe í + . Bfffase en Arnon, 1988, la historia y participación de MBerredoxina en éste y otros procesos bioquímicos.) Hlieacción general para el funcionamiento del FS I pue- ■feexpresarse de la siguiente manera, utilizando las cua- ISjl&plastocianinas reducidas (por cada dos H 2 C) que se pliklan) que proporciona el complejo cit b(-,-f y abre- KÜKtdo ferredoxina como Fd:■ dectrones, provenientes de la ferredoxina móvil, ■lo común se utilizan entonces en el paso final del Bsporte de electrones en que se reduce NADP + y se Bna(con H + ) NADPH. Esta reacción.es catalizada en Wstfoina por una enzima denominada ferredoxina- reductasa (lo cual se revisa en Paschorn et al., ■tjpS). La reacción siguiente muestra la transferencia de iítaiatro electrones que en un principio se tomaron Silos moléculas de agua:

HPSintasa o Factor de Acoplamiento■Éimo complejo conocido en los tilacoides es un gru- Bdcpolipéptidos que convierte ADP y fosfato inor- Bfco(P/) en ATP y H 2 0. Se le denomina ATP sintasa ■ntetasa) y también factor de acoplamiento, debido BÉCacopla la formación de ATP con el transporte de HnDnes y H + a través de la membrana tilacoidal. En ■lesivo se le nombrará del primer modo, que des cribe mejor su función. Al igual el fotosistema I, existe sólo en los tilacoides del estroma y en regiones no apre sadas de los tilacoides del grana (Anderson y Anders- son, 1988). Consta de dos partes principales: un tallo, denominado CF 0 , que se extiende por el lumen v a tra vés de la membrana tilacoidal hasta el estroma, y una porción esférica (cabeza) que se conoce como CF, y que descansa en el estroma. En la ATP sintasa existen un total de nueve polipéptidos, algunos de los cuales son codificados por el DNA del cloroplasto, mientras que otros lo son por el DNA del núcleo. La estructura de la ATP sintasa de cloroplastos es muy similar a la pro pia de la que se encuentra en mitocondrias (véase la Secc. 13 7) y en la bacteria Escherichia coli. Su come tido en la fotofosforilación se describirá en la Secc. 10.8.

10.6 Oxidación de Moléculas de H2O por el Fotosistema II: Suministro de Electrones por el Complejo Emisor de OxígenoYa se ha insistido en que, durante la fotosíntesis, los electrones se transportan del ITO al NADP ' y se al macenan temporalmente en moléculas de NADPH an tes de la reducción de CC> 2 . El motivo por el cual se necesita energía luminosa es que, termodinàmicamen te, el H 2 0 es muy difícil de oxidar, y que el NADP 4 es moderadamente difícil de reducir. La transferencia gradual de electrones, primero de los componentes del LI 2 0 en el núcleo del FS II a los del núcleo del cit b^-f, después a los del FS I y, por último, a la ferredoxina y el NADP + , todo a través de una membrana tilacoi dal, ayuda a detener reacciones inversas que podrían impedir la oxidación del H 20. La interrogante de có mo un complejo emisor de oxígeno (CEO u OEC) extrae en realidad electrones del H_,0 es resuelta en parte por información reciente sobre la estructura del complejo FS II y en parte por

información obtenida a finales de la década de I 960.En 1969, en París, Pierre Joliot demostró que los clo roplastos mantenidos en la oscuridad y después expues tos a destellos

luminosos extremadamente rápidos liberan O? del H 2 0 en cuatro picos luminosos bien de finidos. Como la liberación de una molécula de 0 2 re quiere la oxidación de dos moléculas de H>0 y la extracción de cuatro electrones de ellas, esta periodi cidad de cuatro destellos sugirió a Bessel Kok que al guna molécula o moléculas debían acumular una carga positiva después de cada destello hasta que reunían cuatro cargas positivas y eran capaces de recuperar cua tro electrones por una oxidación, en un solo paso, de dos moléculas de H 2Ü. Denominó a estos estados di ferentes S 0 , Sj, S 2 , S 3 y S 4 y concibió la importante idea de que la conversión de S 0 en Sj implica la pérdida de un electrón, la conversión de S, en S 2 la pérdida de

Figura 10-9 Reloj oxidante del agua. S0 a S4 representan quizá estados de oxidación crecientes de dos o más iones manganeso, como se explica en el texto. Cuando se transfiere la energía luminosa al P680, éste se oxida a P680+, que a su vez (quizá indirectamente vía una tirosina del poli- péptido D1) acepta un electrón de S0, S,, S2 o S3 para regresar a P680, sin carga. Como se muestra, se utilizan cuatro fotones (que se representan como hv/); cada fotón provoca un avance en el reloj. Al final, S4 absorbe cuatro electrones de dos moléculas de H20 y regresa al estado S0, neutro. (Adaptado de varias fuentes.)otro, y así hasta que S 4 tiene cuatro cargas positivas ex tra; es entonces cuando S 4 recupera los cuatro electro nes, los cuales provienen de dos moléculas de agua, y regresa al estado S 0 , con cuatro cargas menos que S 4 . Estos cambios se describen en el modelo de la Fig. 10-9- En ocasiones, este modelo se conoce como reloj oxi dante del agua.

Pero, ¿cuál es la naturaleza química de los estados S en el reloj? Pronto se comprendió que el P680 se oxi da por la pérdida de un electrón después de un deste llo luminoso, pero que este P680 no puede corresponder a S, ya que el P680 sólo puede perder un electrón y acumular una sola carga positiva. Estudios posteriores condujeron a la comprensión actual sobre el tema, por la que se sabe que los diversos estados S representan diversos estados de oxidación del manga neso, incluyendo Mn 2 + , Mn- U y Mn‘ í + . Se sabe que cuatro átomos de Mn se asocian con cada sistema cen tral del FS II y que los cuatro son esenciales para la li beración de 0 2 . Se sospecha que, de alguna manera, están unidos entre sí y a los polipéptidos DI y D2 en la parte del lumen tilacoidal del FS II, donde se libera 0 2 . Sin embargo, aún no está claro cómo funcionan o la valencia de cada uno en los estados S cambiantes. Se pueden encontrar revisiones útiles de este tema en Renger (1988), Rutherford (1989), Ghanotakis y Yocum (1990) y Govindjee y Coleman (1990). En estas revisio nes también se exponen diversas hipótesis acercad® las funciones esenciales de Cl _

y Ca 2+ durante laooB dación del H,0.

10.7 Transporte de Electrones del H20 al NADP + a través de los TilacoidesEn la Fig. 10-10 se presenta un modelo en el cual la tres graneles complejos portadores de electrones (FSI el complejo cit b ( ,-f y FS 1) cooperan para realizara cho transporte del H¿0 al NADP + . Seguiremos lapl ta a la mayor parte de las reacciones individuales p* el transporte de electrones que hay en el modelo. Ni tese que FS II y el complejo cit b 6 -f se localizan enul región apresada del tilacoide, mientras que FS I yf complejo CF se sitúan en tilacoides del estromaoll giones no apresadas.

Cuando el H^O se oxida en el CEO, se liberan di electrones para transporte. El primer compuesto enJ cibirlos, uno a la vez, es un aminoácido (tirosina)J se localiza en el polipéptido DI, el cual los pasa entol ces al P(í80. Sin embargo, el P680 puede aceptar* electrón sólo si acaba de perder uno propio, lo que o® rre cuando este pigmento es excitado por la energía* miñosa que le transfiere un pigmento que absorbe* localizado en el sistema LHCII. Así, la luz provocil oxidación del P680, y a continuación

el P680 + adfl como un atractor de electrones (oxidante) lo bastafl poderoso para extraer un electrón de la tirosinasil« da en el polipéptido DI el cual, a su vez, extrae une» trón del ion Mn del complejo CEO. El P680 cedefl electrón a la feofitina (Feo), la cual lo pasa entone« una plastoquinona especializada denominada Q A ,<p está unida fuertemente al polipéptido D2. La Q A tr» fiere el electrón a otra plastoquinona, denominada^ que se encuentra cerca unida de manera laxa al pfl péptido DI. Para reducir por completo cada Q^yj se requiere, dos electrones, por lo que ambos elec* nes del agua llegan, uno a la vez, hasta estas moiécuB De hecho, para su reducción también deben agrejJi dos H ', como sigue:

El requerimiento de dos electrones y dos H + para reducir la plastoquinona (PQ) es importante para la fos forilación fotosintética, ya que el H ' que se utiliza proviene del estroma pero, cuando más adelante se oxi da la PQ, el H f se transfiere de ésta al lumen tilacoi- dal. Así, el resultado global de la reducción de la PQ en el FS II, y su posterior oxidación en el complejo cit b 6 -f, es el transporte de dos II + del estroma hacia el lumen del tilacoidal. Más tarde estos H + son transpor tados de regreso por la ATP sintetasa, en un proceso ; que lleva a la formación de ATP. Si bien la PQ denomi nada QA se encuentra fuertemente unida al polipépti do D2, la PQ denominada Q B se libera del polipéptido DI cuando Q B recibe dos electrones de Q A y dos H + del estroma. Entonces otra plastoquinona oxidada ocu pa el lugar de Q ñ en D1, donde otra PQ había estado antes unida. Existen varias de estas quinonas disueltas en la membrana del tilacoide las cuales son muy móvi- ; les, por lo que este reemplazo continuo se efectúa con . la rapidez adecuada. (Ciertos herbicidas matan las ma lezas al ocupar el sitio de unión de Q B en DI, lo cual impide la unión de la PQ y detiene el transporte de elec trones, con lo que se bloquea la fotosíntesis; véase el ensayo “Herbicidas y transporte fotosintético de elec- [ trones” en este capítulo.) Por cada par de moléculas de H 2 0 que oxida el CEO, se transportan cuatro elec trones a través de las quinonas, por lo que dos molé- ■, culas de Q B deben reducirse, abandonar DI y ser reemplazadas. Cada una de estas Q B reducidas (que í ahora son PQH 2 móviles) llevan dos electrones al com- , piejo cit b 6 -f, en donde se presenta un transporte sub secuente de electrones. Debe notarse que, como , portador móvil, PQ es capaz de interactuar con varios complejos FS II y cit b(,-f diferentes en una membrana . tilacoidal. Hasta aquí se han descrito las reacciones in- r dividuales resumidas en la Reacción 10.6.El complejo cit bg-f sólo puede aceptar un electrón f i la vez proveniente de cada PQFI 2 rtióvil que se for- '{■ ma en el complejo FS II. Estos electrones se transfie ren, uno por uno, ya sea a la ferrosulfo proteína en este mismo complejo o al cit b 6 -f. En cualquier caso, es un í FeJ+ de la proteína el que acepta el electrón, al redu- . drse a Fe 2 + . Los dos H f provenientes de cada PQH 2 ¡ se depositan en el lumen del tilacoide. Por ello, de ca da molécula de H 2 0 que el CEO oxida se depositan un (otal de cuatro H + en el lumen: dos de la oxidación del agua y dos de la PQH 2 . La oxidación de dos molé- ' culas de H 2 0 (para liberar un 0 2 o fijar una molécula deC02) da por resultado la acumulación de ocho pro-l tones en el lumen.

El cit f acepta cada electrón del hierro, ya sea de cit ' bftO de la ferrosulfo proteína, lo cual reduce el hierro ' de dicho complejo a Fe 2 + . Luego, el cit f cede un elec trón al Cu 2+ de la plastocianina, de modo que lo re- t duce a Cu + . Cuando el cit f reduce cuatro plastociani- ’nas, se tiene la Reacción 10.7.

Cada PC móvil transporta un electrón por el lumen del tilacoide, hasta el FS I. La primera molécula en acep tar un electrón del Cu 4 que se localiza en la PC es la P700. Sin embargo, como en el caso del P680 en el FS íl, la P700 del FS I es incapaz de aceptar un electrón sin antes haber perdido uno. La pérdida de un electrón por el P700 para formar P700 + ocurre cuando se transfiere energía luminosa de los pigmentos colecto res de luz en el complejo LHCI al P700, con lo que un electrón del P700 se excita lo suficiente para ser elimi nado. Así, un fotón absorbido por un pigmento del sis tema colector FS I provoca la formación de P700 + , el cual toma un electrón de una PC reducida, formando PC oxidada y P700 reducido. Cada electrón del pigmen to P700 se desplaza a un estado A 0 (quizá otra molé cula de clorofila a a la que su ambiente químico confiere características especiales); luego, A„ pasa su electrón, primero a A, (probablemente la vitamina K, —filoqui- nona— ya mencionada) y después a un hierro que se localiza en diversas proteínas 4Fe-4S del complejo cen tral en FS I que ya se mencionó. Estas reacciones del FS I se resumieron en la Reacción 10.8. Por último, las ferredoxinas móviles (Fd en el modelo) aceptan un elec trón cada una y los transfieren al NADP + para formar NADPH en el estroma (Reacción 10.9). La estructura del NADP t que se muestra en la Fig. 10-1 1 señala cómo es que para su reducción se necesitan dos electrones y un H*.

En conjunto, las reacciones luminosas por las que se transfieren electrones a través de las membranas de los tilacoides para formar NADPH se conocen como transporte acíclico de electrones, ya que estos electrones no regresan al H¿0. Sin embargo, muchos investigado res piensan que, por medio de una vía un poco distin ta, la luz puede hacer que los electrones entren en un ciclo que inicia en el P700 y pasa por la ferredoxina de regreso a ciertos componentes del sistema portador de electrones recién descrito, y de aquí nuevamente al P700. Este proceso se conoce como transporte cíclico de electrones. Los electrones que la ferredoxina no cede al NADP + pueden, en cambio, transportarse al com plejo cit bf,-f, tal vez directamente hasta el cit bg. De aquí pueden movilizarse hacia una plastoquinona, cu ya completa reducción (como se recordará) necesita de dos electrones y dos

H + ; ambos H + provienen de la parte de los tilacoides que da hacia el estroma. Cuan do después los electrones se desplazan hacia la proteí na Fe-S, cada PQH 2 libera sus dos H 4 en el lumen del tilacoide. Estos H + también contribuyen al gradiente de pH que estimula la fotofosforilación. De la proteína Fe-S los electrones se mueven, vía la ruta acíclica prin cipal, a través del cit f y la plastocianina, y regresan al P700. Por supuesto, el transporte cíclico de electrones requiere energía: un fotón por cada electrón que se transfiere.

lumenFigura 10-10 Cooperación entre el FS II (izquierda), el complejo cit bG-f y el FS I en el acarreo de electrones, del H20 (abajo a la izquierda) en un lumen tilacoidal, a través de una membrana tilacoidal, hasta el NADP+ en el estroma. Estos complejos también coo-peran para depositar H 1 en el lumen y eliminar H f del estroma. La ATP sintasa (extremo de la derecha, indicada como CF0 y CF,) transporta H y de regreso, del lumen al estroma, y convierte ADP y Pi en ATP y H20. Para mayor claridad visual, se omiten los lípidos de la membrana, así como la mayor parte de los polipéptidos que hay.en cada, uno de los cuatro grandes complejos. Plastoquinonas (PQ), plastocianina (PC) y ferredo- xina (Fd) son móviles y llevan electrones de la manera que indican las líneas de trazos. La función del cit b3 en el FS II es aún incierta.

En resumen, nuestro modelo (Eig 10-10) muestra que la transferencia ele un electrón, del H 2C¡ al NADP + , re quiere dos fotones, ya que es fundamental que haya ex citación de ambos fotosistemas. Esto explica el efecto Emerson, el cual constituyó el primer indicio de la exis tencia de una cooperación entre dos fotosistemas. En el modelo también se sugiere el funcionamiento de va rios otros componentes del transporte de electrones, así como sus relaciones físicas en los tilacoides.

Pasemos ahora a relacionar este modelo con la reac ción resumida de la fotosíntesis (Reacción 10.3). Esta ecuación muestra que, por cada molécula de C0 2 que se fija, se libera una molécula de 02 y se usan dos de H 20. No se especifica el número de fotones, pero es te número es importante si se quieren calcular eficien cias fotosintéticas. Nuestro modelo requiere dos fotones por cada electrón que se transporta. Cada H 2 0 aporta dos electrones y se necesitan dos moléculas de H 20, por lo que nuestro modelo predice que podría requerirse un mínimo de ocho fotones para oxidar dos moléculas de H 20, liberar una de 0 2 y proporcionar cuatro electrones. Estos cuatro electrones podrían re ducir dos NADPH*, por lo que son esenciales dos NADPH para reducir una molécula de CO> (véase 1aSecc. 11.1). Por lo tanto, basándose sólo en la forma-| ción de NADPH, nuestro modelo indica un requer miento de ocho fotones para realizar la reducción d una molécula de C0 2 . En hojas de muchos tipos ve] getales, por lo común se necesitan de 15 a 20 fotone*' por molécula de C0 2 (Ehleringer y Pearey, 1983; 0: borne y Garrett, 1983), pero probablemente en las coií iliciones más ideales sólo se requieren 12 fotonesl (Ehleringer y Bjórkman, 1977). Sin embargo, es nea sario un mínimo de nueve o diez fotones en hojas ( espinaca y chícharo (Evans, 1987), y hay constantes afir-] maciones de que el alga verde Cblorella requiere sól seis fotones, como se explica en las revisiones de Pii (1986) y Osborne y Geidcr (1987). No se sabe de mo j délo alguno capaz de explicar de manera adecuada u n * requerimiento de seis fotones, y las revisiones citada se refieren a resultados que se obtuvieron hace mucho años.

Para entender la aparente discrepancia entre nue! tro modelo de ocho fotones y la necesidad de nuev^ a doce fotones, determinada mediante experimenta cuidadosos, es necesario preguntarse cuánto ATP se re 1 quiere para que haya fotosíntesis y en qué medidas satisface lo que indica nuestro modelo. Como se señal

ENSAYO 10-1Herbicidas y transporte fotosintético de electronesSospechará el lector que una manera en que los herbicidas eliminan las malezas consiste en inhibir la fotosíntesis, lo cual ciertamente es el caso de algunos herbicidas. Los que hacen esto generalmente interfieren en alguna reacción del transporte de electrones. Diversos derivados de la urea, en especial monurón o CMU (3-p-clorofeniM,1-dimetilurea) y diurón o DCMU (3-[3,4-diclorofenil]-1,1-dimet¡lurea), que se aplican en el suelo, se desplazan por el xilema hasta las hojas, en donde bloquean el transporte de electrones al tomar el lugar de QB en el polipéptido D1 del FS II. Ciertos herbicidas a base de triazinas, como simazlna y atrazina, así como algunos herbicidas a base de uracilos substituidos, incluyendo bromacil e isocil, parecen efectuar el bloqueo en el mismo paso (lo cual se revisa en Schulz et al., 1990). Maíz y sorgo son tolerantes a las triazinas (pero no a los derivados de urea o uracilo) porque contienen enzimas que destoxifican dichos compuestos.la en la Secc. 11.2, se necesitan tres ATP para reducir un CO¿ a un carbohidrato simple; se necesita más ATP (una cantidad indeterminada) para inducir la acumulación de solutos (Secc. 7.8) y la corriente citoplásmica, y aún más para formar polisacáridos complejos, proteínas y ácidos nucleicos a partir de cada molécula reducida de CO¿. Por consiguiente, nuestro modelo debería explicar el exceso de tres ATP que se produce por cada dos moléculas de H 20 que se oxidan y dos de NADPH que se forman. ¿Cuánto ATP se produce en realidad durante la fotofosforilación, y cómo ocurre es te proceso? En la siguiente sección aborda estas preguntas.10.3 FotofosforilaciónDesde un punto de vista termodinámico, la formación de ATP a partir de ADP y Pi es muy desfavorable. La fotofosforilación es posible sólo gracias a que, de alguna manera, la energía luminosa la activa. Para entender cómo ocurre esto, debe tenerse en cuenta que la ATP sintasa, o factor de acoplamiento (CF 0 + CF,) en la Fig. 10-10, provoca la formación de ATP en el estroma, así como el transporte de H+ del lumen tilacoidal al estroma. Cada proceso es favorecido por el otro, pero la formación de ATP requiere absolutamente el transporte de H ' . Los iones H+ del lumen tilacoidal provienen de la oxidación de H 20 y PQH2. Estas

En los últimos 20 años, más de 40 especies consideradas malezas se han vuelto resistentes a las triazinas, lo que en gran parte se debe a una mutación en el gen de cloroplasto que codifica el aminoácido serina en la posición 264 en D1 (Mazur y Falco, 1989). En los no mutantes, este polipéptido se une tanto a QB como a triazinas; el mutante de D1 también se une a QB, por lo que puede efectuarse el transporte de electrones, pero ya no puede unirse a triazinas, monurón, diurón o uracilo sustituido. So realizan varios intentos por incorporar a plantas cultivadas el gen que imparte resistencia en malezas, de manera que los cultivos sean resistentes y así puedan utilizarse los herbicidas para eliminar sólo plantas dañinas no resistentes. En un ejemplo moderadamente exitoso se han efectuado cruces sexuales entre la maleza resistente Brassica campestris y ejemplares no resistentes de Brassica napus, por lo que es posible que pronto haya disponibles semillas resistentes de rutabaga, col y colza de importancia.comercial (revisado en Mazur y Falco, 1989). En la revisión de Schulz et al. (1990), se describe también el progreso realizado con experimentos de in-geniería genética para producir vegetales resistentes a herbicidas distintos de los que interfieren en el fotosistema II.oxidaciones hacen que la concentración de H+ en el lumen (p\ 1 5) sea unas 1 000 veces mayor que la del estroma (pH 8) durante la fotosíntesis. Así, existe un fuerte gradiente en la concentración de H f hacia el estroma, pero los tilacoides son bastante impermeables al H * y otros iones, excepto cuando los transporta la ATP sintasa. Este gradiente de pH a través de la mem brana es una forma poderosa cié energía química potencial. principal responsable de que se efectúe la fotofosforilación.

La idea de que los gradientes de pH pueden proporcionar energía para la formación de ATP en mitocon- drias, cloroplastos y bacterias fue propuesta originalmente en 1961 por Peter Mitchell en Inglate rra, pero sus ideas no fueron aceptadas durante muchos años por la mayoría de los bioquímicos. (A fin de cuen tas, Mitchcll recibió un premio Nobel de Química en 1978; véanse sus revisiones de 1966 y 1985 .) Su teoría se conoce como teoría quimiosmótica, si bien no tiene una relación ciara con la osmosis, la cual se estudió en capítulos anteriores. Los primeros en obtener eviden cia directa de la teoría quimiosmótica fueron los investigadores de la fotosíntesis G. Hind y Andre Jagendorf en la Cornell University hacia 1963 (véase Jagendorf, 1967). Sus trabajos, junto con la perseverancia de Mitchell, fueron causa de otros miles de estudios, y en la actualidad la teoría es ampliamente aceptada.1 La teoría incluso explica cómo funcionan los desacopladores de la fotofosforilación. A los desacopladores se les llamó

244 Parle Dos Bioquímica de las Plantas

Figura 10-11 Estructuras del NADP+ (izquierda) y el NADPH (derecha). La porción de la molécula de NADP h que se reduce, el anillo de nicotinamida, está encerrado por líneas de trazos. Se agrega un electrón al átomo de nitrógeno de la nicotinamida, neutralizando su carga positiva, mientras que el segundo electrón se agrega como parte de un átomo de H a su átomo de carbono superior. El relativamente complejo NADP+ es una combi nación de dos nucleótidos, monofosfato de adenosina (AMP; mitad inferior de la estruc tura) y mononucleótido de nicotinamida (mitad superior de la estructura). Todos los nucleótidos constan de tres partes principales: (1) un anillo heterocíclico, en este caso nicotinamida, pero en otros nucleótidos es la base pur'ina o pirimidina, (2) ribosa, un azúcar pentosa, y (3) fosfato. El fosfato está esterificado en la posición C-5 de la unidad de ribosa. Los dos nucleótidos en el NADP+ están conectados en un enlace anhídrido entre el grupo fosfato C-5 de cada porción de ribosa. Nótese también que el NADP4 contiene otro grupo fosfato esterificado al grupo OH en la posición C-2 (véase el asterisco) de es ta porción de ribosa perteneciente al AMP. La presencia de esle fosfato adicional es lo único en que difieren las moléculas de NADP* y NADPH de otra importante coenzima transportadora de electrones, denominada l\IAD + (dinucleótido de adenina y nicotinamida). El NAD+ y su forma reducida, NADH, son mucho menos abundantes en los cloroplastos que el NADP+ y el NADPH, pero participan en el transporte de electrones durante varias reacciones de respiración (Cap. 13), metabolismo del nitrógeno (Cap. 14), degradación de grasas (Cap. 15) e incluso en unas pocas reacciones de la fotosíntesis (Cap. 11).así porque eliminan la interdependencia (acoplamien to) entre el transporte de electrones y la fosforilación. Se conocen muchos, incluyendo el dinitrofenol y el relativamente simple NHV La mayoría actúan como “transbordadores”, penetrando en los canales de los tilacoides, tomando un protón y llevándolo de regreso al estroma, donde el pH es superior y donde se libe ra el protón, que reacciona con OH - para formar H2Ü. Otros compuestos más, como gramicidina y carbonil- cianuro p-trifluorometoxifenilhidrazona, pueden bloquear la fotofosforilación al impedir la salida de H + a través de CF„. La acción repetida de los desacopladores destruye el gradiente de pH a través de la membrana tilacoidal e impide la formación de ATP, pero muchas veces el transporte de electrones se ve acelerado debido a que, en estas circunstancias, termodinàmicamente resulta más sencillo para el transporte de electrones provocar una separación de H + a través de la membrana.Un problema aún sin resolver es que no se comprende el mecanismo por el cual la ATP sintasa utiliza laenergía que se libera por el movimiento “cuesta aba jo" de I I + , de un canal al estroma, para convertir ADP y P i en ATP. A pesar de ello, resulta claro que el movimiento de H f, mediante la ATP sintasa, causa cambios estructurales en algunos de sus polipéptidos, de manera que éstos unen ADP y Vi con suficiente fuerza para que reaccionen y se forme ATP y H ¿0. Aun desconociendo el mecanismo, es posible cuantificar el número de H + que deben transportarse para formar un ATP, y este número parece ser de tres.

Ahora considérese que la oxidación de dos moléculas de IhO liberará cuatro II 1 de manera directa, y que otros cuatro LI + saldrán de dos moléculas de H20 durante el transporte acíclico de electrones en el paso co rrespondiente a la oxidación de la PQH2. Por tanto, como en nuestro modelo se necesitan ocho fotones pa ra oxidar dos moléculas de H^O, estos ocho fotones también proporcionan ocho H + , suficientes para formar tres ATP, pero insuficientes para formar los más de tres que se requieren para convertir un C02 en compuestos complejos y mantener otros procesos ce

lularcs. El proceso de la formación de ATP mediante estas reacciones, en las que los electrones provenien- tes del H¿0 se transportan al NADP + , acompañado por un transporte de H + , se conoce como fotofosfori- larión acíclica. La mayoría de los expertos piensan que la formación de ATP adicional se origina en la ruta cí- : dica que se describió antes. La absorción de dos de es tos fotones hace que dos electrones entren en el ciclo, ’ y que se depositen dos H + en el canal del tilacoide ■í cuando se oxida la PQH 2 . No se disocia ningún H>0■ porque no participa el FS II, de modo que no hay for- Bnación de NADPH. Pero la ATP sintasa produce ATP en respuesta a la disminución del pH en el lumen tila- £ coidal; de ahí que la formación de ATP en esta ruta cí- . dica para el transporte de electrones sea conocida f como fotofosforilación cíclica.> Si ocho fotones participantes en ambos fotosistemasI producen ocho H + por transporte acíclico de electro- ' nes, y si cuatro fotones adicionales absorbidos sólo por d FS I producen cuatro H 1 más, entonces el total de 12 fotones podría originar la formación de cuatro mo fe léculas de ATP. Ya se dijo que se necesitan más de tres | ATP para convertir un C0 2 en compuestos complejos, j- y que cuantificaciones realizadas en hojas muestran quel le requiere un mínimo de nueve (o doce) fotones por Oda Cü> que se utiliza. Con ambos tipos de transpor- fefcdc electrones, cíclico y acíclico, nuestro modelo vie- ; Oca ser consistente con los resultados experimentales;[ así que podemos reepresar la Reacción 10.3 para mos- uar, de manera aproximada, cuántos fotones de luz se í necesitan para convertir un C0 2 en un producto al : que nos referiremos como (CH 2 0), a manera de abre-i viatura de carbohidratos tales como sacarosa y almidón.

! En realidad, este (CH 2 0) representa todas las formas ' orgánicas del carbono en el vegetal. Las proteínas y áci- F dos nucleicos que para su producción requieren (en pe- f so) más ATP que los polisacáridos, abundan más en [ Cílulas en crecimiento activo que en células maduras,i. tn las cuales predominan polisacáridos. Por lo tanto, f h nueva ecuación (Reacción 10.11) indica un requeri- f miento mínimo de 12 fotones, dependiendo de las con- [ (liciones fisiológicas de las células y tomando en cuenta cierta incertidumbre en la fotofosforilación:E En este resumen no aparecen ATP o NADPH, por- ■que su producción es compensada por su utilización tnla reducción de C0 2 . Además, nótese que, si el ci- ■idoQ es operante (véase la Secc. 10.5), se duplica el Húmero de H + que se mueven del estroma al lumen 'Jurante el transporte de electrones, por lo que este he- ího podría intensificar la fotofosforilación (sin modifi car la producción de NADPH) y, por consiguiente, reducir el requerimiento de fotones a unos ocho.

10.9 Distribución de la Energía Luminosa entre FS I y FS IIPara mantener una máxima eficiencia en la fotosínte sis, se requiere que cada fotosistema reciba el mismo número de fotones por unidad de tiempo, de manera que la activación de las P680 y P700 pueda conducir electrones de modo cooperativo hacia el NADP + (Fig. 10-10). Hasta alrededor de 1980, los científicos supo nían que los dos fotosistemas existían en proporciones semejantes en cada cloroplasto, pero después la inves tigación efectuada con diversas especies de angiosper- mas cultivadas en la sombra o al sol (e incluso con cianobacterias) demostró que las proporciones FS I/FSII varían de 0.43 a 4. 1; las proporciones mayores se ob servaron en vegetales cultivados con sombra profun da. Rara vez se presentó la proporción esperada de 0.1 (Meli.s y Brown, 1980). ¿Cómo se puede presentar una fotosíntesis eficiente en vegetales que contienen más de un sistema cjLie del otro?

La respuesta implica adaptación a la luz, tanto a cor to como a largo plazo. A corto plazo (30 segundos o me nos), los fotosistemas se adaptan de modo que ocurre una redistribución de la energía entre FS II y FS I Para la redistribución de energía de FS II a FS I. hav un movimiento real de algunos de los pigmentos LHCII y proteínas, de manera que ahora se asocian con FS I en ios tilacoides del estroma (Barber, 1987b; Anderson, 1986; Anderson y Andersson, 1988). Ahí, los pigmen tos LHCII transfieren más energía luminosa al FS I y na da de ella al FS II, El movimiento se debe a que las proteínas del LHCII adquieren una carga mucho más negativa al ser fosforiladas por la acción del ATP y de una proteína cinasa específica que transfiere fosfato del ATP a aquellas proteínas. Los grupos fosfato se ionizan (pierden H + ) para crear las cargas negativas adiciona les en tales proteínas. Este exceso de cargas negativas obliga a algunas proteínas del LHCII con pigmentos aso ciados a separarse, y éstas son entonces atraídas hacia una proteína específica con carga positiva o a proteí nas del FS1 en los tilacoides del estroma.

La participación de la luz en el movimiento del LHCII parece ser la siguiente: La absorción preferencial de luz por el FS II provoca la reducción de numerosas molé culas de PQ a PQH 2 (véase la Fig. 10-10); luego, estas PQH, activan la proteína cinasa. La luz que es absor bida de manera preferencial por el FS I provoca la oxi dación de moléculas de PQH 2 , detiene la fosforilación y permite la extracción de fosfato por una fosfatasa que hidroliza grupos fosfato, separándolos de las proteínas móviles del LHCII. La pérdida de fosfato reduce su car ga negativa, por lo que regresan a las regiones apresa das del tilacoide y donan la energía luminosa al FS II. Aún no está claro cómo hacen las plastoquinonas para controlar la actividad de la proteína cinasa, y cómo los

ENSAYO 10-2Función de la clorofila a en la fotosíntesis Govindjee

Covindjee. quien utiliza sólo su nombre (su apellido. Astba- na. fue suprimido por su padre en protesta contra el sistema de castas que impera en la tndia), obturo su doctorado (en biofísica) en l()6(). en la llüiversity of Illinois en IJrbana-Champaign (l'lll(í). Desde /%/ trabaja en el cuerpo docente del Department of Pbysiology and Biopbysics and Plant lüology de la U/UC. Hntre las distinciones que ba recibido se incluyen: Anterior Presidente de la American Society for PbotobiologyC.onferencista Distinguido de la Scbool of I.ife Sciences. UIUC: miembro de la American Association of Advancement of Science y de la National Academy of Science (India). Su investigación se centra en fotoquímica primaria, uso de fluorescencia de clorofila a como herramienta para la investigación! de la fotosíntesis, i ’ mecanismos de las reacciones deI fotosistema II.Mi interés en la fotosíntesis se remonta a 1953, cuando eia estudiante de maestría de Shri Ranjan en la Uníversity of Allhabad, en la India. Acababa yo de firmar un contrato para escribir un artículo especial en Advanced Plant Physio- logy, para lo que decidí hacer una composición sobre la "Función de la clorofila en la fotosíntesis". La investigación bibliográfica me condujo a los artículos precursores de Roben Emerson acerca de los espectros de acción de la fotosíntesis, incluyendo todos sus amenos anexos, como la furiosa controversia entre Emerson y Otto Warburg respecto al requerimiento fotónico mínimo para la emisión de O2 en la fotosíntesis (ocho cuantos para Emerson y cuatro para Warburg) y a la presencia poco usual de la "caída del rojo" -la ineficiencia de la luz absorbida por la clorofila a en la región del espectro correspondiente al rojo (>680 nml.

No fue sino hasta que terminé mi maestría en botánica, en 1954, y después de haber estado trabajando por un tiempo en un emocionante proyecto sobre los efectos de la infección por virus en el metabolismo de los aminoácidos, con el equipo de Ranjan (M. M. Laloraya, í. Rajarao y Raj- ni Varma), cuando inicié correspondencia con Emerson.Las cartas entusiastas y de carácter personal de Emerson, una beca Fulbright para viajar y una beca en biología fisicoquímica de la University of Illinois, me llevaron al laboratorio de Emerson en los sótanos del viejo Natural History Building en Urbana. Ahí mis pasos se cruzarían con los de Warburg, quien ya había realizado visitas procedente deBerlín, y con los do Eugéné Rabinowitch, fisicoquímico y profeta de la fotosíntesis y la paz mundial, quien me recíbi ría y sería mi tutor en biofísica y fotosíntesis. Bajo los estrictos pero amistosos ojos de Emerson, luché por aprende técnicas, complejas pero en extremo tediosas, de manóme tría (las lecturas se tomaban con un catetómetro situado e manómetros que se mantenían en movimiento constante para obtener una precisión de centésimos de mm en el cambio de presión) y bolometría para medir el rendimiento cuántico absoluto de la emisión de 02 y los espectros de acción de la fotosíntesis. El monocromador de alta dispersión que utilicé para los estudios era enorme, y había sido construido por el mismo Emerson. Emerson nos daba responsabilidades y concedía independencia, y pronto nos contagiamos de su entusiasmo y emoción por su descubrimiento del efecto Emerson. El trágico accidente aéreo en East River, cerca del aeropuerto La Guardia de Nueva York el 4 de febrero de 1959, que costó la vida a Emerson, nos obligó a mí esposa Rajni y a mí a terminar nuestro doctora do sin el beneficio do su guía. Finalizamos el grado con Rabinowitch, quien fue muy generoso y nos recibió como estudiantes suyos.

En la diatomea Navícula mínima descubrí una nueva banda en el espectro de acción del efecto Emerson de intensificación (o simplemente efecto Emerson), la cual tenía un pico hacia los 670 nm en la región de absorción de la clorofila a. Me emocioné mucho con este descubrimiento porque daba una solución a la discrepancia entre (a) el I punto de vista de Emerson de que los pigmentos acceso- I rios (como clorofila b en las plantas verdes, fucoxantol y I clorofila c en diatomeas, y ficobilinas en las algas rojas y I verdeazules) efectuaban una reacción luminosa y la clorofila a realizaba otra, y que las dos cooperaban para la fotosín-1 tesis, y (b) los primeros trabajos de L. N. M. Duysens en I los Países Bajos, en los que se demostraba que la energía! luminosa absorbida por los pigmentos accesorios se trans-f feria de manera eficiente a la clorofila a. A partir de los re-J sultados que obtuve, resultaba claro que la clorofila a ten# una función importante en ambos fotosistemas. La ideada dos reacciones luminosas (para referirnos a éstas utilizábaí mos los términos fotorreacciones de onda corta y de ondíl larga) en serie para explicar los requerimientos fotónicos I mínimos de ocho ya se mencionaba en el libro de RabinoP witch de 1945, y la idea de que una reacción luminosa po| día reducir una molécula de citocromo y la otra podía L oxidarla mientras reducía al NADP f se enunciaba tambiésH en un libio de Rabinowitch de 1956; sn otras palabras, oF bases del denominado esquema de R. Hill y F. Bendall I (1960) ya existían en Urbana (véanse discusiones en M. Duysens, Photosynthesis Research 21: 61-69, 1989), I

En 1957 Bessel Kok ya había descubierto la existencia* de una clorofila a especial a la que denominó P700, y pral puso que ésta era el centro de reacción para la clorofilaifll en la fotosíntesis. En nuestro artículo de 1965 en ScienüB American acerca de la "Función de la clorofila en la fotw síntesis" (213[ 1 ]: 74-83), Rabinowitch y yo especulamos^ bre la existencia de otra clorofila a especial más, el centfl de reacción P680 del sistema de onda corta. Ciertamente, este centro de reacción se descubrió en 1968 en el laboratorio de H. T. Witt en Berlín. La mayoría de las moléculas de clorofila a en ambos sistemas de pigmentos sirven para la captura de energía luminosa, por lo que estas moléculas pertenecen a lo que se conoce como "sistema colector''.Su función es absorber y transferir la energía de excitación al centro reactivo de las moléculas especiales de clorofila a, conocidas como P680 y P700. Este cometido no es muy diferente, en principio, del que realizan diversos pigmentos accesorios tales como los carotenoides. Las P680 y P700, que se presentan en una de varios cientos de moléculas de clorofila a, son los sitios en que se inicia

la conversión de la energía luminosa en energía química. (Véase una exposición general en mi artículo de 1974, escrito junto con Rajm, "The primary events of photosynthesis", Scientific American 231(6]: 68-82.)

Las reacciones primarias de la fotosíntesis son:P680 + feofitina a + hv'1^ P680'1 + feofitina a~P700 + clorofila a + hv^-’.?P7004 + clorofila a~Aquí, P680 y P700 son los donadores primarios de electrones, y feofitina a (en esencia clorofila a sin Mg, pero con iones H+ en su centro) y clorofila a (también denominada Ao) son los aceptores primarios de electrones. Al recibirse la energía luminosa, se presentan las reacciones primarias anteriores para la separación de cargas. Éstas son las verdaderas reacciones luminosas de la fotosíntesis, en las cuales la energía luminosa se convierte en energía química. Las transferencias de electrones, de la P680 a la feofitina y de la P700 a la clorofila a (Ao), son procesos "cuesta arriba” desde un punto de vista energético y requieren la entrada de energía luminosa.

En 1977, V. Klimov, A. A. Krasnovsky y colaboradores, en la ex Unión Soviética, habían descubierto que la feoflti- na era el aceptor primario de electrones del fotosistema II, el sistema que contenía a la P680. No fue sino hasta 1989 cuando nosotros, en colaboración con Mike Wasielewski y Doug Johnson, del Argonne National Laboratory en Illinois, V Mike Seibert, del Solar Energy Research Institute en Colorado, pudimos medir la increíblemente rápida transferencia de electrones entre la P680 y la feofitina. A 4°C, ocurre en 3 picosegundos (o 3 000 femtosegundos; téngase en cuenta que hay más femtosegundos en un segundo que segundos en 30 millones de años). Varios investigadores han propuesto que el aceptor primario de electrones del fotosistema I, el sistema que contiene a la P700, es una molécula de clorofila a especial. En colaboración con James Fenton, y trabajando en dos diferentes laboratorios, hemos logrado demostrar que el aceptor primario del fotosistema I es una forma de clorofila a que se reduce en 10 picosegundos.

Pasemos al tema de la fluorescencia de la clorofila a. Al absorber luz, las moléculas de clorofila a colectoras excitadas tienen varias vías potenciales para volver a su estado anterior: transferencia de energía a otras moléculas de clorofila a, procesos radiactivos (calor), y emisión de luz (fluo rescencia). Desde que era estudiante en la University of Allahabad (1950-1954), me fascinaba e intrigaba la emisión luminosa en animales y vegetales. Cuando llegué a Urbana, el grupo de investigación de Rabinowitch se encontraba trabajando en estudios sobre -fluorescencia de la clorofila a; el potencial de esta técnica para descubrir cosas nuevas acerca de la fotosíntesis parecía ilimitado.

En 1958, Steve Brody no sólo había descubierto la nueva banda de emisión de fluorescencia en onda larga (ahora clasificada como F730) a 77K (temperatura del nitrógeno líquido), que ahora se sabe procede del fotosistema I, sino que también había realizado las primeras mediciones del tiempo de vida de la fluorescencia dé la clorofila a in vivo. En cuanto se me presentó la primera oportunidad, efectué pruebas para saber si la fluorescencia de la clorofila a podría utilizarse como herramienta para corroborar la existencia de dos reacciones luminosas en la fotosíntesis. Provocamos la excitación de células algales con luz azul y del rojo lejano, por separado y a la vez, y en 1960 descubrimos el efecto represor del rojo lejano sobre la fluorescencia roja de la clorofila a producida por la luz azul; estos datos resultaron ser consistentes con el esquema de dos reacciones luminosas para la fotosíntesis. Mi fascinación por el empleo de la fluorescencia de la clorofila a como herramienta en la investigación de reacciones fotosintéticas continúa hasta la fecha. Existe una larga lista de observaciones realizadas por nosotros que han proporcionado información nueva sobre la estructura y función del fotosistema II y su irtteracción con el fotosisiema I. Daré unos pocos ejemplos.

Me emocionó especialmente el hallazgo, realizado en 1963, de una banda de emisión de fluorescencia en los 696 nm (F696) a 77 K, la cual se originaba en el fotosistema II; ahora se le utiliza para detectar y vigilar "actividad" de fotosistema II. Entre 1966 y 1970, la dependencia respecto a la temperatura de estas bandas de emisión (F730 y F695) y la bien conocida banda F685 hasta a 4 K proporcionó información sobre el mecanismo de transferencia de la energía de excitación en la fotosíntesis; es decir, estos hechos demostraron la validez del mecanismo de Fórster para la transferencia por resonancia inductiva.

Los cambios que se producen en el rendimiento de fluorescencia de la clorofila a después de un cambio simple, un destello actínico brillante, constituyen una herramienta en extremo poderosa para investigar la reacción del fotosistema II. En el lapso comprendido entre un nanosegundo y menos de un microsegundo, el incremento en la fluorescencia de la clorofila a permite verificar la donación de un electrón por el donador de electrones Z (en la actualidad se sabe que es la tirosina) al P680 oxidado, P680 1 , mientras que en un lapso que dura de microsegundos a milisegun- dos, el decaimiento en la fluorescencia de la clorofila a permite verificar el flujo de electrones del aceptor quinónico primario del fotosistema II al aceptor quinónico secundario del mismo fotosistema, QB. El incremento en la fluorescencia se presenta debido a que P680+ es un represor de la fluorescencia de la clorofila a, y el flujo electrónico de Z a

ENSAYO 10-2P680+ hace disminuir la concentración de P680+ . Sin embargo, el decaimiento de la fluorescencia se debe a que Qa-, que se forma en el destello brillante, se reoxida, y se forma un represor de la fluorescencia de la clorofila a (QA) cuando los electrones se transfieren a QB. Hemos aprove chado este método basado en el decaimiento de la fluorescencia para comprender el sitio de acción de C02 o bicarbonato en las reacciones propias del cloroplasto que se realizan en las membranas tilacoidales.

En 1958, Warburg había descubierto que la reacción de Hill se ve drásticamente disminuida si se elimina el C02 de los sistemas fotosintéticos. Él interpretó esta observación como un apoyo a su hipótesis de que el 02 de la fotosíntesis se origina del C02, no del H20. En 1970, Alan Stemler retomó este problema para hacer su tesis de doctorado, después de escuchar mi conferencia sobre el origen del 02 en la fotosíntesis. Desde 1975, hemos utilizado con éxito el método de decaimiento de la fluorescencia para establecer, junto con otros, que uno de los principales efectos de eliminar los iones bicarbonato de las membranas tilacoidales es una drástica desaceleración (o bloqueo) del flujo de electrones de QA al fon-do de plastoquinonas, proceso que escambios resultantes en la carga de las proteínas del LHCII hacen que funcionen mejor en un fotosistema que en el otro. De cualquier forma, es seguro que este mecanismo incrementa la cooperación de los dos fo- muy similar al que ocurre cuando se administra a las plantas herbicidas como diurón y atrazina (véase el ensayo "Herbicidas y transporte fotosintético de electrones" en es- ■ te capítulo). El sitio de acción para el bicarbonato, entre QA y el fondo de plastoquinonas, ha sido del todo confirmado por medio de otras mediciones bioquímicas y biofísicas.Aún no se encuentra evidencia que apoye el modelo de Warburg de la participación del C02 en la formación del2. En nuestra investigación actual utilizamos la fluorescencia de la clorofila a como herramienta para estudiar reacciones en que participa QA en cianobacterias transformables, producto de mutaciones localizadas que confieren resistencia a herbicidas específicos, a fin de descifrar el sitio de unión de C02 o bicarbonato.En—1 ( plastos NA PI me ci a redu< po ''ari ex| ca gopcl 1 ducció ma ;r: cui ____ ; d ción, d de 'is¡ fl S'derotesis st caí on do-^u< logró r du da fec_is zo pos 1lie« c cutas (véase cui d* gr;_ia; seman pr< pr. ne t i negro: vos E da< dt

En conclusión, la clorofila a no sólo participa en la captación de energía luminosa, en la conversión de dicha energía en energía química, como donador primario de electrones (P680, P700) y como aceptor primario de electrones (Ao; la feofitina se deriva de la clorofila por sustitución de Mg por iones H+ en el centro) sino que, además, puede utilizarse su fluorescencia como herramienta sensible y no destructiva para estudiar la estructura y función de la fotosíntesis.tosistemas y representa una adaptación importante pa ra maximizar ia eficiencia fotosintética. Las adaptaciones a largo plazo de los cioroplastos en respuesta a diver sas condiciones del medio se estudian en el Cap. 12.