DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS CON EL MÉTODO DE BIURET

CONCEPTOS PREVIOS: Métodos colorimétricos para la determinación de proteínas.1.2. Método de BiuretSe basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y losgrupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidadde proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, demanera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muybaja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparadosmuy concentrados (por ejemplo en suero).

1.3. Método de BradfordSe basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambiénServa Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dosformas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul paraformar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayorque el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, baratoy pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias queinterfieren estánlos detergentes y las soluciones básicas.

1.4. Método de BCAEl ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar uncomplejo púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivoforma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuprosoproducido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino(reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona unmétodo para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muysensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otrosmétodos.OH-Proteína + Cu2+ → Cu1+Cu1+ + BCA → complejo púrpura BCA- Cu1+1.5. ObjetivosCon esta práctica se pretende introducir al alumno en los diferentesmétodos para la cuantificación de proteínas: su fundamento, sus ventajas einconvenientes. Se utilizarán tres métodos (Biuret, Bradford y BCA), para cadauno de ellos se realizará una curva estándar, se determinará el coeficiente deextinción, el rango de sensibilidad, y se realizará la cuantificación de dosmuestras problemas.

Métodos para la determinación de nitrógeno Características de las proteínas

INTRODUCCION

El termino proteína fue utilizado por primera vez por el químico alemán Gerardus Mulder, en 1838, tomo este nombre del vocablo griego PROTERIOS, que significa primordial nivel primario.Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones.Las proteínas como un grupo de biomoléculas, desempeñan una gran variedad de funciones, algunas participan en la contracción muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan moléculas pequeñas.Los anticuerpos (moléculas que sirven para como protección inmunológica) son proteínas al igual que las enzimas (catalizadores biológicos) y algunas hormonas.Las proteínas pueden llevar a cavo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en la composición y secuencia de aminoácidos.Las proteínas también se clasifican según su composición, las que se forman solo de residuos de aminoácidos y no tienen otras biomoléculas son PROTEÍNAS SIMPLES; no todas las proteínas son solubles en agua, de hecho las proteínas insolubles son esenciales para dar soporte y mantener la integridad estructural de las células y organismos.

DETERMINACION DE PROTEINASI. OBJETIVOS:* Determinar el nivel de proteína que posee un alimento a través del contenido de nitrógeno.* El estudiante conocerá el fundamento del análisis de proteínas por los métodos: Kjeldahl y Sorensen.* El estudiante se familiarizará con los equipos y el procedimiento del análisis de proteínas para los métodos de Kjeldahl y sorensen .* El estudianteaprenderá a realizar los cálculos pertinentes para la determinación de nitrógeno en proteínas.

II. FUNDAMENTO TEORICO:El problema que representa proporcionar proteínas adecuadas a la población del mundo es un tanto secundario en el problema general de alimentación mundial. Además de su significado nutritivo las proteínas juegan un papel importante en las propiedades organolépticas de los alimentos. Las proteínas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. El análisis para la determinación de proteínas, a pesar de no estar incluido generalmente como factor de clasificación en los estándares de granos se acepta como un factor comercial.Las proteínas existen en los alimentos en combinación física o química con carbohidratos o lípidos. Las glucoproteínas y las lipoproteínas afectan las propiedades reológicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones técnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne está relacionado con cambios químicos en las proteínas. Las proteínas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullición, panificación, asado) las cadenas laterales de aminoácidos se degradan o interactúan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azúcares reductores) para conferir sabores típicos. El calentamiento excesivo puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo.El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido proteico total de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezcla compleja de proteínas. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de

naturaleza empírica. El aislamiento y pesado directo de la proteína proporcionaría un método absoluto, sin embargo, dicho método es llevado a cabo sólo a veces en investigaciones bioquímicas pero es completamente impráctico para el análisis de alimentos.Metodos MÉTODO MICRO KJELDAHLLa materia orgánica es digerida por la acción del H2SO4 concentrado, convirtiéndose en CO2 y H2O; además reduce el nitrógeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el ácido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reducción del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultáneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor.La digestión de la muestra es la parte mas difícil de la determinación, esta se acelera mediante la adición de catalizadores como el mercurio metálico, el óxido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cúprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullición y disminuir entonces el tiempo de digestión. Cuando la totalidad de la materia orgánica ha sido digerida, se libera el amoníaco por descomposición del sulfato de amonio con un álcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilación y recolección en un volumen de ácido bórico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulación con solución valorada de HCl 0,1 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo, el cual en medio ácido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.

Resumen de las reacciones químicas en el método Micro-Kjeldahl

Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente fórmula:

%N= G x N x 0.014 x 100MDonde:V = mL de HCl gastados en la titulación.N = normalidad de la solución de HCl (0,1 N).M=Peso de la muestra en gramos

Luego de calculado el porcentaje de nitrógeno, es necesario calcular el porcentaje de proteínas basándose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuación;%P=Nx FDonde:N=porcentaje de nitrogenoF=FACTOR:ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL: N*6.25ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL: N*5.70LECHE Y DERIVADOS: N*6.38

III. MATERIALES Y METODOS:

* MATERIALES:* Muestra.* Destilador.* Incinerador.

* Matraz Kjeldahl.* matraz Erlenmeyer (250 ml)* Bureta fina.* Matraces de 100 y 1000 ml.* Pipetas de 10 ml.* Probetas de 25 ml.

* REACTIVOS:* Acido sulfúrico 98%.* Mezcla catalizadora: 3 gr de oxido de titanio (TiO2), 3 gr de sulfato cúprico (CuSO4) y 100 gr de sulfato de potasio (K2SO4).* Disolución de hidróxido de sodio al 50%.* Disolución de acido clorhídrico (HCl) 0.1 mol/l.* Indicador rojo de metilo.

* METODO DE KJELDAHL MODIFICADO:* Este método consta de 4 fases:1. Digestión o ataque de la materia orgánica.2. Destilación del amoniaco.3. Titulación del borato de amonio. FASES DE DIGESTIÓN:* Pesar 0.3 gr de la muestra seca.* Agregar 3 gr dela mezcla catalizadora y 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y unas perlas de vidrio.* Colocar el balón en posición inclinada sobre una de las hornillas de digestión del multi Kjeldahl.* Se inicia con un calentamiento suave y mantener en ebullición, a calor, el tiempo necesario para que la solución sea amplia y tenga un color ligeramente azul.

* FASE DE LA DESTILACIÓN DEL AMONIACO:* Terminado la digestión enfriar el balón a temperatura ambiente (tener cuidado).* Agregar con cuidado agua destilada (aproximadamente 40 ml).* Pasar a un balón de destilación y completar hasta 150ml con agua destilada, lavar el balón Kjeldahl con agua destilada.* Se añade 10ml de disolución de hidróxido de sodio al 40%. * Colocar el balón en una de las hornillas para destilación y conectarlo al tubo condensador correspondiente mediante un bulbo de seguridad de vidrio, ajustar bien las uniones. * Colocar en un Erlenmeyer o Beacker de 400 ml, 50 ml de acido bórico al 4% para retener los gases de amoniaco y dos gotas del indicador rojo de metilo.* Luego el Erlenmeyer o Beacker se coloca en la parte inferior del tubo condensador de tal manera que el extremo se encuentre sumergido en el acido borico.* Hacer circular el agua de caño por el condensador de Kjeldahl y comenzar la destilación a temperatura controlada.* Continuar la disolución hasta que se haya eliminado el amoniaco, comprobar con papel de tornasol o fenolftaleína.* Retirar el Erlenmeyer lavando con un poco de

agua destilada el extremo del tubo.

* FASE DE TITULACION* Titular el contenido de Erlenmeyer con una solución de ácido clorhídrico (HCl) al 0.1N (cada

ml de esta solución equivale a 1.4008 mg de Nitrógeno) hasta que vire de color (amarillo a rojo o verde a azul) esto depende del indicador que se adiciona. Efectuar los cálculos de acuerdo a la muestra utilizada y el factor de conversión de acuerdo a la muestra.* FACTOR DE CONVERSIÓN DE NITRÓGENO EN ALIMENTOS* Avena, cebada y centeno 5.83* Arroz 5.95* Trigo, harina refinada 5.70* Trigo, grano entero 5.83* Almendras 5.18* Soya 5.71* Leche y sus productos 6.40* Otros(carne, Huevos, maíz) 6.25El contenido porcentual de proteína P de la muestra se calcula:P=a-b1.4008FM* a: gasto en ml de la disolución del acido clorhídrico (0.1mol/l), en la muestra.* b: gasto en ml de la solución de acido clorhídrico (0.1mol/l), en el blanco.* F: factor de conversión para calcular el contenido proteico.* M: peso en gramos de la muestra.1.4008mg de Nitrógeno por cada ml de gasto de disolución valorada en ácido clorhídrico.

* MÉTODO VOLUMÉTRICO DE SORENSEN POOL

Fundamento: Se basa en que el formaldehido va a actuar bloqueando los grupos aminos, dando como resultado la liberación de los grupos carboxilos con el consiguiente aumento de la acidez, la cual se valora con NaOH al 0.1N.

Procedimiento:* Medir 10 de leche neutralizar con HCl al 0.1 N* Agregar 20 ml de formaldehido neutro (neutralizado con NaOH 0.1N), se agrega el formaldehido a la leche y desaparece el color rosado.* Titular nuevamente con NaOH al 0.1 N

Cálculos:%P=G x 0.1909 x 5

IV. CALCULOS Y RESULTADOS:

* PORCENTAJE DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO KJELDAJL DE HARINA:

%P= G x N x 0.014 x F x 100M

%P=23 x 0.02 x 0.014 x 100x 5.700.3

%P=12.24%

* PORCENTAJE DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO SORENSEN POOL.* Determinación de acidez de leche

0.14-0.18%→Rango de acidez en la leche

%A=V x N x F x 100M

%A=3.4 x 0.1 x 0.09 x 10020

%A=0.152%

* Determinación de proteína de la leche:2.8-3.4%→Rango de proteinas en la leche

V1=2.4 ml%P=G x 0.1909 x 5%P=2.4 x 0.1909 x 5%P=2.2908%

V2=3.2 ml%P=G x 0.1909 x 5%P=3.2 x 0.1909 x 5%P=3.0544%V. DISCUSIONES:* Para la determinación de proteínas en leche por el método de Sorenser, comparando nuestros resultados con los de , en primer lugar con el V1 nos damos cuenta de que el % de proteína obtenida no se asemeja al de la bibliografía por lo que podemos darnos cuenta de que la leche fue adulterada o alterada por algún agente, por lo que realizamos nuevamente el proceso, obtuvimos un V2 con el que dio como resultado un % de 3.0544 que si está dentro del rango estipulado en .* Este problema de los volúmenes lo asumimos por el viraje en l titulación, que depende de la vista de la persona encargada del trabajo.

VI. CONCLUSIONES:* El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en:a) Acido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, ob) Acido bórico formándose borato de amonio el que se valora con ácido clorhídrico.

* Es importante el análisis de proteínas para: la determinación de la actividad biológica en alimentos ejemplos: pectinasas durante la maduración de frutos; investigación sobre propiedades funcionales. Ejemplos: gliadina y gluteninas para la elaboración del pan; para el etiquetamiento nutricional del producto final, etc. * Existe una gran necesidad del análisis de proteínas con el fin de obtener el contenido proteico total, composición de aminoácidos contenido de alguna proteína particular, contenido proteico durante el aislamiento y purificación de una proteína, nitrógeno no proteico y valor nutritivo relacionados con un alimento específico a analizar.* Constituyen fuentes de error en del método de Kjeldahl son: la inclusión de nitrógeno no proteico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógeno durante la digestión, la digestión incompleta de la muestra.

* Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una descomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco; generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C.* También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiado titanio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente; las condiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores. * Ventajas del método de Kjeldahl:* Apropiado para varios tipos de productos. Alta fiabilidad.* Usado como método de referencia.* Desventajas del método de Kjeldahl:* Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.

VII. CUESTIONARIO:* ¿Qué es una proteína bruta?El nitrógeno total o proteína bruta (N x 6,25) se determina por el método de Kjeldahl, que consiste en convertir todo el N orgánico (de las proteínas en su mayoría) en N amoniacal (como NH4SO4), destilar el amoniaco (en medio básico) y valorarlo con una disolución ácida contrastada. El % de proteína se calcula multiplicado el % de N por el factor de 6,25.

* Señale los grupos de alimentos y los factores de conversión que se usa para el cálculo de proteína total.

* Trigo-harina entera 5,83* Harinas (excepto la entera) 5,70* Salvado 6,31* Arroz 5,95* Cebada, avena, centeno 5,83* Maíz 6,25* Soya 5,71* Nueces-cacahuates, nueces del Brasil 5,41* Almendras 5,18* Otras nueces 5,30* Leche y productos lácteos 6,38* Gelatina 5,55* Todos los otros alimentos 6,25

* Cuando se denomina nitrógeno proteico y nitrógeno no proteico.Se denomina nitrógeno no proteico a los compuestos de nitrógeno que pueden se convertidos en proteínas por algunos organismos vivos.Muchos organismos superiores no pueden obtener aminoácidos de otras formas, más que absorbiéndolos de la dieta. A los sumo pueden convertir algunos aminoácidos en otros diferentes.

Los compuestos que forman el NNP son los que contienen amoníaco, nitritos y nitratos y otros como la urea, el biuret o el ácido úrico.Los organismos que puede utilizar el NNP son los hongos, las plantas y algas, bacterias y organismo que viven en simbiosis con ellos

VIII. BIBLIOGRAFIA:

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