determinacion de actividad de antibiotico por difusiÓn en gel

DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL

PARTE I

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL ACTIVO Y EL TIPO MICROORGANISMO

1. OBJETIVO

Determinar el efecto del tipo de microorganismo y la concentración del activo sobre el

diámetro del halo de inhibición para la evaluación de una sustancia antimicrobiana por

difusión el gel.

2. MATERIALES (Materiales por grupo de Trabajo)

Tubo de ensayo con 4 ml de inóculo 1

Tubo de ensayo con 2 ml de solución estándar del antibiótico de 1mg/ml 1

Tubos de ensayo pequeños vacíos 10

Recipiente con 60 ml de agar antibiótico No.1 fundido a 50°C 1

Recipiente con 15 ml de agua destilada estéril 1

Cajas de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1

Pipeta de 10 ml estéril 1


Pinza estéril 1

3. MICROORGANISMOS

Escherichia coli

Pseudomonas eruginosa

Klebsiella pneumoniae

Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis

Streptococcus faecalis

De los anteriores microorganismos cultivar dos cepas de cada uno en 5 ml de caldo MH

incubados a 35ºC por 24 horas.

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Preparación del Activo

4.1.1. Marque los tubos pequeños del 1 al 10

4.1.2. Con ayuda de la pipeta de 10 ml adicione 1 ml de agua destilada estéril en cada tubo

4.1.3. Tome 1 ml de la solución estándar de antibiótico de 1 mg/ml y colóquelo en el tubo

marcado como No 1 y homogenice.

4.1.4. Del tubo 1 tome 1 ml de solución y colóquelo en tubo marcado como No. 2 y homogenice.

4.1.5. Repita el procedimiento hasta el tubo marcado como No 10 y homogenice.

4.1.6. Vea la Figura No. 1

Figura 1. Preparación de las diluciones del activo

4.2. Preparación del Inóculo

4.2.1. De cada microorganismo haga un cultivo masivo en agar MH e incube a 35°C por 24

horas.

4.2.2. Con caldo de preservación coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una

suspensión del microorganismo de 25%T (600nm)

4.3.Desarrollo del Ensayo

4.3.1. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri según

diagrama adjunto (Figura No. 2).

4.3.2. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a

entre 48 y 50ºC con 1 ml del inóculo de 25%T.

4.3.3. Mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de

acero.

4.3.4. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero

4.3.5. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior

4.3.6. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la

distribución que se ve en la Figura No 2.

4.3.7. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central.

4.3.8. Incube las cajas a 35ºC por 24 horas

4.3.9. Luego de incubar mida con un calibrador los diámetros de los halos de inhibición.

Figura No.2. Distribución de los pozuelos en el agar.

1

4 3

56

7 8

910

2

5. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

5.1. Revise las características del halo de inhibición y determine cuales microorganismos producen

halos de inhibición bien definidos.

5.2. Registre en la Tabla no. 1 los valores de los diámetros de los halos de los microorganismos

seleccionados

5.3. Con la información realice el Gráfico No. 1 de Diámetro del halo versus Logaritmo de

concentración

5.4. Calcule los valores de la corona ([Diámetro del halo – Diámetro del Pozuelo]/2)

5.5. Con la información realice el Gráfico No. 2 de Longitud de la Corona versus Logaritmo de

concentración.

5.6. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos gráficos, el

valor de R2 y el del intercepto.

5.7. Para determinar el rango de concentración con la mejor correlación realice regresiones de

mínimos cuadrados en grupos de cinco (5) concentraciones C1 a C5, C2 a C6, C3 a C7,

C4 a C7, C5 a C9 y C6 a C10, en caso de ser posible. (Tenga en cuenta que el valor

máximo de diámetro del halo puede estar entre 25 y 30 mm y el menor de 12 mm).

5.8. El valor del intercepto en la Grafica No 2, es equivalente a la concentración mínima inhibitoria

5.9. Con al información calculada realice el análisis de resultados y las conclusiones respectivas,

que se emplearán para la segunda sección del trabajo.

Tabla No. 1

DOSISCONCENTRACION

mcg/ml

LOGARITMO DE

CONCENTRACION

DIAMETRO

DEL HALO

(mm)

LONGITUD

DE LA CORONA

(mm)

C1 500

C2 250

C3 125

C4 62,5

C5 31,25

C6 15,625

C7 7,8125

C8 3,90625

C9 1,953125

C10 0,9765625


PARTE II

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA DENSIDAD DEL INOCULO

6. OBJETIVO

Determinar el efecto de la densidad del inóculo sobre el diámetro del halo de inhibición

para la evaluación de una sustancia antimicrobiana por difusión el gel.

7. MATERIALES (Por grupo de Trabajo)






Caja de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1



Pinza estéril 1

8. MICROORGANISMO

Bacillus subtilis

9. PROCEDIMIENTO


9.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlación.

9.1.2. A partir de la solución de 1 mg/ml realice una dilución que tenga la concentración más alta

del rango seleccionado la cual llamaremos C1.

9.1.3. A partir de C1 realice diluciones seriadas 1:1 hasta C5 esta actividad de la misma manera

que se realizó en la sección 4.1.


9.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l)

e incube a 30°C por al menos 5 días.

9.2.2. Verifique al microscopio que el cultivo esté totalmente esporulado.


suspensión del microorganismo de 25%T (600nm). Lo llamaremos Inóculo 1X

9.2.4. Haga tratamiento térmico (70°C por 10 minutos) para eliminar las formas vegetativas

presentes en la suspensión.

9.2.5. Para preparar el inóculo de mayor densidad Tome 10 ml de la suspensión y centrifugue a

5000 rpm por 15 minutos; retire el sobrenadante; resuspenda en pellet en 1 ml de caldo de

conservación. Lo llamaremos Inóculo 10X

9.2.6. Para los inóculos menos densos haga una dilución 1:100 de la suspensión de 25%T. lo

llamaremos Inóculo 10-2X

9.3.Desarrollo del Ensayo




entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10X


entre 48 y 50ºC con 0,1 ml del inoculo 10X


entre 48 y 50ºC con 0,1 ml del inoculo 1X


entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10-2X


entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10-2X

9.3.7. En cada caso mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los

cilindros de acero.


9.3.9. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior




9.3.12. Incube las cajas a 35ºC por 8 a 12 horas




10.1. Registre en la Tabla No. 2 los valores de los diámetros de los halos


concentración

10.3. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos

gráficos, el valor de R2 .

10.4. Con los valores de pendiente e intercepto de cada gráfico determine la influencia de la

densidad del inóculo sobre la respuesta del activo.

10.5. Haga la respectiva discusión y las. conclusiones

C1

C2 C3

C2C3

C4 C5

C4C5

C1

Tabla No. 2

DOSISCONCENTRACION

mcg/ml

LOGARITMO DE

CONCENTRACION

DIAMETRO

DEL HALO

(mm)

C1

C2

C3

C4

C5


PARTE III

VALORACION DE LA POTENCIA DE UN ANTIBIOTICO

11. OBJETIVO

Determinar la potencia de un antibiótico comercial por difusión el gel.

12. MATERIALES






Cajas de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1



Pinza estéril 1

13. MICROORGANISMO

Bacillus subtilis

14. PROCEDIMIENTO


14.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlación.

14.1.2. A partir de la solución de 1 mg/ml del antibiótico estándar realice una dilución que tenga la

concentración más alta del rango seleccionado la cual llamaremos C1.

14.1.3. Haga diluciones serias 1:1 hasta C5 de la misma manera que se hace en la sección 4.1.

14.1.4. Diluya el producto en agua destilada hasta obtener una solución de 1 mg/ml.

14.1.5. A partir de la solución de 1 mg/ml del producto realice una dilución que tenga la

concentración más alta del rango seleccionado la cual llamaremos P1.

14.1.6. Haga diluciones serias 1:1 hasta P5 de la misma manera que se hace en la sección 4.1


14.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l)

e incube a 30°C por al menos 5 días.

14.2.2. Verifique al microscopio que el cultivo esté totalmente esporulado.


suspensión del microorganismo de 25%T (600nm).

14.3. Desarrollo del Ensayo




entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo

14.3.3. Mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de

acero.


14.3.5. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior. En caso de presencia de residuos

de agar retírelos con una espátula delgada estéril.




14.3.8. Incube las cajas a 35ºC por 8 a 12 horas



15.1. Registre en la Tabla No. 3 los valores de los diámetros de los halos


concentración

15.3. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos

gráficos, el valor de R2.

15.4. Verifique que las curvas sean paralelas.

15.5. Calcule la potencia del producto de acuerdo con las siguientes ecuaciones.

Distancia de Concentración = 2

I = Log (2)

E = [(C1 + P1) – (C5 + P5)]

F = 1/5[(P1+P2+P3+P4+P5) – (C1+C2+C3+C4+C5)]

b = I/E

M = F/b

Potencia = Antilogaritmo (M)


P1

C2 C3

P2P3

C4 C5

P4P5

C1

Tabla No. 2

DOSISCONCENTRACION

mcg/ml

LOGARITMO DE

CONCENTRACION

ESTANDARD

DIAMETRO

DEL HALO

(mm)

MUESTRA

DIAMETRO

DEL HALO

(mm)

1

2

3

4

5

determinacion de actividad de antibiotico por difusiÓn en gel

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