destrucciÃ³n tÃ_rmica de microorganismos 2015

Ingeniera Qumica UNC. Procesos Biotecnolgicos - 2015

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Destruccin de microorganismos

1. Introduccin La esterilizacin es el proceso mediante el cual se consigue la eliminacin total de

organismos o clulas viables. Los procesos de esterilizacin se aplican para: permitir la utilizacin segura de productos al eliminar determinados

microorganismos causantes de algn tipo de riesgo sanitario que pudiesen estar presentes,

evitar contaminacin ambiental por vertido de organismos al medio, impedir el deterioro de un producto por accin de organismos, incluyendo su

multiplicacin. asegurar que un proceso incluye slo el o los organismos deseados,

La condicin de estril no posee graduaciones: algo es estril o no lo es. No obstante, es importante diferenciar el concepto de esterilizacin y el de esterilizacin comercial. Un producto que ha sido sometido a un proceso de esterilizacin comercial presenta una certeza de esterilidad ligada a la probabilidad estadstica de poseer un nivel de contaminacin previamente especificada o a la posibilidad de un fallo cada determinado nmero de procesos de esterilizacin realizados. El concepto de esterilizacin comercial se encuentra asociado a la necesidad de contemplar que:

los procesos de eliminacin de microorganismos implican condiciones agresivas para todos los componentes presentes en el elemento a procesar, lo que algunas veces requiere soluciones de compromiso tecnolgicamente adecuadas entre la necesidad de eliminar los microorganismos y la de satisfacer algn otro requerimiento (por ejemplo, permitir sobrevida de algunos microorganismos banales en las condiciones de uso, o en un nmero muy reducido, pero que no se inactive alguna sustancia importante o que no se deteriore el recipiente en el cual est contenido el producto),

los procesos de eliminacin de microorganismos llevan asociado un costo que es funcin de los valores que asumen las variables del proceso, y

los modelos utilizados para el clculo de las condiciones de esterilizacin poseen caractersticas de matematizacin estadstica y niegan la posibilidad de lograr la eliminacin total de los organismos.

2. Mtodos de esterilizacin La esterilizacin se lleva a cabo eliminando los organismos viables, ya sea por

separacin, como en la filtracin, o por destruccin por medio de una de las siguientes formas:

calentando, irradiando con radiaciones ultravioleta, gamma o rayos X, tratando con productos qumicos en solucin o en forma gaseosa, por medio de otros mtodos no tradicionales, tales como la utilizacin de altas

presiones, microondas, sonicacin, etc. La eleccin del agente depende de las circunstancias, servicios existentes,

naturaleza del material o equipo que ha de ser esterilizado, y costo. En el caso de la destruccin, la proporcin de microorganismos eliminados es

funcin de la dosis letal aplicada, siendo la dosis el producto entre la duracin del tratamiento y su intensidad. La intensidad, en el caso del tratamiento trmico es funcin de la temperatura, en la irradiacin es funcin del flujo radiante y, en el caso de los tratamientos qumicos, de la concentracin del agente activo. Deben considerase dos aspectos fundamentales en este tipo de tratamientos:


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la funcin que relaciona la intensidad del tratamiento con su efecto no es usualmente lineal, sino de naturaleza aproximadamente exponencial,

cada tipo de organismo presenta una determinada susceptibilidad al tratamiento especfico al cual se ve sometido, por lo que la prediccin de resultados slo debe realizarse cuando se cuente con suficientes datos empricos que los avalen.

3. Resistencia a la esterilizacin La esterilizacin debe ser capaz de eliminar los individuos ms resistentes de las

especies ms resistentes Las esporas bacterianas son las clulas vivas conocidas ms resistentes al calor, habindose descrito que las esporas de las bacterias termfilas sobreviven el vapor de agua a presin a 134 C durante entre 1 y 10 minutos, y el calor seco a 180 C durante al menos 15 minutos.

La resistencia de las esporas individuales dentro de una poblacin vara, y cuanto mayor sea la poblacin, mayor es el nmero de esporas individuales ms resistentes. La resistencia de las esporas ser afectada tambin por las condiciones de esporulacin, condiciones de almacenamiento y edad, as como por las condiciones durante y despus del calentamiento. En cuanto a los tratamientos por radiacin, el organismo ms resistente es Deinococcus (= Micrococcus) radiodurans sobreviviente a dosis tan altas como 6.000 krad.

Para destruir organismos, cualquiera que sea el mtodo, se requerir una dosis letal, que depender principalmente de la duracin del tratamiento y de su intensidad. En todos los casos, otros factores alterarn los valores de estas relaciones, por ejemplo la presencia de agua, de oxgeno u otros gases, o agentes protectores como protenas, la temperatura de desarrollo, etc. Cualquier dato sobre mortalidad debe incluir las condiciones experimentales, y en especial el nivel inicial de contaminacin, ya que el tamao de la poblacin determina el proceso de esterilizacin. A esto deben agregarse las dificultades propias de las determinaciones experimentales, que hace que diversas fuentes ofrezcan datos muy dismiles para casos supuestamente iguales.

4. Mecanismos de muerte 4.1. Calentamiento

La muerte de un organismo puede producirse por: desnaturalizacin irreversible de todas las molculas de cualquier enzima

esencial para su mantenimiento (para el caso de una espora para su germinacin o crecimiento), o

dao irreversible del gen que codifica para una enzima esencial. En el caso de los tratamientos trmicos, es ms probable que la destruccin se deba

a la inactivacin de las molculas proteicas, ya que si bien las altas temperaturas producen ruptura de ADN, existe una asociacin entre este y el dipicolinato clcico de las esporas bacterianas que protege este ADN. Esto explica tambin el efecto protector que un intervalo de concentracin del in calcio produce sobre esporas sometidas a esterilizacin.

La termorresistencia de las protenas (y por lo tanto de las enzimas) es funcin inversa de su grado de hidratacin, ya que mientras mayor sea ste ms fcilmente penetrar en los mbitos (dominios) hidrofbicos internos de las molculas de protenas causando un cambio irreversible en su conformacin. De esta manera deben diferenciarse los tratamientos en los que se aplica calor seco de los que se utiliza calor hmedo.

En la esterilizacin hmeda el vapor a presin tiene dos funciones importantes: ceder rpidamente una gran cantidad de calor al material a esterilizar por

condensacin sobre su superficie, lo que se traduce en una muy rpida elevacin de la temperatura,


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mantener o aumentar el nivel de hidratacin existente en los organismos, especialmente en las esporas.

En la esterilizacin con calor seco, el calor es transferido muy lentamente y, en general, debido a la disminucin de la humedad relativa ambiente por aumento de la temperatura, la hidratacin se reduce, lo que aumenta la resistencia de las protenas, encontrndose que las esporas son considerablemente ms resistentes al calor seco que al calor hmedo.

4.2. Radiacin La irradiacin mediante luz ultravioleta de longitud de onda 250-280 nm conduce a

un dao en el ADN que es proporcional a la dosis de radiacin, principalmente por formacin de dmeros de pirimidinas entre bases adyacentes. Los mecanismos de reparacin son capaces de restablecer la integridad del ADN, pero es improbable que funcionen en una espora latente o con elevado nivel de dao. La radiacin ultravioleta no es muy penetrante y no se puede confiar en ella como agente esterilizante, a menos que se pueda garantizar la exposicin directa del organismo contaminante.

La irradiacin con rayos gamma y con rayos X es ms eficaz, debido a su alto poder de penetracin. Existen dos clases principales de efectos: produccin de un gran nmero de rupturas de las cadenas sencillas y de la doble cadena

del ADN; ionizacin de molculas intracelulares formando especies txicas altamente reactivas,

como perxidos y radicales libres, a los que los grupos sulfihidrilos de las enzimas son extremadamente sensibles. 4.3. Agentes qumicos

Los agentes qumicos esterilizantes pueden matar como resultado de su capacidad de oxidar o alquilar. Muchos son tambin txicos para el hombre, o carcinognicos, y puede requerirse un equipo especial para su uso. Por ejemplo, el xido de etileno es fuertemente explosivo en mezclas con aire, crnicamente txico a concentraciones no detectadas por el olfato y puede producir hipersensibilizacin de la piel, eritema y edema.

5. Determinacin de la destruccin de los microorganismos 5.1. Resistencia de los microorganismos

Los microorganismos presentan diferentes grados de resistencia a los agentes fsicos y qumicos. Esta respuesta est relacionada con elementos estructurales de los microorganismos tales como la capacidad de formar esporas, la presencia de ciertos componentes en la pared celular (ej. lpidos) o el grosor de esta. Por lo tanto, la resistencia es diferente en las distintas especies microbianas. El grado de resistencia de los agentes contaminantes, segn una escala genrica que va de mayor a menor es:

Priones Esporas bacterianas Mycobacterium Esporas de hongos Virus pequeos o sin envoltura lipdica Hongos formas vegetativas Bacterias vegetativas Virus medianos o con envoltura lipdica Las diferencias en la resistencia han permitido seleccionar cepas indicadoras para la

esterilizacin y desinfeccin de alto nivel y preparar indicadores biolgicos. Para estos efectos se selecciona la especie ms resistente para el mtodo y si la destruye se asume que tambin destruye los microorganismos menos resistentes. Los microorganismos son


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afectados por el calor de distinta manera, dependiendo la termorresistencia de varios factores que actan asociadamente y cuyos valores deben ser establecidos empricamente, los cuales son: el tipo de microorganismos a eliminar, el nmero inicial de microorganismos, mientras mayor sea este, mayor ser el tratamiento

trmico que se precise, el medio de cultivo donde se han desarrollado los microorganismos a eliminar, cuanto

ms favorable sea el medio para el crecimiento, ms resistentes sern estos. la temperatura a la cual han crecido los organismos, ya que, en general, la mxima

resistencia se produce cuando ha desarrollado en su temperatura ptima de crecimiento. la etapa en que se encuentre el cultivo o poblacin, siendo mxima la resistencia durante

su ltima etapa de latencia, y la mnima, en su fase de crecimiento logartmico, la forma en que se encuentre el microorganismo (vegetativa, esporulada, esclerocios,

etc), las caractersticas del medio en que se encuentren los microorganismos, ya que la

presencia de sustancias como azcares, lpidos y ciertas sales ejercen un efecto protector, mientras que otros iones suelen disminuir la termorresistencia,

la concentracin de hidrogeniones (pH). Los microorganismos y sus formas vegetativas son ms resistentes al calor cuando estn en un medio en el que su pH sea neutro. Desplazamientos en los valores de pH disminuyen la termorresistencia, tanto ms cuanto ms se aleje de estos valores, y con cadas ms veloces al variar hacia el lado cido que al hacerlo hacia el bsico, debindose tener presente que por lo general las variaciones de temperatura producen variaciones en el pH de un medio,

la relacin tiempo-temperatura. El tiempo necesario para destruir clulas o esporas, bajo ciertas condiciones, disminuye al aumentar la temperatura y las caractersticas de esta disminucin es propia de cada tipo de microorganismo,

el grado de humedad con que se realiza el tratamiento, siendo esto muy importante para las formas vegetativas. 5.2. Cintica de destruccin microbiana

A una temperatura constante suficiente para causar dao a los microorganismos, estos no mueren todos al mismo tiempo, sino que en cada intervalo de tiempo lo hace una fraccin aproximadamente constante de la poblacin presente. Por ejemplo, para una colonia de microorganismos sometidos a una temperatura constante letal (supongamos 110 C), si por cada 3 minutos que transcurren muere un 60 % de la cantidad presente al inicio del intervalo considerado, (es decir que por cada 3 minutos que se prolongue el calentamiento a dicha temperatura slo sobrevive el 40 % de la poblacin), debe suponerse que el nmero de microorganismos presentes a los 6 minutos de calentamiento ser del 16 % de la poblacin inicial, y a los 9 minutos sobrevivir aproximadamente el 6,5 %.

Si se acepta la constancia de la fraccin destruida (o de la superviviente) se puede asumir que el proceso sigue una cintica de primer orden, coincidente con la expresin (1), donde C es la concentracin de los organismos, kd es la constante especfica de la reaccin de destruccin, dependiente de la temperatura, y t es el tiempo a la temperatura de trabajo. En la expresin puede sustituirse concentracin por nmero sin que se altere la validez de la misma, aunque deben controlarse los supuestos de trabajo para el uso de una u otra. Esta expresin integrada da por resultado las siguientes, sea en su forma natural (2) o en base decimal (3 y 4)

Ln Nf = - kd . t log Nf = - K . t log Nf = - Kd . t donde kd = K No No No 2,302 2,302

(2) (3) (4) (5)

- dC = kd . C . dt (1)


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Estas expresiones pueden transformarse en la (6) o en

similares a ella, segn se utilice la constante procedente de una modelizacin que utiliza la logaritmacin decimal o la natural:

La representacin grfica del nmero de microorganismos supervivientes en funcin del tiempo de exposicin a una temperatura letal constante es una funcin exponencial, que representada en ordenadas lineales es una curva asinttica a cero (Fig. 1), y en ordenadas con escala logartmica (Fig. 2) es una recta cuya pendiente es el exponente de la funcin (6) (kd si el logaritmo es natural y K si es decimal).

Estas grficas pueden tambin expresarse en funcin de la fraccin Nf/No en vez de Nf, recibiendo las logartmicas el nombre de grficas de superviviencia (Fig. 3 y 4).

Cuando el descenso logartmico es constante desde el tiempo cero, tal como en los

ejemplos anteriores, la curva es una forma de cintica de choque nico, donde una lesin irreversible es suficiente para matar a una clula.

No todas las poblaciones exhiben cintica de choque nico, pudindose encontrar experimentalmente una curva que muestre una mayor resistencia a las condiciones letales,

Nf = No - kd . t

. e (6)


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con aparicin de una zona horizontal y de forma similar a un hombro antes del comienzo de la inactivacin logartmica (Fig.5):

Como se observa en la Fig. 6, la prolongacin de la recta que representa la evolucin del nmero de microorganismos en el tiempo indicara que la poblacin inicial es mayor que la experimentalmente determinada, ya que a tiempo cero la fraccin (n de microorganismos a tiempo t)/(n inicial de microorganismos) es mayor que uno. En estos casos, la expresin cintica para la supervivencia es:

(7) donde n es un nmero de extrapolacin igual a la interseccin sobre el eje N/No que da el nmero de choques requeridos para la letalidad (en el caso del ejemplo graficado corresponde al valor 4). La explicacin para este comportamiento es que, o existe un requerimiento de choques mltiples para lograr la letalidad, o que cada unidad viable puede consistir en un agregado de varias clulas o esporas diferentes y la inactivacin de la unidad compuesta (medida como un solo organismo) no se observa hasta que todos los componentes sean inactivados. Este exponente es el factor por el que se debe multiplicar la poblacin inicial medida con esta caracterstica de mortalidad por choque mltiple para encontrar al nmero terico de individuos con caractersticas de mortalidad por choque nico que conforma una poblacin equivalente a la primera en funcin de su resistencia al tratamiento. Debe tenerse en cuenta que en la prctica tambin se encuentran curvas de supervivientes no lineales.

5.2.1. Influencia de la temperatura sobre la velocidad de destruccin trmica. En esta modelizacin de la destruccin

de los microorganismos debe considerarse que, al igual que en cualquier reaccin, su velocidad es dependiente de la temperatura, siendo el parmetro influenciado por esta la constante de velocidad kd, tal como lo seala la ecuacin de Arrhenius (8), donde A es el factor de frecuencia o constante de Arrhenius, Ea es la energa de activacin de la reaccin, en este caso la de termodestruccin celular, T la temperatura absoluta a la cual se desarrolla la reaccin y R la constante de los gases ideales.


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En la expresin puede considerarse que el factor de

frecuencia o constante de Arrhenius A corresponde a la constante cintica a temperatura infinita (verificable aplicando logaritmacin y graficando el logaritmo de Kd en funcin de 1/T), con lo que puede escribirse en funcin de este parmetro kd como se muestra en (9)

5.3. Definiciones Existe una gran cantidad de definiciones y parmetros que se utilizan en la

modelizacin de la eliminacin de microorganismos, slo se harn referencia a los necesarios para el desarrollo del tema, siendo los ms usuales los siguientes:

tiempo trmico letal o de destruccin trmica F: tiempo

coeficiente de letalidad (1/F):

necesario para destruir los microorganismos a una temperatura determinada y bajo condiciones especficas;

inversa del tiempo

punto trmico letal: la

requerido para destruir cierto nmero de microorganismos a una temperatura definida y bajo condiciones especficas;

temperatura

Si bien estos parmetros son usualmente encontrados como datos, a menos que sean conocidos tanto el tamao inicial de la poblacin y las condiciones precisas del tratamiento al que se la somete, no son particularmente tiles. Los parmetros generales ms tiles son los siguientes:

ms baja que se necesita para matar a los organismos en 10 minutos.

ndice de reduccin o valor : logaritmo decimal del nmero de veces

tiempo de reduccin decimal o valor D:

que se redujo una poblacin bacteriana (equivale a reducir una poblacin de 10 microorganismos hasta 1 microorganismo).

tiempo

constante de resistencia termal o valor z:

(en minutos y a una temperatura determinada) que se requiere para reducir la poblacin viable al 10% de su valor.

diferencia en temperaturas

El tiempo de reduccin decimal o D es distinto para diferentes especies microbianas (inclusive para individuos de la misma que han desarrollado o se encuentran en distintas condiciones), un valor D elevado es indicativo de una gran resistencia al calor (termorresistencia). A modo de ejemplo, se adjuntan valores de D121C para distintos microorganismos:

Bacillus cereus: ............................... 2 - 3 seg Clostridium botulinum: .................... 12 - 25 seg Bacillus stearothermophilus ............ 410 seg

necesaria para causar una reduccin de un 90% en el valor D (modificar el valor D por un factor de 10).

kdT = A - Ea / (RT)

. e (8)

kdT = kd

- Ea / (RT)

. e (9)


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El valor D se relaciona con el exponente cintico por medio de la expresin (3), donde se reemplaza Nf por 0,1No, con lo que el tiempo t por definicin se transforma en el tiempo de reduccin decimal D. Resolviendo y reacomodando se obtiene la relacin entre D y K (10) o kd (11). El valor D tambin se obtiene por interpolacin grfica como el tiempo necesario para producir la reduccin en el nmero de supervivientes en una unidad logartmica de base decimal, medida sobre la parte recta de la grfica (Fig. 8). A partir de dicho grfico puede fijarse el tiempo de reduccin decimal requerido destruir el 90% de la poblacin a una determinada temperatura. Estos valores de D se indican mediante un subndice, con el que se seala la temperatura en grados Celsius. Cuando los logaritmos de los valores D a diferentes temperaturas se trazan frente a la temperatura, se encuentra que la relacin es generalmente una Inea recta, de la cual puede ser obtenido directamente el valor z por interpolacin (Fig. 9). Los valores de z indican la sensibilidad de los microorganismos a la variacin de las temperaturas letales.

Mientras los valores D son muy dependientes de la temperatura y de las condiciones, tanto de procesamiento como de evaluacin de la destruccin, los valores z son bastante menos dependientes de estos factores (aunque siguen siendo fuertemente influenciados por las condiciones de proceso). Estos valores z pueden ser importantes para

determinar los lmites de un proceso, ya que los materiales pueden ser incapaces de soportar ciertas condiciones, especialmente de temperatura. Sin embargo, los valores z no pueden ser verdaderamente constantes a lo largo de un amplio rango de temperatura, ya que por debajo de una temperatura particular no ocurrir ningn dao (umbral trmico de letalidad) y el valor D sera infinito. La relacin matemtica entre D y la temperatura puede obtenerse a partir de la expresin (9) y considerando que segn el mismo kd es igual a 2,302/D, puede obtenerse (12). La expresin (13) que relaciona z, T y D puede deducirse de la Fig. 9, y permite calcular el valor de D a cualquier temperatura T a partir de un valor DR conocido a una temperatura de referencia TR

Los valores D y z caracterizan la termorresistencia de un microorganismo y son los necesarios para comparar la de diferentes microorganismos y para calcular los tratamientos trmicos.

log Nf = - K . t (3) No

log 0,1 . N0 = - K . D No

1 = D (10) K

2,302 = D (11) kd

D

(Tr T) z

= DR . 10 (13)

Ea / (RT) D = D . e (12)


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6. Determinacin de la intensidad requerida para esterilizacin A partir de la expresin (3), de la definicin del

ndice de reduccin y del tiempo de reduccin decimal DT a la temperatura T puede deducirse que la relacin entre ambos y el tiempo de tratamiento t es la indicada en (14), que reordenada se transforma en (15) y (16), donde el trmino No/Nf es la cantidad de veces que disminuye la poblacin. Estas expresiones permiten establecer dos aspectos bsicos: en teora y debido a la naturaleza logartmica del

modelo, solamente con un tiempo de tratamiento infinito se eliminara la totalidad de los microorganismos. Segn esto, la esterilizacin entendida como la eliminacin absoluta de toda forma de vida nunca puede ser lograda con total certeza, por lo que se ha desarrollado el concepto de esterilidad comercial, donde los tratamientos reducen el nmero final de microorganismos a un valor determinado asociado a una probabilidad mnima de encontrar los individuos que hayan sobrevivido,

para alcanzar determinada concentracin final la carga inicial de organismos es un factor determinante de la intensidad del tratamiento trmico a realizar, siendo de fundamental importancia que sea lo ms reducida posible para que el tratamiento no requiera extrema rigurosidad. Por esto, la esterilizacin ha pasado a ser considerada ms que una operacin un proceso donde cada una de sus etapas es importante, va a influir en los resultados y debe ser supervisada y evaluada para garantizar el producto, proceso que comienza con el cuidado de todos los elementos que compondrn el material a esterilizar. Si a esto se le agrega el cuidado de los diversos elementos y materiales durante y posteriormente a la etapa de destruccin de los organismos, se afirma que la esterilizacin es el resultado de un proceso global y no solamente de la exposicin al agente esterilizante. 6.1. Eficiencia del tratamiento trmico

Dentro del modelo de esterilizacin comercial, es usual utilizar el tiempo de destruccin trmica F para medir la intensidad de un tratamiento, y corresponde al tiempo de esterilizacin a una temperatura determinada T necesario para alcanzar el ndice de reduccin especificada o a cualquier combinacin de variables tiempo-temperatura que produzcan el mismo efecto. Esto permite establecer o comparar la intensidad de diferentes tratamientos trmicos. Dado que es vlida cualquier combinacin de valores que produzcan el resultado especificado, el valor de tiempo de destruccin trmica F puede obtenerse hacindolo igual al tiempo t obtenido a partir de las expresiones (15) y (16), con lo que se transforman en (17) y (18). Por ejemplo, para una reduccin del 90% de la poblacin, el valor F ser igual al valor D. Para una lograr una reduccin del 99% de la poblacin microbiana, el valor F deber ser igual a 2D.

Esta unidad de comparacin F se utiliza transformndolo en su inversa, conocida como coeficiente de letalidad o de destruccin trmica, la cual expresa la fraccin de tratamiento alcanzada por unidad de tiempo a la temperatura a que se encuentra sometido. Si se integra el coeficiente de destruccin trmica en funcin del historial trmico, se obtiene la eficiencia del tratamiento propuesto o desarrollado.

log Nf = - t (14) No DT

DT . log No = t (15) Nf

DT . log 10 = t 1

DT . = t (16)

DT . = F (17) DT . log

No = F (18) Nf

Reduccin en la poblacin de 90 %

Valor F

1D 99 % 2D 99,9 % 3D 99,99 % 4D 99,999% 5D


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Puede observarse que existe un valor de F para cada grado de reduccin () y que si este se mantiene constante, este valor de F depender linealmente slo del tiempo de reduccin decimal D, por lo que cualquier variacin de D ser proporcional al de F. Cuando la temperatura de trabajo T es la 121 C (250 F), se denomina Fo y es el valor usualmente encontrado como dato. De esta manera, la Fig. 9 puede transformarse en la Fig. 10, de donde puede deducirse la expresin matemtica general de la funcin (19) que permite calcular los tiempos t o F para cualquier temperatura T:

(19) Estos tiempos son los tiempos letales F

para destruir cierto microorganismo en determinado medio y con una concentracin definida a la temperatura T. En numerosas ocasiones es posible encontrar en bibliografa el smbolo f para representar los valores de F, reservando este ltimo cuando la temperatura es de 121 C.

Para plantear un tratamiento de esterilizacin por temperatura, los pasos a seguir son los siguientes: establecer el grado de seguridad estadstica que se pretende, por ejemplo, que sobreviva

no ms de un organismo de cada 1012, o que uno de cada 106 procesos de esterilizacin falle por supervivencia de un organismo, etc.1

en funcin de la carga inicial de organismos y del grado de seguridad estadstica determinar el grado de reduccin () necesario,

,

con el grado de reduccin () y el tiempo de reduccin decimal D determinar el tiempo de esterilizacin F requerido (histrica y arbitrariamente se ha establecido que el mnimo tratamiento trmico debe reducir cualquier poblacin de esporas de C. Botulinum a 10-12, lo que se conoce como concepto 12D, estando las esporas de C. Botulinum caracterizadas por un valor D121 de 0,21 minutos).

Para determinar la eficacia de un tratamiento, a los puntos anteriores debe agregarse el control de haber alcanzado el tiempo de tratamiento requerido, en cuyo caso debe contarse con los datos del perfil de temperatura en funcin del tiempo para el elemento que est siendo sometido a esterilizacin. Cuando se somete a tratamiento trmico un medio o producto, la elevacin de la temperatura, medida en su porcin crtica (la ms lenta en modificar su temperatura) puede no ser no ser instantnea hasta el valor mximo de trabajo sino que ser paulatina en el tiempo, existiendo un conjunto de temperaturas menores a la mxima a las cuales ya existe termodestruccin de una fraccin del conjunto de microorganismos.

Asumiendo que la termodestruccin es aditiva, la totalidad de los microorganismos se habr destruido cuando la integral de la curva que representa el coeficiente de letalidad en funcin del tiempo de calentamiento sea la unidad. Es evidente que para esto se requiere conocer, adems de F y z para el microorganismo en cuestin, la variacin de temperatura en funcin del tiempo de calentamiento en el punto crtico del material que se est esterilizando.

1 La agencia reguladora americana FDA -Federal Drug Administration- exige que en los mtodos de esterilizacin se debe documentar la probabilidad de encontrar un producto no estril, lo que se denomina SAL Sterility Assurance Level o nivel de esterilizacin garantizada. Este indicador es el utilizado en la actualidad para definir un producto estril. En trminos prcticos SAL describe el potencial terico de inactivacin microbiana de un proceso de esterilizacin en trminos de la probabilidad de encontrar un producto no estril en un conjunto de elementos sometidos a este proceso


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La grfica de temperatura (T) en el punto crtico en funcin del tiempo de calentamiento (t) en un proceso de eliminacin de microorganismos donde el punto crtico se calienta instantneamente desde la temperatura inicial To hasta la temperatura de proceso Tp y de la misma forma se enfra luego de transcurrido el tiempo de tratamiento (tf to) hasta la temperatura final Tf, correspondera a la de la Fig. 11, mientras que si se produce un retraso en alcanzarlo y en su posterior enfriamiento, correspondera a una similar a la de la Fig. 12. En el caso mostrado en la Fig. 12, el calentamiento comienza a un tiempo toc y existe un cierto retraso en alcanzar Tp, mientras que el enfriamiento comienza a tf pero slo se alcanza la temperatura final Tf a un tiempo tfc.

La combinacin Tp-t indica la severidad del tratamiento. En el caso correspondiente a la Fig. 11, el tiempo t durante el cual acta la temperatura Tp es (tf - to). En la Fig. 13 puede verse que en este primer caso, por encontrarse a la temperatura constante Tp, el coeficiente de letalidad 1/F para esas condiciones tambin ser constante. Si, a modo de ejemplo, se supone que en este caso el proceso sostiene la temperatura durante 3 minutos y que F para la temperatura Tp tiene un valor de 4 minutos, el coeficiente de letalidad 1/F valdr 1/4 min-1, con lo que en cada minuto de tratamiento se lograr una esterilizacin equivalente a 0,25 del total, representada en la Fig.13 por el rea sombreada. Al sumar los efectos logrados en cada uno de los tres minutos que ha durado el proceso se obtiene un tratamiento esterilizante de 0,75 (o 75 %), el cual es insuficiente para lograr la eliminacin de los microorganismos. Puede observarse que para este caso, la integral es directamente el producto entre el tiempo de tratamiento t y el coeficiente letal 1/F para la temperatura de esterilizacin.

En el caso representado en la Fig. 14, donde la temperatura en el punto crtico va subiendo desde la inicial hasta la de proceso, para evaluar el grado de esterilizacin alcanzado debe evaluarse la integral bajo la curva total, para lo cual deben determinarse las temperaturas alcanzadas a tiempos entre toc y to y entre tfc y tf, calcularse para cada uno de


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ellos el coeficiente de letalidad 1/F a partir de la frmula indicada en (18) y as conformar los puntos ti;1/Fi), cuyos aportes al total corresponden a las porciones sombreadas de la Fig. 14.

Si bien las integrales pueden resolverse de muchas maneras, tanto grfica como analticamente, el mtodo grfico que se ha seguido histricamente corresponde al siguiente procedimiento:

1. sobre la curva de variacin de temperatura en el punto crtico en funcin del tiempo de proceso se seleccionan temperaturas significativas, entendiendo por esto a aquellas a las cuales exista algn efecto letal (Fig.15),

2. se calcula para cada una de las temperaturas anteriores el coeficiente de destruccin trmica (1/Fi),

3. se grafican estos coeficientes de destruccin trmica en funcin del tiempo de calentamiento ti (Fig.16),

4. se calcula la integral bajo la curva resultante a partir de la cantidad de rectngulos de altura de medida a (segn la escala de coeficientes de letalidad 1/F) y base de medida b (segn la escala de tiempos t), siendo el valor de la integral el producto del nmero n de unidades de rea (rectngulos) por el rea de cada uno de ellos, es decir, el producto entre a y b (Fig.17): rea total = n x a x b. (20)

Si este valor es igual a 1 (uno), el proceso de esterilizacin es exactamente el requerido, si es menor es insuficiente y si es mayor se encuentra sobreesterilizado.

La determinacin de la cuanta de la desviacin del proceso de esterilizacin por este mtodo grfico se realiza a travs del clculo de la diferencia entre el rea medida y el valor 1 a partir del nmero de unidades de rea (rectngulos) y su rea:

desviacin del proceso = nmero real de unidades de rea. a x b 1 (21) Esta desviacin a su vez es igual al nmero de unidades de rea faltantes

multiplicadas por su rea unitaria, de donde puede despejarse el nmero de unidades de superficie que es necesario agregar o quitar para llegar al grado terico de esterilizacin:

desviacin del proceso = nmero a modificar de unidades de rea. a x b (22) De existir una seccin isoterma a la mayor temperatura, la correccin de esta

desviacin del proceso habitualmente se carga a ella, transformando la desviacin del proceso calculada por (21) en una nueva rea rectangular cuya altura es el coeficiente de letalidad a la mayor temperatura T alcanzada y la base es el intervalo de tiempo que es necesario agregar o eliminar en la porcin isoterma del proceso:

desviacin del proceso = 1/FT . t (23)


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Si no se cuenta con una funcin integrable o con la posibilidad de efectuar otro mtodo de integracin, la determinacin de la eficacia del proceso puede realizarse numricamente mediante el siguiente procedimiento:

1. sobre la curva de variacin de temperatura en el punto crtico en funcin del tiempo de proceso se establece el tiempo promedio que se encuentra el medio en cada una de las temperaturas (promedio) que se hayan elegido como significativas,

2. se calcula para cada una de las temperaturas anteriores el coeficiente de destruccin trmica (1/FT),

3. se multiplican estos coeficientes por los tiempos promedio que se mantuvieron a esa temperatura media,

4. se realiza la sumatoria de estos productos, si el resultado es menor a 1 el medio an no est estril, si lo sobrepasa se encuentra sobresterilizado.

T promedio Tiempo ti de exposicin a T

promedio (igual unidad que FT)

(C) 1/FT = [FR.10 (T

R-T

R)/z]-1 t . (1/FT)

T0 ta = t0/2 1/Fo ta . 1/Fo T1 tb = (t1 - t0) 1/F1 tb . 1/F1 T2 tc = (t2 - t1) 1/F2 Tc . 1/F2

.......... .......... .......... .......... Tn-1 ty = (tn-1 tn-2) 1/Fn-1 tx . 1/Fn-1 Tn tz = (tn tn-1) 1/Fn tz . 1/Fn

[ti . (1/Fi)] Al igual que antes, la determinacin de la cuanta de la desviacin del proceso de

esterilizacin por este mtodo se realiza a travs del clculo de la diferencia entre la sumatoria y el valor 1:

(1/Fi . ti) 1 = desviacin del proceso (24) Esta desviacin a su vez es igual al producto entre el tiempo t que se debe agregar o

quitar del perodo que se encuentra a la temperatura T (habitualmente la isoterma ms elevada) y el coeficiente de letalidad a esa temperatura T (25), de donde puede despejarse dicho tiempo (26) y (27): desviacin del proceso = 1/F . t (25) desviacin del proceso . F = t (26) desviacin del proceso . FR . 10(TR T)/z = t (27)

Destruccin de microorganismos

destrucciÃ³n tÃ_rmica de microorganismos 2015

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