Descubrimiento de Snu17p

1. Habían aislado en levaduras el complejo Tri-snRNP (U4/U6.5)mediante cromatografía de afinidad.

2. Logran separar parcialmente Tri-snRNP (U4/U6.5) de U1 y U2 snRNPmediante gradientes de glicerol.

3. Encontaron 34 bandas correspondientes a proteínas que comigrabancon Tri-snRNP (U4/U6.5)

4. De esas 34 proteínas generaron péptidos mediante proteólisis y estofue analizado mediante espectrometría de masas; las secuenciashalladas fueron buscadas en DATABase

28 P Asociadas a 2 p específicas Tri-snRNP (U4/U6.5) de U2 snRNP

Una nueva proteína con RRM a la cual llamaron Snu17p

Snu17p es una proteína U2 snRNP

¿Está Snu17p asociada al spliceosoma?

- Snu17p se asocia al pre-mRNA en el prespliceosoma- se asocia también al lariat-exón2 forma parte del spliceosoma catalíticamente activo- es un factor general del splicing

Transcripción de pre-mRNA de actina ó U3 en presencia de [-32P]UTP

Incubación con extracto de splicing de AGY9 (Snu17p-tag) ó TR2 (Snu17p)

-25°, 20 ó 40 minutos-

Extracción de RNA Inmunoprecipitación con IG-beads

Electroforesis en gel desnaturalizante Extracción de RNA

Autorradiografía Electroforesis en gel desnaturalizante

Autorradiografía

¿Es Snu17p esencial para la viabilidad

celular?

5´UTR HIS3 3´UTR

Transformación de cepa TR1(integración al genoma por recombinación homóloga)

Crecimiento en medio HIS-

Cepa AGY17 (Snu17p)

Esporulación

2 esporas normales + 2 esporas de crecimiento lento (Snu17::HIS3)

Cepa AGY21 (knock-out para el gen SNU17)

Aislamiento de esporas Snu17p

Análisis de crecimiento a 17,30 y 37°C

- El fenotipo de crecimiento lento no se modifica con la temperatura

- Bajo cualquier condición, las levaduras Snu17 crecen 1.3 veces más lento que las wild type

Interesa determinar si la deleción en el gen Snu17p tiene algún efecto sobre el splicing

-La cepa Snu17p presenta defectos en el splicing tanto a 25° como a 37°C.

- A pesar de no presentar un fenotipo sensible a la temperatura, los defectos del splicing aumentan con la misma.