Desarrollo de pruebas moleculares isotérmicas para la detección del SARS-

CoV-2

Mónica Pajuelo TravezañoLaboratorio Microbiología Molecular

Laboratorios de Investigación y Desarrollo – FACIE – UPCH

1

COVID-19

Enfermedad producida por la infección con SARS-Cov-2

2

Toma de muestra

Extracción de material genético

PCR- “Real time”(cuantitativo)

Diagnóstico de COVID-19: Método de detección molecular

3

Extracción del material genético

Método molecular

4

Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR)

Retrotranscripción

Método molecular

5

PCR- “Real time” (cuantitativo)

Lisis

RPA – Prueba isotérmica30 minutos

Lectura de resultados

Detección de SARS-CoV-2 por un método molecular

Toma de muestra

6

Diseño de primers para la identificación de SARS-CoV-2Selección de región viral

7

S

qPCR Primer NIID(N) 29133-29290nt

“Japón”qPCR Primer CDC(N1) 28295-28366nt

“USA”

qPCR Primer Corman, 2020. (RdRp) 15352-

15451nt

“Europa y China”

RT-RPA

8

ARN

M-MLV Trascriptasa reversa

Cebadores

Cebadores

Recombinasa Proteina SSB Polimerasa

Nucleótidos

RT-RPA

9

RT-RPA

10

RT-RPA

11

RT-RPA

12

RT-RPA

13

RT-RPA

14

Cebadores

Cebadores

Recombinasa Proteina SS Polimerasa

Nucleótidos

15

Especificidad analítica

16

PC: SARS-CoV-2 (104 copies/µL), HMPV: Human metapneumovirus, A/H1N pdm: Influenzavirus A H1 pandemic, HRSV: Human respiratory syncytial virus, HPIV-2: Human parainfluenza virus 2, HPIV-4: Human parainfluenza virus 4, HPIV-1: Human parainfluenza virus 1, HPIV-3: Human parainfluenza virus 3, IVB: Influenza B virus, IVC: Influenza C virus, SARS-1: SARS coronavirus 1, MERS-CoV: MERS coronavirus, NTC: Non template control.

Límite de detección del RT-RPA-LF

17

Figura 6. Límite de detección de SARS-CoV-2 RPA-LF con diluciones seriadas 1/10 del plásmido control

positivo, equivalentes a 105, 104, 103, 102, 10, 1, 10-1 copia/µL, con RPA-LF. Se realizaron 3 repeticiones.

Detección por flujo lateral

18

Biotina 6-FAM

Detección por flujo lateral

19

Detección por flujo lateral

20

Detección por flujo lateral

21

Detección por flujo lateral

22

Detección por flujo lateral

23

Agradecimientos - Financiamiento

• Instituto Nacional de Salud - INS• Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación

Tecnológica (FONDECYT), Contrato 045-2020.• Fondo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS),

KAKENHI JP19K24679.• Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología del Japón

(MEXT).

24