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Desarrollo de péptidos bioactivos y probióticos para la tercera edad

Ingredientes funcionales para la tercera edad

1. El proyecto SENIFOOD

2. A la búsqueda de péptidos bioactivos

3. ES1: un probiótico contra la inflamación

4. Conclusiones

Ingredientes funcionales para la tercera edad

1. El proyecto SENIFOOD

2. A la búsqueda de péptidos bioactivos

3. ES1: un probiótico contra la inflamación

4. Conclusiones

Biopolis SL

• Empresa biotecnológica creada hacediez años como una spin-off del CSIC

• De la búsqueda del producto a suvalidación, de la idea original a lacomercialización (“tailor-madebiotechnology”)

• Trabajamos con la excelencia científicacomo herramienta para comercializarproductos de alto valor añadido

• Nos dirigimos al sector de laalimentación humana y al químicofarmacéutico

• Somos expertos en la búsqueda,validación y producción de ingredientesfuncionales y en la revalorización deresiduos

Centro de I+D

• El Centro de I+D de Biopolis SL está situado en el Parc Cientific de la Universitat deValència; es un edificio con 1500 m2

• Está formado por once laboratorios y dos plantas de producción (una GMO y otra no-GMO), así como toda una serie de instalaciones anejas

• Todas las instalaciones han sido autorizadas por la Comisión Nacional de Bioseguridad

Las plataformas de trabajo

Bioquímica

Microbiología

Biología molecular

Cultivos celulares

Organismos modelo

Escalado

Fermentación

Metabolómica

Modelos murinos

Genómica

La principal fortaleza

• En el grupo Biopolis trabajan 43 personas (36 en Biopolis SL y 7 en LifesequencingSL)

• La mayoría son doctores (18) o licenciados (15); el resto son FP de grado superior(10)

• Nuestra plantilla incluye biólogos, biotecnólogos, farmacéuticos, informáticos,ingenieros agrónomos e ingenieros químicos, químicos, tecnólogos de alimentos,abogados y economistas

El proyecto SENIFOOD

Mejorar la calidad de vida de las personas mayores por medio de la alimentacióna través de la formulación de dietas equilibradas de acuerdo con carenciasnutricionales o patologías propias de las personas mayores o derivadas delenvejecimiento

Objetivos de Biopolis SL en SENIFOOD

Péptidos

InflamaciónProbióticos

Alzheimer

Ingredientes funcionales para la tercera edad

1. El proyecto SENIFOOD

2. A la búsqueda de péptidos bioactivos

3. ES1: un probiótico contra la inflamación

4. Conclusiones

La enfermedad de Alzheimer

Estrés oxidativoInflamación

Degeneración neuronalHaces neurofibrilares

Inhibición de PEPEfecto antioxidante in vivo

Efecto antiagregante in vivo

Escrutinio de residuos agroalimentarios

Z-gly-pro-ρNA ρNA

PEPOD410

± producto

Estrésoxidativo

(3mM H2O2)

5 horas5 días

- CCX

+ CCX

ViablesC. elegans

Wild-type N2

1

2

3Δt

El barquillo de cacao

Péptidos desde el barquillo de cacao

Hydrophobic Interaction chromatography (HIC)

HIDRÓLISIS PROTEÍCA

FRACCIONES HIC

FRACCIONES HIC POSITIVAS

Reverse Phase Chromatography (RPC)

FRACCIONES RPC

FRACCIONES RPC POSITIVAS

MALDI-TOF

“COCOA BARQUILLO”

IDENTIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS

Identificación del péptido

Theobroma cacao 21 kDa seed protein (221 aas)

FRACCIONES RPC POSITIVAS

IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF

SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)

mktatavvlllfaftsksyffgvanaanspvldtdgdelqtgvqyyvlssisgagggglalgratgqscpeivvqrrsdldngtpvifsnadskddvvrvstdvniefvpirdrlcststvwrldnydnsagkwwvttdgvkgepgpntlcswfkiekagvlgykfrfcpsvcdscttlcsdigrhsdddgqirlalsdnewawmfkkasktikqvvnakh

B. Muguerza, H. Monzó, N. Alepuz, E. Bataller, S. Genovés, M. Enrique, P. Martorell, D. Ramón. (2010). Obtainment of cocoa extracts rich inbioactive peptides with inhibiting activity of ACE and PEP enzymes. EP2322041A1

E. Bataller, S. Genovés, P. Martorell, D. Ramón, A. Ibañez, S. Llopis, N. González, H. Monzó, B. Muguerza. (2011). Obtainment of bioactive productsfrom cocoa having inhibitory activity against the PEP enzyme and antioxidant and/or anti-neurodegenerative activity. WO2011/076954A1

Resultados

0

10

20

30

40

50

60

70

80

NGM NGM+vitamin C 9L 11R 13L 13R%

Wo

rm S

urv

iva

l (C

. e

leg

an

s N

2)

Antioxidant Activity

24 41 43 45 47 49 51 530

25

50

75

100

125

NGM

ZPP

9L

11R

13L

13R

not induced

Time (h)

Per

cen

tag

e N

ot

para

lyze

d • Paralysisassay

IC50 PEP 13-mer(0.19 mg/ml)

[13-mer] mg/ml

0,0001 0,001 0,01 0,1 1

% In

hibi

tion

-20

0

20

40

60

80

100

• El valor IC50 más bajo para la inhibición de PEP lo dió el péptido 13L-mer (0.19 mg/mL)

• Este péptido presentó la mayor actividad antioxidante in vivo

• También fue el más eficaz en la reducción de la parálisis

• Curiosamente, el péptido 13L-mer inhibe in vitro la enzima humana PLA2

• Hemos detectado trazas de este péptido en chocolates comerciales

Actividad antioxidante ParálisisInhibición PEP

Transcriptómica

PÉPTIDO 13L-mer

RegulaciónMetabolismo del

piruvato

RegulaciónProteasoma

RegulaciónMetabolismo del

triptófano

Acetil coA Turnover de proteínas Serotonina

Función sináptica Reducción delagregado amiloide

LocomociónApetito

REDUCCIÓN DE LATOXICIDAD DE Aβ

Inhibición de la agregación de Aβ

25

112

30

61

13

Tubulina

Placebo 13L

Rat

io d

e ag

rega

ció

n

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Martorell P, Bataller E, Llopis S, González N, Álvarez B, Montón F, Ortíz P, Ramón D, Genovés S. A cocoa peptide protects Caenorhabditis elegansfrom oxidative stress and β-amyloid peptide toxicity. PLOS ONE 8: e63283

Ingredientes funcionales para la tercera edad

1. El proyecto SENIFOOD

2. A la búsqueda de péptidos bioactivos

3. ES1: un probiótico contra la inflamación

4. Conclusiones

Origen de la cepa

• La cepa ES1 fué aislada por el grupo de la Dra.Yolanda Sanz en el Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos del Consejo Superior deInvestigaciones Científicas en Valencia

• Se aisló a partir de las heces de un niño sano, menorde tres meses y sometido a lactancia materna

• Mediante taxonomía molecular (secuenciación de laregión del gen que codifica el rRNA 16S) se haclasificado como un miembro de la especieBifidobacterium longum

• Dicha especie está incluida en los listados GRAS yQPS de la Food and Drug Administration y laEuropean Food Safety Agency, respectivamente

• La cepa está protegida por una patente y depositadaen la Colección Española de Cultivos Tipo bajo elcódigo CECT 7347; esta patente fue licenciada enexclusiva a Biopolis SL y está transferida a variospaíses

Respuesta anti-inflamatoria en células PBMC

• Se ha realizado un estudio con heces coincubadascon la cepa ES1 y se diseñaron controles negativossin la cepa; las muestras se usaron posteriormentepara estimular células mononucleares de sangreperiférica (PBMC) provenientes de individuosadultos sano

• Las heces de los individuos con inflamación dieronlugar a un incremento de la producción de TNFα yla expresión de CD86 y a una disminución de laproducción de IL-10 y la expresión de CD4

• Las heces coincubadas con la cepa ES1 suprimieronesta respuesta pro-inflamatoria e incrementaron laproducción de IL-10

• Se hicieron experimentos similares concélulas Caco-2

• Se midieron los niveles de transcripciónde los genes que codifican el receptorCXCR3, NFκβ y TNFα

• Por ELISA se analizaron los niveles de lasproteínas correspondientes y de IL-1β yp50

• Los cultivos celulares coincubados conla cepa ES1 tenían reducidos los nivelesde transcripción y, consecuentemente,las concentraciones celulares de IL-1β,NFκβ , p50 y TNFα

Respuesta anti-inflamatoria en células Caco-2

Respuesta anti-inflamatoria en células dendríticas

• Se investigó la interacción de la cepa ES1 concélulas dendríticas derivadas de monocitos(CDDM), en combinación con gliadinas ycélulas Caco-2

• Al contrario que algunas cepaspatógenas(Escherichia coli o Shigella CBD8),la cepa ES1 indujo mínimos cambiosmorfológicos en las células CDDM y activómenos la adhesión, la propagación y laproducción de citoquinas inflamatorias

• Además, promovió una menor inducción dela expresión de CD86 y CD40 y unareducción en la producción inducida porgliadinas de IFN-γ, y dio lugar a unincremento en la secreción de IL-10

Estudio preclínico de efectividad en ratas

B. longum ES1

Placebo

• Se usó un modelo de enteropatíainducida por gliadinas utilizando ratasrecién nacidas sensibilizadas con IFN-γque fueron alimentadas con la cepa ES1frente a un grupo control alimentadascon placebo

• Las ratas alimentadas con la cepa ES1tenían importantes cambios en lamorfología del epitelio intestinal

• En concreto, era posible detectar en lasratas de este grupo una restauración dela altura de los enterocitos, una de lascaracterísticas negativas de laenfermedad celiaca

Respuesta anti-inflamatoria en animales

• Además, en los dos grupos se analizó la producción de componentesdel sistema inmunitario y se estudió la microbiota de las heces

• Los yeyunos de las ratas alimentadas con la cepa ES1 contenían menosTNF-α y más IL-10

Estudios de seguridad alimentaria in vitro

• Se evaluó la seguridad alimentaria del probiótico ES1 siguiendo lasrecomendaciones de FAO y OMS

• Se analizó la producción de metabolitos no deseados (aminas biogenas, ratioD-láctico/L-láctico y sales biliares desconjugadas,) no detectándose valoresproblemáticos

• Se determinaron los break-points de una veintena de antibióticos de usoclínico y no se detectó resistencia significativa a alguno de ellos

Estudios de seguridad alimentaria in vivo

• En colaboración con el Instituto Pasteur deMontevideo, se llevó a cabo un estudio deingesta aguda de la cepa ES1 (109 ufc/día)en ratones BALB/c sanos o sometidos ainmunodepresión por tratamiento conciclofosfamida

• No se detectó mortalidad ni patologíasasociadas a la ingesta de la cepa

• Tampoco se observó translocación de lacepa, pudiéndose concluir la seguridadalimentaria de la misma

Secuenciación del genoma de la cepa

• Se ha secuenciado el genoma de la cepa ES1utilizando técnicas de pirosecuenciacióngenómica masiva

• El genoma de la cepa ES1 tieneaproximadamente 2.5 Mb

• En total se dispone de casi 75 Mb deinformación (aproximadamente 30X desecuencia del genoma)

• No se detectan genes de virulencia ofactores de patogenicidad

• No hay genes funcionales de resistencia aantibióticos

Escalado de producción

• Se ha escalado la fermentación de la cepa ES1, desde el laboratorio a la planta piloto ydesde la planta piloto a la planta de producción

• El proceso de fermentación ya está optimizado

• También se ha escalado y optimizado el proceso de secado por liofilización

Ensayo clínico fase I

• Se llevó a cabo con 12 voluntarios humanos(edad media 30.3 años, rango de 23 a 40años); fue un ensayo doble ciego, aletaorio ycon control de placebo

• Los voluntarios ingirieron la cepa ES1 o elplacebo durante dos semanas (109 ufc/día),posteriormente se realizó un período delavado de 2 semanas y luego se siguió laingesta cruzada durante otras 3 semanas

• La ingesta de la cepa ES1 no produjo efectosadversos

• La microbiota de las heces de los individuoscontrol frente a los que habían ingerido lacepa ES1 no presentó diferenciassignificativas, si bien el 70-80% de las cepasde bifidobacterias en los individuosproblema eran la cepa ES1

Ensayo clínico fase II (I)

• Se llevó a cabo un ensayo doble ciego,aletaorio y con control de placebo sobre 40niños celiacos voluntarios de edadescomprendidas entre los 2 y los 14 años(Hospital Universitari Sant Joan de Reus yHospital Sant Joan de Déu de Barcelona)

• Uno de los grupos recibió la cepa ES1durante 3 meses en una dosis diaria de 109

ufc y el otro recibió un placebo

• Al analizar sangre periférica se detectó unadisminución de la concentración de TNF-α yde linfocitos CD3+

• Finalmente, los individuos del grupo quehabía ingerido el probiótico presentaron unamayor talla y peso (si bien en este últimocaso la diferencia no fue estadísticamentesignificativa)

Ensayo clínico fase II (II)

• El estudio de la microbiota de los dos grupos reveló datos muy interesantes

• Se detectó una disminución estadísticamente significativa de Bacteroides yClostridium en el grupo que recibió el probiótico ES1 frente al grupo querecibe el placebo

• El grupo que recibió la cepa ES1 presentó mayores recuentos debifidobacterias, aunque los datos no fueron estadísticamente significativos

Dossier científico

• Izquierdo E, Medina M, Ennahar S, Marchioni E, Sanz . (2008). Resistance to simulated gastrointestinalcondtions and adhesions to mucus as probiotic criteria for Bifidobacterium longum strains. CurrentMicrobiology 56: 613-618

• Medina M, de Palma G, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. (2008). Bifidobacterium strains suppress in vitro

the pro-inflammatory milieu triggered by the large intestinal microbiota of coeliac patients. Journal ofInflammation 3: 5-19

• Laparra JM, Sanz Y. (2010). Bifidobacteria inhibit the inflammatory response induced by gliadins in intestinalepithelial cells via modifications of toxic peptide generation during digestion. Journal of Cell Biochemistry 109:801-807

• Olivares M, Laparra M, Sanz Y. (2011). Influence of Bifidobacterium longum CECT 7347 and gliadin peptides onintestinal epithelial cell proteome. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 7666-7671

• Laparra JM, Olivares M, Gallina O, Sanz Y. (2012). Bifidobacterium longum CECT7347 modulates immuneresponses in a gliadin-induced enteropathy animal model. PLoS ONE 7: e30744

• de Palma G, Kamanova J, Cinova J, Olivares M, Drasarova H, Tuckova L, Sanz Y. (2012). Modulation ofphenotypic and functional maturation of dendritic cells by intestinal bacteria and gliadin: relevance for celiacdisease. Journal of Leukocyte Biology 92: 1043-1054

• Olivares M, Laparra M, Sanz Y. (2012). Oral administration of Bifidobacterium longum CECT 7347 modulatesjejunal proteome in an in vivo gliadin-induced enteropathy animal model. Journal of Proteomics 77: 310-320

• Chenoll E, Codoñer FM, Silva A. Ibañez, Martínez-Blanch JF, Bollati-Fogolin M, Sanz Y, Ramón D, Genovés S.(2013). Genomic sequence and pre-clinical safety assessment of Bifidobacterium longum CECT7347, a probioticable to reduce the toxicity and inflammatory potential of gliadin-derived peptides. Journal of Probiotics andHealth 1: 106 doi:10.4172/jph.1000106

• Laparra JM, Olivares M, Sanz Y. (2013). Oral administration of Bifidobacterium longum CECT 7347 amelioratesgliadin-induced alterations in liver iron mobilization. British Journal of Nutrition 110: 1828-1836

• Olivares M, Castillejo G, Varea V, Sanz Y. (2013). Double-blind, randomized, placebo-controlled intervention trialto evaluate the effects of Bifidobacterium longum CECT 7347 on children with newly diagnosed celiac disease.Aceptado en British Journal of Nutrition

El producto Proceliac

Ingredientes funcionales para la tercera edad

1. El proyecto SENIFOOD

2. A la búsqueda de péptidos bioactivos

3. ES1: un probiótico contra la inflamación

4. Conclusiones

Biología de sistemas: clave de futuro

• Nuestra experiencia de I+D con clientesnos ha enseñado que un abordajegenómico/metabolómico es clave paraentender el fondo real de los problemasindustriales

• Estamos empezando a entender labiología de sistemas a través de nuestrosproyectos internos de I+D

• No nos creemos el binomio ciencia básicaversus ciencia aplicada

• Nos gusta el modelo de interacción con lopúblico que siguen algunos de nuestrosclientes en Holanda, Suiza y paísesnórdicos

El ejemplo de los líderes

Daniel Ramón Vidal (daniel.ramon@biopolis.es)

http://www.linkedin.com/profile/view?id=64921252&trk=tab_pro

Biopolis SL

Parc Cientific Universitat de València

C/ Catedrático Agustín Escardino Benlloch 9; Edificio B; 469809-Paterna; Valencia