departamento de química física y analítica · colaboración: grupo de Óptica integrada y...

Departamento de QuDepartamento de Quíímica Fmica Fíísica y Analsica y Analííticatica

GRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISIS

Prof. AgustProf. Agustíín Costa Garcn Costa Garcííaa

RED BIOSENSORESRED BIOSENSORES

MadMadridrid

13 de febrero de 200713 de febrero de 2007

UNIVERSIDAD DE OVIEDO

GRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISISde la Universidad de Oviedode la Universidad de Oviedo


Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

MicrochipsMicrochipsde electroforesis capilarde electroforesis capilarElectrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados

OroOro

CarbonoCarbono

10 10 mmmm

34 34 mmmm

Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis Capilar

SustratoSustrato vidriovidrio

DeposiciDeposicióónnfotoresinafotoresina

InsolaciInsolacióónn UVUV

EliminaciEliminacióónnresinaresina

GrabadoGrabado hhúúmedomedoHF:NHHF:NH44F 1:6F 1:6

ReveladoRevelado

SelladoSellado canalescanales650 650 –– 675 675 ººC, 5hC, 5h

Microscopia de Barrido Electrónico (SEM)Microscopia Confocal

A: Disolución reguladora

D: Desecho

C: Muestra

B: Detección

ColaboraciColaboracióón: n: Grupo de Grupo de ÓÓptica Integrada y ptica Integrada y OptoelectrOptoelectróónicanicaDpto. de FDpto. de Fíísica, Universidad de Oviedosica, Universidad de Oviedo

Canal separación



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis CapilarDiseDiseñño de detectores o de detectores amperomamperoméétricostricos



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Conexióneléctrica

Lámina Au10 nm Ti / 100 nm Au

10 μm0,4 mm

Diseño I: Detector “in-channel”

Diseño II: Detector “end-channel”con hilos metalicos

Hilo Au (100 o 250 μm Ø) o Pt (300 μm Ø)

Diseño IV: Detector “end-channel”con películas

Diseño III: Detector “dual”

10 μm0,4 mm

Hilo Au (250 μm Ø)

Lámina Au(100 nm)

SPE o Lámina Au

Conexióneléctrica

Lámina Au10 nm Ti / 100 nm Au

10 μm0,4 mm

Diseño I: Detector “in-channel”

Diseño II: Detector “end-channel”con hilos metalicos

Hilo Au (100 o 250 μm Ø) o Pt (300 μm Ø)

Diseño IV: Detector “end-channel”con películas

Diseño III: Detector “dual”

10 μm0,4 mm

Hilo Au (250 μm Ø)

Lámina Au(100 nm)

SPE o Lámina Au

SeparacionesSeparaciones enen microchipmicrochips de electroforesis capilars de electroforesis capilar

Microchip de Topas (comercial) con detector “end-channel” de hilo de Au

Microchip de Su-8 (Ikerlan) con electrodos integrados de Pt

12

13

14

15

16

17

18

19

50 75 100 125 150 175 200 225 250

tiempo (s)

Inte

nsidad

(nA

)

DA EPDopamina (DA) + Epinefrina (EP)

Viny = +250 V, tiny = 5 s,

Vsep = +750 V, Ed = +1.2 V,

Buffer: 25 mM MES-His pH = 5.7

p-aminofenol (pAP) + Acido Ascórbico (AA)

Viny = +2000 V, tiny = 5 s,

Vsep = +2000 V, Ed = +0.8 V,

Buffer: 50 mM Tris-Gly pH = 9.0

32

34

36

38

40

42

44

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

tiempo (s)

Inte

nsidad

(nA

)

pAP AA

Microchip de Topas (comercial) con detector “end-channel” de hilo de Au

Microchip de Su-8 (Ikerlan) con electrodos integrados de Pt

12

13

14

15

16

17

18

19

50 75 100 125 150 175 200 225 250

tiempo (s)

Inte

nsidad

(nA

)

DA EPDopamina (DA) + Epinefrina (EP)

Viny = +250 V, tiny = 5 s,

Vsep = +750 V, Ed = +1.2 V,

Buffer: 25 mM MES-His pH = 5.7

p-aminofenol (pAP) + Acido Ascórbico (AA)

Viny = +2000 V, tiny = 5 s,

Vsep = +2000 V, Ed = +0.8 V,

Buffer: 50 mM Tris-Gly pH = 9.0

32

34

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40

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10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

tiempo (s)

Inte

nsidad

(nA

)

pAP AA

Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis Capilar



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

time (s)

Curr

ent

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

time (s)

Curr

ent

• Reacción de Marcado (off-chip)

Hebra sencilla DNA (ssDNA)

Intercaladorelectroactivo

(Azul de metileno, MB)Temperaturaambiente

Inyección

Mezcla

• Análisis en Microchip

ssDNA-MB MB

DetecciónAmperométrica

200 pA

MB 100 μM + ssDNA 10 ng/μL

MB 100 μM

MB ssDNA-MBDetector end-channelde hilo de Au (100 μm Ø)

Buffer: TBE (50 mM Tris-Bórico pH = 7.0

1 mM EDTA)

Viny= +1500 V, tiny= 5 s

Vsep= +2000 V, Ed= -0.3 V

Separación

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

time (s)

Curr

ent

15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

time (s)

Curr

ent

• Reacción de Marcado (off-chip)



(Azul de metileno, MB)



(Azul de metileno, MB)Temperaturaambiente

Inyección

Mezcla

• Análisis en Microchip

ssDNA-MB MB

DetecciónAmperométrica

200 pA

MB 100 μM + ssDNA 10 ng/μL

MB 100 μM

MB ssDNA-MBDetector end-channelde hilo de Au (100 μm Ø)

Buffer: TBE (50 mM Tris-Bórico pH = 7.0

1 mM EDTA)

Viny= +1500 V, tiny= 5 s

Vsep= +2000 V, Ed= -0.3 V

Separación

Microchips de Electroforesis CapilarMicrochips de Electroforesis CapilarAnAnáálisis de ADNlisis de ADN



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

ParParáámetros optimizadosmetros optimizados

- [AuCl4-]

- E constante / I constante- Tiempo

Oro coloidal

Sequedad

- Tamaño de partícula- Densidad de partículas

Electrodeposiciónde oro

AuCl4-

AplicaciAplicacióónn

Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

NanopartNanopartíículasculas de orode oro

NanoestructuraciNanoestructuracióónn de la superficie de la superficie electrelectróódicadica

5 μm 1 μm

Electrodo Serigrafiado de Carbono

(SPCE)

SPCE-Nanotubos de carbono

5 μm 1 μm

NanoestructuraciNanoestructuracióónn de la superficie de la superficie electrelectróódicadicaElectrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiados



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

NanotubosNanotubos de carbonode carbono



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Superficie electródica

1. Estreptavidina

2. Albúmina

12 h, 4ºC

Estable a 4ºCdurante 12 meses

Anticuerpo BiotiniladoINMUNOSENSOR

Estable a 4ºC durante12 meses

Oligonucleótido BiotiniladoGENOSENSOR

Estable a 4ºCdurante 6 meses

0.1 M H2SO425 μA, 2 min

Activación

Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiadosInmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores

Electrodo serigrafiado Electrodo serigrafiado modificado con modificado con estreptavidinaestreptavidina(bloqueado con (bloqueado con albalbúúmina)mina)

NeumolisinaNeumolisina

Anticuerpo Anticuerpo policlonalpoliclonal de de conejo conejo αα--neumolisinaneumolisina

Anticuerpo monoclonal de ratAnticuerpo monoclonal de ratóón n αα--neumolisinaneumolisina biotiniladobiotinilado

33--IPIP

IndigoIndigoAPAPAPAP

Anticuerpo de cabraAnticuerpo de cabra αα--IgGIgG de de conejo, conejo, marcado con APmarcado con AP




Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensoresInmunosensorInmunosensor para para neumolisinaneumolisina

Detección cronoamperométrica

directa

-Pt-FITC

-Pt-FITC

DNADNA(marcado con (marcado con FITCFITC a a

travtravéés des de PtPt))

APAP

Anticuerpo Anticuerpo antianti--FITC FITC marcado marcado concon APAP

33--IPIP

IndigoIndigo

APAP-Pt-FITC

Detección voltamperométrica

enzimática

Capaz de detectar 1.5 Capaz de detectar 1.5 fmolfmol de de oligonucleoligonucleóótidotido ((StreptococcusStreptococcus

pneumoniaepneumoniae: : plyply, , lytAlytA))DetecciDeteccióón de una mutacin de una mutacióónn

Capaz de detectar 250 Capaz de detectar 250 fmolfmol(1 mutaci(1 mutacióón), pero el n), pero el

tiempo de antiempo de anáálisis es menorlisis es menor

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3

E / V

i / μA

Voltammetry

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3

E / V

i / μA

Voltammetry

FosfatasaFosfatasaAlcalinaAlcalina33--IPIP Azul de Azul de

ÍÍndigondigoÍÍndigo ndigo

CarmCarmíínn

-1200-1000

-800-600-400

-2000

0 50 100 150 200 250 300 350

t / s

i / μ

A

Chronoamperometry

-1200-1000

-800-600-400

-2000

0 50 100 150 200 250 300 350

t / s

i / μ

A

Chronoamperometry

Pt(IIPt(II) + 2 e) + 2 e-- PtPt

2 H2 H++ HH22

E = E = --1.4 V1.4 V




Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensoresGenosensorGenosensor para para StrpStrp. . pnpn..

Detección cronoamperométrica

directa

-Pt-FITC

-Pt-FITC

DNADNA(marcado con (marcado con FITCFITC a a

travtravéés des de PtPt))

APAP

Anticuerpo Anticuerpo antianti--FITC FITC marcado marcado concon APAP

APAP-Pt-FITC

Capaz de detectar 0.2 Capaz de detectar 0.2 fmolfmol de de oligonucleoligonucleóótidotido

((StreptococcusStreptococcus pneumoniaepneumoniae: : lytAlytA))

Capaz de detectar 250 Capaz de detectar 250 fmolfmol(1 mutaci(1 mutacióón), pero el n), pero el

tiempo de antiempo de anáálisis es menorlisis es menor




Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Inmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores

-100

102030405060708090

100

-0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

E / V

i / μ

A

Redisolución de plata

FosfatasaFosfatasaAlcalinaAlcalina33--IPIP

++AgAg++

Azul de Azul de ÍÍndigondigo++

AgAg00

33--IPIP + Ag+ Ag++

Indigo + Indigo + AgAg00

GenosensorGenosensor para para StrpStrp. . pnpn..

-1200-1000

-800-600-400

-2000

0 50 100 150 200 250 300 350

t / s

i / μ

A

Chronoamperometry

-1200-1000

-800-600-400

-2000

0 50 100 150 200 250 300 350

t / s

i / μ

A

Chronoamperometry

Pt(IIPt(II) + 2 e) + 2 e-- PtPt

2 H2 H++ HH22

E = E = --1.4 V1.4 V



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Electrodos serigrafiadosElectrodos serigrafiadosInmuno y Inmuno y genosensoresgenosensores

APAP33--IPIP

II

HSHS HSHSHS HS

APAP

HSHSHSHSHSHS

HSHSHS HSHSHS HSHSHSHSHSHS

HS

HSHS HSHS

APAP

HSHS HSHSHS HSHSHSHSHSHSHS

HSHSHSHS

OligoOligo--33’’CC33SHSH

11--hexanotiolhexanotiol

OligoOligo biotiniladobiotinilado

EstreptavidinaEstreptavidina--APAP

GenosensorGenosensor sobre superficie de orosobre superficie de oro



Madrid, 13 / 02 / 2007Madrid, 13 / 02 / 2007

Oportunidades de colaboraciOportunidades de colaboracióón n ……

Acoplamiento de Acoplamiento de deteccideteccióón electroqun electroquíímicamica a a microchipsmicrochips de electroforesis capilarde electroforesis capilar

FabricaciFabricacióónn en vidrio de en vidrio de microchipsmicrochips de electroforesis capilarde electroforesis capilar

Desarrollo de Desarrollo de inmunoinmuno-- y y genosensoresgenosensores sobre sobre electrodos serigrafiadoselectrodos serigrafiados micromicro-- o o nanoestructuradosnanoestructurados

Universidad de OviedoUniversidad de OviedoGRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISIS


Facultad de QuFacultad de QuíímicamicaDptDpt. . QQªª FFíísica y Analsica y AnalííticaticaC/ JuliC/ Juliáán Clavern Claveríía, 8a, 833006 Oviedo33006 OviedoAsturiasAsturias

TelTel.: 985 103 488.: 985 103 488FAX: 985 103 125FAX: 985 103 [email protected]@fq.uniovi.es

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GRUPO DE INMUNOELECTROANGRUPO DE INMUNOELECTROANÁÁLISISLISIS



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