departamento de ingeniería civil y ambiental facultad de

OTERO-LEÓN,N. [2012] IAMB 201210 22

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DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS

MICROBIANAS RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS EN MUESTRAS DE AGUA

DEL RIO BOGOTÁ

Natalia Otero León, Johana Husserl Orjuela, PhD.

Presentado para el titulo de Ingeniera Ambiental

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental

Facultad de Ingeniería

Universidad de los Andes, Bogotá, 2012

RESUMEN

La contaminación en el Río Bogotá puede generar que los microorganismos originen

procesos adaptativos que se expresan como mecanismos de resistencia. Uno de los

problemas en la salud pública es que los genes de resistencia sean transferidos de bacterias

ambientales a patógenos de humanos. Dado que en Colombia no hay investigaciones

similares, se presenta este estudio tomando muestras en tres diferentes puntos del Rio

Bogotá en zona rural. Se utilizó la metodología de difusión por discos de Kirby-Bauer. A las

23 colonias aisladas se les determinó la resistencia a los antibióticos ampicilina, tetraciclina,

cloranfenicol y kanamicina. El 73,9% de las bacterias aisladas presentaron resistencia al

menos a un antibiótico. Del total de las cepas, 6 mostraron multirresistencia a dos y tres

antibióticos. Se logró realizar la identificación de dos cepas seleccionadas dando como

resultado Escherichia coli. Con esta investigación de espera el inicio de la estandarización

de este método en el contexto del país, ya que a nivel nacional no hay una guía o manual de

esta metodología por parte del ente regulador.

INTRODUCCION

La resistencia a los antimicrobianos es un problema para la salud pública a nivel mundial,

sin embargo es de mayor preocupación para los países en vías de desarrollo, ya que en estos

hay menos opciones económicas y apropiadas de tratamiento. Es cada vez más importante

monitorear los patrones de resistencia ya que este ha aumentado en los agentes patógenos

bacterianos que generan enfermedades respiratorias, febriles, diarreicas y del tracto

reproductivo (Organización Mundial de la Salud, 2003). Este fenómeno tiene implicaciones

sociales y económicas, generadas por el incremento de morbilidad y mortalidad, lo cual


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aumenta los costos de los tratamientos y de las largas estancias hospitalarias (Sussmann,

Mattos, & Restrepo, 2002).

La resistencia bacteriana se caracteriza por la capacidad de los microorganismos de resistir y

sobrevivir a los efectos de los antibióticos. Existen dos tipos de resistencia, la adquirida y la

natural. La resistencia adquirida aparece por cambios en el ADN como las mutaciones o por

transferencia de genes, sistemas de conjugación, transducción y transformación, y por

adquisición de plásmidos, trasposones e integrones (Ordóñez Smith, 2003). Se presenta

resistencia natural a los mecanismos permanentes determinados genéticamente, no

correlacionables con el incremento de dosis del antibiótico. Los diagnósticos incorrectos,

prescripciones innecesarias y el uso generalizado del tratamiento, generan una presión

evolutiva en los microorganismos (Sussmann, Mattos, & Restrepo, 2002).

Desde la perspectiva molecular y bioquímica se han identificado tres diferentes mecanismos

utilizados por las bacterias para generar resistencia a los antibióticos, los cuales son, la

destrucción o inactivación enzimática del antibiótico, cambios en la permeabilidad de la

membrana interna y alteraciones de los precursores de la pared celular, de la membrana y de

los ribosomas. Es importante destacar que los tres mecanismos pueden ocurrir de manera

simultánea (Ordóñez Smith, 2003).

La destrucción o inactivación del antibiótico se realiza por medio de la producción de

enzimas bacterianas que lo hidrolizan. También se puede inactivar el antibiótico por medio

de la transformación enzimática del mismo. Por ejemplo esta la modificación del

cloranfenicol la cual la realiza una enzima intracelular, cloranfenicol acetil transferasa

(CAT), que existe en Gram positivos y en Gram negativos. Esta enzima previene la unión

del cloranfenicol al ribosoma 50S (Sussmann, Mattos, & Restrepo, 2002).

Los cambios en las barreras de permeabilidad que generan resistencia son: la modificación

energética en la permeabilidad de la membrana interna, lo cual dificulta transportar el

antibiótico hacia el interior de la célula y mutación en las Porinas (canales de difusión que se

encuentran en la membrana externa de la bacteria) que genera la disminución del paso del

antibiótico (Sussmann, Mattos, & Restrepo, 2002).

La alternación del sitio blanco es el tercer mecanismo de resistencia, en el cual se modifican

algunos sitios específicos de la anatomía celular, como la pared celular, la subunidad 50s y

30s ribosomal (Sussmann, Mattos, & Restrepo, 2002).

En los humanos existen diferentes causas que podrían generar resistencia a los antibióticos,

como lo es la automedicación y el uso de tratamientos no requeridos. Actualmente se

presenta la problemática de la transferencia de la resistencia por medio de la comida, como

en el caso del uso de de los antibióticos como aditivos promotores de crecimiento en pollos


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de engorde. Dado el uso subterapéutico de los antibióticos, con frecuencia se ha dudado que

estas concentraciones bajas puedan generar resistencia transferible. Sin embargo, mediante

estudios realizados en Inglaterra, se demostró que la alimentación de pollos con

oxitetraciclina, generó en estos resistencia del la bacteria E. coli a la tetraciclina, y que había

transferencia de las cepas de E.coli resistentes al personal de la granja (Witte, 1999).

Para la determinación de la susceptibilidad de la bacteria a un antibiótico, se plantea el uso

de la metodología de discos de difusión. Su escogencia se debe a la facilidad en su uso, su

efectividad y su bajo costo.

Hace aproximadamente tres decenios los microbiólogos emplean discos de papel para

determinar si un cultivo es susceptible o no a un antibiótico. Uno de los aportes de mayor

importancia fue de los científicos Bauer, Kirby, Sherris y Turck de la Universidad de

Washington, Seattle. Estos autores diseñaron una técnica de disco único que se interpreta en

forma cuantitativa. Ellos utilizaron diferentes variables del método, como el medio de

cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966 publicaran su estudio describiendo la

prueba que se utiliza en la actualidad (Thornsberry, 1976).

El concepto básico del método de Kirby-Bauer es que existe correlación ente el tamaño de la

zona de inhibición y la susceptibilidad clínica del microorganismo. Basados en esta

hipótesis, se genero un procedimiento para establecer un conjunto de diámetros con fines

interpretativos (Thornsberry, 1976).

En esta prueba se manejan muchos factores los cuales pueden afectar el resultado, como lo

es el uso de un agar distinto al Mueller- Hinton, el pH del medio de cultivo que puede variar

las interpretaciones de los tamaños de las zonas de resistentes a sensibles y la temperatura de

incubación, como lo es el caso de S. aureus el cual presenta resistencia a cefalotina a 35°C,

pero no se le ve nunca a 37°C (Thornsberry, 1976).

Las limitaciones de éste método se basan en que solo sirve para bacterias de desarrollo

rápido y no sirven para microorganismos que se aíslan raras veces. Los resultados de la

prueba de Kirby – Bauer no son valederos si los cultivos no son puros (Thornsberry, 1976).

El Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI), anteriormente conocido como

El Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS), adoptó los pasos

básicos del procedimiento descrito por Bauer y sus compañeros como el método de

referencia para difusión por disco. Esta organización se encarga de desarrollar y

promocionar el uso de las metodologías estandarizadas por ellos mismos, relacionadas con

las pruebas de susceptibilidad, su uso apropiado y la interpretación de los resultados (Coyle,

2002).


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El CLSI estandarizó el método de susceptibilidad antimicrobiana a nivel internacional por

medio de la Organización Mundial para la Salud. La prueba de difusión por discos fue

estandarizada para el uso en países escandinavos por Ericsson y para el uso en Estados

Unidos por Bauer et al, conservando las variables de control importantes como la densidad

del inoculo, el agar, las condiciones de incubación, etc. Hasta 1975 fue aprobado el

documento M2 del CLSI el cual describe cómo se realiza la prueba de difusión por disco y

el documento M100 contiene las tablas para interpretar los resultados de esta prueba, estos

documentos presentan revisiones anuales (Barry, 2007).

La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para el test de difusión es

importante. Las consideraciones para su escogencia son eficacia clínica, prevalencia de

resistencia, costo, entre otros. Los antimicrobianos se dividen en betalactámicos,

aminoglucósidos, macrólidos, sulfonamidas y trimetoprima, glicopéptidos, tetraciclinas,

quinolonas, cloranfenicol, rifampicina y clindamicina (Ordóñez Smith, 2003) .

Los agentes antimicrobianos se dividen en el efecto que generan en las bacterias, siendo

bacteriostáticos o bactericidas. Los agentes bacteriostáticos inhiben el crecimiento y

multiplicación de las bacterias, pero, si el agente es retirado, las células vuelven a

multiplicarse. En cambio, los agentes bactericidas inhiben el crecimiento de las células y

además desencadenan mecanismos dentro de la célula que conllevan a la muerte celular, por

lo tanto su efecto es irreversible (Coyle, 2002).

En la Tabla 1 se presenta la información generalizada de los antibióticos utilizados en esta

investigación.

Tabla 1. Información de los antibióticos utilizados

Antibiótico Características Usos

Ampicilina

Pertenece al grupo de penicilinas

(Betalactámicos).

Agente bactericida.

Su uso inició desde el año 1961 como la

primera penicilina semisintética.

(J, Mª, Ret, & Doyma, 2008)

Trata la neumónica, bronquitis,

infecciones del oído, pulmón, piel y vías

urinarias.

(J, Mª, Ret, & Doyma, 2008)

Tetraciclina

Antibiótico de amplio espectro.

Agente bacteriostático.

Es uno de los antibacterianos más

experimentados y su uso inició en el año 1953,

fue tanto el auge que para 1955 ya se hablaban

de cepas resistentes

(Robert, 1956).

Trata la neumonía, paludismo, cólera e

infecciones en las vías respiratorias; el

acné; infecciones en la piel, los genitales

y el sistema urinario; y la infección que

causa úlceras estomacales (Helicobacter

pylori)

(Biblioteca Nacional de Medicina de

EE.UU., 2010).


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Cloranfenicol

Antibiótico de amplio espectro.

Agente bacteriostático, excepto para

Haemophilus influenzae, para el que es

bactericida.

Fue aislada en 1947 de Streptomyces

venezuelae.

Debido a su potencial toxicológico, su uso se

limita a infecciones graves.

Puede ocasionar depresión de la médula ósea

que conlleva a la anemia plástica. También

tiene efectos adversos en el SNC,

dermis,gastrointestinales y puede producir el

“síndrome del niño gris”

(Sanchez & Javeriana).

Trata la fiebre tifoidea y otros tipos de

salmonelosis sistémicas.

También se usa para el tratamiento

empírico de meningitis.

Es utilizado conjunto con la penicilina

para el tratamiento de abscesos cerebrales.

Otras aplicaciones son infecciones mixtas

(aerobios-Anaerobios), Gangrena gaseosa

y conjuntivitis bacteriana.

(Sanchez & Javeriana).

Kanamicina

Pertenece al grupo de los

aminoplucósidos.

Es de amplio espectro.

Agente bactericida.

Fue descubierta en 1955 en el Instituto

Nacional de Higiene de Japón.

Se pueden presentar efectos adversos, no tan

frecuentes, en el bloqueo de la placa

neuromuscular y efectos ototóxicos y

neurotóxicos.

(Rodríguez Alvaréz, 2002)

Tratamiento de infecciones urinarias altas

complicadas, infecciones serias

respiratorias, de piel, tejido blando y

posquirúrgicas, meningitis tuberculosa,

tuberculosis multiresistente e infecciones

estafilocócicas.

(Maguiña Vargas, Ugarte, & Montiel,

2006)

A nivel internacional, existen investigaciones de resistencia bacteriana en ecosistemas

acuáticos, como lo son ríos, océanos, aguas residuales y aguas para el consumo humano. Las

causas del aumento de antimicrobianos en el medio ambiente se deben al uso médico, la

agricultura y la ganadería, lo cual genera una presión selectiva en poblaciones bacterianas

(Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007).

Estudios realizados en Turquía, utilizando la metodología del CLSI, en agua potable luego

de un tratamiento básico y proveniente de ríos, muestra la presencia de resistencia de E.coli a

antibióticos de interés para esta investigación, como lo son la ampicilina, tetraciclina y

cloranfenicol. El río descrito es similar al Rio Bogotá en los puntos de muestreo, ya que

pertenece a zonas rurales subdesarrolladas y agrícolas, y con aguas residuales de

asentamientos locales (Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007). Otra investigación realizada

en Venezuela también utilizó la metodología del CLSI. Se tomaron muestras de aguas

residuales de la PTAR que recibe aguas del sector industrial, en la cual se encontró

resistencia de E.coli a ampicilina y tetraciclina (Martínez & Villalobos, 2008).


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A diferencia de esta investigación, los estudios presentados realizan el aislamiento selectivo

para la bacteria E.coli. Pero, un estudio realizado en Cuba, el cual también utiliza la

metodología planteada, se tuvieron en cuenta 23 aislados obtenidos para ser identificados y

expuestos a la prueba de resistencia. Las colonias fueron obtenidas de muestras de agua y

sedimento del río Almendares, el cual es receptor de aguas residuales no tratadas o con

tratamiento deficiente. Se hiso uso de antibióticos de interés como kanamicina y

cloranfenicol, donde se presencio resistencia y multirresistencia principalmente en los

géneros Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus Pseudomonas, Acinetobacter y Neisseria

(Martínez, y otros, 2010).

El uso de antibióticos para las investigaciones varía dependiendo de la frecuencia del uso

que se le da en cada país.

A nivel nacional, no se encontraron estudios de bacterias ambientales resistentes a

antibióticos. El mayor riesgo en la salud pública es que los genes de resistencia sean

transferidos de bacterias ambientales a patógenos de humanos.

La mayoría de los países latinoamericanos utilizan como fuente principal las normas del

CLSI y además implementan algunas modificaciones a los métodos para contextualizarlos a

las características de cada país. Como ejemplo se encuentra Argentina, el cual su Ministerio

de Salud expide el Manual de los procedimientos para determinar la sensibilidad de las

bacterias a los antibióticos (Malbrán, Carlos; Instituto nacional de enfermedades infecciosas,

2001). Así mismo se encuentra Perú (Instituto Nacional de Salud de Perú, 2002) y Chile

(Instituto de Salud Pública de Chile), en los cuales sus Ministerios de Salud conjunto con los

Institutos de la Salud emiten los manuales que deben utilizar los laboratorios de estos países.

En el caso de Colombia, a pesar de que existen investigaciones que implementan el método

de difusión por discos, no se tiene aún una metodología adaptada a sus características y

estandarizada por el ente regulador. La Secretaría Distrital de Salud de Bogotá, emite un

Manual de resistencia bacteriana siguiendo las normas del CLSI en el año 2010, pero en

comparación con los países vecinos, este manual es muy general y no presenta el

procedimiento detallado de los métodos (GREBO, 2010). La Secretaría Distrital de Salud

también emite la Guía de infecciones intrahospitalarias (Chalá, 2007) y la Política de

prevención, control y vigilancia epidemiológica de infecciones intrahospitalarias (Contraídas

en el hospital) y entre sus objetivos esta la vigilancia en la salud pública, gestión de calidad,

prestación de servicios e investigación de la resistencia antimicrobiana en Bogotá con

enfoque en la microbiología clínica (Secretaría de Salud Distrital de Bogotá, 2007).

En Colombia no existe un sistema formal integrado a nivel nacional para la vigilancia de la

resistencia antimicrobiana. Sin embargo el Instituto Nacional de Salud ha estado haciendo

vigilancia pasiva de patógenos de importancia en la salud humana (Donado Godoy, 2010).

Además se encuentra la Secretaría Distrital de Salud y el Grupo para el Control de la


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Resistencia Antibacteriana en Bogotá (GREBO) que manejan un enfoque clínico, mas no a

nivel de medio ambiente, además su alcance es a únicamente distrital. No se encontró ningún

documento del Ministerio de Salud y Protección Social en relación al tema tratado.

“Considerando estos aspectos preliminares, se desprende que la vigilancia de la resistencia

antimicrobiana es necesaria, pero es fundamental asegurar la calidad de los resultados de

laboratorio, siendo indispensable por tanto, estandarizar los procedimientos” (Instituto

Nacional de Salud de Perú, 2002). Por lo tanto el objetivo de esta investigación es el

desarrollo de un protocolo para evaluar la susceptibilidad de bacterias ambientales a

diferentes antibióticos.

METODOLOGÍA

Muestreo

Se escogieron cuatro puntos de muestreo del Rio Bogotá, en la Sabana de Bogotá. Para cada

muestra se tomo un volumen de 150ml en envases estériles. La recolección se realizó en el

agua superficial del río, con el fin de obtener bacterias aerobias.

La primera muestra 3 (M3) fue tomada en el cruce de la vía Cota – Suba con el Rio Bogotá.

La muestra 4 (M4) fue tomada en el mismo punto que la tercera muestra, con la diferencia

que ésta se recolecto en el desagüe de una tubería dirigida al río, posiblemente de aguas

residuales de las cercanías debido a su color y olor. La quinta muestra (M5) fue tomada en la

calle 193 con carrera 18 en el punto del canal (caño) Torca, Bogotá.

Métodos microbiológicos

Para cada muestra, se hicieron cuatro diluciones seriadas con solución salina al 0,85%. Se

realizó una siembra superficial en agar nutritivo, añadiendo 0,1 ml de cada dilución a la caja

de petri. Finalmente se incubó a 37,5°C por 24 horas.

Se realizó el recuento de las colonias en la menor dilución, con el fin de medir la

concentración bacteriana en UFC/ml. Se escogieron las colonias, que por morfología

macroscópica presentaron diferencias.

Con el propósito de obtener cultivos puros se realizó el aislamiento de las colonias en agar

nutritivo (Becton, Dickinson and Company). Se incubó a 37°C durante 18 a 24 horas

(tiempo estándar de crecimiento de las bacterias). Se realizaron los pases necesarios hasta

comprobar que se tenía un cultivo puro (Ordoñez Smith, 1994).


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Cepario

Una vez obtenidos los cultivos puros, cada una de las cepas se almacenó en glicerol al 1% a -

80°C. Estas se encuentran en el laboratorio del Centro de Investigación en Ingeniería

Ambiental de la universidad.

Prueba de sensibilidad

Se utilizó como guía el método estandarizado por El Comité Nacional de Estándares de

Laboratorio Clínico (NCCLS) la norma M2.

Se realizó la suspensión de las colonias en solución salina al 0,85%, y se hiso ajuste de

turbidez para que fuera igual al estándar de 0.5 de McFarland, lo cual es equivalente a

inocular 1,5 X 108

(UFC)/ml, y se procedió a la siembra en superficie añadiendo 0,1 ml en el

medio Mueller-Hinton (Becton, Dickinson and Company) (Instituto Nacional de Salud de

Perú, 2002).

Se utilizarón los sensidiscos de los antibióticos ampicilina (10µg), tetraciclina (30µg),

kanamicina (30µg) y cloranfenicol (30µg) (Becton, Dickinson and Company), también se

hizo uso de ampicilina comercial marca GENFAR en concentraciones de 30µg.

Los discos se colocaron dentro de los 10 minutos siguientes a la inoculación de la caja. Se

utilizaron dos discos de diferentes antibióticos por caja, siguiendo una forma paralela de

colocación. Para todas las colonias se utilizaron los cuatro antibióticos nombrados, con su

correspondiente duplicado. Se incubaron a una temperatura de 35°C -37°C, por 18 a 24

horas (Coyle, 2002).

Interpretación del antibiograma:

La lectura se hizo justo después de transcurridas las horas de incubación. Se midió el

diámetro con una regla de la zona o el halo de inhibición (zona en la cual no se presenta

crecimiento alrededor del disco) (Ordoñez Smith, 1994).

Según el método de la NCCLS, los resultados del diámetro del halo de inhibición son

informados como sensibles, intermedios y resistentes. Esta interpretación proviene de las

tablas 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H ó 2I de las normas M2 – A7 del NCCLS de Enero de

2001, las cuales relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su

interpretación (Instituto nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001). Pero, en

este caso, las bacterias utilizadas para realizar el antibiograma no han sido caracterizadas

previamente, por lo tanto, aquellas que no generaron un halo fueron consideradas resistentes,

y las que si generaron inhibición, fueron consideradas sensibles.


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Ilustración 1. Colonia resistente a Tetraciclina y Sensible a Kanamicina

Las cepas identificadas como resistentes fueron aisladas y sembradas en el medio Mueller-

Hinton. En el caso de algunas cepas que presentaron morfología distinta en una misma caja

de petri, fue necesario aislarlas y realizar nuevamente la prueba de sensibilidad.

Se realizó el procedimiento de tinción de Gram, con el fin de tener una primera evaluación

del tipo de bacterias presentes, además para comprobar la eficiencia del aislamiento y la

pureza del cultivo. Por lo tanto, las cepas que presentaron variación en los resultados de la

tinción, fue necesario realizarles nuevamente la prueba de sensibilidad. Esto es importante

para garantizar la identificación de la bacteria completamente aislada y no generar

problemas en los procedimientos moleculares.

Extracción de ADN

Se utilizaron diferentes métodos de extracción con el fin de encontrar el más óptimo para el

requerimiento y las características de cada bacteria. Se realizo el método de extracción Fenol

Cloroformo, basado en el protocolo estandarizado del Centro de investigaciones de

Ingeniería Ambiental (CIIA) de la Universidad de los Andes. También el método de

extracción de suelos PowerSoil® DNA Isolation Kit siguiendo los requerimientos del

fabricante MO BIO Laboratories, Inc.

Cuantificación del ADN

Con el producto obtenido de la extracción, se realizó un gel de agarosa al 1% con el fin de

verificar si se obtuvo ADN.

Para algunos métodos de biología molecular es importante cuantificar la concentración del

ADN y para esto se hace uso de la espectrofotometría. En este procedimiento pueden existir

dos tipos de contaminación que afecta la medición del ADN, los cuales son residuos de fenol

y RNA (Walker & Rapley, 2000). Se hizo uso del espectrofotómetro NanoDrop 2000c, al

cual se le añadio 2µL de ADN de la muestra. Se tomaron los datos de la relación 260/230 la


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cual debía tener un valor menor a 1.8, ya que mide la posible contaminación del ADN; y se

tomó la concentración del ADN dada en ng/µL. De acuerdo con lo que se obtuvo, se

ajustaron las concentraciones de las muestras a un valor aproximado de 30ng/µL, cantidad

optima para el desarrollo de las pruebas moleculares.

PCR (Polymerase chain reaction)

La PCR es utilizada para generar varias copias de fragmentos específicos de ADN con el fin

de poder identificar las colonias aisladas. La PCR involucra dos oligonicleotidos o primers

los cuales permiten que la Taq Polimerasa inicie la reacción, además estos delimitan la zona

de ADN que se quiere amplificar. La reacción se realiza en un Termociclador que permite la

exposición de la reacción a una rampa de calentamiento y enfriamiento de los tubos de

reacción, con el fin de controlar la temperatura de cada etapa (McPherson & Moller, 2000).

Se realizó la amplificación 16S del ADN ribosomal. Los primers utilizados fueron 101F y

1392R.

PCR de gradiente

Se realizó una PCR de gradiente con el fin de encontrar la temperatura óptima para realizar

la PCR. El Termociclador evalúa la temperatura adecuada en la que se presenta el

anillamiento de los primers al ADN, teniendo en cuenta el rango de temperatura, el cual

divide en ocho partes, siendo para el primer 101 F 85,3°C y para el primer 1392 R 60,5°C.

Como resultado se obtuvo que la temperatura óptima de anillamiento sea de 64,7°C.

Estandarización de la PCR

Con el fin de buscar las mejores condiciones para la realización de la PCR, se realizaron

diferentes mezclas de reactivos, en los cuales se variaba la cantidad de ADN, de Primers y

de MgCl2. Como resultado se obtuvo la siguiente mezcla:

Tabla 2. Reactivos utilizados en al PCR

Reactivos Concentración 1x (µl)

MgCl2 2,2 mM 2,2

Buffer 1x 2,5

Primer F 1,6 µM 0,35

Primer R 1,6 µM 0,35

dNTPs 0,2mM 0,5

Tag 1u 0,2

ADN 30 ng/µL 2,2

Agua Desionizada 16,7

TOTAL 25


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Electroforesis

Para la realización de la electroforesis primero se preparó el gel para el cual se utiliza

agarosa y Buffer TAE al 1x, siendo la mezcla al 2%; y se añadió GelRed (marca Byothum).

La cantidad de estos varía de acuerdo con el tamaño del gel. Para un gel pequeño se utilizó

0,8g de agarosa, 40ml de Buffer TAE y 1,3µL de GelRed. Para un gel grande se utilizó 1,4g

de agarosa, 70ml de Buffer TAE y 2,2µL de GelRed.

Cuando el gel se solidifico, en los canales se añadió la mezcla de 1,3 µL de Buffer y 3 µL

del ADN (proveniente de la PCR). Se expuso a 90V y 400mA durante 60 minutos.

Finalmente se utilizó un transiluminador (BIORAD XX) el cual utiliza la luz ultravioleta

para mostrar la migración del ADN en el gel.

Purificación

Se utilizó el kit de purificación de producto de PCR llamado EXOSAP de la marca

Fermentas y se siguieron las indicaciones del fabricante.

Secuenciación

La secuenciación se realizó en el Laboratorio de Secuenciación de ADN de la Universidad

de los Andes. Para esto se utilizaron los primers de 101F y 1392R, y dos primers internos

975R y 352F, dada la cantidad de pares de bases. Se utilizó el método de secuenciación de

Sanger.

Para la lectura de los resultados de la secuenciación, se utilizó un software "CLC Main

Workbench 6". Este programa permite la importación de secuencias de ADN y la formación

de la secuencia consenso a partir de dos secuencias editadas.

Para la limpieza de la secuenciación se seleccionó la región libre de dobles picos y se creó la

secuencia editada.

Después de obtener una secuencia limpia, se llevo a cabo una búsqueda en NCBI Blast para

encontrar el microorganismo que corresponde a la secuencia. Este programa compara los

nucleótidos o proteínas de la secuencia con secuencias presentes en la base de datos, y

realiza un cálculo estadístico de las coincidencias (Basic Local Alignment Search Tool

(BLAST)).


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Ilustración 2. Plataforma de CLC Main Workbench 6

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Métodos microbiológicos

Por medio de las diluciones seriadas se logró establecer la concentración bacteriana de cada

muestra y escoger las colonias a evaluar.

Tabla 3. Resultado diluciones

Muestra Concentración

bacteriana (UFC/ml)

# Colonias

escogidas

M3 18 x 105 6

M4 53 x 105 8

M5 19 x 105 9

TOTAL 23

En la Tabla 3 se presenta que la muestra con mayor concentración bacteriana es la número

cuatro. Las muestras tres y cinco son muy similares, y la concentración menor se presenta en

la muestra uno. Este resultado es equivalente al lugar de toma, en el cual la muestra cuatro

pertenece a un efluente de una tubería al río, siendo más concentrada; y las muestras tres y

cinco son directamente del rio.


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La escogencia de las colonias se realizó por medio de la morfología observada; aunque se

tuvo en cuenta todo tipo de morfologías diferentes presentes en cada muestra, es posible que

no se hayan incluido todas las bacterias presentes; además el procedimiento de dilución

seriada, permite distinguir las colonias en las diluciones más altas.

Metodología de difusión por discos

En el transcurso de la realización de esta investigación, se efectuaron cambios a la

metodología estandarizada y referenciada del CLSI y de Kirby-Bauer, esto con el fin de

aplicar la prueba a bacterias ambientales.

Un cambio satisfactorio fue el de la realización de replicas por colonia para la prueba de

susceptibilidad. Esta decisión generó mejores y más confiables resultados, con los cuales se

corroboró la resistencia o sensibilidad. Por lo tanto se recomienda para investigaciones

posteriores realizar un número igual o mayor de replicas.

Otro cambio que se realizó en esta investigación a la metodología estandarizada por el CLSI

es la interpretación del antibiograma. Dado que la prueba de CLSI contiene tablas que

relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su interpretación (Instituto

nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001), fue necesario excluirlas debido a

que las cepas no se encontraban identificadas. Por tal razón se tomó la decisión de informar

los resultados sólo como sensibles o resistentes, excluyendo la clasificación de intermedios

como se muestra en la Ilustración 1. Aunque esta decisión generó una fácil interpretación del

antibiograma, fueron descartadas varias cepas intermedias que podrían presentar resistencia

a los antibióticos ya que formaban un diámetro aproximado a 0,8 cm. Por lo tanto se

recomienda tener en cuenta la clasificación de intermedio para la interpretación del

antibiograma.

Se presentan a continuación las variables y el control satisfactorio utilizado en esta

investigación, dado que la mayoría de errores que se pueden presentar en la prueba de

difusión por discos obedecen a que no se controlan las variables del procedimiento (Coyle,

2002):

La concentración del inóculo se controló por medio del estándar de McFarland. La

cantidad de microorganismos por unidad de volumen de inóculo influye mucho sobre

los resultados de las pruebas.

Se utilizó el agar Mueller-Hinton recomendado por la metodología de Kirby-Bauer.

En esta investigación no se midió el pH del medio el cual debe estar entre 7,2 a 7,4;

lo que pudo generar inconsistencias en su eficiencia, ya que la interpretación de los

tamaños de estas zonas varían de resistentes a sensibles según el pH del medio

(Barry, 2007).


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El contenido del antimicrobiano en el disco se encuentra estandarizado por el

fabricante y se siguieron las medidas de almacenamiento. Aun así, cuando se

identifico la cantidad de cepas resistentes a ampicilina, se realizó nuevamente la

prueba con el antibiótico en líquido para confirmar o rechazar la resistencia de las

cepas.

Se escogieron sólo dos discos por placa para permitir que los halos de inhibición se

formaran sin que se generara interrupción.

Se utilizó la temperatura de incubación recomendada por el método estandarizado

(Coyle, 2002).

El tiempo de incubación fue entre 20 a 24 horas, lo cual es lo recomendado por la

CLSI. Aun así, no se realizaron pruebas de incubación por mayor tiempo, lo cual

podría generar el crecimiento de diferente tipo de bacterias.

Se efectuaron mediciones precisas de los halos de inhibición.

Prueba de sensibilidad

En el Anexo 1, se presenta la tabla de resultados de las colonias aisladas, la cual contiene la

información de la sensibilidad o resistencia hacia los antibióticos y la coloración de Gram;

con base en esta tabla se realizan las siguientes gráficas.

Gráfica 1. Número de colonias Vs resultados de la prueba de sensibilidad

Dada la prueba de susceptibilidad, se obtuvo que 10 de las cepas aisladas fueran resistentes a

la ampicilina, 8 a tetraciclina, 5 a cloranfenicol y sólo 2 a kanamicina. Estos valores incluyen

multirresistencia por lo que la suma no genera las 23 cepas aisladas.

2

4 5

2

10

8

0

2

4

6

8

10

12

Resultados

inconsistentes

Sensibles R. Cloranfenicol R. Kanamicina R. Ampicilina R. Tetraciclina

Num

ero

de

Co

lonia

s


15

Se genera mayor resistencia al antibiótico Ampicilina, luego a Tetraciclina, Cloranfenicol y

finalmente Kanamicina. Este orden de resistencia es similar a otras investigaciones de

bacterias ambientales provenientes de ríos. En estos estudios se reporto que prevalece la

resistencia a ampicilina (47%), tetraciclina (12,8%) y a cloranfenicol (2,5%) (Birol, Celik, &

Alpay-Karaogly, 2007). Es probable que este patrón se genere debido al alto consumo y uso

que se le da a estos antibióticos, siendo de uso común la ampicilina y tetraciclina, y de usos

para infecciones mas graves el cloranfenicol y la kanamicina como se describe en la Tabla 1.

Los resultados inconsistentes mostrados en la Gráfica 1 son aquellos en los que la prueba de

sensibilidad es diferente entre las replicas de la colonia. Es posible que esto ocurra debido a

la variedad de bacterias en la misma colonia y por lo tanto sería necesario realizar varios

aislamientos hasta obtener colonias puras. Aunque para estos casos se repitió la prueba una

segunda vez, los resultados obtenidos siguieron siendo diferentes entre replicas.

Las colonias sensibles son aquellas que presentaron halos de inhibición a los cuatro

antibióticos. Como se aclaró en la metodología, se calificó como resistente aquellas colonias

que no generaron halos de inhibición.

Gráfica 2. Número de colonias Vs resultados de la prueba de sensibilidad por muestra

La Gráfica 2 presenta los resultados obtenidos en la prueba de sensibilidad de cada muestra.

Se generó multiresistencia hasta a tres antibióticos en una misma colonia. Tanto en la

muestra cuatro como cinco, la cantidad de colonias resistentes es mayor a la cantidad de

colonias sensibles y con resultados inconsistentes; pero en la muestra tres existe la misma

4

3

2

6

1 1 1

2 2

1

0

1

2

3

4

5

6

7

Un Antibiotico Dos

Antibioticos

Tres

Antibioticos

Resultados

inconsistentes

Sensibles

Núm

ero d

e co

lonia

s

M5 M4 M3


16

cantidad de colonias resistentes en comparación con colonias con resultados inconsistentes,

esto genera un grado de error considerable al momento de realizar el aislamiento.

Gráfica 3. Numero de colonias que presentan resistencia a antibióticos para cada muestra

Al igual que la Grafica 2, la Grafica 3 no presenta un patrón de la resistencia a antibióticos

entre las muestras. Con base en lo anterior, se puede afirmar que la resistencia varía con el

punto de muestreo, sus efluentes y sus alrededores.

La presencia de multirresistencia en bacterias ambientales ya se ha reportado en otras

investigaciones [ (Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007); (Martínez, y otros, 2010);

(Martínez & Villalobos, 2008)].

Dado que no hay investigaciones en Colombia, la comparación de los resultados con

investigaciones internacionales puede generar diferencias, ya que el comportamiento de

consumo de antibióticos es diferente entre los países y así mismo el uso que se le está dando

al río del cual fueron aisladas las bacterias.

Es importante resaltar que sólo 4 de las cepas aisladas son sensibles a los antibióticos y 17

presentan al menos resistencia a un antibiótico. Con esto se sustenta la existencia ambiental

de resistencia en un sistema acuático y se puede afirmar que la ocurrencia de resistencia

bacteriana a antibióticos es el reflejo de la influencia de los seres humanos en el medio

ambiente.

2

5

3 3

1

4

2

1

2

1 1

0

1

2

3

4

5

6

Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5

Nú

mer

o d

e co

lon

ias

R. Ampicilina R. Tetraciclina R. Cloranfenicol R. Kanamicina


17

Selección de las colonias a identificar

Dada la cantidad de colonias obtenidas se desarrollaron criterios de selección de las colonias

más representativas con el fin de identificarlas y realizarles procesos moleculares. Estos

fueron los criterios:

Presentar resistencia a más de un antibiótico

Resultados consistentes de las replicas

Colonia pura, verificado por coloración de Gram

Por lo anterior, las colonias escogidas fueron las siguientes:

Tabla 4. Colonias seleccionadas

Muestra Colonia Replica Resistencia [R] y Diámetro Halo (cm)

C K AM TE

M5

C1 K a 2

R 1,5

R b 2,3 1,8

C3 a

R 2,5

R 2

b 2,4 2

C6 a

R 2

R 2

b 2,2 1,9

M3

C1 a

R 2

R R b 1,9

C3 a

R 2

R R b 2

M4 C4

a R

2,5 1,3 R

b 2,2 1,1


18

M5C6. (Gram negativo) Bacilo Aglomerado

M3C1. (Gram negativo) Bacilo

M5C1K. (Gram negativo) Bacilo esporulado




Ilustración 3. Coloración de Gram de las seis colonias seleccionadas


19

M5C6.

M3C1.

M5C1K.

M5C3.

M4C4.

M3C3.

Ilustración 4. Aislamiento en caja de petri de las colonias seleccionadas


20

PCR

Por medio del ADN obtenido de la extracción Fenol Cloroformo, se realizó la PCR y se

lograron amplificar las colonias M3C3 y M3C1. Para las colonias M5C6 y M5C3 se logró la

amplificación por medio del ADN extraído por el Kit de suelo PowerSoil®.

Tabla 5. Valores de concentración y relación 260/230 de colonias amplificadas

Colonia Concentración

(ng/µl)

Relación

260/230

M3C3 24,7 1,22

M3C1 36,1 1,45

M5C6 20 0,72

M5C3 12 0,65

En la ilustración 4 y 5 se muestran las bandas de ADN con algunas impurezas que son

necesarias remover. No se muestran todas las bandas de los productos de PCR y se evidencia

dímeros de primers.

En la ilustración 4, las bandas de ADN no corresponden al tamaño de los primers escogidos

(1291 pares de bases), ya que al comparar con la escalera, se encuentran en 300 pares de

bases. Lo mismo sucede en la ilustración 5 para la colonia M5C3.

Ilustración 5. Gel PCR Extracción Fenol Cloroformo


21

Ilustración 6. Gel PCR Extracción Kit Suelo

Se generaron grandes dificultades en la obtención de resultados de la PCR, ya que de las seis

bacterias escogidas, se lograron amplificar cuatro y sólo la colonia M5C6 corresponde al

peso molecular dado por los primers escogidos.

En la Tabla 5 se presentan los resultados de los métodos de extracción para las bacterias que

lograron ser amplificadas. Utilizando Fenol-Cloroformo se obtuvieron valores mayores en la

relación 260/230 en comparación con el kit de suelo. Pero, las concentraciones de ADN

obtenidas por la extracción de fenol- cloroformo son mayores y más óptimas para la

realización de la PCR que las concentraciones del kit de suelo. Es posible que estos factores

hayan generado que el ADN de las colonias M4C4 y M5C1K no fuera de buena calidad y no

se amplificaran.

Existen factores que influyen en los resultados del PCR como lo son la selección de los

reactivos, su uso y almacenamiento, la cantidad y la temperatura de anillamiento.

Los reactivos utilizados se encontraban almacenados a una temperatura de -10°C,

siendo mayor a la necesaria de -20°C, lo cual pudo generar deterioro de estos

(Espinosa Asuar, 2007).


22

Se realizó la estandarización de las condiciones del PCR, estableciendo la cantidad y

la concentración de cada reactivo incluyendo el ADN, lo cual se encuentra en la

Tabla 2.

La temperatura de anillamiento de los primers generan uno de los factores más

importantes para la obtención de buenos resultados. Dado que el primer 101F tiene

una temperatura 85,3°C y el primer 1392 R de 60,5°C, se presenta una gran

diferencia entre temperaturas lo cual no es recomendable. El rango aceptable de

diferencia es de 5°C (McPherson & Moller, 2000). Esto pudo generar que se

presentara la amplificación en un fragmento inespecífico como se muestra en la

Ilustración 5. Sin embargo estos primers han sido reportados en otros estudios como

satisfactorios (Schafer & Muyzer, 2001).

Secuenciación

Las muestras M5C6 y M5C3 no presentaron un resultado adecuado en la secuenciación. Es

posible que esto haya ocurrido debido la densidad de las muestras o problemas en los

primers.

Ilustración 7. Resultados no adecuados de la secuenciación, visto del programa CLC Main Workbench 6

Para las muestras M3C3 y M3C1 se obtuvieron buenos resultados en la secuenciación, por lo

cual se realizó la búsqueda en Blast de la secuencia consenso. La Tabla 6 y 7 muestran los

primeros cinco resultados reportados en Blast de acuerdo con la mayor puntuación. Dado

que el valor E es muy cercano a cero para todas las muestras, los resultados son altamente

significativos en el puntaje y la alineación de la secuencia, por lo tanto son altas las

posibilidades de que los microorganismos aislados correspondan a los encontrados con el

análisis de Blast.


23

Tabla 6. Resultados Blast de la secuencia consenso de M3C3

Descripción Max

Puntaje

Puntaje

Total

Query

coverage E-value

Max

Identidad

Escherichia coli 55989

chromosome, complete genome 383 383 100% 3e-103 98%

Escherichia coli SE11 DNA,

Compete genome 383 761 100% 3e-103 98%

Escherichia coli 53G main


Escherichia coli UMNK88,

complete genome 377 377 100% 1e-101 98%

Escherichia coli O103:H2 str.

12009 DNA, complete genome 377 377 100% 1e-101 98%

Tabla 7. Resultados Blast de la secuencia consenso de M3C1

Descripción Max

Puntaje

Puntaje

Total

Query

coverage E-value

Max

Identidad

Escherichia coli 55989


Escherichia coli SE11 DNA,

Compete genome 401 792 100% 9e-109 98%

Shigella sonnei 53G main


Escherichia coli UMNK88,

complete genome 396 396 100% 4e-107 97%

Shigella sonnei Ss046, complete

genome 396 796 100% 4e-107 97%

Por lo tanto, la muestra M3C3 corresponde al microorganismo Escherichia coli. Dado que

la muestra M3C1 presentó resultados de dos microorganismo, se revisó la coloración de

Gram hecha anteriormente, la cual presentó mayor similitud a la bacteria Escherichia coli.

Lo anterior representa que de las dos muestras, se obtuvo una misma bacteria.

Estos resultados se asemejan a los obtenidos en estudios realizados en Turquía, en los cuales

se aisló la bacteria E.coli de agua potable luego de un tratamiento básico y proveniente de

ríos en zonas rurales subdesarrolladas y agrícolas, y con aguas residuales de asentamientos

locales. Sus resultados presentaron que la bacteria generó multirresistencia a los antibióticos

ampicilina, tetraciclina y cloranfenicol (Birol, Celik, & Alpay-Karaogly, 2007). En otra

investigación realizada en Venezuela, también se identificó la bacteria E.coli, aislada de una

planta de tratamiento de aguas del sector industrial, la cual presento resistencia a ampicilina

y tetraciclina (Martínez & Villalobos, 2008).


24

Escherichia coli se encuentra comúnmente en la flora intestinal de humanos y animales,

puede causar infecciones en el tracto urinario, meningitis, septicemia nosocomial, colitis

hemorrágica, entre otras. El uso excesivo de antibióticos como las tetraciclinas, penicilinas y

antibióticos de amplio espectro, generan la resistencia antimicrobiana y pueden ser

diseminados al medio ambiente por medio de las aguas residuales (Martínez & Villalobos,

2008). E. coli es generalmente aceptado como el vehículo predominante para la difusión de

genes de resistencia y vectores debido a su abundancia en estos entornos (Birol, Celik, &

Alpay-Karaogly, 2007).

La problemática de la contaminación del río con aguas residuales domesticas, industriales y

contaminantes metálicos, son los causantes del desarrollo de bacteria resistentes. En el

estudio de Martínez y otros en el año 2010, se evidencio la influencia de la exposición a

metales pesados (iones plomo, cromo y cadmio) en promover la resistencia y

multirresistencia de las bacterias a los antibióticos.

A pesar de las repercusiones en la salud pública generadas por la resistencia antimicrobiana,

estas cepas pueden ser utilizadas en procesos de biorremediación o degradación de los

antibióticos, como medida de disposición, ya que es posible que no solo sean resistentes si

no también degradadoras del antibiótico.

CONCLUSIONES

En Colombia es importante la evaluación de susceptibilidad de bacterias ambientales a los

antibióticos dado que no se presentan estudios similares en el país, resaltando que el mayor

riesgo en la salud pública es que los genes de resistencia sean transferidos de bacterias

ambientales a patógenos de humanos. Además el desarrollo del método de difusión por

discos genera el inicio de la estandarización de este método en el contexto del país, ya que a

nivel nacional no hay una guía o manual de esta metodología por parte del ente regulador, lo

cual si sucede en otros países (Instituto Nacional de Salud de Perú, 2002; Instituto de Salud

Publica de Chile; Instituto Nacional de enfermedades infeccionas de Argentina, 2001).

La prueba de susceptibilidad antimicrobiana por discos de difusión es sencilla, rápida y poco

costosa. Es importante controlar de manera adecuada las variables de la prueba y la pureza

de los aislamientos, de lo contrario se puede presentar errores en los resultados de

susceptibilidad o inconsistencias en la prueba. Los cambios realizados a la metodología de

Kirby-Bauer se deben a las condiciones de la investigación, siendo de manera adecuada la

adición de replicas para cepas en la prueba de susceptibilidad, y de mayor control la


25

exclusión de cepas clasificadas como intermedio en la interpretación del antibiograma. Para

la identificación de las bacterias, es muy importante realizar la extracción del ADN de

manera adecuada, utilizando el kit necesario para obtener un ADN sin impurezas. Además se

deben tener en cuenta todos los factores que permiten la realización del PCR.

Por medio de la prueba de difusión por discos se obtuvo que 17 de las bacterias aisladas

presentaron resistencia al menos a un antibiótico, siendo el más común ampicilina y el

menor kanamicina, debido a su uso médico. Además 6 de estas bacterias presentaron

multirresistencia a los antibióticos, hecho que se ha evidenciado en otras investigaciones.

Se lograron identificar dos bacterias multirresistentes por medio de la secuenciación y

análisis Blast, por lo cual se obtuvo Escherichia coli con alta compatibilidad. Este resultado

se ha presentado en otras investigaciones y la presencia de este microorganismo en aguas

residuales es común.

Fue difícil realizar comparaciones de los resultados obtenidos con otros estudios, debido a la

falta de información en Colombia y al no tener identificadas las bacterias.

Se espera que con esta investigación se dé inicio a la caracterización de bacterias

ambientales en Colombia y sirva como apoyo a otras investigaciones en el tema

metodológico de difusión por discos.


26

AGRADECIMIENTOS

Ante todo a mis padres, quienes por su esfuerzo lograron que yo cumpliera la meta de

estudiar esta carrera en la mejor universidad. Gracias por su apoyo, enseñanzas y amor que

me han brindado.

A mi hermano por ser mi profesor personal, gracias por tu ayuda en todo, por tu compañía y

enseñanzas.

Gracias a Alejandro por ser mi mano derecha y mi apoyo. Por la colaboración en esta

investigación y ayudarme en todo lo de microbiología; además por estar a mi lado, hacerme

reír y vivir conmigo todos estos años de la universidad.

Gracias a Juliana Martínez por compartir conmigo sus conocimientos en microbiología, por

su paciencia, apoyo incondicional en la investigación y enseñarme el encanto del trabajo en

laboratorio.

Gracias a Johana Husserl por su asesoramiento y guía, por siempre ayudarme a enfocarme en

el pensamiento ingenieril del estudio.

Gracias a todos mis amigos, Diana, Laura, Luisa, María Camila y Alejandro, por su infinita

ayuda, acompañamiento y risas en estos años, por compartir conmigo la pasión de esta

carrera.

Gracias a mis amigas Estefanía, Any, Daniela y Catalina, por siempre estar pendientes de

estos años de universidad y por los ratos libres con ustedes para equilibrar la carga

académica.

Gracias a Estefanía Guzmán por hacerme conocer esta carrera, por su ayuda y por ser parte

de mi familia.

Gracias a todas las personas del laboratorio de ingeniería ambiental por su ayuda y por

generar el mejor ambiente de trabajo.


27

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30

ANEXO 1

MUESTRA COLONIA Replica Resistencia [R] y Diámetro Halo (cm) Coloración

GRAM C K AM TE

M5

C1 C a 2 2 R 3 (-) Bacilo

b 1.8 2.2 R 3.1

C1 K a 2 R 1.5 R (-) Bacilo

esporulado b 2.3 R 1.8 R

C2 a 2.5 2 1 2.2 No se realizo

b 2.4 1.8 1 2.2

C3 a R 2.5 R 2 (-) Bacilo

b R 2.4 R 2

C4 a 2 0.8 2 R (+) Bacilo

b 2.2 1 2 R

C5 a 3 2.2 2.2 3 No se realizo

b 3.4 2 2 2.8

C6 a R 2 R 2 (-) Bacilo

aglomerado

b R 2.2 R 1.9

C7 a 2.2 2 2 R (-) Bacilo

b 1.8 2.1 2 R

C8 a 2.2 2 3 R (-) Bacilo

b 2 2 3 R

M3

C1 a R 2 R R (-) Bacilo

b R 1.9 R R

C2 a 2.5 2.1 R 2.4 No se realizo

b 2.4 2 2 2.2

C3 a R 2 R R (-) Bacilo

b R 2 R R

C4 a 2.4 1.6 2 R (-) Bacilo

b 2.5 1.6 2 R

C5 a 2.3 2.5 1.1 2.3 No se realizo

b 2.1 2.5 1.1 3

C6 a 3.3 3.3 4 3.5 No se realizo

b 3 R 4 3

M4

C1 a 2.2 2.2 1.5 1.3 No se realizo

b 2.3 2 1.8 1.1

C3 a 3.1 3 R 3 (+) Bacilo cortos

b 3 2.5 R 2.1

C4 a R 2.5 1.3 R (-) Bacilo

b R 2.2 1.1 R

C6 a 3.5 R 4 2.5 (-) Bacilo

esporulado

b 3.5 R 4 2

C7 a 0.8 2 R 3.3 (-) Bacilo

b 1 1.5 R 3.5

C8 a 3 1.1 R 2.3 (-) Bacilo

b 3.2 2.1 R 3

C9 a 2.2 1.6 R 2.5 (+) Bacilo

b 2.5 2 R 2

C10 a 2.3 2.5 R 2.6 (+) Bacilo

b 2.5 1.5 R 2.6


31

ANEXO 2

MANUAL DE PRUEBA DE DIFUSIÓN POR DISCO PARA LA DETERMINACION

DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS EN BACTERIAS

AMBIENTALES

1. Objetivos

Detallar los pasos necesarios para realizar la prueba de difusión por disco.

Resaltar las variables que deben ser controladas en la prueba.

Interpretar los diámetros de la zona de inhibición, siguiendo las recomendaciones del

CLSI.

2. Diluciones seriadas

Se recomienda realizar diluciones seriadas con el fin de disminuir la concentración

bacteriana de la muestra. Es importante realizarlas en muestras de aguas y suelos

contaminados. La cantidad de diluciones a realizar dependerá de la contaminación de la

muestra.

1. Cada tubo de ensayo debe contener 9 ml de solución salina al 0,85% y se le añade

1ml de la muestra de manera seriada.

2. Se realiza la siembra superficial en agar nutritivo, añadiendo 0,1 ml de cada dilución

a la caja de petri.

3. Incube a 37°C por 24 horas.

4. Realice el recuento de las colonias para medir la concentración bacteriana en

UFC/ml.

Ilustración 1. Diluciones seriadas. Tomado de http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm


32

3. Aislamiento

Para el método de difusión de disco es necesario que las cepas se encuentren aisladas.

1. Tome una porción del cultivo con el asa, haga un masivo (esparcir) en una parte de la

caja de Petri nueva.

2. Esterilice el asa en el mechero y enfríela insertándola en el agar al borde de la caja.

3. Esparza el cultivo dos veces, como se muestra en la ilustración 2, esterilizando el asa

cada una de las veces.

4. Haga un espiral en el centro.

Ilustración 2. Aislamiento. Tomado de http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm

La caja de petri se incuba a 37°C durante 18 a 24 horas (tiempo estándar de crecimiento de

las bacterias). Se realizan los aislamientos necesarios hasta obtener un cultivo puro.

Para lograr conservar los cultivos, se recomienda envolver las cajas de petri en papel wrap

(pelicula trasparente auto adherida), introducirlas en bolsas y guardarlas en la nevera. Es

importante realizar pases constantes a un nuevo medio con el fin de evitar la muerte del

cultivo.

Ilustración 3. Forma de almacenamiento de los cultivos.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm


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4. Prueba de susceptibilidad microbiana

Estándar de turbidez escala 0,5 Mc Farland

Para estandarizar la densidad del inóculo, se utiliza el estándar de turbidez Mc Farland, lo

cual es equivalente a inocular 1,5 X 108

(UFC)/ml.

1. Agregar 0,5ml de la solución de BaCl2 2H2O (1,175% P/V ) a 99,5ml de la solución

de H2SO4 (1% V/V).

2. Medir la densidad óptica en el espectrofotómetro. La absorbancia a 625nm debe estar

entre 0,08 a 0,10 para el estándar.

3. Distribuir de 4 a 6 ml en tubos similares a los que se va a preparar el inóculo.

4. Sellar y guardar a oscuras a temperatura ambiente.

5. Al momento de utilizarlos, es necesario agitarlos para lograr la turbidez homogénea.

Medio de Agar Mueller-Hinton

El agar Mueller Hinton es usado siempre para las pruebas se susceptibilidad debido a

rendimiento satisfactorio en el crecimiento de la mayoría de bacterias patógenas.

Preparación

1. Preparar el Agar Mueller-Hinton a partir de la base deshidratada de acuerdo con las

indicaciones del fabricante.

2. Autoclavar el medio, de acuerdo con lo indicado por el fabricante.

3. Adicionar 20ml del medio en cajas de petri, de manera que el grosor del agar sea

aproximadamente de 4mm, lo cual corresponde a cajas de 100mm de diámetro

interno. Es importante que este paso se realice dentro de la cámara de extracción,

para evitar contaminación del medio.

4. Dejar las cajas entre abiertas para que el agar se enfríe y no genere un exceso de

humedad en el medio ni en la tapa de la caja.

5. Si las cajas no se van a utilizar ese día, se deben envolver en plástico para evitar el

secado del agar y se debe guardar en la nevera.

Preparación del inóculo

Luego de haber preparado el estándar de Mc Farland y el medio de cultivo, se realiza la

suspensión del cultivo y la inoculación en la caja de petri.

1. Suspender las colonias en solución salina al 0,85% y agitar el tubo hasta que esté bien

mezclada. Se recomienda suspender poco a poco las colonias mientras se compara con el

estándar.


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Ilustración 4. Colonia a suspender

2. Hacer el ajuste del inoculo a una turbidez equivalente al estándar de 0.5 de McFarland.

3. Comparar la turbidez del inoculo y el estándar ubicando los tubos frente a un papel

blanco o una tarjeta de líneas blancas y negras.

Ilustración 5. Comparación tubos

4. Tomar 0,1 ml del inoculo y servirlo en el medio de cultivo Mueller-Hinton.

5. Con ayuda de un rastrillo, distribuir en toda la superficie el inoculo agregado de manera

homogénea.

Ilustración 6. Uso del rastrillo para distribuir el inoculo en la caja

A. Tubo con solución salina al 0,85%

B. Tubo con el inoculo

C. Estándar de 0,5 de McFarland


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Aplicación de los sensidiscos

Los sensidiscos deben ser almacenados en la nevera donde se encuentran los reactivos del

laboratorio y deben estar forrados con plástico. En el momento de su uso, es importante

retirarlos de la nevera aproximadamente con una hora de anterioridad, así se minimiza la

condensación.

Los discos se colocan dentro de los 10 minutos siguientes a la inoculación de la caja. Se

pueden utilizar dos discos de diferentes antibióticos por caja, siguiendo una forma paralela

de colocación. Es importante presionar cada disco para asegurar el contacto con la superficie

del agar.

Se invierten las placas y se incuban a una temperatura de 35°C a 37°C, por 18 a 24 horas.

Ilustración 7. Pasos para la aplicación de los sensidiscos

Se recomienda hacer duplicados de una misma colonia, con el fin de tener mejores

resultados; así la colonia estaría expuesta dos veces a un mismo antibiótico y se esperaría

que los resultados sean los mismos.


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5. Interpretación del antibiograma

La lectura se debe realizar justo después de transcurridas las horas de incubación. Para esto

se mide con una regla o calibrador el diámetro de la zona o el halo de inhibición (zona en la

cual no se presenta crecimiento alrededor del disco). Se recomienda realizar este

procedimiento sobre una superficie de color negro, para facilitar la visión.

Según el método de la NCCLS, los resultados del diámetro del halo de inhibición son

informados como sensibles, intermedios y resistentes. Esta interpretación proviene de las

tablas 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H ó 2I de las normas M2 – A7 del NCCLS de Enero de

2001, las cuales relacionan la bacteria, el antibiótico y el diámetro, para hallar su

interpretación (Instituto nacional de enfermedades infecciosasde Argentina, 2001).

Ilustración 8. Lectura de los halos de inhibición.

6. Bacterias resistentes Las cepas identificadas como resistentes deben ser aisladas y sembradas en el medio

Mueller-Hinton. Si se presenta una morfología distinta en una misma caja de petri, es

necesario aislarlas y realizar nuevamente la prueba de sensibilidad.

Es importante realizar la tinción de Gram, con el fin de

tener una primera evaluación del tipo de bacterias

presentes, además para comprobar la eficiencia del

aislamiento y la pureza del cultivo. Esto es importante para

garantizar la identificación de la bacteria completamente

aislada y no generar problemas en los procedimientos

moleculares.

Ilustración 9. Caja de petri y placa previo a la tinción de Gram


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7. Variables de la prueba

Se presentan a continuación las variables de la prueba, las cuales deberán ser controladas en

el momento de realizar el procedimiento.

La concentración del inóculo por medio del estándar de McFarland.

Procedimiento de inoculación.

Uso del agar Mueller-Hinton, su pH y su profundidad en la caja de petri.

El contenido del antimicrobiano en el disco y las medidas de almacenamiento.

Numero de discos por caja de petri.

Temperatura y tiempo de incubación

Mediciones precisas de los halos de inhibición.